KR101890058B1 - 신규한 마리올라이드 유도체 및 이를 함유하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 화학식 1로 표시되는 마리올라이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능함 염, 및 이를 유효성분으로 함유하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 마리올라이드 유도체는 Nrf2의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시켜 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 만성 염증성 질환의 치료제나 건강기능식품 첨가물로서 용이하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 천연물인 마리올라이드 유도체의 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-Related Factor-2) 활성화를 통해 만성 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증은 외부의 적이 침입했을 때에 우리의 몸을 지켜주는 중요한 면역 반응이지만 만성적으로 발생하는 염증은 생체 내 다양한 만성 질환과 밀접한 관련을 갖는다. 염증은 주로 산화적 스트레스에 기인하고 세포는 산화적 스트레스로부터 자신을 보호하기 위하여 다양한 종류의 항산화 효소를 만든다.
산화적 스트레스는 수퍼옥사이드(O2 -), 과산화수소(H2O2), 및 히드록실 라디칼( . OH) 등의 산화 유리 라디칼 분자로 일컬어지는 반응성 산소 종(ROS)의 이상 노출과 밀접하게 관련된다. 적당한 양의 ROS는 호기성 세포에서 적절한 레독스 항상성을 유지하는데 필수적이지만, 높은 수준의 ROS는 핵산, 지질 및 단백질 등의 세포 거대분자에 직접적인 산화적 데미지를 유발하기 때문에 해롭다.
산화적 스트레스를 처리하기 위해, 호기성 생물들은 헴 옥시게나제(heme oxygenase-1: HO-1)를 포함하는 많은 phase II 세포보호 효소를 소유한다. HO-1은 항산화 및 항염증 활성을 갖는 세 효소 생성물: 일산화탄소, 철이온(Fe2 +), 및 빌리버딘(biliverdin)을 발생하기 위한 헴 분해 경로에서 제1 및 율속 효소이다. 다른 동형 단백질과 달리, HO-1은 대부분의 조직에서 낮은 수준으로 존재하고, 다양한 자극에 반응하여 고도로 유도될 수 있다. 또한, HO-1 녹 아웃(knock-out) 쥐는 자발적 염증 질환을 전개시키고, 실험적 패혈증에 고도로 예민하다. 또한, 유전적으로 HO-1 결핍된 개체의 표현형 변화는 HO-1 녹 아웃 쥐에서 관찰된 것과 유사하다.
1990년대 후반 항산화 효소 단백질의 전사를 조절하는 총괄적인 전사 인자로서 NRF2가 제시되었다(Chan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11366-11370, 1993). 후속 연구를 통하여 NRF2 단백질은 항산화 효소의 프로모터(promoter)에 존재하는 항산화 반응 요소(antioxidant response element:ARE, 5'-TGACnnnGCA-3')라고 일컬어지는 특정한 DNA sequence에 결합하여 항산화 효소의 전사를 조절한다는 사실이 규명되었다(Itoh et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 236: 313-322, 1997). 스트레스가 없는 상태에서 NRF2 단백질은 세포질에 존재하는 KEAP1 단백질과 결합하여 끊임없이 분해되지만 산화적 스트레스에 노출되면 KEAP1 단백질과 분리되어 핵 안으로 이동하고 이후 ARE sequence에 결합한다(Itoh et al., Gene Dev., 13: 76-86, 1999).
현재까지의 연구 결과에 따르면 NRF2를 유도하는 화합물은 다양한 염증 관련 만성 질환 억제에 효과적이라고 알려져 있다(Choi and Keum, Molecules, 19(7): 10074-10789, 2014). 가장 대표적인 예로서 NRF2 활성 화합물인 dimethylfumarate(DMF)가 있는데, 최근 미 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA)에서 재발성 다발 경화증(recurrent multiple sclerosis)에 적응하는 약물로 판매 허가가 승인되었으며, 이러한 사실은 NRF2가 염증성 질환의 약물 타겟으로 유효하다는 것을 증명한다.
최근 천연물인 마리올라이드(marliolide)가 NRF2 단백질을 강하게 유도하는 것이 밝혀졌다. 마리올라이드는 최초 Mollinedia marliae의 잎의 헥산 추출물로부터 분리되었다.
이에, 본 발명자들은 NRF2 활성화 효과가 우수한 마이올라이드를 합성하기 위해 예의 노력한 결과, 마리올라이드는 인간 정상 케라틴세포 HaCaT 세포에서 HO-1을 강하게 유도하는 신규 천연 화합물임을 동정하고, 마리올라이드 화학 구조 분석을 통하여 예상되는 NRF2 유도 및 항산화 효소 발현 메커니즘을 추측하고 이에 기반한 추가 유도체 합성을 통해 항산화 효소 유도 활성이 더욱 증가된 마리올라이드 유도체를 합성하는데 성공하고, 본 발명을 완성하였다.
Chan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11366-11370, 1993
Itoh et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 236: 313-322, 1997
Choi and Keum, Molecules, 19(7): 10074-10789, 2014
본 발명은 신규한 마리올라이드 합성 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 이를 유효성분으로 포함하는 만성 염증성 질환을 예방, 억제 또는 치료하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
상기 식에서 R1은 수소, 히드록실기 또는 3-메틸부타노에이트기이고; R2는 C4~18의 알킬이고, 인접한 퓨란 고리의 탄소와 단일결합 또는 이중결합을 형성한다 (단, 마리올라이드는 제외).
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 1a로 표시되는 (S)-dihydro-5-methylfuran-2(3H)-one에 치환기 R1 및 R2가 결합된 형태의 마리올라이드 유도체이다.
[화학식 1a]
구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물들 중의 하나일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 도 5에 나타낸 대로 합성할 수 있다.
본 발명의 제2양태는 D-리보스 또는 L-리보스를 출발 물질로 하여 본 발명의 제1양태의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 화합물의 제조방법을 제공한다.
도 5를 참조하면, 상기 제조방법은 D-리보스를 출발 물질로 
(n은 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 16) 또는 
(n은 12)을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계는 문헌 1(Mailar, K.; Choi, W. J. The first asymmetric synthesis of marliolide from readily accessible carbohydrate as chiral template. Carbohydr . Res. 2016, 432, 31-35)에 8 스텝 및 4 스텝으로 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
상기 
은 E-isomer이며, 
은 Z-isomer이다.
상기 제조방법은 
로부터 팔라듐을 사용한 환원반응에 의해 
및 
를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 
로부터 순차적으로 산화적 재배열 반응; 팔라듐을 이용한 환원반응; 및 알코올 제거반응에 의해 
를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 제조방법은 
로부터 이소발레닐 염소와 결합 반응에 의해 
를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 일 례로, 상기 제조방법은 L-리보스를 출발 물질로 하여 
을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계는 문헌 1(Mailar, K.; Choi, W. J. The first asymmetric synthesis of marliolide from readily accessible carbohydrate as chiral template. Carbohydr . Res. 2016, 432, 31-35)에 6 스텝 및 4 스텝으로 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 제3양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 만성 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 만성 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
상기 조성물은 전사인자 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-Related Factor-2)의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물의 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 제4양태는 본 발명의 제3양태의 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 만성 염증성 질환 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제5양태는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 첨가물을 제공한다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 건강기능식품의 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품 첨가물은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 마리올라이드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 NRF2의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시켜 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 만성 염증성 질환의 치료제나 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.
도 1은 HT-29 세포에 표 1의 개별 천연 화합물을 노출시키고 HO-1 항체에 대한 웨스턴 블롯 어세이를 수행한 결과.
도 2는 (A) 마리올라이드의 화학적 구조. (B) HaCaT 세포를 10 μM 마리올라이드에 노출하고, 상대조 현미경에 의해 전체 모폴로지를 관찰한 결과. (C) HaCaT 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, G1/S 차단의 백분율을 FACS analysis에 의해 모니터링한 결과. (D) HaCaT 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, 세포사멸 유도를 클리브드 카스파제-3 항체를 이용하여 면역형광에 의해 모니터링한 결과. (E) 10 μM 마리올라이드fmf 다른 시간(6, 12 및 24시간)에 HaCaT 세포에 노출시키고, 클리브드 카스파제-3 및 클리브드 PARP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실행한 결과.
