KR101876525B1 - 공정 샘플 중 미생물의 다양성 지수 및 생존도 지수를 구성하기 위한 방법 - Google Patents

공정 샘플 중 미생물의 다양성 지수 및 생존도 지수를 구성하기 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제지 공정의 특정 부분에 존재하는 특이적 미생물을 식별하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 방법은 공정으로부터의 샘플의 다양성 지수를 수득하고 비교하는 것을 포함한다. 어떠한 시스템도 생물학적 침입으로부터 완전히 자유롭지 못하기 때문에, 개체군 변화로부터 취해진 정보를 이용하여 원치 않는 효과로부터 시스템을 보호하는데 유용한 정보를 제공한다. 다양성 지수는 생물학적 및 비-생물학적 사건 사이의 구별을 허용할 뿐만 아니라, 심지어 특정 유기체가 특정 문제를 초래할 것이라는 점을 미리 알지 못하더라도 문제를 예측 가능하게 한다.

Description

공정 샘플 중 미생물의 다양성 지수 및 생존도 지수를 구성하기 위한 방법 {A METHOD FOR CONSTRUCTING A DIVERSITY INDEX AND A VIABILITY INDEX OF MICROORGANISMS IN PROCESS SAMPLES}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2012년 1월 24일 출원된 US 특허 출원 13/360,238의 부분계속출원이다.
연방에서 지원된 연구 또는 개발에 대한 언급
적용 안됨
본 발명은 일반적으로 통상의 공정 시스템에 존재하는 미생물을 일반적으로 검출하고, 식별하고 다루는데 유용한 물질의 조성물, 장치 및 방법에 관한 것이다.
통상의 공정 시스템에서 특정 미생물의 존재 및 성장은 지속적인 도전이 되고 있다. 통상의 공정 시스템의 많은 다양한 스테이지는 다양한 양의 수분, 영양분, 열, 쉘터, 앵커링 기질, 화학적 상태 및/또는 포식자의 부재를 포함한 다양한 상태를 가지며, 이는 종종 모든 종류의 미생물의 서식에 적합한 환경적 적소로서 작용한다. 이들 미생물에 의한 개체군 성장은 공정 기능 저하 및 최종 제품 오염을 포함하는 많은 문제점들을 제기한다.
한 이러한 문제점은 미생물 유도된 크러스트 침착 형성이다. 크러스트는 통상의 공정 시스템에 존재하는 아이템 표면상으로의 침착된 유기 및/또는 무기 물질을 포함하는 강성의 고체 조성물의 축적물이다. 크러스트는 미생물 분비물 및/또는 미생물 자체의 콜로니일 수 있다. 특히, 크러스트는 하나 이상의 종류의 경질 외피 및/또는 키틴 함유 및/또는 산호 유기체의 축적물을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 크러스트는 감소된 작동 효율, 이른 장비 고장, 생산성 저하, 생산품 품질 손실 및 증가된 건강-관련 위험과 같은 시스템에 많은 부정적인 영향을 끼칠 수 있다. 무엇보다도 안 좋은 점은, 크러스트가 스크랩핑 또는 기타 물리적 수단에 의해 물리적으로 종종 제거되어야 하며, 이는 일부 또는 모든 공정 시스템의 고비용의 중단 또는 분해를 필요로 한다.
미생물이 제기하는 또 다른 문제점은 바이오필름의 형성을 통해서이다. 바이오필름은 미생물 군집 형성을 돕는 미생물에 의해 분비된 엑소폴리머 물질 또는 미생물을 포함하는 유기 물질 층이다. 바이오필름은 공정 장비의 표면 뿐만 아니라 유체 풀 (pool)에서 성장할 수 있다. 이러한 바이오필름은 영양분 농축을 위한 수단을 확립하고 성장을 위한 보호를 제공하는 복합 에코시스템이다. 바이오필름은 크러스트, 부식 및 그 밖의 오염 과정을 가속화시킬 수 있다. 바이오필름은 시스템 효율 감소에 대한 원인을 제공할 뿐만 아니라, 이들은 또한 병원성 유기체를 포함하는 기타 미생물의 미생물 증식을 위한 탁월한 환경을 제공한다. 따라서, 바이오필름 및 기타 오염 과정을 가능한 가장 최대 범위로 감소시켜 공정 효율을 최대화시키고 이러한 병원체로부터의 건강-관련 위험성을 최소화시키는 것이 중요하다.
