KR101890877B1

KR101890877B1 - 바실러스 서브틸러스와 비타민b2를 함유한 양어용 보조사료와 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101890877B1
Application number: KR1020170055252A
Authority: KR
Inventors: 김철홍; 한송희; 박주연; 강범용
Original assignee: (주)현농
Priority date: 2017-04-28
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2018-08-23

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바실러스 서브틸러스 미생물로 발효시킨 발효미강과 비타민B2를 함유하여 어류의 내병성을 증대시킴으로써 어류의 폐사율은 낮추고 성장은 촉진시킬 수 있는 양어용 보조사료와 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 양어용 보조사료는 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 함유하고, 발효미강은 미강에 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 배양액을 첨가하여 발효시킨다.

Description

바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료와 이의 제조방법{supplementary feed for fish farming and manufacturing method thereof}

본 발명은 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료와 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바실러스 서브틸러스 미생물로 발효시킨 발효미강과 비타민B2를 함유하여 어류의 내병성을 증대시킴으로써 어류의 폐사율은 낮추고 성장은 촉진시킬 수 있는 양어용 보조사료와 이의 제조방법에 관한 것이다.

수산양식이란 인간의 생활에 필요한 수산생물 등을 육상 농업과 마찬가지로 물에서 길러 수확하는 것을 가리키는 말로, 일명 수중농업이라고 불린다.

우리나라는 삼면이 바다로 둘러싸여 있고, 동서 남해안의 수온 및 지형 등 바다특성이 달라 각 해역에 따라 다양한 어종의 양식이 가능하고, 해안선이 갈고 복잡하며 또한, 간지가 넓고 물의 온도가 알맞아 양식업을 하기에 유리하다.

하지만, 현재 국내 양식산업은 급속한 양적 팽창으로 인해 양식장의 무분별한 난립과 포르말린, 과산화수소수와 같은 각종 살균 소독제의 과다한 사용으로 인한 수질오염의 악화에 기인한 환경적인 요인과 새로운 어종의 도입에 따른 병균의 유입 및 출현, 각종 항생제의 남용에 따른 내성균의 출현 등과 같은 생물학적인 요인 등에 의하여 고수온기뿐만 아니라, 연중 돌발적인 폐사가 발생하여 많은 양식장에 심각한 피해를 주고 있다.

현재 어류 양식장에서 발생하는 질병에 대한 예방 및 치료방법에는 주로 항생제요법이 사용되고 있으나 항생제의 오남용은 내성균의 출현(『Bacterial resistance to antimicrobial agents used in fish farming』-Smith Paul외 2명, Annu. Rev. Fish Dis. No.4(1994) pp.273-313), 체내잔류(『Mass mortality of penaeus monodon larvae due to antibiotic resistant Vibrio harveyi infection』-Karunasagar외 2명, Aquacult.128(1994) pp.203-209) 및 주변의 수질오염 등의 심각한 문제를 야기하고 있다.

이러한 문제점으로 인해 어류의 성장 촉진 및 질병억제, 사료의 효율 개선, 생산물의 품질향상 등을 위해 사료에 첨가하여 사용하는 다양한 기술의 보조사료가 개발되고 있다. 보조사료는 배합사료에 첨가하여 어류의 생리활성, 성장촉진, 면역증강 등 기능성을 개선하기 위하여 사용하는 첨가제를 말한다.

대처방안의 하나로 식물자원의 유용물질, 유산균 또는 광물질을 양어사료에 첨가한 친환경적인 요법에 관한 연구결과가 발표되었는데 그 중의 한 예로, 한약재로 많이 쓰이고 있는 감초가 사료첨가제로 이용할 경우 어류의 성장과 질병 저항성을 향상시킨다는 연구보고(『Mass mortality of penaeus monodon larvae due to antibiotic resistant Vibrio harveyi infection』-Karunasagar외 2명, Aquacult. 128(1994) pp.203-209)가 있으며, (『Lactobacillus sakei BK19의 어류 병원성 세균에 대한 항균활성』-양병규외 2명, 미생물학회지 제39권 제1호(2003.03) pp.56-61)에서는 발효식품으로부터 얻어지는 유산균은 어류의 병원성 세균에 대해 항균효과가 있음이 확인되었다.