도 3은 (A) HaCaT 세포를 다양한 농도의 마리올라이드(상부 패널) 또는 다양한 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, HO-1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (B) HaCaT 세포를 6시간 및 12시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, 면역형광법을 HO-1 항체를 이용하여 수행한 결과. (C) 3x ARE 서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 pGreenFire 벡터 내로 결찰하고, HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 렌티바이러스 형질 도입 및 푸로마이신 선택에 의해 수립된 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고 GFP 시그널링을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과. (D) HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 24 시간 동안 다른 농도의 마리올라이드에 노출시키거나(좌측 패널), 10 μM 의 농도에서 다른 시간에 마리올라이드에 노출시키고(우측 패널), 루시퍼라제 어세이를 실행한 결과.
도 4는 (A) HaCaT 세포를 24 시간 동안 다른 농도에서 마리올라이드에 노출시키거나(상부 패널), 10 μM의 농도에서 다른 시간에 마리올라이드에 노출시켰다(하부 패널). NRF2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (B) HaCaT 세포를 6시간 및 12시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, NRF2 항체를 이용하여 면역형광법을 수행한 결과. (C) Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs로부터 게놈 DNA를 준비하고, 유전형질 분석을 수행하고, 다른 시간에 Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs에 10 μM 마리올라이드를 노출한 후에, HO-1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (D) Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs로부터 전체 RNA를 제조하고, HO-1 특이 PCR 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR 어세이를 수행한 결과.
도 5는 마이올라이드 유도체의 합성 과정.
도 6은 (A) 마리올라이드에 의해 가능한 활성 메커니즘. (B) HaCaT 세포에서의 HO-1의 유도에 관한 마리올라이드 및 유도체의 효과 평가를 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (C) HaCaT 세포에서의 HO-1 mRNA 수준에 대한 화합물 1, 12, 13, 14 및 15의 효과를 실시간 RT-PCR로 평가한 결과. (D) HaCaT 세포의 생존률에 대한 마리올라이드 및 모든 유도체의 효과를 MTT 어세이로 평가한 결과.
도 7은 (A) 무모쥐의 등부에 10 μmole의 마리올라이드의 국부적으로 적용하고 NRF2, HO-1 및 글루타메이트-시스테인 리가아제(GCLC) 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과. (B) 마리올라이드가 2단계 쥐 피부 발암 모델에서 DMBA/TPA-유도 유두종 형성의 숫자(상부 패널) 및 발생정도(하부 패널)에 대해 상당한 억제 효과를 보임을 나타낸 것. (C) 마리올라이드가 무모쥐의 피부에서 DMBA/TPA에 의해 유도되는 유두종의 성장을 억제함을 나타낸 것. (D) 마리올라이드가 무모쥐의 피부에서 DMBA/TPA에 의해 유도되는, 8-하이드록시구아노신(hydroxyguanosine)(8-OH-G, 좌측 패널) 및 4-하이드록시노네날(4-HNE, 우측 패널)의 발생을 억제함을 나타낸 것.
도 8은 마리올라이드 유도체 별 세포 생존률 및 HO-1 mRNA 유도 효과.
도 9는 Keap1/Nrf2에 의한 HO-1의 조절 기작을 모식적으로 나타낸 것.
도 10은 Nrf2에 의한 HO-1의 조절 기작을 나타낸 것.
도 11은 마리올라이드가 H2O2 유도 세포내 산화적 스트레스를 억제함을 나타낸 것.
도 12는 마리올라이드에 의한 마이클 반응: NRF2 활성화 기작을 모식적으로 나타낸 것.
도 13은 화학적 부분의 변화: 구조 활성 관계(SAR)를 나타낸 것.
도 14는 마리올라이드의 순차적 마이클 반응을 나타낸 것.
도 2는 (A) 마리올라이드의 화학적 구조. (B) HaCaT 세포를 10 μM 마리올라이드에 노출하고, 상대조 현미경에 의해 전체 모폴로지를 관찰한 결과. (C) HaCaT 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, G1/S 차단의 백분율을 FACS analysis에 의해 모니터링한 결과. (D) HaCaT 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, 세포사멸 유도를 클리브드 카스파제-3 항체를 이용하여 면역형광에 의해 모니터링한 결과. (E) 10 μM 마리올라이드fmf 다른 시간(6, 12 및 24시간)에 HaCaT 세포에 노출시키고, 클리브드 카스파제-3 및 클리브드 PARP 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실행한 결과.
도 3은 (A) HaCaT 세포를 다양한 농도의 마리올라이드(상부 패널) 또는 다양한 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, HO-1 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (B) HaCaT 세포를 6시간 및 12시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, 면역형광법을 HO-1 항체를 이용하여 수행한 결과. (C) 3x ARE 서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드를 pGreenFire 벡터 내로 결찰하고, HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 렌티바이러스 형질 도입 및 푸로마이신 선택에 의해 수립된 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 24 시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고 GFP 시그널링을 형광 현미경 하에서 관찰한 결과. (D) HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 24 시간 동안 다른 농도의 마리올라이드에 노출시키거나(좌측 패널), 10 μM 의 농도에서 다른 시간에 마리올라이드에 노출시키고(우측 패널), 루시퍼라제 어세이를 실행한 결과.
도 4는 (A) HaCaT 세포를 24 시간 동안 다른 농도에서 마리올라이드에 노출시키거나(상부 패널), 10 μM의 농도에서 다른 시간에 마리올라이드에 노출시켰다(하부 패널). NRF2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (B) HaCaT 세포를 6시간 및 12시간 동안 10 μM 마리올라이드에 노출시키고, NRF2 항체를 이용하여 면역형광법을 수행한 결과. (C) Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs로부터 게놈 DNA를 준비하고, 유전형질 분석을 수행하고, 다른 시간에 Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs에 10 μM 마리올라이드를 노출한 후에, HO-1 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (D) Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) MEFs로부터 전체 RNA를 제조하고, HO-1 특이 PCR 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR 어세이를 수행한 결과.
도 5는 마이올라이드 유도체의 합성 과정.
도 6은 (A) 마리올라이드에 의해 가능한 활성 메커니즘. (B) HaCaT 세포에서의 HO-1의 유도에 관한 마리올라이드 및 유도체의 효과 평가를 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과. (C) HaCaT 세포에서의 HO-1 mRNA 수준에 대한 화합물 1, 12, 13, 14 및 15의 효과를 실시간 RT-PCR로 평가한 결과. (D) HaCaT 세포의 생존률에 대한 마리올라이드 및 모든 유도체의 효과를 MTT 어세이로 평가한 결과.
도 7은 (A) 무모쥐의 등부에 10 μmole의 마리올라이드의 국부적으로 적용하고 NRF2, HO-1 및 글루타메이트-시스테인 리가아제(GCLC) 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과. (B) 마리올라이드가 2단계 쥐 피부 발암 모델에서 DMBA/TPA-유도 유두종 형성의 숫자(상부 패널) 및 발생정도(하부 패널)에 대해 상당한 억제 효과를 보임을 나타낸 것. (C) 마리올라이드가 무모쥐의 피부에서 DMBA/TPA에 의해 유도되는 유두종의 성장을 억제함을 나타낸 것. (D) 마리올라이드가 무모쥐의 피부에서 DMBA/TPA에 의해 유도되는, 8-하이드록시구아노신(hydroxyguanosine)(8-OH-G, 좌측 패널) 및 4-하이드록시노네날(4-HNE, 우측 패널)의 발생을 억제함을 나타낸 것.
도 8은 마리올라이드 유도체 별 세포 생존률 및 HO-1 mRNA 유도 효과.
도 9는 Keap1/Nrf2에 의한 HO-1의 조절 기작을 모식적으로 나타낸 것.