수개의 인자들은 생물학적 오염 범위에 기여하며, 적합한 반응을 지배한다. 물 온도: 물 pH; 유기 및 무기 영양분, 성장 조건 예컨대, 호기성 또는 혐기성 조건, 및 일부 경우에, 일광의 존재 또는 부재 등은 중요한 역할을 수행할 수 있다. 이들 인자는 또한 어떤 유형의 미생물이 수계에 존재할 수도 있는지 및 이러한 미생물을 어떻게 최상으로 제어할 수 있는 지를 결정하는 것을 돕는다. 미생물의 적절한 식별은 또한, 적합한 대응에 있어 중대하다. 미생물이 식물, 동물 또는 진균류인지 또는 이들이 부유 또는 부착 생물인지의 경우에 따른 차이는 다양한 바이오컨트롤 (biocontrol)이 얼마나 효과적일지를 결정한다. 다양한 미생물이 다양한 문제점들을 유발할 수 있기 때문에, 적절한 식별은 원치 않는 미생물 효과를 적절하게 조정하는데 있어서 중대하다. 마지막으로, 화학적으로 초래된 문제점은 살생제로 개선될 수 없기 때문에, 어떤 문제가 비-생물학적 기반 기원인지를 확인하는 것이 또한 필요하다.
공정 시스템을 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 표준 기법은 표준 평판 계수 기법을 포함한다. 이들 기법은 긴 인큐베이션 기간을 요하며, 적극적인 제어 및 미생물 성장과 관련된 문제점 방지에 대한 충분한 정보를 제공하지 못한다. 더욱 최근에, 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 측정법이 적극적인 제어 수단으로서 사용되었다. 그러나, 시약은 고가이며, 대량 수계로부터 적은 용적이 샘플링된다. ATP 검정법을 이용하여 샘플중의 미생물 활성을 정량화하는 것이 가능하나, 한 유형의 미생물에 의해 생성되는 ATP와 또 다른 ATP 간의 반응을 구별할 수 없으며, 이는 생존가능하나 억제된 유기체는 검출하지 못한다. 또 다른 단점은 이러한 방법이 시이트 (sheet) 검출에 대한 미생물 기여를 측정하는데 이용될 수 없다는 점인데, 왜냐하면 대부분의 유기체는 건조기 섹션의 열에 노출된 후에 생존하지 못하기 때문이다. 데이타 수집은 또한 저빈도로 이루어지며, 이는 데이타의 현저한 갭을 초래한다. 따라서, 이러한 접근법은 관심 시스템에서 미생물 상황에 대해 제한된 정보를 제공한다. 또한, 이러한 접근법은 전형적으로 부유성 박테리아를 모니터링하는데 이용된다. 일부 경우에, 바이오필름 박테리아를 정량화하기 위해 표면이 면봉 채취되고 분석될 수 있다. 이러한 접근법은 매우 지루하고 시간 소모적이다.
미생물 활성 및 호기성 대사가 용존 산소 농도의 감소를 유도한다는 점이 널리 공지되어 있기 때문에, 용존 산소 (DO) 프로브는 유체중 미생물 활성을 측정하는데 사용되었다. 미국 특허 5,190,728 및 5,282,537은 DO 측정을 이용하여 상업 용수의 오염을 모니터링하는 방법 및 장치를 기술한다. 그러나, 이러한 접근법은 비-생물학적 오염으로부터 생물학적 오염을 구별하는데 영양분 첨가제의 사용이 필요하며, 프로브 표면이 오염된 후 추가의 측정을 위해서 어떻게 프로브가 재생되는지에 대한 언급이 없다. 또한, 기재된 접근법에는 산소 연속 공급 수단이 필요하다.
표준 클라크 (Clark) 스타일 전기화학 DO 프로브는 많은 한계 예컨대: 화학적 간섭 (H2S, pH, CO2, NH3, SO4, Cl-, Cl2, ClO2, MeOH, EtOH 및 다양한 이온 종), 빈번한 교정 및 막 교체, 느린 반응 및 드리프팅 리딩 (drifiting reading), 열 쇼크 및 막 높은 막 통과 흐름 요건을 갖는다. 많은 회사 (예를 들어, ACH, Loveland, CO)에 의해 최근 시중에서 입수가능한 새로운 유형의 용존 산소 프로브는 이러한 한계중 거의 모든 한계를 극복하여, DO는 공정 용수에서 온-라인으로 측정될 수 있다. 이러한 새로운 DO 프로브 (LDO)는 형광 수명시간 감쇠를 기반으로 하며, 여기서 산소의 존재는 여기된 형광단의 형광 수명시간을 단축시킨다. 형광단은 센서 표면의 필름에서 부동화되며, 블루 LED를 사용하여 여기가 제공된다. 미국 특허 5,698,412 및 5,856,119는 유체중 생물학적 활성을 모니터링하고 제어하는 방법으로서, DO가 pH 및/또는 ORP (산화-환원 전위)와 함께 측정되어, 특히 영양분/기질 소모와 관련된 대사 경향에서의 변환이 측정되는 방법을 기술한다.
전형적인 플레이팅 기법 및 산화제 잔류물은 적절한 살생제 용량 및 미생물 성장 제어를 나타낼 수 있으나, 침착, 결함 및 파손이 여전히 성행한다. 산업 시스템에서 미생물 성장 및 바이오필름 형성에 대한 더욱 정확한 정보 제공의 분명한 요구가 있다. 정량적 PCR 기법은 시이트 결함, 펠트, 공정 용수 샘플 등의 신속한 분석을 허용하여 품질 논란에 대한 미생물의 원인 제공을 측정한다. 이러한 새로운 접근법은 문제점에 대한 더욱 적극적인 진단을 허용하여 개선된 기기 효율 및 제품 품질을 유도하는 것으로 입증되었다.