대한민국 공개특허 제10-1999-0046017호: 납두균과 황토가공물을 이용한 양어용 사료 제조방법.

본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 바실러스 서브틸러스 미생물로 발효시킨 발효미강과 비타민B2를 함유하여 어류의 내병성을 증대시킴으로써 어류의 폐사율은 낮추고 성장은 촉진시킬 수 있는 양어용 보조사료와 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료는 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 함유하고, 상기 발효미강은 미강에 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 배양액을 첨가하여 발효시킨다.

상기 배양액 중의 이투린(iturin)과 설팩틴(surfactin)의 함량을 증대시키기 위해 상기 배양액은 포도당, 효모추출물, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산마그네슘이 함유된 배지에 바실러스 서브틸러스를 접종하여 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시킨다.

상기 포졸란 100중량부에 대하여 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 더 함유한다.

그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료의 제조방법은 포도당, 효모추출물, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산마그네슘이 함유된 배지에 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)를 접종하여 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시키는 배양단계와; 상기 배양단계에서 수득한 배양액에 미강을 혼합하여 25 내지 35℃에서 2 내지 6일 동안 발효시켜 발효미강을 얻는 발효단계와; 포졸란 100중량부에 대하여 상기 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 혼합하는 혼합단계와; 상기 혼합단계에서 수득한 혼합물을 펠릿 형태로 성형하는 성형단계;를 포함한다.

상기 혼합단계는 상기 포졸란 100중량부에 대하여 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 더 혼합한다.

상술한 바와 같이 본 발명은 바실러스 서브틸러스 미생물로 발효시킨 발효미강과 비타민B2 등을 함유하여 어류의 내병성을 증대시킴으로써 어류의 폐사율은 낮추고 성장은 촉진시킬 수 있다.

따라서 본 발명의 양어용 보조사료는 사료비 절감과 생산성 증대를 불러올 수 있다.

도 1은 담수어류 영향시험에 따른 시험농도를 나타낸 것이고,
도 2 및 도 3은 시험기간에 따른 시험생물 체중 변화량을 나타낸 것이고,
도 4는 시험기간에 따른 시험생물의 지질 변화량을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료와 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 예에 따른 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료는 포졸란, 발효미강, 어분, 메티오닌, 포도당, 비타민C, 비타민B2를 함유한다.

포졸란(pozzolan)은 화산회로 이루어진 것으로서 광물의 일종으로 알려져 있다. 포졸란은 화산재, 응회암, 규산백토, 규조토 및 천매암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

포졸란은 주성분이 실리카 또는 실리카-알루미나일 수 있다. 포졸란은 주성분 외에 산화철이나 게르마늄이 함유될 수 있다. 포졸란은 실리카의 함량이 70중량% 이상이거나, 실리카와 알루미나의 함량이 80중량% 이상인 것이 바람직하다.

포졸란은 200 내지 500메쉬 입도 크기로 분쇄된 분말을 이용한다. 포졸란은 항균성 및 내병성을 증대시킨다.

발효미강은 미강에 미생물 배양액을 첨가하여 발효시킨 것이다. 미생물 배양액으로 바실러스속(Bacillus sp) 균주를 배양한 것을 이용할 수 있다. 바실러스속 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas)속 다음으로 널리 연구되고 상용화된 세균으로서 생물학적 활성이 있는 다양한 2차 대사산물을 생산하며, 열에 안정하고 열악한 환경에 저항성인 내생포자(endospore)를 형성하는 특징을 가진다. 바람직하게 바실러스속 균주로 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)를 이용한다.

미강은 현미에서 백미로 정미하는 과정에서 발생하는 도정 부산물로서, 속겨(쌀겨)와 쌀눈을 일컫는다. 쌀의 영양성분을 분석하면 쌀겨부분에 29%, 쌀눈에 66%, 그리고 백미에는 5%의 영양이 분포되어 있어 쌀의 영양분 대부분은 쌀겨와 쌀눈으로 구성된 미강에 있다.

본 발명에 적용된 발효미강은 바실러스 서브틸러스 미생물이 함유되어 있어 병원성 세균의 증식을 억제하고 질병을 방제하여 결과적으로 폐사율을 감소시키는 역할을 한다.