도 10은 Nrf2에 의한 HO-1의 조절 기작을 나타낸 것.
도 11은 마리올라이드가 H2O2 유도 세포내 산화적 스트레스를 억제함을 나타낸 것.
도 12는 마리올라이드에 의한 마이클 반응: NRF2 활성화 기작을 모식적으로 나타낸 것.
도 13은 화학적 부분의 변화: 구조 활성 관계(SAR)를 나타낸 것.
도 14는 마리올라이드의 순차적 마이클 반응을 나타낸 것.
이하, 본 발명의 실험예(실시예)를 예시한다. 하기의 실험예(실시예)는 본 발명의 이해를 돕도록 하기 위해 예시적으로 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
실험예
1: 다양한 천연물에 의한 HO-1 유도 효과 시험
본 발명자들은 하기 표 1에 기재된 천연 화합물 중에서 HO-1의 화학적 인듀서를 확인하고자 하였다. 천연 화합물은 리스트 상의 식물로부터 직접 준비하거나, Chromadex (Irvine, CA, USA)로부터 구입하였다. HT-29 세포에 개별 천연 화합물을 노출시키고 HO-1 항체에 대한 웨스턴 블롯 어세이를 수행하였다. 화학적예방 이소티오시아네이트인 설포라판(Sulforaphane)(SFN)을 양성 대조군으로서 포함시켰다. 그 결과 두 개의 천연 화합물, 커큐민(12번) 및 마리올라이드(59번) 만이 유의하게 HO-1을 유도함을 확인하였다(도 1).
커큐민에 의한 HO-1의 유도는 이미 인식되었지만, HO-1의 인듀서로서 마리올라이드는 아직 인식되지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 마리올라이드를 이용한 후속 실험을 진행하기로 하였다. 처음에, 본 발명자들은 마리올라이드가 인간 정상 케라틴피부 HaCaT 세포의 생존률에 영향을 주는지를 조사하였다(도 2A). 에토포시드를 세포주기 차단 및 세포사멸 인듀서에 대한 양성 대조군으로서 포함하였다. 결과로서, 상대조 현미경은 마리올라이드는 HaCaT 세포 전체에 영향을 주지 않음을 보여준다(도 2B). 유사하게, 마리올라이드는 세포주기 차단을 유도하는데 실패함을 관찰하였다(도 2C). 또한, 마이올라이드는 형광 현미경(도 2D) 및 웨스턴 블롯 분석(도 2E)으로 관찰된 바와 같이 HaCaT 세포에서의 세포자멸을 유도하는데 실패하였다. 또한, 이러한 결과는 마리올라이드가 전체 HaCaT 세포에 영향을 주지 않음을 입증한다.
이와 같이, 본 발명자들은 12번 커큐민(curcumin)과 59번 마리올라이드가 HO-1의 발현을 강하게 유도하는 것을 관찰하였다. 커큐민에 의한 NRF2 유도는 많은 선행 연구에서 보고되었지만 마리올라이드에 의한 항산화 효소 유도 효과는 현재까지 보고가 없다. 이러한 사실을 바탕으로 본 발명자들은 마리올라이드 및 유도체에 의한 항산화 메커니즘에 대한 후속 연구를 진행하였다.
실험예
2: 세포 배양, 화합물,
플라즈마
및 항체의 준비
DMEM, RPMI, FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 (Pen/Strep)을 WELGENE (Daegu, Korea)사로부터 구입하였다. HaCaT 세포는 한국세포주은행 (대한민국 서울)으로부터 구입하였다. HaCaT 세포를 10% FBS 및 Pen/Strep (100 U/ml)가 보충된 RPMI 배지 중에서 성장시켰다. 설포라판(Sulforaphane), TPA, 에토포사이드(etoposide), NRF2에 대한 항체, 토탈 액틴, 8-OH-G를 Santa Cruz biotechnology사(Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. 폴리브렌(Polybrene)은 Merck-Millipore사(한국 대전)로부터 구입하였다. pGreenfire 플라스미드는 System Bioscience사(Palo Alto, CA, USA)로부터 구입하였다. 렌티바이러스 헬퍼 플라스미드(Lentiviral helper plasmids: pMD2.G 및 psPAX.2)를 Addgene사(Cambridge, MA, USA)로부터 구입하였다. 탠덤(Tandem) ARE 올리고뉴클레오티드를 Macrogen사(Seoul, Korea)로부터 구입하여, 어닐링하고 Cla1 및 Spe1 제한효소로 이중 소화하여 pGreenfire 벡터내로 서브클로닝하였다.
HO-1 항체를 Enzo Life Science사(Farmingdale, NY, USA)로부터 구입하였다. GCLC에 대한 항체, 클리브드 카스파제-3(Cleaved-caspase-3) 및 클리브드 PARP(Cleaved-PARP)를 Cell Signaling Technology사(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다. 4-HNE 항체를 Abcam사(Cambridge, MA, USA)로부터 구입하였다.
실험예
3: 형광 활성화 세포 분류(
FACS
)에 의해 세포 주기의 측정
적절한 처리 후에, 동일한 수의 HaCaT 세포(1×106/그룹)를 글래스 튜브에 분배하고, 1×PBS 및 70% EtOH을 3:7의 비율로 함유하는 용액으로 고정시켰다. 1×PBS로 세척 후, 세포를 요오드화프로피디움(20 ㎍/㎖)과 혼합하고, 세포 주기의 변화를 FACS Calibur flow cytometer(Becton Dickinson, San Jose, USA)에 의해 측정하였다.
실험예 4: 면역형광 어세이
적절한 처리 후에, 융합성 HaCaT 세포를 슬라이스 글래스 상에서 성장시키고 차단혈청(1% BSA))으로 30 분 동안 배양시켰다. 1×PBS로 세척한 후에, HaCaT 세포를 고정하고 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체로 혼성화하였다. 슬라이드를 1×PBS로 세척하고 FITC-결합 래빗 2차 항체로 프로빙(probing)하였다. C2 공초점 현미경(Nikon Korea, Seoul, Korea)으로 형광 이미지를 수득하였다.
실험예 5: 렌티바이러스 형질도입에 의해 HaCaT-GFP-루시퍼라제 세포를 제조
293T 패키징 세포를 JETPEI 시약(Polyplus-Transfection, New York, NY, USA)을 사용하여 렌티바이러스 헬퍼 벡터(3 ㎍ pMD2.G and 3 ㎍ psPAX.2)와 함께 3 ㎍ pGreenFire-ARE 플라스미드로 감염시켰다. 48 시간 후에, 바이러스 상층액을 수집 및 여과하고, 융합 HaCaT 세포 내로 형질도입하였다. 렌티바이러스 형질도입된 HaCaT 세포를 푸로마이신(1 ㎍/㎖)으로 48시간 선택하였다.
실험예
6:
HaCaT
-ARE-
GFP
-
루시퍼라제
세포 중에서
GFP
및
루시퍼라제
활성의 모니터링
수립된 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 24-웰 배양 플레이트(2×105 cells/6-well)에 플레이팅하였다. 마리올라이드 처리 후에, 세포 GFP 발현이 형광 현미경에 의해 관찰되었다. 루시퍼라제 어세이를 위해, HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 세포를 1×PBS로 세척하고 루시퍼라제 용해 버퍼[0.1 M 포타슘 포스페이트 버퍼, pH 7.8, 1 % Triton X-100, 1 mM DTT, 2 mM EDTA]로 용해시켰다. 루시퍼라제 활성을 GLOMAX Multi-system(Promega, Madison, WI, USA)으로 측정하고 세포의 단백질 농도로 정규화하였다.