따라서, 통상의 공정 시스템에 존재하는 미생물의 적절한 식별을 위한 신규한 방법 및 조성물에는 명백한 유용성이 존재함이 분명하다. 본 단락에 기술된 기술은 특별히 그렇다고 지명하지 않는 한, 본원에 언급된 임의의 특허, 공개 문헌 또는 그 밖의 정보가 본 발명에 대한 "종래 기술"임을 인정하는 것으로 의도되지 않는다. 또한, 이러한 단락은 현행 37 CFR § 1.56 (a)에 규정된 바와 같은 다른 관련 정보가 존재하지 않거나 조사가 이루어짐을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 하나 이상의 구체예는 산업 공정 시스템에서 미생물 침입을 다루는 방법에 대한 것이다. 본 방법은 1) 산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 1 측정을 수행하는 단계로서, 이러한 확인은 다양성 지수 기준선을 적어도 부분적으로 규정하는 단계, 2) 산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 2 측정을 수행하는 단계로서, 이러한 확인은 후속 다양성 지수를 적어도 부분적으로 규정하며, 하나 이상의 제 2 측정은 제 1 측정(들) 보다 나중에 수행되는 단계, 3) 두 유기체의 임의의 상대 농도 변화를 주목하는 단계, 4) 제 2 측정이 소정의 한계량 (threshold amount)보다 많은 양만큼 측정과 차이가 난다면, 이러한 변화가 산업 공정 시스템에 대한 원치 않는 효과와 관련되어 있는지의 여부를 결정하는 단계, 및 5) 개선책을 시행하여 원치 않는 효과를 개선하는 단계를 포함한다.
제 1 및 제 2 측정은 DNA 분석, PCR 분석, qPCR 분석 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택된 하나 이상의 항목에 의해 수행될 수 있다. 한계량은 산업 공정의 최종 제품 또는 비제한적으로 펠트를 포함하는 공정으로부터 취해진 기타 고체 샘플의 그램 당 100개 세포 또는 시스템으로부터 취해진 유체 ml 당 100개 세포일 수 있다. 본 방법은 유기체중 하나가 개척물인지 적응물인지를 확인하고, 이러한 하나의 유기체가 개척물이며 이의 농도가 후속 지수의 한계를 초과할 만큼 증가한 경우, 개선책은 개척물을 표적으로 하는 살생 요법을 적용하는 것을 포함하며, 바이오필름 형성제가 검출되지 않는 경우, 개선책은 미생물 정착을 촉진하는 비-생물학적 벡터를 확인하고 제거하는 것을 포함하는 단계를 추가로 포함한다.
전체 생물학적 개체군이 동일하게 유지되는 경우라도, 하나 이상의 유기체의 정체 (identity)에 상관없이, 유기체의 상대 농도가 이전 측정 대비 한계를 초과하는 양만큼 증가한 경우, 살생 처리가 시스템에 부가될 수 있다.
본 방법은 다양성 지수의 변화를 산업 시스템에서 발생한 또 다른 사건과 연관시키고 사건을 역행시키는 단계로서, 그 다른 사건이 하나 이상의 공급 물질의 공급원 교체, 하나 이상의 공급 물질의 종류 교체, 시스템의 적어도 일부를 작동시키는 속도 변화 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 단계를 추가로 포함한다. 샘플중 전체 세포 농도는 제 1 측정과 제 2 측정 사이에 변화되지 않은 채 유지될 수 있다. 측정은 침착물이 그 위에 형성된 시스템의 일부에서 수행되며, 침착물은 임의의 유의한 생물학적 구성요소를 함유하지 않는다. 측정은 시스템 전반에 걸쳐 복수의 위치에 대해 수행될 수 있으며, 지수는 전체 시스템 개체군을 비교한다.
하나 이상의 제 3 다양성 지수 측정은 제 2 측정 후 및 개선책 시행 후에 수행될 수 있으며, 개선책의 효율이 제 3 다양성 지수 측정에서 측정된 바와 같은 2개 이상의 유기체의 상대 농도 변화에 의해 평가된다. 샘플중 전체 세포 농도는 제 1 및 제 2 측정 사이에 변화되지 않은 채 유지될 수 있으며, 제 1 및 제 2 유기체의 정체가 공정 설비 또는 최종 제품에 임의의 원치 않는 효과를 초래하는 것으로 공지되어 있지 않으며, 한계 변화가 검출되는 경우 유효한 살생제가 시스템에 부가되어 제 1 및 제 2 유기체를 치사시킬 수 있다. 유기체중 하나는 살생제에 내성인 포자를 형성할 수 있으며, 그러한 유기체의 상대량이 한계를 초과하여 증가하는 경우, 처리는 영양 세포를 갖는 공정 영역을 표적으로 하여 포자형성을 방지할 수 있다.
