KR101889434B1

KR101889434B1 - 흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR101889434B1
Application number: KR1020170031601A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 김진홍
Original assignee: 안동대학교 산학협력단; 주식회사 상생
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-03-14
Publication date: 2018-08-20

Abstract

본 발명은 우엉(Arctium lappa) 지하부를 고온조건의 밀폐용기에서 장시간 가열처리하여 제조된 흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 수세 정선된 우엉 지하부를 70~80℃의 밀폐용기에 담아 10일 이상 가열하고 이후 1~2일간 저온 숙성하는 단계를 통해 제조된 흑우엉의 열수 또는 에탄올 추출물을 조제하고 이를 순차적 유기용매 분획하여 회수된 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 흑우엉 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 혈전 생성 관련 효소 저해 및 혈액 응고 인자의 저해에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않을 뿐만 아니라, 우엉에 비해 항혈전 성분을 16배 이상 회수할 수 있으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF ANTI-THROMBOSIS COMPRISING BLACK BURDOCK ROOT EXTRACTS AS AN EFFECTIVE COMPONENT AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 우엉(Arctium lappa) 지하부를 고온조건의 밀폐용기에서 장시간 가열처리하여 제조된 흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 수세 정선된 우엉 지하부를 70~80℃의 밀폐용기에 담아 10일 이상 가열하고 이후 1~2일간 저온 숙성하는 단계를 통해 제조된 흑우엉의 열수 또는 에탄올 추출물을 조제하고 이를 순차적 유기용매 분획하여 회수된 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성 성분으로서의 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, XII 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 상기의 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있으며, 외인성 혈전 생성경로의 경우, factor II(prothrombin), V 인자, VII 인자, X 인자의 활성화에 따른 혈전생성이 알려져 있다. 현재까지, 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 우엉은 분류학적으로 쌍떡잎 식물 초롱꽃목 국화과의 두해살이 식물로서, 원산지는 유럽이며, 시베리아, 만주, 한국 등에 널리 분포한다. 국내에서는 경남을 중심으로 대량 재배되고 있으며, 특유의 향과 씹는 맛이 좋아 어린 순을 삶아 먹거나 뿌리를 먹는 근채류이다. 통상 생으로 먹지 않고 소금에 절이거나, 식초에 데치거나, 또는 간장에 졸여 식용한다. 한방에서는 그 뿌리를 우방근, 열매를 우방자, 줄기를 악실경이라 부르며, 그 용도를 엄격히 구분하고 있다. 식용으로 주로 이용되는 우엉 지하부는 점성이 있고 쓴맛을 가져 주로 간장에 졸여 식용하며, 이눌린, 비타민 B1, 아세트산, 아르크티제닌, 베타-카로텐, 부티릭산, 커피산, 클로로겐산, 코스틱산, 이소바레익산, 로릭산, 리그닌, 미리스트산, 프로피오닉산, 시토스테롤, 스티그마스테롤 및 구리, 크롬, 망간, 인, 셀렌, 규소, 아연 등 다량의 미네랄을 포함하는 것으로 알려져 있다.

현재까지 우엉에 대한 주요 연구로는 재배, 뿌리의 박피 및 세정(정진웅 외, 2003. 한국식품유통학회지, 국제학술심포지움 쌀박람회, P-23, p145: P-100, p202), 거피 후 갈변억제(문광덕 외, 2005, Kor. J. Food Preserv. 12: 489-495) 등에 집중되어 있으며, 우엉김치(최미정 외, 1999, J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 27: 618-624) 및 우엉가루 첨가 머핀 제조 등의 가공식품 연구(김미경 외, 2010, Kor. J. Food Cookery Sci. 26: 575-585)가 제한적으로 알려져 있다.