특히, 바실러스 서브틸러스의 배양시 미생물의 대사산물로 생성되는 이투린(iturin)과 설팩틴(surfactin)이 발효미강에 함유되어 있는 장점을 갖는다. 이투린과 설팩틴은 항균물질로 알려져 있다. 따라서 이러한 발효미강을 원료로 포함하는 보조사료는 항균활성이 매우 우수하다.

어분은 사료의 주요 단백질원으로서 기호성과 질이 우수하여 오래전부터 사용되어져 온 사료원이다.

메티오닌(L-methionine)은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로, 식품 첨가제, 의약용 수액제 및 의약품의 합성 원료 등으로 사용된다. 메티오닌은 화학적 합성과 생물학적 합성을 통하여 생산할 수 있다.

포도당은 피로회복 및 신진대사를 촉진하는 역할을 한다.

비타민C는 항산화 활성을 높이고, 비타민 B2는 어류의 성장 촉진, 면역력 증강 효과를 갖는다.

특히 비타민 B2와 L-메티오닌의 두 성분의 시너지 작용으로 인해 어류에서 병저항성 유도 반응이 나타나 질병에 걸리는 확률을 낮추어 주고 결과적으로 어류의 폐사율을 낮추는 역할을 한다.

상술한 재료들은 균일하게 혼합하여 양어용 보조사료를 제조한다. 가령, 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 혼합하여 양어용 보조사료를 제조할 수 있다.

한편, 본 발명은 녹나무 오일과 곤달비 추출물을 더 함유할 수 있다. 가령, 보조사료는 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부와, 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 함유한다.

녹나무(Cinnamomum camphora)는 상록의 교목으로서, 잎은 달걀 모양의 타원형이며 윤이 나고 향기가 있으며, 꽃은 양성화로 5월경에 황백색의 작은 꽃이 잎겨드랑이에서 원추꽃차례를 이루면서 피는 식물이다. 녹나무에 들어 있는 향기 성분은 캄파, 사프롤, 씨네올 등의 정유성분으로서, 녹나무 목질과 잎, 열매에 1% 가량 들어 있다.

녹나무 오일은 녹나무의 잎, 줄기, 가지 중 어느 하나로부터 추출할 수 있다. 추출방법으로 통상적인 수증기 증류법을 이용하여 오일을 추출할 수 있다. 녹나무 오일은 펠릿의 성형성을 향상시키고, 보조사료의 항균성을 높인다.

곤달비(Ligularia stenocephala)는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀로서 한국(전라남도), 일본, 타이완, 중국 등지에 분포하며, 깊은 산의 습지에서 자란다. 곤달비는 주로 어린잎을 나물로 섭취하며 한방에서는 전초 혹은 뿌리를 보익, 진정 및 부인병 등에 약으로 사용한다고 한다. 곤달비는 곰취와 더불어 쌈, 나물, 장아찌, 김치 등으로 다양하게 식용되고 있으며, 곤달비에서 분리 보고된 물질로는 1β,6α-dihydroxy-5(15)-eudesmene, phthalic acid di-Bu ester, N-phenyl-2-naphthylamine, neophytadiene, vanillin, triterpenoid 유도체, 4-hydroxyacetophenone, chlorogenic acid, caffeic acid 등이 있다(Roh EJ, Kim YS, Kim BG. 2009. Effect of antioxidation and inhibition of melanogenesis from Ligularia stenocephala extract. J Korean Oil Chemists' Soc 26: 87-92).

곤달비 추출물은 보조사료의 항산화 활성과 항균활성을 상승시킨다.

본 발명의 양어용 보조사료는 분말이나 펠릿 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 양어용 보조사료는 통상적인 양어용 배합사료에 첨가되어 어류에게 급이된다. 가령, 배합사료 100중량부에 대하여 보조사료 0.1 내지 5중량부가 첨가될 수 있다. 어종과 크기, 기간에 따라 보조사료의 첨가량은 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 양어용 보조사료는 어류의 배합사료에 일정량 첨가하여 급이함으로써 어류의 생리활성촉진, 성장 촉진, 면역력 증강, 내병성 증대 효과로 인해 생산성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 양어용 보조사료는 생균수가 1.0~1.4×10⁹cfu/ml일 수 있다.

이하, 본 발명의 양어용 보조사료의 제조방법에 대하여 설명한다.