도면에 대한 구체적인 언급과 함께 본 발명의 상세한 설명은 이하 기술된다.
도 1은 코팅된 자유 박판 압연기에서 수집된 헤드박스 침착물중의 전체 박테리아 (A), 일차 (B) 및 적응성 (C) 바이오필름-형성 박테리아의 신속한 검출을 위한 본 발명의 적용을 도시하는 3개의 그래프를 지닌다.
도 2는 본 발명이 적용된 코팅된 자유 박판 압연기 (1-5), 박엽지 압연기 (6) 및 비코팅된 자유 박판 압연기 (7)로부터의 시이트 검출의 전체 박테리아 부하 그래프를 도시한다.
도 3은 본 발명이 적용된 시이트 검출 샘플의 전체 박테리아 부하 그래프이다.
도 4는 3개의 상이한 제지 압연기의 기기 펠트로부터 수집된 DNA 샘플의 미생물 다양성을 나타내는 파이형 도표를 도시한다.
하기 정의는 본 출원에 사용된 용어 및 특히, 청구범위가 어떻게 해석되어야 하는 지를 결정하기 위해 제공된다. 정의의 구성은 단지 편의를 위한 것이며, 어떠한 정의도 임의의 특정 카테고리로 제한하고자 하는 것은 아니다.
"적응물 (adaptor)"은 바이오컨트롤 프로그램에 대한 일부 수준의 내성을 나타내는 유기체를 의미한다. 어댑터의 미생물 경쟁이 살생제에 의해 저하되는 경우, 이러한 적응성 유기체는 번성할 수 있어 바이오필름을 형성할 수 있다.
"생물학적"은 조성물의 적어도 10% (부피 또는 질량)가 유기체로부터의 세포를 포함하는 물질의 조성을 의미한다.
"결함"은 산업 공정과 관련된 아이템의 원치 않는 속성을 의미한다. 이는 비제한적으로, 펠트상의 하나 이상의 플러그, 및 구멍, 변색, 자국, 반점, 반투명 반점 및 이들의 임의의 조합의 종이 시이트의 이러한 속성을 포함한다.
"펠트"는 재료의 컨베이어로서 작용하는 제지 공정에서 사용된 인터위브드 울 (interweaved wool) 또는 임의의 기타 섬유로 제조된 벨트를 의미하며, 여기서 인터위브드 섬유가 복수의 루멘을 규정하며, 이를 통해 물 또는 그 밖의 유체가 통과할 수 있다. 펠트는 또한 압연 롤 사이의 쿠셔닝을 제공할 수 있으며, 또한 제지 물질로부터 물을 제거하는데 사용된 수단일 수 있다. 펠트는 비제한적으로, 바닥 펠트, 바닥 보드 펠트, 실린더 화장지 습식 펠트, 건조기 펠트, 순환 펠트, 픽업 펠트, 흡인 픽업 펠트, Harper 탑 펠트 및 탑 펠트를 포함한다.
"기회감염물 (opportunist)"은 미리-확립된 바이오필름, 크러스트, 침착물 또는 유기체의 그 밖의 콜로니에 정착하여 번성하고, 개척 유기체 및/또는 이전의 기회감염 유기체와 함께 대신하거나 대체하거나 공존하는 경향을 갖는 유기체를 의미한다.
"종이 제품 또는 종이 시이트"는 전통적으로 그러나, 비필수적으로 셀룰로오스 섬유를 포함하는 제지 공정의 임의의 형성된 섬유 구조 최종 제품을 의미한다. 이러한 최종 제품의 예로는 비제한적으로, 페이셜 티슈, 배쓰 티슈, 테이블 냅긴, 원고지, 프린터 용지, 필기 용지, 노트북 용지, 신문지, 보드지, 대자보 용지, 본드지, 판지 및 기타 등등을 포함한다.
"제지 공정"은 원료 물질을 종이 제품으로 전환시키기 위한 하나 이상의 공정을 의미하며, 이는 비제한적으로, 펄핑 (pulping), 다이제스팅 (digesting), 정제, 건조, 캘린더링, 프레싱, 크레이핑, 탈수 및 표백과 같은 그러한 단계 중 하나 이상을 포함한다.
"PCR 분석"은 중합효소 연쇄 반응 분석을 의미한다.
"개척물 또는 일차"는 깨끗한 표면 또는 영역에 부착되어 그러한 표면에 바이오필름, 크러스트 또는 침착물 형성을 개시하는 유기체를 의미한다.
"플러그"는 펠트의 루멘 내에 위치한 물질의 고형물, 반고형물, 점성물 및/또는 그 밖의 침착물을 의미한다. 플러그는 루멘을 통과하는 물질의 흐름을 억제할 수 있고/거나 펠트의 임의의 다른 기능에 손상을 끼칠 수 있다.