최근에는, 우엉의 유용 생리활성 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 우엉뿌리 추출물의 항염증 효과(김예진 외, 2012, 한국자원식물학회지, 25: 1-6), 우엉으로부터 분리된 arctiin의 항당뇨 활성(Lu 등, 2012. Planta Med. 2012.) 및 암세포 사멸 활성(Susanti 등, 2012, J. Nat. Med. 66: 614-621), 우엉의 caffeoylquinic acids에 의한 항산화 효과(Liu 등, 2012, J. Agric. Food Chem. 60: 4067-4075), 우엉 arctiin의 소포체 스트레스 완화효과(Gu 등, 2012, Acta Pharmacol. Sin. 33: 941-952), 우엉 뿌리 추출물의 성적능력 증대 및 불임해소 효과(Jian 등, 2012, BMC Complement Altern. Med. 12: 8), 위궤양 예방효과(de Almeida 등, 2012. J. Med. Food. 15: 378-383) 등이 보고되어 있어 최근 가장 각광받는 약용식물로 급부상하고 있다. 또한, 국내에서는 우엉 씨의 항염증 활성(박소영 외, 2005, Nat. Product Sci. 11: 85-88), 우엉의 에틸아세테이트 및 헥센 추출물의 라드 열산화 및 자동산화 방지 효과(김문정 외, 2004, Food Sci. Biotechnol. 13: 460-466), 우엉 새싹채소의 항산화 효과(이무열 외, 2009, 한국자원식물학회지, 22: 1304-311) 및 우엉 에탄올 추출물의 항산화 및 항돌연변이 효과(이미숙, 2011, 한국식품영양학회지, 24: 713-719)가 보고되어 있다.

또한, 우엉의 지상부의 경우, 우엉잎 추출물의 Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa에 대한 항균활성이 보고되어 있으며(Fabiola Barbieri Holetz, 2002. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 97: 1027-1031), Pereira 등도 우엉잎의 70% 에탄올 추출물의 헥센 분획물에서 치내 감염균(Endodontic pathogen)에 대한 항세균 활성(Pereira 등, 2005. Braz Dent J. 16: 192-196) 및 우엉잎을 포함하는 지상부의 메탄올 추출물의 디클로메탄 분획물의 항결핵균 활성도 보고되어 있다(Zhao Jinlian 등, 2014. J. Ethnopharmacology. 155: 796-800).

한편, 우엉 뿌리의 항혈전 활성은 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서만 보고된 바 있으며(김미선 등, 2014년 한국식품저장유통학회지, 21: 727-734), 이때 항응고 활성을 나타내는 에틸아세테이트 분획물은 100g 우엉으로부터 0.045g을 회수할 수 있으며, 5mg/ml 농도에서 트롬빈, 프로트롬빈 및 혈액응고인자들을 저해하여 무처리구에 비해 13배 이상 혈전 생성을 억제함이 알려져 있다. 그러나, 우엉을 밀페조건에서 가열처리하여 제조된 흑우엉의 증가된 항혈전 활성에 대해서는 알려진 바 없다.

한편, 우엉과 관련된 특허문헌으로는, 여드름 치료 및 예방에 효과가 있는 천연물 함유화장품(대한민국 등록특허 제10-0357824호, 등록일자 2002. 10.9), 우엉추출물 발효액을 이용한 모공 축소용 화장품 조성물(대한민국 등록특허 제10-1002796호, 등록일자 2010. 12. 14), 우엉추출물을 유효성분으로 하는 수렴 화장품 조성물(대한민국 등록특허 제10-0874113호, 등록일자 2008. 12. 9), 우엉 추출물과 냉감 성분을 함유하는 모공축소용 화장료 조성물(대한민국 등록특허 제10-0767974호, 등록일자 2007. 10. 11), 항염 및 피부자극완화 효과가 있는 천연식물의 혼합추출물을 함유하는 화장료 조성물(대한민국 등록특허 제10-1000695호, 등록일자 2010. 12. 6), 당귀와 우엉 추출물을 주요성분으로 하는 탈모방지 기능을 가진 샴푸 조성물(대한민국 등록특허 제10-0609210호, 등록일자 2006. 7. 27), 블랙헤드 제거용 화장품 조성물(대한민국 등록특허 제10-0962344호, 등록일자 2010년 6월 1일), 생약추출물 특히 우엉 추출물을 주성분으로 하는 아토피 피부용 한방화장료 조성물(대한민국 등록특허 제10-0905386호, 등록일자 2009년 6월 23일) 등의 항염증 및 화장품 조성물에 관련된 특허가 대부분이며, 그 밖에 니코틴 제거용 조성물(대한민국 등록특허 제10-0960305호, 등록일자 2010. 5. 20), 우엉뿌리를 유효성분으로 함유하는 지혈용 조성물(등록특허 제10-0628429호) 및 우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 (등록특허 제10-1602190호) 특허가 알려져 있다. 공개특허로는 제10-2013-0013950호, 우엉 발효추출물을 포함하는 세제용 조성물에 우엉의 열수 추출물을 효모, 고초균, 유산균 등으로 발효시킨 발효우엉 추출물을 이용한 항균활성의 세제용 조성물이 공개되어 있다. 그러나, 현재까지 우엉을 밀폐조건에서 가열처리하여 제조된 흑우엉의 강력한 항혈전 활성에 대해서는 알려진 바 없다.