본 발명의 양어용 보조사료의 제조방법은 배지에 바실러스 서브틸러스를 접종하여 배양시키는 배양단계와, 배양단계에서 수득한 배양액에 미강을 혼합하여 발효시켜 발효미강을 얻는 발효단계와; 포졸란과 발효미강 및 기타 재료들을 혼합하는 혼합단계와, 혼합단계에서 수득한 혼합물을 펠릿 형태로 성형하는 성형단계를 포함한다. 각 단계별로 상세하게 살펴본다.

1. 배양단계

미강을 발효시킬 배양액을 만들기 위해 배지에 바실러스 서브틸러스를 접종하여 배양시킨다.

바실러스 서브틸러스 배양액은 바실러스 서브틸러스 종균을 LB(Luria Bertani) 배지에 접종하여 24 내지 48시간 동안 30 내지 35℃에서 종균배양한 다음 본배양 배지에 접종한 후 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시켜 얻을 수 있다.

상기 본배양 배지는 멸균된 증류수에 포도당, 효모추출물, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산마그네슘을 혼합하여 조성할 수 있다.

가령, 배지 1ℓ당 포도당 6g, 효모추출물 5g, 펩톤 10g, 인산칼륨 2.5g, 염화나트륨 1.5g, 탄산나트륨 0.5g, 황산마그네슘 1g으로 조성될 수 있다.

상술한 본배양 배지를 이용하여 바실러스 서브틸러스를 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시킨 방법을 통해 배양액 중의 이투린(iturin)과 설팩틴(surfactin)의 함량을 크게 증대시킬 수 있다. 이투린과 설팩틴은 위에서 언급한 바와 같이 바실러스 서브틸러스의 대사산물로 생성되는 것으로서, 우수한 항균력을 갖는 물질이다.

2. 발효단계

다음으로, 배양단계에서 수득한 배양액에 미강을 혼합하여 발효시켜 발효미강을 얻는다.

발효의 일 예로, 고압멸균처리한 미강 100중량부에 대하여 바실러스 서브틸러스 배양액 5 내지 15중량부를 첨가한 다음 발효기에서 25 내지 35℃에서 2 내지 6일 동안 고체발효시킨다. 발효기간 동안 발효를 촉진시키기 위해 지속적으로 미강을 교반시키면서 발효시킨다.

발효 완료 후 발효미강의 수분을 감소시키기 위해 건조시켜 최종적으로 수분함량이 4 내지 10중량%인 미강 발효물을 얻는다. 건조시킨 미강 발효물은 덩어리 형태로 뭉쳐있기 때문에 분쇄기를 이용하여 100 내지 300메쉬 입도크기로 분쇄하여 분말 형태로 만든다.

3. 혼합단계

다음으로, 준비한 재료들을 혼합한다.

가령, 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 혼합한다.

혼합은 내부에 교반기가 설치된 교반탱크 내부에서 수행될 수 있다. 이 경우 각 재료가 저장된 저장탱크로부터 일정량이 배출되고, 배출된 재료는 이송컨베이어에 의해 교반탱크 내부로 투입될 수 있다. 교반탱크 내부로 투입된 재료들은 교반기의 회전에 의해 균일하게 혼합된다.

4. 성형단계

다음으로, 혼합단계에서 수득한 혼합물을 펠릿 성형기에 투입하여 펠릿 형태로 성형한다.

펠릿 성형기로 통상적인 가압식 성형기를 이용할 수 있다. 펠릿 성형기를 이용하여 펠릿 형태로 사료를 가공하는 것은 공지의 기술이므로 구체적인 설명은 생략한다.

펠릿 성형기를 통해 약 1 내지 20mm 크기의 펠렛 형태로 성형될 수 있다. 제조된 펠릿 형태의 보조사료는 일정량씩 포대에 담아 포장할 수 있음은 물론이다.

한편, 본 발명의 다른 예로 혼합단계에서 녹나무 오일과 곤달비 추출물을 더 혼합할 수 있다. 가령, 포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부와, 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 혼합한다.

녹나무 오일은 녹나무의 잎, 줄기, 가지 중 어느 하나로부터 추출할 수 있다. 추출방법으로 통상적인 수증기 증류법을 이용하여 오일을 추출할 수 있다.

그리고 곤달비 추출물은 건조시킨 곤달비에 추출용매를 가하여 추출할 수 있다.