실험예
7:
웨스턴
블롯
분석
처리 후에, 배양 세포를 수집하고 얼음 냉각 1×PBS 버퍼로 세척하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고, RIPA 용해 버퍼[50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜릭산, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 1 mM Na3VO4, 1 mM 디티오트레이톨(DTT), 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)]로 RIPA로 재현탁시켰다. 세포 용해물을 수집하고 BCA Protein Assay Kits(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 동일한 양의 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 재용해시키고 PVDF 막으로 이송하였다. 1 시간 동안 차단버퍼(1×PBST 중 5% 스킨 밀크) 상에서 배양한 후, 상기 막을 4℃에서 하룻밤 동안 적절한 1차 항체로 혼성화시켰다. 1×PBST로 세척한 후에, 상기 막을 HRP-결합 2차 항체 (Thermo Fischer scientific, Waltham, MA, USA)로 혼성화시켰다. 최종적으로 상기 막을 ECL 검출 시스템으로 시각화하였다. 시료의 동일 로딩량을 설명하기 위해 토탈 액틴 블롯(Total actin blot)을 대조군으로 사용하였다.
실험예
8: 실시간
역전사
-
폴리머라제
체인
리액션
(RT-
PCR
)
마리올라이드 처리 후에, HaCaT 세포를 수집하고 Hybrid-R RNA extraction kit (GeneAll, Seoul, Korea)에 의해 토탈 RNA을 추출하였다. PrimeScript RT-PCR kit (TAKARA Korea, Seoul, Korea)를 사용하여, 토탈 RNA를 cDNA 합성에 도입하였다.
실시간 RT-PCR 분석을 CFX384 Real-time system (BioRad, Hercules, CA, USA) 상에서 SYBR 믹스를 사용하여 수행하였다. 증폭 프로토콜은 하기 PCR 주기를 포함한다: 95℃에서 5 분의 단일 주기; 95℃에서 10초, 59℃에서 10초 및 72℃의 20초의 40 주기; 95℃에서 10초의 최종 사이클. 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같다: HO-1 실시간 PCR 프라이머 [5'-ATGCCCCAGGATTTGTCAGA-3' (Forward) 및 5'-ACCTGGCCCTTCTGAAAGTT-3' (Reverse)] 및 GAPDH 실시간 PCR 프라이머[5'-CAC AGTCCATGCCATCACTG-3' (Forward) 및 5'-GTCCACCACTGACACGTTG-3' (Reverse)]. HO-1의 상대적 mRNA 수준을 GAPDH의 mRNA 수준으로 정규화하였다.
실험예
9:
MTT
어세이
HaCaT 세포를 96 웰 플레이트(30,000 세포/웰)에 파종하고, 24 시간 동안 마리올라이드 또는 그 유도체에 노출시켰다. 1×PBS로 세척한 후에, 상기 세포를 4시간 동안 MTT 용액으로 배양시켰다. 상기 세포를 100 ㎕ DMSO를 용해시키고 560 nm의 파장에서 분광광도계에 의해 흡광도를 측정하였다.
실험예 10: DMBA/TPA 2단계 피부 발암 모델
6주 수컷 무모쥐를 대한 바이오링크사(한국 음성)으로부터 구입하였다. 상기 동물을 무균 필터 캡핑된 마이크로아이솔레이터 케이지에 보관하고, 물 및 음식물을 임의로 공급하였다. 일주일 간의 순화 후에, 개별 쥐들을 주제별로 아세톤(비이클) 또는 DMBA를 적용하였다. 일주일 후에, 무모쥐의 등에 10주 동안 TPA (10 nmole) 단독 또는 마리올라이드(10 μ mole)와의 조합을 적용하였다. 실험 과정 동안, 유두종의 수를 손으로 계산하였다. 희생하여, 쥐 스킨을 30% 포르말린에 침지시키고 파라핀 블록에 매립하였다. 슬라이드를 제조하고 헤마톡실린/에오신(H/E) 염색을 수행하고 면역형광 어세이를 위해 상대조 현미경에 의해 이미지를 얻었으며, 상기 슬라이드를 4℃에서 하룻밤 동안 1차 8-OH-G 및 4-HNE 항체로 혼성화시키고, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-결합 2차 항체(Jackson Immunoresearch, West grove, PA, USA)로 프로빙하였다. C2 공초점 현미경(Nikon Korea, Seoul, Korea)으로 형광 이미지를 수득하였다. 동국대학교 실험동물운영위원회 승인 프로토콜 (IACUC-2015-066) 하에서 동물 실험을 수행하였다.
실험예 11: 마리올라이드의 NRF2 유도를 통한 HO-1 활성 효과 시험
마리올라이드는 HaCaT 세포의 생존률에 영향을 주지 않는 반면, 웨스턴 블롯(도 3A) 및 면역형광(도 3B) 어세이 결과 HaCaT 세포에서의 HO-1 수준을 상당히 증가시킴을 알 수 있다. HO-1을 포함하는 phase II 세포보호 효소의 전사 조절은 적어도 일부가 이들 효소의 5'-업스트림 프로모터 영역에 존재하는 뉴클레오티드 모티프 서열인 항산화 반응 요소(ARE)에 의해 조정되기 때문에, 본 발명자들은 마리올라이드가 ARE-의존 유전자 발현을 활성화시킬 수 있는지 조사하였다. 이러한 목적으로, 본 발명자들은 pGreenFire 듀얼 리포터 플라스미드 내로 3× ARE 서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레이티드를 서브클로닝하고, 렌티바이러스 형질 도입 및 푸로마이신에 의한 선택에 의해 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 리포터 세포를 수립하였다(도 3C).
그 결과 마리올라이드의 노출은 ARE-의존 GFP 발현을 증가시켰다(도 4C). 유사하게, 마리올라이드는 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 리포터 세포에서의 루시퍼라제 활성을 상당히 증가시켰다(도 4D). NF-E2-관련 인자-2(NRF2)는 ARE-의존 유전자 활성에 책임있는 류신-지퍼 전사 인자(leucine-zipper transcription factor)이기 때문에, 본 발명자들은 HaCaT 세포를 마리올라이드에 노출시키고 NRF2 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 마리올라이드가 HaCaT 세포에서의 NRF2 수준을 상당히 증가시킴을 관찰하였다(도 4A). 또한, 마리올라이드는 핵 내로 NFR2의 유의있는 전좌를 유발하였다(도 4B). HO-1의 마리올라이드 유도가 Nrf2 유전자형에 의존되는지 조사하기 위하여, Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) 쥐 배아섬유아세포(MEFs)(도 4C, 상부 패널)를 준비하여 마리올라이드에 노출시켰다. 결과로서, Nrf2 (+/+) MEFs (도 4C, 하부 패널)과 비교하였을때. Nrf2 (-/-) MEFs에서 HO-1의 마리올라이드 유도가 감소하였음을 관찰하였다. 또한, HO-1 mRNA 수준의 마리올라이드 유도는 Nrf2 (+/+) MEFs (도 3D)와 비교하였을때 Nrf2 (-/-) MEFs에서 유의하게 더 낮았다. 이러한 결과는 HO-1의 마리올라이드 유도는 NRF2-의존 ARE 활성화를 통해 일어난다는 것을 시사한다.
실험예
12:
NRF
-2 의존 ARF 활성화를 통한
마리올라이드에
의한 HO-1 유도 효과 시험
마리올라이드는 HaCaT 세포의 생존률에 영향을 주지 않는 반면, 웨스턴 블롯(도 3A) 및 면역형광(도 3B) 어세이 결과 HaCaT 세포에서의 HO-1 수준을 상당히 증가시킴을 알 수 있다. HO-1을 포함하는 phase II 세포보호 효소의 전사 조절은 적어도 일부가 이들 효소의 5'-업스트림 프로모터 영역에 존재하는 뉴클레오티드 모티프 서열인 항산화 반응 요소(ARE)에 의해 조정되기 때문에, 본 발명자들은 마리올라이드가 ARE-의존 유전자 발현을 활성화시킬 수 있는지 조사하였다. 이러한 목적으로, 본 발명자들은 pGreenFire 듀얼 리포터 플라스미드 내로 3× ARE 서열을 포함하는 DNA 올리고뉴클레이티드를 서브클로닝하고, 렌티바이러스 형질 도입 및 푸로마이신에 의한 선택에 의해 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 리포터 세포를 수립하였다(도 3C).