"프라이머"는 전형적으로, DNA의 특이적 구획에 상보적이며, DNA의 특이적 구획에 인접한 DNA에 상보적인 누클레오티드 사슬의 합성을 위한 출발점으로서 작용하는 것으로 공지된 누클레오티드의 짧은 가닥인 물질의 조성물을 의미한다.
"프로브"는 DNA의 표적화된 구획에 결합하는 것으로 구성되고 배열된 물질의 조성물을 의미하며, 이는 이렇게 결합되는 경우 용이하게 검출될 수 있어, DNA의 표적화된 구획의 존재 또는 부재를 나타내는데 사용된다.
"qPCR 분석"은 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 의미한다.
"미생물"은 산업 공정 (제지 공정 포함)에 사용된 장비 내에, 장비에 인접하게, 장비의 상단에 또는 장비에 부착되어 그 자체가 심어지기에 충분히 작은 임의의 유기체를 의미하며, 이는 비제한적으로, 매우 작아서 현미경의 도움 없이 관찰될 수 없는 그러한 유기체, 너무 작아서 육안으로 관찰될 수 없는 많은 개별 유기체들을 포함하는 육안으로 관찰될 수 있는 그러한 작은 유기체의 수집물 또는 콜로니, 및 육안으로 관찰될 수 있는 하나 이상의 유기체를 포함하며, 이는 그 존재가 펠트 내에 플러그 형성 및/또는 종이 시이트 내의 결함 초래와 같은 산업 공정에 어떤 식으로든 손상을 끼치는 임의의 유기체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 곳에 언급된 상기 정의 또는 설명이 통상적으로 사용되거나, 사전에 사용되거나 본 출원에 참조로서 통합된 자료에 언급된 (분명한 또는 내포된) 의미와 일치하지 않는 경우, 본 출원 및 특히 청구범위 용어는 통상의 정의, 사전 정의 또는 참조로서 통합된 정의에 따라서가 아니라 본 출원의 정의 또는 설명에 따라 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 상기의 견지에서, 용어가 사전에 의해 해석되는 경우에만 용어가 이해될 수 있는 경우, 용어가 문헌 [Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 5th Edition, (2005), (Published by Wiley, John & Sons, Inc.)]에 의해 정의된다면 이러한 정의는 용어가 어떻게 청구범위내에서 정의되어야 하는지를 규제할 것이다.
본 발명의 하나 이상의 구체예는 시스템의 적어도 일부의 현 다양성 지수와 기준선 지수를 비교함으로써 미생물 침입을 확인하는 방법에 관한 것이다. 사실상, 미생물 유기체가 100% 없는 시중의 공정 시스템은 존재하지 않는다. 공정 시스템은 유기체가 통과하여 유입될 수 있는 거대한 부피의 많은 투입부를 종종 포함하며, 이들이 서식할 수 있는 많은 다양한 적소를 지녀 이는 항상 어떤 종류의 생물학적 개체군을 갖는다. 그러나, 통상의 관점에서, 시스템은 공정을 손상시키거나, 제품을 손상시키거나 사람에게 위험을 제기하는 것과 같은 해로운 유기체가 서식하기 보다는 유순한 유기체가 서식하는 것이 매우 바람직하다. 그 결과, 다양성 지수의 이용은, 개체군 변화를 유순한 영향으로부터 악영향으로의 변화와 연관시키는 유용한 진단 접근법이다. 어떤 유기체가 존재하는지 및 이들이 어디에 위치하는 지를 정확히 확인하는 방법은 적절한 개선책을 선택하고, 최적의 위치에 이를 배치하는 것을 도울할 수 있다.