추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급 알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가 알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

추출의 일 예로 곤달비 전초에 대하여 물을 중량비로 4 내지 10배를 가한 후 10 내지 150℃에서 1 내지 48시간 동안 열수추출, 냉침 또는 온침 추출 등을 이용할 수 있다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시 예로 한정하는 것은 아니다.

(실시예)

바실러스 서브틸러스 균주를 LB(Luria Bertani) 배지에 접종하여 48시간 동안 35℃에서 종균배양한 다음 본배양 배지에 접종한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하여 바실러스 서브틸러스 배양액을 얻었다.

본배양 배지는 멸균된 증류수에 여러 물질을 혼합하여 조성하였다. 본배양 배지로 하기 표 1과 같이 4종류를 제작하여 바실러스 서브틸러스를 각각 배양하였다.

배지종류	배지조성(g/ℓ)
배지1	Glucose 6g
	Yeast extract 8g
	K₂HPO₄ 2.5g
	NaCl 1.5g
	Na₂CO₃ 0.5g
	MgSO₄1g
배지2	sucrose 15g
	Yeast extract 8g
	K₂HPO₄ 2.5g
	NaCl 1.5g
	Na₂CO₃ 0.5g
	MgSO₄ 1g
배지3	Glucose 6g
	Yeast extract 5g
	peptone 10g
	K₂HPO₄ 2.5g
	NaCl 1.5g
	Na₂CO₃ 0.5g
	MgSO₄ 1g
배지4	sucrose 15g
	Yeast extract 5g
	peptone 10g
	K₂HPO₄ 2.5g
	NaCl 1.5g
	Na₂CO₃ 0.5g
	MgSO₄ 1g

멸균처리한 미강 100중량부에 대하여 바실러스 서브틸러스 배양액 10중량부를 혼합한 다음 고체발효기에 투입하여 30℃에서 4일 동안 발효시켰다. 발효 후 건조시켜 수분함량을 6중량%로 감소시킨 다음 분쇄기를 이용하여 200메쉬 입도크기로 분쇄하여 발효미강 분말을 수득하였다.

포졸란(겔라이트, 도성기업) 100중량부에 대하여 발효미강 75중량부와, 어분(전남서부어류양식수협) 45중량부와, L-메티오닌(신원무역) 3중량부와, 포도당(광주과학) 1.5중량부와, 비타민C(크레도코리아) 1.5중량부와, 비타민B2(크레도코리아) 1.5중량부를 혼합한 다음 펠릿 성형기에 투입하여 펠릿 형태의 보조사료를 제조하였다.

<실험예>

1. 보조사료의 생균수 측정

배지 3에서 배양한 바실러스 서브틸러스 배양액으로 제조한 보조사료의 보관온도와 보관일수에 따른 생균수를 측정하기 위해 시험의뢰하였다. 시험결과를 하기 표 2에 나타내었다.

보관일수	4℃	40℃	65℃
0일째	1.0±0.2×10⁹cfu/ml	1.4±0.2×10⁹cfu/ml	0.1±0.1×10⁹cfu/ml
7일째	1.0±0.1×10⁹cfu/ml	1.1±0.2×10⁹cfu/ml	1.1±0.2×10⁹cfu/ml
30일째	1.0±0.1×10⁹cfu/ml	1.2±0.2×10⁹cfu/ml	1.0±0.1×10⁹cfu/ml
60일째	1.0±0.2×10⁹cfu/ml	1.1±0.1×10⁹cfu/ml	1.0±0.1×10⁹cfu/ml

표 2를 참조하면, 4℃와 40℃에서 보관할 경우 균수의 변화는 거의 없었으며, 65℃에서 보관했을 경우에도 크게 균수 변화는 일어나지 않았다. 65℃에서 60일간 보관한 경우와 실온에서 1년간 보관한 경우의 보존율이 같다고 판단할 경우 본 발명의 보조사료의 생균수는 실온에서 1년 이상 보존될 것으로 기대된다.

2. 배지별 설팩틴 및 이투린 함량분석

바실러스 서브틸러스는 대사산물로서 항균물질인 설팩틴(surfactin)과 이투린(iturin)을 생산하는 것으로 알려져 있다. 따라서 설팩틴과 이투린의 함량이 높은 보조사료는 항균활성이 높을 것으로 예상할 수 있다. 각 배지에서 바실러스 서브틸러스를 배양한 배양액에 함유된 설팩틴과 이투린의 농도를 분석하여 하기 표 3에 나타내었다.