그 결과 마리올라이드의 노출은 ARE-의존 GFP 발현을 증가시켰다(도 3C). 유사하게, 마리올라이드는 HaCaT-ARE-GFP-루시퍼라제 리포터 세포에서의 루시퍼라제 활성을 상당히 증가시켰다(도 3D). NF-E2-관련 인자-2(NRF2)는 ARE-의존 유전자 활성에 책임있는 류신-지퍼 전사 인자(leucine-zipper transcription factor)이기 때문에, 본 발명자들은 HaCaT 세포를 마리올라이드에 노출시키고 NRF2 수준을 측정하였다. 본 발명자들은 마리올라이드가 HaCaT 세포에서의 NRF2 수준을 상당히 증가시킴을 관찰하였다(도 4A). 또한, 마리올라이드는 핵 내로 NFR2의 유의있는 전좌를 유발하였다(도 4B). HO-1의 마리올라이드 유도가 Nrf2 유전자형에 의존되는지 조사하기 위하여, Nrf2 (+/+) 및 Nrf2 (-/-) 쥐 배아섬유아세포(MEFs)(도 3C, 상부 패널)를 준비하여 마리올라이드에 노출시켰다. 결과로서, Nrf2 (+/+) MEFs (도 4C, 하부 패널)과 비교하였을때. Nrf2 (-/-) MEFs에서 HO-1의 마리올라이드 유도가 감소하였음을 관찰하였다. 또한, HO-1 mRNA 수준의 마리올라이드 유도는 Nrf2 (+/+) MEFs (도 4D)와 비교하였을때 Nrf2 (-/-) MEFs에서 유의하게 더 낮았다. 이러한 결과는 HO-1의 마리올라이드 유도는 NRF2-의존 ARE 활성화를 통해 일어난다는 것을 시사한다.
실험예
13:
마리올라이드의
산화적
스트레스
데미지
억제에 의한
무모쥐에서
DMBA/TPA-유도 유두종 형성 감소 효과 시험
마리올라이드는 HaCaT 세포에서의 NRF2 및 HO-1를 강하게 유도하였기 때문에, 마리올라이드가 생체 내에서 NRF2 및 phase II 세포보호 효소를 유도할 수 있는지 조사하였다. 이 문제를 해결하기 위해, 무모쥐의 등부에 마리올라이드를 국부적으로 적용하고 쥐 피부 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯 어세이를 수행하였다. 그 결과 마리올라이드가 쥐 피부에 NRF2 및 phase II 세포보호 효소(HO-1 및 GCLC)의 시간의존적 발현을 유도했음을 알 수 있었다(도 6A). 발암은 산화적 스트레스에 노출됨으로써 가능해질 수 있는 다중 유전 돌연변이를 필요로 하기 때문에, 마리올라이드는 NRF2/HO-1의 유도를 통해 항산화 활성을 나타내고, 따라서 생체 내에서 발암을 억제하는 것을 추정하였다. DMBA/TPA 2 단계 쥐 피부 발암 모델을 선택하여 이 문제를 해결하였다. 연구 중에, 마리올라이드의 국부적 적용은 무모쥐의 등부에 DMBA/TPA-유도 유두종의 숫자 및 발생을 유의적으로 억제함을 관찰하였다(도 6B). 부검에서, 본 발명자들은 마이올라이드가 DMBA/TPA-유도 유두종(도 6C)의 성장을 방해하고, 공지의 산화적 스트레스 생성물인 8-히드록시구아노신(8-OH-G) 및 4-히드록시노네알(4-HNE) (도 6D)의 생체 내 형성을 억제함을 관찰하였다. 또한, 마리올라이드는 생체 내 유의한 항산화 효과를 나타냄으로써, 유의한 화학예방 활성을 나타냄을 알 수 있다.
실시예
1:
마이올라이드
유도체의 합성
현재까지 수행된 연구에 따르면 NRF2 유도는 많은 설프하이드릴(sulfhydryl) 기를 갖는 KEAP1(Kelch like-ECH-Associated Protein 1)과 같은 세포 내 센서 단백질에 마리올라이드와 같은 화합물이 마이클 반응 (Michael reaction, 도 7의 A)을 통하여 직접 결합하여 센서 단백질의 활성을 저해할 수 있다고 알려져 있다.
이러한 사실에 바탕하여 본 발명자들은 추측한 마이클 반응 메커니즘에 기반한 여러 마리올라이드 유도체를 합성하였다(도 5의 반응식 1, 2, 3).
재료 및 실험장치
모든 재료는 상업적 공급원으로부터 구입하여 추가적인 정제없이 사용하였다. 모든 반응은 핫 오븐 건조 글래스웨어 중에서 건조 질소의 비활성 분위기 하에서 루틴하게 실행되었다.
1H-NMR 스펙트럼(CDCl3, DMSO-d 6 )을 Varian (400 MHz) 스펙트로메터(Varian Medical Systems, Inc., Palo Alto, CA, USA) 상에서 수행하였다. 1H-NMR 데이터는 피크 다중도(peak multiplicities)로서 기록되었다: s for singlet, d for doublet, dd for doublet of doublets, t for triplet, q for quartet, br s for broad singlet and m for multiplet. 13C-NMR 스펙트럼(CDCl3, DMSO-d 6 )을 Varian (100 MHz) 스펙트로메터 상에서 수행하였다.
편광축 회전을 적당한 용매 중의 Jasco P-2000 편광계 상에서 수행하였다. 적외선 스펙트럼을 FT-IR(NICOLET-iS5) 상에서 기록하였다. 녹는점을 Thermoscientific-9200 상에서 기록하였다. 모든 합성 화합물의 순도 분석을 위해 원소 분석(C, H) 을 실행하였다. 그 결과는 산출값의 ± 0.4%이내이고, 신뢰도는 > 95% 순수도이다. 반응을 TLC(Merck 예비코팅된 60F254 plates)로 모니터링하였다. UV 광선 하에 관찰된 스팟들을 아니스알데히드 용액 또는 염기성 KMnO4 용액에 침지시킨 후 태워 착색하였다. 컬럼 크로마토그래피를 실리카 겔 60(230-400 mesh Kieselgel 60) 상에서 실행하였다. Shimadzu-2020 상에서 얻은 LRMS(electron ionization MS) 또는 G2 QTOF 매스 스펙트로메터 상에서 얻은 HRMS(electrospray ionization MS)를 사용하여 매스 스펙트럼을 기록하였다.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
테트라데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (1), 마리올라이드
D-ribose를 출발물질로 하여 문헌1(Mailar, K.; Choi, W. J. The first asymmetric synthesis of marliolide from readily accessible carbohydrate as chiral template. Carbohydr . Res. 2016, 432, 31-35)에 공지된 8 스텝 및 4 스텝에 따라 오프화이트(off-white) 고체로서 마리올라이드 1을 수득하였다: mp 72-74 ℃; [α]20 D= -92.0 (c=1.0, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.97-6.93 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 4.83-4.81 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.56-4.50 (m, 1H), 2.45-2.34 (m, 2H), 1.65-1.59 (m, 1H), 1.56-1.50 (m, 2H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.39-1.25 (bs, 20H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 169.9, 147.8, 130.5, 78.7, 67.8, 31.9, 29.9-29.4, 28.4, 22.7, 14.1, 14.0; IR (neat) 3383, 2920, 2846, 1745, 1692, 1212, 1050 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C19H34O3 [M+H]+: 311.2583, found: 311.2583; Anal. calculated for C19H34O3: C, 73.50; H, 11.04, found: C, 73.48; H, 11.03.