KR

10-1602190

B

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 우엉 지하부를 밀폐조건에서 10일 이상 가열처리하여 제조된 흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 흑우엉(Black burdock) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 흑우엉 추출물은 흑우엉 열수 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

상기 흑우엉 추출물은 흑우엉 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명의 상기 기재된 흑우엉 추출물을 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 흑우엉 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 혈전 생성 관련 효소 저해 및 혈액 응고 인자의 저해에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈전 생성 관련 효소 및 혈액 응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않을 뿐만 아니라, 우엉에 비해 항혈전 성분을 16배 이상 회수할 수 있으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에 사용된 우엉 지하부(우방근)의 사진도이다.
도 2는 우엉 지하부를 고온에서 장시간 열처리하여 제조된 흑우엉의 사진도이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 흑우엉을 대상으로 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 제조한 흑우엉의 추출물을 조제하고, 상기 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 항혈전 활성 성분으로 회수하였으며, 에틸아세테이트 분획물은 인간 적혈구에 대해 용혈 활성은 전혀 나타내지 않으면서도, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 추출물 및 분획물을 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 민간에서 다양한 생리 활성이 있다고 알려진 우엉을 밀폐조건에서 고온처리하여 흑우엉을 조제한 후 이를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 흑우엉을 대상으로 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 각각 조제하고, 이들 추출물들을 대상으로 순차적 유기용매 분획물을 조제한 후 각각의 항혈전 활성을 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접 저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 평가하여, 흑우엉의 에틸아세테이트 분획물이 우엉의 어떠한 분획물보다 강력한 항응고 활성이 있음을 확인하였다. 특히, 우엉의 경우 항혈전 활성을 나타내는 에틸아세테이트 분획물이 우엉 100g당 0.046g을 회수할 수 있는 데 비해, 흑우엉의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 흑우엉 100g당 0.774g을 회수하여 우엉보다 흑우엉에서 16.8배 이상 많은 항혈전 활성성분을 회수 할 수 있었다. 또한, 우엉의 열수 추출물 및 이의 분획물들은 항응고 활성을 전혀 나타내지 않는데 비해 흑우엉 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서는 강력한 항응고 활성이 확인되었으며, 이는 흑우엉 100g당 0.084g을 회수하여 우엉에 비해 1.8배 이상 많은 항혈전 활성성분을 회수 할 수 있었다. 또한, 항응고 활성을 나타내는 흑우엉의 에틸아세테이트 분획물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 나타내지 않아 급성독성을 유발하지 않음을 확인하였다.

이하에서는, 본 발명의 흑우엉 추출물 및 항혈전 활성 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 정선, 세척된 우엉 지하부를 70~80℃의 밀폐용기에 담아 10~20일 동안 가열하고, 이후 1~10℃에서 1~2일간 저온 숙성하는 단계를 통해 흑우엉을 제조하는 단계; 제조된 흑우엉으로부터 추출물을 조제하는 단계; 흑우엉 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가 단계 및 에틸아세테이트 분획물의 활성물질의 안정성 조사 단계의 실험들을 수행하였다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "흑우엉 추출물"은 2015년 국내에서 재배된 우엉의 성숙된 지하부를 채취하여 세척한 후 70~80℃의 밀폐용기에 담아 10일 동안 가열하고 이후 4℃에서 1~2일간 저온 숙성하는 단계, 흑우엉을 마쇄하여 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 흑우엉 추출물은 흑우엉을 열수 또는 에탄올로 추출할 수 있다.

또한, 상기 열수 또는 에탄올 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수도 있다.

본 발명에서는, 우엉의 열수 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구에 비해 각각 1.06배, 0.91배, 0.98배로 나타나 항응고 활성은 인정되지 않았으나, 흑우엉의 열수 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구에 비해 각각 1.28배, 1.22배, 1.24배로 나타나, 유의적인 트롬빈, 프로트롬빈 및 혈액응고인자 저해에 의한 항응고 활성을 확인하였다. 또한, 우엉 열수 추출물의 유기용매 분획물들은 매우 미약한 항응고 활성을 나타내었으나, 흑우엉 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 5.0mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임측정 결과, 무첨가구에 비해 모두 15배 이상 연장되어, 매우 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다.