각 배지별 배양액을 원심분리를 통해서 상등액만을 분리하고, 그 상등액을 염산을 이용하여 pH 2.0으로 맞춘 후 4℃ 저온에서 16시간 동안 놓아두었다. 그리고 이를 다시 원심분리를 통하여 상등액은 버리고 남아있는 침전물에 메탄올을 가해 3회 추출하였다. 추출한 메탄올 추출물을 농축기로 농축시킨 후 고성능액체크로마토그래피(Shimadzu Prominence LC-20AD)를 이용하여 분석하였다.

배지종류	물질 농도(ppm)
배지종류	surfactin	iturin
배지1	2240.87	451.98
배지2	2860.13	1307.01
배지3	2550.27	3415.16
배지4	3347.32	1436.46

상기 표 3을 참조하면, 설팩틴은 배지 4에서 배양한 배양액에서 가장 높게 나타났고, 이투린은 배지 3에서 배양한 배양액에서 가장 높게 나타났다. 특히, 이투린의 경우 배지 3과 다른 배지들과의 농도 차이가 크게 나타났다. 그리고 설팩틴과 이투린을 합한 총 농도는 배지 3에서 배양한 배양액에서 가장 높게 나타났다.

이러한 결과를 통해 배지 3을 이용하여 바실러스 서브틸러스를 배양한 배양액으로 보조사료를 제조할 경우 항균활성이 가장 우수할 것으로 예측된다.

3. 항균활성 실험

배지 3에서 바실러스 서브틸러스를 배양한 배양액으로 제조한 보조사료(이하, 시험보조사료)의 항균활성이 우수할 것으로 예상되어 시험보조사료에 대하여 항균활성을 실험의뢰하였다. 병원성 미생물(Salmonella typhimurium)에 대한 실험결과를 하기 표 4에 나타내었다. 살모넬라 균주를 시험보조사료에 접종하여 24시간이 지난 후에 보조사료 중의 살모넬라 균수를 측정하여 항생제 대체 효과를 입증하고자 하였다.

처리구로서 살모넬라(Salmonella typhimurium) 균주를 배양시킨 1000ml 플라스크에 시험보조사료를 1% 수준으로 넣어주고 24시간 후 균주의 생존율을 확인하였다. 그리고 대조구로서 일반보조사료를 1% 수준으로 넣어주었고, 무처리구로서 증류수를 1% 수준으로 넣어주어 24시간 후 균주의 생존율을 확인하였다. 유의성 검정을 위하여 모든 실험은 3반복으로 진행하였다.

S. typhimurium	처리구	대조구	무처리구
1차	0.8×10³cfu/g	1.1×10⁸cfu/g	1.1×10⁸cfu/g
2차	1.1×10³cfu/g	1.1×10⁸cfu/g	2.1×10⁸cfu/g
3차	0.9×10³cfu/g	1.1×10⁸cfu/g	1.2×10⁸cfu/g
평균	0.9×10³cfu/g	1.1×10⁸cfu/g	1.5×10⁸cfu/g

상기 표 4를 참조하면, 처리구는 대조구와 무처리구와 비교하여 유의성 있는 수준에서 살모넬라 균수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 양어용 보조사료의 항균력이 우수할 것으로 기대된다.

4. 담수어류 영향시험

시험보조사료(상표명: 리보킹)를 이용하여 담수어류인 잉어의 영향시험을 한국화학융합시험연구원에 의뢰하였다. 본 실험은 어류의 급여실증 실험을 통하여 폐사율과 성장능력 개선효과를 검증하기 위하여 실시하였다.

시험보조사료의 담수어류(잉어) 영향시험을 40일 동안 유수식(Continuous flow-through system)으로 실시하였다. 시험농도당 노출어류 20마리에 대한 치사수, 일반중독증상, 체중 증가량을 관찰하였다.

본 실험의 시험농도는 하기 표 5와 같이 설정하였다(도 1 참고).