다양성 지수는 통상의 공정 시스템에 존재하는 유기체의 생물학적 다양성의 스냅숏 (snapshot)이다. 다양성 지수는 시스템 전체일 수 있거나 공정 시스템의 특정 부분으로 제한될 수 있다. 예를 들어, 이는 많은 풍부 유체 투입물의 수렴점이기 때문에, 제지 공정의 헤드박스는 미생물이 종종 고도로 서식하며, 시간에 걸쳐 광범위하게 변화하는 다양성 지수를 갖는 것으로 예측될 수 있다. 그에 반해, 제지 공정에 사용되는 처리된 담수는 거의 유기체를 함유하지 않아, 소수개의 유기체 내지 박테리아 집합체의 다양성 및 존재비의 변화는 문제를 나타낼 것이다. 결과적으로, 특정 구획의 다양성 지수의 주목은 종종 폭 넓은 다양성 지수 시스템이 제공하지 못하는 통찰을 제공한다. 이러한 종류의 다양성 변화 및 이들이 위치하는 장소에 대한 주목은 살생제에 대한 공급 지점이 어디에 위치해야 하는지 및 개체군이 어떻게 다루어져야 하는지에 대해 영향을 끼친다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수는 해로운 미생물학적 영향이 발생하기 전에 이를 우선적으로 회피하는데 사용된다. 통상의 공정 시스템에 특이적인 특정 문제점에 상응하는 매우 많은 다양한 종류의 유기체가 존재하기 때문에, 특정의 표적화된 유기체의 존재 또는 부재 또는 상대비에 중점을 두는 것이 때때로 효율적이다. 예를 들어, 일부 유기체는 개척물이며, 일부는 적응성 바이오필름-형성제이다. 개척물은 이전에 존재하지 않았던 장소에 바이오필름 또는 크러스트 침착물을 생성시키는 반면, 적응성 바이오필름-형성제는 처리 프로그램에 대한 내성을 나타낸다. 다양성 지수의 검토가 하나의 유기체를 우세하게 포함하는 필름 또는 크러스트를 먼저 나타내고 이어서, 후에 상이한 유기체로 변화된 이의 조성을 나타내는 경우, 이는 개척물로부터 기회감염성 적응물로의 전환을 나타낼 수 있으며, 살생 요법은 이러한 상황을 적당하게 다루도록 수정될 수 있다. 유사하게는, 일차 필름 형성제가 한 기계 장치로부터의 시스템 및 또 다른 기계장치로부터의 적응물에 접근하는 경향이 있는 경우, 어떤 종류의 유기체가 존재하는지를 적절하게 확인하는 것은 미생물 오염의 벡터 공급원의 확인을 돕는다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 분석은 최종 제품의 품질 제어 검토에 중점을 두는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 유기체 예컨대, 일부 진균류는 공정 자체에 현저한 손상을 초래하지 않으나, 이들은 최종 제품 또는 기기 구성요소 내에 삽입되는 경향을 띠는 덩어리를 형성하여, 원치 않는 결함, 저하된 펠트 탈수 및 저하된 기계적 효율을 초래한다. 다양성 지수에서 진균류 농도의 증가는 특히, 결함에 대한 최종 제품의 철저한 정밀 조사가 적정함을 시사할 것이다.
하나 이상의 구체예에서, 지수 변화 특성은 다양성 변화 속도만큼 중요하지 않다. 예를 들어, 시간에 걸친 해당 다양성 지수는 비교적 정적인 개체군 다양성을 나타내는 경향이 있으나 갑작스럽게 변화되는 경우, 이는 시스템에서 어떤 중요한 것이 변화되었음을 나타낸다. 이는 물질 투입이 개체군 변화를 자극하는 결함을 가질 수 있거나, 한 개의 장비가 손상되거나 오작동될 수 있음을 의미할 수 있으며 이는 다양한 유기체에 대한 새로운 적소를 제시한다. 결과적으로, 다양성 지수 분석은 공정 시스템에서 비-생물학적 문제를 검출하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수의 변화는 실제로 문제점이 드러나기 전에 발생할 문제점을 검출하는데 사용될 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 다양성 지수의 변화는 결함성 물질 또는 손상되거나 오작동되는 장비를 나타낼 수 있다. 때때로, 다양성 변화는 그 밖의 원치 않는 효과 (예를 들어, 작동 효율 손실 또는 결함이 있는 최종 제품)가 발생하기 전에 검출될 수 있으며, 다양성 변화의 원인 확인은 이의 효과가 유의한 또는 고가의 방식으로 드러나기 전에 잠재적인 문제점을 제기할 수 있다. 유사하게는, 다양성 변화는 크러스트 침착물 또는 바이오필름 또는 또 다른 유기체 유도된 문제점이 발생할 것임을 나타낼 수 있으나, 이러한 지수는, 문제적 미생물이 이의 관련 문제점을 초래하기 전에 제거되게 한다. 때때로, 신속한 변화는, 해로운 유기체의 서식화 노력을 미리 차단한 유순한 유기체가 더 이상 강력하지 않으며, 해로운 유기체가 이제 자유롭게 이러한 적소에서 서식함을 나타낸다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수의 분석은, 분석된 영역 내의 전체 세포 계수는 변화되지 않은채 유지되나, 미생물의 조성은 변화되는 상황하에 발생한다. 하나 이상의 구체예에서, 다양성 변화는 전체 세포 계수가 증가하거나 감소하는 상황에 상응한다.
하나 이상의 구체예에서, 공정 시스템의 하나 이상의 부분이 이들의 다양성 지수에 대해 정기적으로 샘플링된다. 샘플은 시간 지수화될 수 있으며, 이는 시설에서의 다른 사건 예컨대, 특정 장비의 활성화, 탈활성화, 작동 상태, 생산 속도 및/또는 온도, 및/또는 다양한 물질, 첨가제 또는 화학약품의 사용과 연관될 수 있다. 이는 시설에서 또 다른 품질 제어 수단으로서 생물학적 다양성을 이용할 수 있게 한다. 일부 다른 사건에 상응하는 유의한 다양성 변화는 그 다른 사건이 공정에 일부 예상치 못한 긍정적 또는 부정적 영향을 끼칠 수 있음을 나타낸다.