한편, 우엉의 에탄올 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구에 비해 각각 1.09배, 1.14배, 1.01배로 나타나 항응고 활성은 인정되지 않았으며, 흑우엉의 에탄올 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구에 비해 각각 1.22배, 1.09배, 1.02배로 나타나, 유의적인 트롬빈 저해활성을 확인하였다. 우엉 에탄올 추출물의 유기용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 5.0mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 보였으며, 헥센 분획(5.0mg/ml)은 트롬빈 타임에서만 무첨가구에 비해 15배 이상 연장된 항응고 활성을 보였다. 흑우엉 에탄올 추출물의 분획물 중 에틸아세테이트 분획물(5.0mg/ml) 역시 무첨가구에 비해 15배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 보였으며, 헥센 분획물(5mg/ml)은 무첨가구에 비해 각각 1.38배, 1.27배, 1.53배의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 나타나, 유의적인 항응고 활성을 확인하였다.

본 발명의 흑우엉 추출물 및 이의 활성 분획물들은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.

상기 검토된 바와 같은 본 발명의 발명자들은 흑우엉 추출물 및 이의 활성 분획물의 우수한 항혈전 활성을 확인하였고, 따라서, 본 발명은 흑우엉 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 흑우엉 추출물은 흑우엉의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

상기 흑우엉 추출물은 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하며, 상기 분획물은 흑우엉 열수 또는 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득될 수 있다.

본 발명의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

상기 본 발명의 약학적 조성물에 관한 용도 이외에도 본 발명의 흑우엉 추출물 및 이의 활성 분획물의 우수한 항혈전 활성은 다음과 같은 건강 기능 식품의 용도로도 적용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 흑우엉 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 우엉의 고온 처리에 의한 흑우엉 조제

통상 관능성이 낮거나 부작용이 있는 식용 천연물의 경우 고온에서 가열, 증숙하면 관능성의 증대와 함께 생리활성 성분의 증가가 나타나며, 부작용이 감소한다고 알려져 있다. 이는 고온에서의 갈변 반응 산물에 의한 풍미 증가와 함께, 생리 활성 성분의 증가 및 새로운 물질의 생성과 관련되며, 대표적으로 홍삼, 흑마늘, 흑도라지 제조 등이 이에 해당된다. 실제 홍삼, 흑마늘, 흑도라지 등은 원래의 인삼, 마늘, 도라지에 비해 우수한 항산화 활성, 뇌기능 인지 증대 및 면역증강 활성이 인정되고 있다. 본 실시예에서는 우엉을 고온 가열처리하여 흑우엉을 제조하고자, 수세 정선된 우엉 지하부를 70~80℃의 밀폐용기에 담아 10일 이상 가열하고, 이후 4℃에서 1~2일간 저온 숙성하는 단계를 통해 흑변된 우엉을 제조하였다. 가장 바람직한 처리로는 75℃의 스테인레스 밀폐용기에 담아 11일 가열하고, 이후 4℃에서 1일간 저온 숙성하는 경우 가장 관능성이 우수한 흑우엉을 제조할 수 있었다. 실험에 사용된 우엉 및 제조된 흑우엉의 사진은 도 1 및 도 2와 같으며, 우엉의 경우 수분함량이 80%이었으나, 흑우엉의 경우 밀폐조건에서 열처리한 경우에 약 70%를 나타내어 열처리, 저온숙성 중 부분적인 수분손실이 나타났다.

실시예 2: 우엉, 흑우엉의 추출물 제조 및 추출물의 성분 분석

시판 우엉을 구입하여, 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거한 후, 에탄올 추출물 및 열수 추출물 제조에 사용하였다. 에탄올 추출물 조제시에는 우엉 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 열수 추출물의 경우에도 동일하게 우엉 시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 1회 반복한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 한편, 시판 우엉을 실시예 1의 방법대로 흑우엉을 제조하였으며, 상기와 동일한 방법으로 에탄올 및 열수 추출물을 조제하였다. 조제된 우엉, 흑우엉 추출물의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고, 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 우엉에 비해 흑우엉은 추출효율이 급격하게 증대되었으며, 에탄올 추출효율은 1.8배 이상, 열수 추출효율은 2.54배 이상 증가 되었다. 총 폴리페놀 함량 역시 우엉에 비해 흑우엉이 증가된 바, 에탄올 추출물은 5.64배, 열수 추출물은 1.46배 증가되었다. 그러나, 총 플라보노이드 함량은 흑우엉의 에탄올 추출물에서만 3.8배 증가되었다. 그러나, 총당 함량은 우엉에 비해 흑우엉이 오히려 감소된 바, 에탄올 추출물은 0.51배, 열수 추출물은 0.76배로 나타났다. 환원당 함량은 우엉에 비해 흑우엉이 급격하게 증가되었으며, 에탄올 추출물은 2.35배, 열수 추출물은 5.45배로 나타났다. 이러한 변화는 우엉의 고온 장기간 열처리에 의해 폴리페놀 성분과 같은 유용성분의 증가가 나타나며, 총당은 감소하나 환원당이 증가되어 관능성의 증가가 나타남을 의미하고 있다.