구분	처리내용
대조군	일반 어류(잉어) 먹이 표준에 근거하여 급이
처리군 1	리보킹 0.5 % + 일반 어류(잉어) 사료
처리군 2	리보킹 1 % + 일반 어류(잉어) 사료
처리군 3	리보킹 2 % + 일반 어류(잉어) 사료

(1)시험물질

상표명 : 리보킹

입수일 : 2017-02-03

입수량 : 20 kg

외관및성상 : 갈색분말

보관조건 : 실온보관 (1~30 ℃)

제조원 : (주)현농

(2)시험용수

시험용수는 수돗물을 전처리필터(1.0μm)와 세균제거필터(0.2μm)를 통과시킨 후 저수조에서 48시간 이상 폭기시킨 후 사용하였다. 수질검사는 (재)한국화학융합시험연구원에서 환경부 고시 먹는물 수질공정시험기준에 따라 분석하였다. 수질검사 결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.

(3)시험계

a. 종명

잉어 (Cyprinus carpio )

b. 공급원

명 칭 : 오창양어장

주 소 : 충북 청원군 오창읍 중신리 331

입 수 일 : 2017-01-18

c. 순화 및 절식

실험 시작 7일 전에 100L의 수조로 잉어 200마리를 이동시켜 순화를 시작하였고, 실험과 동일한 환경하에서 순화를 실시하였다. 순화기간 중 치사가 발생하지 않고 건강상태가 양호하여 실험에 사용하였다. 절식은 실험개시 24시간 전부터 실시하였다.

(4)사육환경

수조 : 장방형의 전면이 유리로 된 수조

광주기 : 16 시간 광조건(08:00 - 24:00) / 8 시간 암조건(24:00 - 08:00)

수온 : (20 - 24) ℃

조도 : (400 - 800)Lux

먹이 : Tetraminⓡ (Germany)

(5)시험방법

실험실 : 어류 실험실

종명 : 잉어 (Cyprinus carpio )

전장 : (2.0 ± 0.2) cm

노출기간 : 40 일

노출조건 : 유수식 (continuous flow-through system)

시험용액 용량 : 50 L

시험생물수 : 20 마리 / 처리군

수온 : (20 - 24) ℃, 수온의 변화는 ± 1 ℃ 이내

용존산소량 : 포화농도의 60 % 이상

수소이온농도 : 6.0 - 8.5

경도 : 10 mg/L - 250 mg/L

광주기 : 광조건 16시간 (08:00 - 24:00), 암조건 8시간 (24:00 - 08:00)

먹이 : 리보킹 (0.5 %, 1 %, 2 %) + Tetraminⓡ (Germany) 체중의 3 % 공급 3회/1일

(7)시험생물 관찰 및 체중.전장 측정

모든 시험수조에 대하여 실험시작 후 1일 1회 이상증상 및 치사 관찰을 실시하였다. 치사의 판정은 어류를 유리막대로 건드렸을 때 움직임이 없거나 아가미 호흡이 중단된 경우 치사로 간주하였다. 또한 시험생물 (잉어)에 대한 체중 및 전장은 시험생물 샘플링일에 측정을 실시하였고, 대조군, 처리군 1, 처리군 2, 처리군 3 에서 각각 20마리를 조사하였다.

(8)지질함량 분석

지질함량을 확인하기 위해서 시험시작 일 일 0, 20(시험중간), 40일(시험종료)에 시험생물 3마리를 모든 농도에서 분석을 실시하였다. 어류의 지질함량 측정은 Bligh-Dyer의 방법에 준하였다.

시료에 MeOH:CHCl₃ (2:1) 9mL을 넣고 glass grinder을 사용하여 마쇄한 후, 다시 CHCl₃ 3mL와 증류수 3 mL을 넣어 마쇄하였다. 마쇄된 시료가 균질화 된 것을 확인한 후 GF/A filter paper로 여과시켰다. 여과된 시료는 분별깔대기 (separate funnel)에 옮겨 유기용매층을 분리하고, 분리된 유기용매층은 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하였다. 미리 칭량된 vial에 시료를 분취하여 N₂ 가스로 용매를 제거한 후, 무게를 칭량하여 지질함량을 계산하였다.