하나 이상의 구체예에서, 일부 미생물 유도된 효과는 오염 시점으로부터 특정량의 시간이 흐른 후 발생하는 것으로 공지되어 있다. 결과적으로, 다양성 지수 변화는, 유기체가 이의 관련 문제점을 초래하는데 얼마나 오래 걸리는지를 결정하는데 이용될 수 있다. 본 방법은 (유기체가 어떻게 작용하는지 알기 위한) 진단법뿐만 아니라 비용 최적화 도구 둘 모두로서 이용될 수 있다. 비용 최적화는, 다양성 변화로부터 해당 시간내에 문제가 발생할 것이라는 사전 경고를 받고, 사전 경고를 이용하여 예상치 못한 비상사태에 대한 갑작스러운 대응으로서 구입될 경우 발생할 것보다 더 적은 비용 또는 더 높은 유효성을 갖는 시점에서 개선책을 이용 또는 구입함으로써 달성될 수 있다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수는 포자-형성 유기체를 검출하는데 이용될 수 있다. 이들 유기체가 포자 형태로 존재하는 경우, 이들은 대사 활성을 거의 또는 전혀 갖지 않으며, 살생제에 대해 고도로 내성이다. 일단 이들이 포자-상태가 되면 유기체를 제어하는데 다량의 살생제가 필요하며, 마무리된 제품 내에 포자를 형성할 가능성이 매우 높다. 낙농인 및 액체 포장 표준은 포자가 존재하는 상황에서 충족되기 않을 것 같다. 그에 반해서, 이들 유기체가 영양적 (vegetative) 상태인 경우, 이들은 살생제에 민감하며 제어하기 더욱 용이하다. 다양성 지수 방법에 의한 포자-형성 유기체의 검출은 그 중점을 바이오컨트롤 프로그램에서 포자 형성 방지로 이동시킨다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수 분석 결과는, 하나 이상의 살생 조성물이 통상의 공정 시스템 내의 하나 이상의 위치에 얼마나 많이, 무슨 종류가 및 얼마나 자주 부가되는 지를 결정함으로써 바이오컨트롤 프로그램을 강화시키는데 이용된다. 하나 이상의 구체예에서, 상기 및 하기 구체예 중 임의의 및 모든 구체예는 통상의 시스템 예컨대, 비제한적으로, 공정 용수 시스템, 제지 공정, 펄핑 공정, 식품 처리 공정, 화학 정제 공정, 목재 처리 공정, 물 여과 공정, 물 정제 공정, 화학 합성 공정, 코팅 공정, 유기 화학 이용 공정 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 산업 시스템에 적용된다. 하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수는 기기 침착물, 시이트 결함, 마무리된 제품, 펠트 등에서 발견된 문제성 미생물을 평가하는데 이용된다. 본 방법은 샘플 추출물 중의 핵산 분석을 기반으로 한다.
하나 이상의 구체예에서, 다양성 지수의 구성요소의 확인은 PCR 프라이머를 사용하여 미생물의 존재, 부재 및 양을 검출하는 것을 포함하는 DNA 기반 분석을 통해 달성된다. 미국 특허 5,928,875는 포자 형성 박테리아의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 PCR 프라이머의 용도를 기술한다. 하나 이상의 구체예에서, 프라이머는 유기체 군 중에서 고도로 보존되는 DNA 가닥의 일부에 대해 표적화된다. 결과적으로, DNA의 특정 부분의 존재에 대한 검출은 특이적 유기체의 존재에 대한 명백한 증거가 된다. 펠트 및 종이 시이트에는 전통적인 플레이팅 방법 또는 ATP 측정법을 위한 생존 유기체가 결여되어 있기 때문에 이의 오염 미생물을 정확하기 확인하기 어렵기 때문에, 펠트 및 종이 시이트를 분석하는데 PCR 분석법이 특히 이용된다.
하나 이상의 구체예에서, PCR 분석은 문헌 [the Article Primer Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase, by Randall Saiki et al., Science, Volume 239, pp. 487-491 (1988)]에 기술된 방법중 하나 이상을 이용하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구체예에서, PCR 분석은 문헌 [the Article Specific Synthesis of DNA in Vitro via a Polymerase-Catalyzed Chain Reaction, by Kary Mullis et al., Methods In Enzymology, Volume 155, pp. 335-350 (1987)]에 기술된 방법중 하나 이상을 이용하는 것을 포함한다.
하나 이상의 구체예에서, PCR 분석은 조 반데솜펠 (Jo Vandesompele)에 의해 서문작성된 Trade Brochure qPCR 가이드 (2012년 1월 19일 웹사이트 http://www.eurogentec.com/file-browser.html로부터 다운받음 바와 같음)에 기술된 바와 같은 qPCR 분석이다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 정량적 qPCR 분석이다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 정성적 qPCR 분석이다.