(
Z,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
테트라데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (2)
D-ribose를 출발물질로 하여 문헌1(Mailar, K.; Choi, W. J. The first asymmetric synthesis of marliolide from readily accessible carbohydrate as chiral template. Carbohydr . Res. 2016, 432, 31-35)에 공지된 8 스텝 및 4 스텝에 따라 오프화이트 고체로서 화합물 2를 수득하였다: mp 55-57 ℃; [α]20 D= -50.1 (c=0.6, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.58-6.54 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 4.66-4.64 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.56-4.52 (m, 1H), 2.80-2.68 (m, 2H), 1.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 1.50-1.42 (m, 2H), 1.39 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.39-1.25 (bs, 20H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.9, 149.9, 129.2, 77.9, 71.4, 31.9, 29.7-29.4, 29.3, 28.8, 27.9, 22.6, 14.1, 14.1; IR (neat) 3383, 2920, 2846, 1745, 1692, 1212, 1050 cm-1; LCMS (ESI) m/z calcd for C19H34O3 [M+H]+: 311.26, found: 311.35.
(
3
R
,4
S,
5
R
)-3-
디하이드로
-4,5-
디하이드록시
-3-
테트라데실푸란
-2(3
H
)-온 (3) 및 (
3
R
,5
R
)-3-
디하이드로
-5-
하이드록시
-3-
테트라데실푸란
-2(3
H
)-온 (5)
에탄올 (1 ml) 중 화합물 1 (30 mg, 0.096 mmol)의 교반된 용액에, 5% Pd/C (5 mg) 및 AcOH을 첨가한 후, 현탁액을 실온에서 수소 분위기에서 하룻밤 동안 교반하였다. 수득한 현탁액을 셀라이트(celite) 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트=9:1 v/v)로 정제하여 오프화이트 고체로서 화합물 3 (22 mg, 73%)을 얻었다: mp 91-93 ℃; [α]20 D= -33.3 (c=1.0, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.48-4.42 (m, 1H), 4.31 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 2.54 (m, 1H), 2.32 (bs, 1H), 1.85-1.76 (m, 1H), 1.7-1.58 (m, 1H), 1.44 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.44-1.39 (bm, 2H), 1.3-1.25 (bs, 22H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 178.1, 79.1, 71.1, 47.6, 29.3-29.7, 31.9, 27.6, 23.3, 22.7, 14.1, 13.7; IR (neat) 2913, 2851, 1731, 1588, 1203 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C19H37O3 [M+H]+: 313.2743, found: 313.2758.
비의도 부산물인 화합물 5 (3 mg, 10.4%)을 오프화이트 고체로 얻었다: mp 58-60 ℃; [α]20 D= -11.9 (c=0.28, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.46 (m, 1H), 2.63-2.55 (m, 1H), 2.5-2.43 (m, 1H), 1.95-1.89 (bm, 1H), 1.46 (m, 1H), 1.42 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.31-1.25 (bs, 25H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 179.0, 75.0, 41.5, 37, 31.9, 30.3, 29.3-29.6, 27.4, 22.6, 21.0, 14.1; IR (neat) 2918, 2846, 1757, 1466, 1206 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C19H37O2 [M+H]+: 297.2794, found: 297.2637.
(
S
)- 3-(1-
하이드록시오테트라데실
)-5-
메틸푸란
-2(5
H
)-온 (II)
아세톤 (1 ml) 중 화합물 1 (15 mg, 0.05 mmol)의 교반된 용액에, 존스 시약(Jones reagent)(0 ℃ 에서 Cr2O3 35 mg, 진한 H2SO4 0.03 ml 및 물 0.5 ml를 혼합하여 제조) 0.5 ml을 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온으로 가열한 후 3 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 냉각한 후 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기층을 MgSO4,로 건조시키고 여과 및 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트=9:1 v/v)로 정제하여 오프화이트 고체로서 화합물 II (10 mg, 66%)를 수득하였다.
(5
S
)-
디하이드로
-3-(1-
하이드록시오테트라데실
)-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온 (III)
에탄올 (1 ml) 중 화합물 II (10 mg, 0.03 mmol)의 교반된 용액에, AcOH 및 5% Pd/C (2 mg)의 촉매량을 첨가한 후, 플라스크를 수소 풍선으로 밀봉하였다. 현탁액을 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 수득한 현탁액을 셀라이트(celite) 패드를 통해 여과하고, 여과액을 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트=9:1 v/v)로 정제하여 오프화이트 고체로서 화합물 III (10 mg, 99%)을 수득하였다.
(
E,S
)-
디하이드로
-5-
메틸
-3-
테트라데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (4)
메틸렌 클로라이드(1.0 ml) 중 화합물 III (10 mg, 0.03 mmol)의 교반된 용액에, 트리에틸아민(0.06 ml, 0.48 mmol) 및 메탄설포닐 클로라이드(0.01 ml, 0.16 mmol)를 0 ℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 3 시간 동안 교반하였다. 과잉의 TEA (0.06 ml, 0.48 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 45 ℃까지 서서히 가열하고 하룻밤 동안 유지시켰다. 반응 완결을 TLC로 모니터링하였다. 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드로 희석시킨 후 포화 NaHCO3 용액으로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과 및 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(헥산/EA=9.8:0.2 v/v)로 정제하여 백색 고체로서 화합물 4(1.6 mg, 17%, E-isomer)를 수득하였다: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.7-6.75 (m, 1H), 4.69-4.64 (m, 1H), 3.02 (m, 1H), 2.43-2.37 (m, 1H), 2.18-2.12 (m, 2H), 1.48 (m, 2H), 1.42 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.25 (bs, 20H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H).
(
E,
2
S,
3
S
)-
테트라하이드로
-2-
메틸
-5-옥소-4-
테트라데실리덴푸란
-3-일 3-
메틸부타노에트
(6)
메틸렌 클로라이드(2 ml) 중 화합물 1 (25 mg, 0.08 mmol)의 교반된 용액에, DMAP (49 mg, 0.41 mmol) 및 이소발레릴 클로라이드(isovaleryl chloride) (73 mg, 0.61 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 냉각시키고, 메틸렌 클로라이드로 추출하였다(3 회 반복). 조합된 유기층을 브라인(brine) 용액으로 세척한 후, MgSO4으로 건조하고 여과 및 증발시켰다. 조 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트=9:1 v/v)로 정제하여 시럽상 고체로서 화합물 6 (25 mg, 79%)을 수득하였다: [α]20 D= -73.5 (c=0.88, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.98 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 4.69-4.63 (m, 1H), 2.29-2.22 (m, 2H), 2.25 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 2.15-2.08 (m, 1H), 1.48 (m, 2H), 1.35 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.25 (bs, 20 H), 0.97 (s, 3H), 0.96 (s, 3H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.1, 169.2, 148.8, 126.7, 68.2, 43, 31.9, 30.2, 29.6-29.3, 28.2, 25.6, 22.6, 22.3, 14.2, 14.1; IR (neat) 2926, 2853, 1767, 1737, 1680, 1455, 1289, 1112, 989, 759 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C24H43O4 [M+H]+: 395.3161, found: 395.3169.
(
E,
4
R,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
테트라데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (7)
L-ribose를 출발물질로 하여 문헌1(Mailar, K.; Choi, W. J. The first asymmetric synthesis of marliolide from readily accessible carbohydrate as chiral template. Carbohydr . Res. 2016, 432, 31-35)에 공지된 6 스텝 및 4 스텝에 따라 오프화이트 고체로서 화합물 7을 수득하였다.: mp 48-50 ℃; [α]20 D= 42.6 (c=0.1, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.0 (t, J = 8.0, 1H), 4.55 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.52-4.47 (m, 1H), 2.8-2.2 (m, 2H), 1.92 (bs, 1H), 1.54-1.48 (m, 2H), 1.35 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.3-1.26 (bs, 20H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) ? 169.4, 148.6, 129.3, 82.4, 72.2, 31.9, 29.7-29.3, 28.4, 22.6, 19.7, 14.1; IR (neat) 3365, 2919, 2846, 1723, 1681, 1463, 1341, 1265, 1047 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C19H35O3 [M+H]+: 311.2586, found: 311.2573.
화합물 8 내지 17를 화합물 1의 합성과 유사한 합성 과정을 이용하여 제조하였다.