실시예 3: 우엉, 흑우엉의 추출물의 혈액응고 저해활성 평가

실시예 2에서 제조된 우엉 및 흑우엉 추출물의 혈액응고 저해활성(혈전생성 억제활성)을 평가하였으며, 기존에 보고된 방법(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928)과 동일하게, 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정하여 평가하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.

트롬빈 타임(Thrombin Time)

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 30.5초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 16.7초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT (activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 58.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT를 용매 대조구의 aPTT로 나눈 값으로 나타내었다.

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 우엉의 에탄올 및 열수 추출물(5mg/ml)은 용매 대조구에 비해 항응고 활성이 나타나지 않았으며, 에탄올 추출물에서 미약한 프로트롬빈 저해가 나타났다. 그러나, 흑우엉의 경우 열수 추출물은 유의적인 트롬빈 저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해를 나타내었으며, 에탄올 추출물은 트롬빈 타임을 1.22배 연장시켜 트롬빈을 유의적으로 저해하는 것으로 나타났다. 이때, 대조구로 사용된 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 1.75배, 1.28배 및 1.42배 연장시켰다.

실시예 4: 흑우엉 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 유기용매 순차적 분획물 조제 및 이들의 성분 분석

상기 실시예 2에서 제조된 흑우엉의 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 각각 회수하였다. 이때, 추출효율, 유기용매 분획 효율, 추출물/분획물의 성분 분석 결과는 표 3에 나타내었다.

그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 흑우엉의 에탄올 추출물의 분획물은 부탄올 분획물이 72.16%, 물 잔류물이 25.18%로 많은 양을 차지한 반면, 헥센 분획물은 2.16%, 에틸아세테이트 분획물은 3.92%로 적은 양을 차지하였다. 반면, 흑우엉 열수 추출물의 분획물의 경우 물 잔류물은 98.24%, 헥센 분획이 0.05%를 차지하였으며, 에틸아세테이트 분획은 3.43%를 차지하였다. 이는 흑우엉 지하부 100g(평균 수분함량 70%으로부터 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 0.77g, 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 0.084g을 회수할 수 있음을 의미한다. 이는 본 연구팀이 기존에 보고(대한민국 등록특허 제10-1602190호)한 항혈전 활성이 확인된 생우엉 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 우엉 100g 당 0.046g 회수할 수 있음을 고려한다면, 흑우엉의 경우 생우엉보다 에탄올 추출물의 경우 16.8배 이상, 열수 추출물의 경우 1.8배 이상 많은 에틸아세테이트 분획물을 회수할 수 있음을 의미한다.

한편, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정결과, 흑우엉의 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서 총 폴리페놀은 26.5~28.2mg/g으로 유사하게 나타났으며, 총 플라보노이드 함량도 3.5~3.8mg/g으로 유사한 함량을 나타내었다. 순차적 유기용매 분획물 중에서는 흑우엉의 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 각각 267.5~252.0mg/g 및 28.5~18.6mg/g의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 나타내었다. 이는 생우엉 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획에 비해, 각각 1.28배의 총 폴리페놀 및 0.42배의 총 플라보노이드 함량이며, 생우엉 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에 비해, 각각 5.63배의 총 폴리페놀 및 0.4배의 총 플라보노이드 함량이다. 즉, 흑우엉의 에틸아세테이트 분획의 경우 총 폴리페놀 함량은 증가되며, 총 플라보노이드 함량은 감소함을 알 수 있었다. 총당 및 환원당 함량은 공히 추출물의 부탄올 분획물 및 물 잔류물에서 높게 나타났다.