(9)통계처리

시험생물(어류)에 대한 growth rate를 확인하기 위해 SPSS 통계프로그램 (Ver. 19.0)을 이용하여 통계분석을 수행하였다. 분산의 동질성을 평가하기 위해 Levene's test를 수행한 후, one way ANOVA test를 실시하여 각 시험군간의 유의성을 확인한 결과 35일부터 유의적 차이를 나타났다.(P<0.05)

(10)시험결과(Results)

a. 시험생물 관찰 및 이상증상

시험기간 동안 대조군, 처리군 1, 처리군 2 및 처리군 3에서 치사 또는 이상증상은 나타나지 않았다.

b. 시험생물 체중 및 변화량

기간에 따른 시험생물 체중 및 변화량을 도 2 및 도 3에 나타내었다.

시험생물(잉어)의 체중은 35일 경과시부터 통계적으로 유의적 차이가 나타났다(P<0.05). 대조군, 처리군 1, 처리군 2 및 처리군 3에서 40일차에 1.26±0.02g, 1.35±0.13g, 1.43±0.25g 및 1.30±0.20g이었다. 대조군과 비교하여 체중 변화량은 처리군 1에서 7.1%, 처리군 2에서 13.5%, 처리군 3에서 3.2% 증가로 나타났다.

c. 지질함량 분석

기간에 따른 시험생물의 지질함량을 도 4에 나타내었다.

시험생물 잉어의 지질함량은 대조군, 처리군 1, 처리군 2, 처리군 3에서 시험시작(0 일차)43.5±9.2mg/g, 37.1±2.9mg/g, 40.4±8.4mg/g 및 42.4±10.5mg/g이었으며, 시험중간(20일차) 46.0±5.5mg/g, 46.9±13.5mg/g, 39.3±3.2mg/g 및 40.3±9.4mg/g이었으며, 시험종료(40 일차) 45.9±8.3 mg/g, 45.1±9.4mg/g, 45.9±8.6mg/g 및 47.4±13.6mg/g 이었다. 시험기간 동안 시험생물(잉어)의 지질함량 변화는 ±25% 이내로 시험결과에 영향을 주는 중대한 변화량은 나타나지 않았다.

d. 시험의 유효성 확인

시험기간 동안 유효성 기준은 아래와 같으며, 시험결과의 적합성을 확인하였다.

- 시험용액의 수온이 최소 23.0℃, 최대 23.6℃로, 시험의 유효성 기준(수온변화가 ± 2℃)에 적합하였다.

- 시험용액의 용존산소가 최소 77.2%로, 시험의 유효성 기준(포화농도의 60% 이상)에 적합하였다.

- 음성대조군 및 시험처리군 에서의 치사율은 0%로, 시험의 유효성 기준(10% 미만)에 적합하였다.

이상의 실험결과를 통해 본 발명은 어류의 내병성을 증대시켜 어류의 폐사율은 낮추고 성장은 촉진시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims

포졸란 100중량부에 대하여 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 함유하고,
상기 발효미강은 미강에 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 배양액을 첨가하여 발효시키며,
상기 포졸란 100중량부에 대하여 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료.
제 1항에 있어서, 상기 배양액 중의 이투린(iturin)과 설팩틴(surfactin)의 함량을 증대시키기 위해 상기 배양액은 포도당, 효모추출물, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산마그네슘이 함유된 배지에 바실러스 서브틸러스를 접종하여 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시킨 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료.
삭제
삭제
포도당, 효모추출물, 펩톤, 인산칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산마그네슘이 함유된 배지에 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)를 접종하여 25 내지 35℃에서 1 내지 3일 동안 배양시키는 배양단계와;
상기 배양단계에서 수득한 배양액에 미강을 혼합하여 25 내지 35℃에서 2 내지 6일 동안 발효시켜 발효미강을 얻는 발효단계와;
포졸란 100중량부에 대하여 상기 발효미강 60 내지 90중량부와, 어분 30 내지 60중량부와, 메티오닌 1 내지 5중량부와, 포도당 0.5 내지 3중량부와, 비타민C 0.5 내지 3중량부와, 비타민B2 0.2 내지 3중량부를 혼합하는 혼합단계와;
상기 혼합단계에서 수득한 혼합물을 펠릿 형태로 성형하는 성형단계;를 포함하고,
상기 혼합단계는 상기 포졸란 100중량부에 대하여 녹나무 오일 2 내지 10중량부와, 곤달비 추출물 1 내지 5중량부를 더 혼합하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸러스와 비타민B2를 함유한 양어용 보조사료의 제조방법.