(
E
,4
S,
5
S
)-3-
부틸리덴
-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온 (8)
왁스상 백색 고체로서 화합물 8을 수득하였다: mp 44-46 ℃; [α]20 D= -174.7 (c=1.2, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.9 (dt, J = 6.4, 1.4 Hz, 1H), 4.8 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.57-4.5 (m, 1H), 2.44-2.33 (m, 2H), 1.9 (d, J = 7.2 Hz, 1H) 1.62-1.53 (m, 2H), 1.45 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 170.0, 147.5, 130.7, 78.7, 67.7, 31.7, 21.7, 13.9, 13.8; IR (neat): 3415, 2960, 1731, 1674, 1196, 1035, 987 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C9H15O3 [M+H]+: 171.1021, found: 171.1017.
(
E
,4
S,
5
S
)-3-
헥실리덴
-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온 (9)
왁스상 백색 고체로서 화합물 9를 수득하였다: [α]20 D= -111.3 (c=2.4, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95 (t, J = 7.8, 1H), 4.8 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.57-4.5 (m, 1H), 2.45-2.32 (m, 2H), 2.2 (bs, 1H) 1.55-1.5 (m, 2H), 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.39-1.29 (m, 4H), 0.91 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 170.2, 147.8, 130.4, 78.9, 67.7, 31.4, 29.8, 28.1, 22.4, 13.9; IR (neat): 3408, 2928, 1728, 1674, 1200, 1034, 984 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C11H19O3 [M+H]+: 199.1334, found: 199.1341.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
옥타일리덴푸란
-2(3
H
)-온 (10)
시럽상 고체로서 화합물 10을 수득하였다: mp 42-44 ℃; [α]25 D= -123.1 (c=0.092, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.93-6.89 (dt, J = 0.8, 8.2 Hz, 1H), 4.87 (bs, 1H), 4.56-4.52 (m, 1H), 2.54 (bs, 1H), 2.44-2.23 (m, 2H), 1.54-1.49 (m, 2H), 1.46 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.35-1.27 (bm, 8H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.4, 147.9, 130.4, 79.1, 67.6, 31.7, 29.8-29, 28.4, 22.6, 14, 13.9; IR (neat) 3391, 2925, 2852, 1722, 1676, 1205, 1037, 982 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C13H23O3 [M+H]+: 227.1647, found: 227.1647.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
노닐리덴푸란
-2(3
H
)-온 (11)
저융점 고체로서 화합물 11을 수득하였다: mp 45-47 ℃; [α]25 D= -110.2 (c=0.104, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.93-6.89 (dt, J = 1.2, 8.4 Hz, 1H), 4.82 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 4.57-4.5 (m, 1H), 2.45-2.34 (m, 2H), 1.82 (bs, 1H), 1.56-1.48 (m, 2H), 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.39-1.27 (bm, 10H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170, 147.8, 130.4, 78.7, 67.7, 31.8, 29.8-29.1, 28.4, 22.6, 14, 13.9; IR (neat) 3381, 2921, 2844, 1722, 1688, 1456, 1208, 1039, 980 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C14H25O3 [M+H]+: 241.1804, found: 241.1804.
(
E,
4
S,
5
S
)-3-
데실리덴
-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온, (-)-
리쿠놀라이드
B (12)
오프화이트 고체로서 화합물 12를 수득하였다: mp 51-53 ℃; [α]25 D= -112.9 (c=0.096, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.94-6.89 (dt, J = 1.2, 8.4 Hz, 1H), 4.82 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.56-4.51 (m, 1H), 2.47-2.23 (m, 2H), 2.36 (bs, 1H), 1.53-1.49 (m, 2H), 1.46 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.33-1.26 (m, 12H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.3, 147.9, 130.4, 79, 67.6, 31.8, 29.8-29.2, 28.4, 22.6, 14.1, 13.9; IR (neat) 3382, 2921, 2848, 1726, 1694, 1457, 1203, 1028, 980 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C15H27O3 [M+H]+: 255.196, found: 255.196.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
운데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (13)
오프화이트 고체로서 화합물 13을 수득하였다: mp 58-60 ℃; [α]20 D= -111.5 (c=0.072, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95-6.91 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 4.81 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.56-4.5 (m, 1H), 2.43-2.34 (m, 2H), 2.3 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 1.53-1.48 (m, 2 H), 1.46 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.37-1.26 (bs, 14H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.1, 147.8, 130.4, 78.8, 67.7, 31.9, 29.3-29.8, 28.4, 22.7, 14.1, 13.9; IR (neat) 3381, 2920, 2846, 1723, 1688, 1457, 1262, 1026, 982 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C16H29O3 [M+H]+: 269.2117, found: 269.2118.
(
E,
4
S,
5
S
)-3-
도데실리덴
-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온, (-)-린코몰라이드 B (14)
오프화이트 고체로서 화합물 14를 수득하였다: mp 63-65 ℃; [α]25 D= -90.2 (c=0.084, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.93-6.89 (dt, J = 0.8, 8.2 Hz, 1H), 4.87 (bs, 1H), 4.56-4.52 (m, 1H), 2.45 (bs, 1H), 2.45-2.36 (m, 2H), 1.53-1.49 (m, 2H), 1.46 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.26 (bs, 16H), 0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.3, 147.9, 130.4, 79, 67.6, 31.9, 29.8-29.3, 28.4, 22.6, 14.1, 13.9; IR (neat) 3381, 2920, 2847, 1721, 1692, 1460, 1215, 1031, 983 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C17H31O3 [M+H]+: 283.2273, found: 283.2273.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
트리데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (15)
오프화이트 고체로서 화합물 15를 수득하였다: mp 67-68 ℃; [α]25 D= -109.7 (c=0.084, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.93-6.89 (dt, J = 1.2, 8.4 Hz, 1H), 4.81 (bs, 1H), 4.56-4.5 (m, 1H), 2.45-2.36 (m, 2H), 2.54 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 1.55-1.48 (m, 2H), 1.46 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.25 (bs, 18H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.2, 147.8, 130.4, 78.9, 67.7, 31.9, 29.8-29.3, 28.4, 22.6, 14.1, 13.9; IR (neat) 3382, 2917, 2846, 1723, 1691, 1454, 1208, 1033, 987 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C18H33O3 [M+H]+: 297.243, found: 297.243.
(
E
,4
S,
5
S
)-3-
헥사데실리덴
-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸푸란
-2(3
H
)-온, (-)-이소디하이드로마우바놀라이드 B (16)
오프화이트 고체로서 화합물 16을 수득하였다: mp 78-80 ℃; [α]20 D= -79.8 (c=1.04, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.98 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.84 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 4.56-4.5 (m, 1H), 2.45-2.32 (m, 2H), 1.65 (bs, 1H) 1.54-1.48 (m, 2H), 1.47 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 1.25 (bs, 24H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (400 MHz, CDCl3) δ 169.9, 147.8, 130.4, 78.7, 67.7, 31.9, 29.8-29.3, 28.4, 22.7, 14.1, 13.9; IR (neat): 3880, 2918, 2847, 1724, 1690, 1457, 1265, 1023, 987 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C21H39O3 [M+H]+: 339.2899, found: 339.2876.
(
E,
4
S,
5
S
)-
디하이드로
-4-
하이드록시
-5-
메틸
-3-
옥타데실리덴푸란
-2(3
H
)-온 (17)
오프화이트 고체로서 화합물 17을 수득하였다: mp 83-85 ℃; [α]20 D= -64.8 (c=0.08, CHCl3); 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.95-6.91 (dt, J = 8.0, 1.4 Hz, 1H), 4.81 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 4.56-4.50 (m, 1H), 2.45-2.34 (m, 2H), 2.0 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 1.55-1.49 (m, 2H), 1.48 (d, J = 5.6 Hz, 3H), 1.3-1.25 (bs, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.1, 147.8, 130.4, 78.8, 67.7, 31.9, 29.3-29.8, 28.4, 22.7, 14.1, 13.9; IR (neat) 3381, 2913, 2846, 1723, 1689, 1455, 1213, 1026, 987 cm-1; HRMS (ESI) m/z calcd for C23H43O3 [M+H]+: 367.3212, found: 367.3214.