실시예 5: 우엉, 흑우엉의 열수 추출물 및 이의 분획물의 혈액응고 저해활성 평가

흑우엉 및 우엉의 열수 추출물의 분획물을 이용하여 실시예 3의 항혈전 활성 평가와 동일한 방법으로 혈액응고 저해활성을 측정하였다. 그 결과는 표 4에 나타내었으며, 흑우엉의 열수 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물에서만 유의적인 항응고 활성을 확인하였다. 특히, 흑우엉의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물(5.0mg/ml)은 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 모두 15배 이상 연장시켜, 매우 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다. 이러한 결과는 우엉의 열수 추출물 및 이의 분획물에서 나타나지 않는 항혈전 활성물질이 흑우엉으로 변화되는 과정 중에 생성된 것을 의미하고 있다.

실시예 6: 우엉, 흑우엉의 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 혈액응고 저해활성 평가

흑우엉 및 우엉의 에탄올 추출물의 분획물을 이용하여 실시예 3의 항혈전 활성 평가와 동일한 방법으로 혈액응고 저해활성을 측정하였다. 그 결과는 표 5에 나타내었으며, 우엉 및 흑우엉의 에틸아세테이트 분획물(5.0mg/ml)은 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 모두 15배 이상 연장시켜 매우 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다. 그러나, 흑우엉의 경우, 우엉보다 16.8배 이상 많은 에틸아세테이트 분획물을 회수할 수 있음을 확인한 바 있다(실시예 4 및 대한민국 등록특허 제10-1602190호). 한편, 우엉 에탄올 추출물의 분획물 중 헥센 분획물 및 부탄올 분획에서 유의적인 항응고 활성이 나타났으며, 흑우엉의 경우 헥센 분획물에서 양호한 활성을 확인하였다.

실시예 7: 흑우엉 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성 평가

우엉 지하부는 식품으로 사용되어 왔으며, 식품 원료로 등록되어 안전성이 확보된 식용 식물이다. 또한, 흑우엉의 경우에도 별도 첨가물이나, 유해물질이 없으므로 안전성은 확보되어 있다. 그러나, 우엉이 흑우엉으로 변화하는 동안 나타날 수 있는 잠재적 급성 독성을 평가하기 위해, 흑우엉 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 6에 나타내었다. 이때 용혈 활성은 기존의 보고(정인창, 손호용, 2014년, Korean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285~292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100(1mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

(%)Hemolysis=[(Abs.S-Abs.C)/(Abs.T-Abs.C)]×100

Abs. S : 시료 첨가구의 흡광도,

Abs. C : DMSO 처가구의 흡광도,

Abs . T : Triton X-100 첨가구의 흡광도.

먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 증류수는 적혈구 용혈 활성이 없었으며, Triton X-100은 1mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 한편, 흑우엉 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 경우 용혈활성이 없었으며, 분획물 중에서는 유일하게 흑우엉 에탄올 추출물의 헥센 분획물에서 강력한 용혈활성을 나타내었다. 반면, 항응고 활성이 우수한 흑우엉 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 1mg/ml 농도까지 전혀 적혈구 용혈현상이 나타나지 않아 급성독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다. 이러한 결과는 흑우엉 추출물의 에틸아세테이트 분획은 항혈전제로 실제적 이용이 가능함을 제시하고 있으며, 위장장해 등의 부작용이 보고된 아스피린을 보완, 대치할 수 있으리라 판단된다.

실시예 8: 흑우엉 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가

상기 실시예 4에서 얻은 흑우엉 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 항응고 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 상기 에틸아세테이트 활성 분획물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 항응고활성의 소실이 없이 우수한 활성을 나타내었다. 따라서, 실시예 4의 분획물의 성분 분석 결과와 유기용매 분획 특성 및 상기의 안정성 결과를 고려할 때, 흑우엉 에틸아세테이트 분획물의 활성물질은 우엉의 밀폐용기에서 장시간 고온 가열하는 과정중 생성된 페놀성 화합물의 배당체로 예상된다.

Claims

다음의 단계들을 포함하는 항혈전 활성을 갖는 우엉(Arctium lappa) 에틸아세테이트 분획물의 수율 향상 방법:
(1) 우엉 지하부를 밀폐 용기에 투입하고 70~80℃에서 10~20일 동안 가열하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 결과물을 1~10℃에서 1~2일 동안 숙성시키는 단계;
(3) 상기 단계 (2)의 결과물을 열수 또는 에탄올로 추출하는 단계; 및
(4) 상기 단계 (3)의 결과물을 에틸아세테이트로 분획하는 단계.
제 1항에 있어서,
상기 단계 (3)의 결과물을 헥센으로 분획하여 헥센 분획물을 제거한 후 상기 단계 (4)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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