실험예14: 마리올라이드의 구조 활성 관계(SAR) 시험
화합물에 의한 NRF2/ARE-의존 유전자 활성화는 2가지 경로를 통해 발생하는 것으로 받아들여지고 있다: (1) 마이클 반응에 의한 KEAP1 또는 다른 NRF2-조절 단백질의 직접 결합 및 후속 불활성화 또는 (2) 세포 내 신호전달 경로의 활성화를 통한 NRF2 트랜스활성화.
본 발명자들은 실시예 1에 따라 합성한 마리올라이드 유도체에 대하여, 웨스턴 블롯팅에 의해 HaCaT 세포에서의 HO-1 수준을 조사하였다(도 7B). 기대된대로, 마리올라이드(1)는 HO-1의 강한 시간의존적 유도를 유발한다. 또한, 화합물 2는 유도 키네틱이 화합물 1보다 느리지만 HO-1을 유도하였다. 그러나, 본 발명자들은 화합물 3이 HO-1을 유도하지 못함을 관찰하였다. 이는 HO-1의 마리올라이드 유도가 마이클 반응을 통해 일어나는 증거이다. 이러한 가설은 다른 γ-부티로락톤 고리의 카르보닐기가 히드록실기로 환원된 마리올라이드 유도체의 사용에 의해 조사될 수 있다. 그러나, 반복적인 노력에도 불구하고, 본질적 불안정성으로 인해 이러한 유도체의 합성에 실패하였다: 헤미-케탈 형성 및 γ-부티로락톤 고리의 후속 개환의 가능성
또한, 화합물 4 및 5는 HO-1를 유도하지 못함을 관찰하였다. 특히, 화합물 4는 HO-1를 유도하지 못하였는데, 이는 γ-부티로락톤 고리의 히드록실기가 마이클 반응에 참가하지 않은 것으로 보이는 점에서 다소 예상치 못한 결과이다. 현재까지 정확한 이유는 불명확하지만, HO-1 유도에 실패한 화합물 6의 관찰 결과는 γ-부티로락톤 고리의 히드록실기가 마리올라이드에 의한 HO-1 유도에 중요함을 강하게 시사한다. 최종적으로, 본 발명자들은 화합물 7이 화합물 1보다는 느리지만 HO-1을 유도하는 것을 관찰하였다. 이는 히드록실기의 형태는 마리올라이드가 HO-1을 유도하는 능력을 크게 간섭하지 않음을 설명한다.
마리올라이드의 지방족 사슬의 길이가 HaCaT 세포에서의 HO-1 유도의 정도에 영향을 주는 지 여부를 조사하기 위해 SAR 연구를 수행하였다(도 7B). 화합물 8 및 9는 HO-1을 유도하지 않음을 관찰하였다. 화합물 1과 비교하여, 화합물 10은 HO-1의 약한 유도 패턴을, 화합물 11은 지연된 유도 패턴을 나타냈다. 대조적으로, 화합물 12, 13, 14 및 15은 화합물 1과 비교하여 동등하거나 더 강한 HO-1 유도를 나타내는 것으로 보였다. 화합물 16 및 17은 화합물 1과 비교하여 더 약하거나 지연된 HO-1 유도를 나타내는 것으로 보였다. HO-1 mRNA의 유도 수준으로 정량적으로 비교하기 위해, 화합물 1, 12, 13 14 및 15을 다양한 시간 동안 HaCaT 세포에 노출시키고 HO-1 특이적 프라이머로 실시간 RT-PCR 어세이를 수행하였다.
그 결과 화합물 12, 13, 14 및 15는 화합물 1보다 동등하거나 통계학적으로 유의있는 HO-1 mRNA 유도를 보이는데(도 7C), 이로부터 HO-1의 유도에 필수적인 마리올라이드 유도체의 최적화된 지방족 사슬 길이를 알 수 있다. 최종적으로, MTT 어세이를 통해 본 발명에 사용된 마리올라이드 및 모든 유도체는 HaCaT 세포에 세포 독성이 아님을 알 수 있었다(도 7D).
실험예
15:
MTT
assay 및 실시간 가역 전사-
PCR
(real-time reverse transcription-polymerase chain
reaction , RT
-
PCR
) 시험
상기 실시예 1에서 합성된 유도체를 HaCaT 세포에 각각 처리하고 마리올라이드 유도체에 의한 HaCaT 세포 생존률 및 약리학적 활성을 MTT assay 및 실시간 역전사-중합 사슬 반응(RT-PCR) 기법을 통하여 관찰하여 그 결과를 도 8에 나타냈다.
MTT 실험 결과 마리올라이드 구조에 기반하여 합성된 총 19 가지 유도체는 모두 HaCaT 세포의 생존에 크게 영향을 미치지 않았다(도 8). 이 결과는 화학적으로 합성된 마리올라이드 유도체가 정상 피부 세포 사멸에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
또한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과에 따르면 마리올라이드 유도체 중 마리올라이드에 비교하여 HO-1 mRNA 유도를 더욱 강하게 유도하는 화합물로서 12, 13, 14, 15가 발견되었다(도 8).
이러한 결과로부터 12: [(E,4S,5S)-3-데실리덴-디하이드로-4-하이드록시-5-메틸푸란-2(3H)-온(-)-리쿠놀라이드 B], 13: [(E,4S,5S)-디하이드로-4-하이드록시-5-메틸-3-운데실리덴푸란-2(3H)-온], 14: [(E,4S,5S)-3-도데실리덴-디하이드로-4-하이드록시-5-메틸푸란-2(3H)-온, (-)-린코몰라이드 B], 15:[ (E,4S,5S)-디하이드로-4-하이드록시-5-메틸-3-트리데실리덴푸란-2(3H)-온] 등의 마리올라이드 유도체가 마리올라이드보다 더욱 강한 NRF2 활성 효과를 보이고 이를 통하여 HO-1의 전사를 더욱 강하게 일으킴을 알 수 있다.
실험예
16:
웨스턴
블롯을
이용한
마리올라이드
유도체에 의한 HO-1 유도 효과 시험
상기한 결과를 다시 확인하기 위하여 본 발명자들은 HaCaT 세포에서 12, 13, 14, 15 유도체의 HO-1 유도 효과를 마리올라이드와 비교하여 웨스턴 블롯(Western blot) 기법으로 분석하였다. 그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 화합물 12, 13, 14, 15는 마리올라이드보다 동등하거나 강한 HO-1 단백질 유도 효과를 가짐을 알 수 있었다. 이는 마리올라이드 유도체가 마리올라이드보다 지용성이 증가되어 향상된 세포 흡수를 통해 더욱 강한 활성을 지니기 때문인 것으로 추측된다.
Claims (15)
- 삭제
- 하기 화학식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 만성 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물로서,
상기 만성 염증성 질환은 만성 염증, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인 조성물:
[화학식 1]
상기 식에서 R1은 히드록실기이고; R2는 C10~13의 알킬이고, 인접한 퓨란 고리의 탄소와 이중결합을 형성한다.
- 삭제
- 삭제
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 전사인자 NRF2(Nuclear factor erythroid 2-Related Factor-2)의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시키는 것인 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 50중량%로 포함되는 것인 조성물.
- 제7항의 조성물을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유동물의 만성 염증성 질환 치료방법으로서,
상기 만성 염증성 질환은 만성 염증, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인 치료방법.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 만성 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 첨가물로서,
상기 만성 염증성 질환은 만성 염증, 염증성 장질환, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것인 첨가물:
[화학식 1]
상기 식에서 R1은 히드록실기이고; R2는 C10~13의 알킬이고, 인접한 퓨란 고리의 탄소와 이중결합을 형성한다.
- 삭제
- 제13항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 건강기능식품 첨가물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 50중량%로 포함되는 것인 건강기능식품 첨가물.
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-
2017
- 2017-02-21 KR KR1020170023106A patent/KR101890058B1/ko active IP Right Grant
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