하나 이상의 구체예에서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)은 핵산 (DNA 또는 RNA)의 서열을 표적화하고, 표적 서열의 복사체 수를 증가시켜 다운-스트림 분석에 유용한 양의 핵산을 수득하기 위한 방법이다. 본 방법은 비제한적으로, 기기 펠트, 시이트 결함, 기기 침착물 등을 포함하는 다양한 샘플 중에서의 미생물 검출에 적용될 수 있다.
하나 이상의 구체예에서, 일단 DNA가 시중에서 입수가능한 임의의 DNA 추출 키트를 사용하여 샘플로부터 추출되면, 이는 정량적 PCR 접근법과 같은 PCR 접근법을 이용하여 실시간으로 분석될 수 있다. 정량적 PCR은 PCR과 동일한 방법론을 이용하나, 이는 실시간 정량적 성분을 포함한다. 본 기법에서, 프라이머는 특이적 유전자의 기능 또는 유기체의 식별을 기반으로 하여 관심 DNA 서열을 표적화하는데 사용된다. 일부 검출 형태 예컨대, 형광은 생성 DNA 또는 'DNA 엠프리콘'을 검출하는데 이용될 수 있다. 형광 변화는 표적 DNA의 양에 정비례한다. 소정의 형광 한계에 도달하는데 필요한 순환 횟수는 특이적 DNA 표적에 상응하는 표준에 필적한다. 표준은 전형적으로 표적 유전자로서, 순수하며 수 log에 걸친 공지량의 농도로 존재한다. 샘플중에 존재하는 표적 DNA 복사체의 수는 표준 곡선을 이용하여 계산된다. 이어서, 샘플 당 복사체 수는 샘플당 세포 수를 결정하는데 이용된다.
하나 이상의 구체예에서, 전체 박테리아를 정량하기 위한 보수적 접근법을 이용하여 박테리아로부터 DNA 서열을 표적화하는 프라이머 세트가 사용된다. 하나 이상의 구체예에서, 비제한적으로, 마이오터무스 (Meiothermus), 슈도산토모나스 (Pseudoxanthomonas) 및 다이노코커스 (Deinococcus)를 포함하는 일차 바이오필름-형성 박테리아를 표적화하는 프라이머 세트가 사용된다. 하나 이상의 구체예에서, 스핑고모나다세아 (Sphingomonadacea) 패밀리 박테리아에 속하는 적응성 바이오필름-형성제를 표적화하는 프라이머 세트가 사용된다. 하나 이상의 구체예에서, 적응성 바이오필름-형성제는 다른 바이오필름 및 부유 미생물 대비 산화제-기반 바이오컨트롤 프로그램에 더욱 높은 내성을 나타내었다. 하나 이상의 구체예에서, 프라이머가 진균류 및 박테리아 침입을 구별하기 위해 사용된다.
하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 생물학적 도메인 수준으로 DNA 구별하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 박테리아, 고세균류 (Archaea) 및 진핵생물 (Eukaryota)의 DNA를 구별하는 것을 포함한다. 이들 유기체는 매우 상이한 DNA를 가지며, 도메인 수준으로의 유기체 DNA 확인에 중점을 둔 프로토콜은 더욱 특이적 측정법보다 대단히 더욱 단순하다. 펠트에 있어서, 상이한 도메인으로부터의 유기체가 종종 상이하게 최상으로 처리되기 때문에, 이러한 단순한 형태의 확인은 특정 오염물을 최상으로 겨냥한 특이적 요법을 정확하게 확인하는데 이용될 수 있다. 하나 이상의 구체예에서, 사용된 평가는 동일한 도메인의 유기체 또는 상이한 종류의 박테리아 또는 상이한 종류의 고세균류 또는 상이한 종류의 진핵생물을 구별할 수 없을 만한 것이다.
하나 이상의 구체예에서, 하나 초과의 프라이머가 하나 초과의 독특하게 인식가능한 누클레오티드 서열을 갖는 유기체를 식별하는데 사용된다. 하나 이상의 구체예에서, PCR 분석을 이용하여 특이적 유기체에 독특하거나 거의 독특한 효소와 결합된 게놈 서열을 검출한다.
하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 결함을 검출하고 그 후, PCR 분석을 이용하여 결함의 다양성 지수를 적절하게 분석하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 결함이 전체적으로 생물학적 기반인지, 전체적으로 비-생물학적 화학적 기반인지, 또는 비-생물학적 화학적, 기계적 및 생물학적 기반 근원의 조합으로부터의 결과인지를 측정한다. 하나 이상의 구체예에서, 결함은 펠트 상의 하나 이상의 플러그이다. 하나 이상의 구체예에서, 결함은 구멍, 구멍의 적어도 일부 주변에 탈색된 할로 (halo)를 지닌 구멍, 탈색 자국, 반점, 반투명 반점 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 갖는 종이 시이트이다.
하나 이상의 구체예에서, 한계 수준은 거짓 양성을 무시하는데 사용된 방법론이다. 때때로 PCR 분석은 존재하나 특정한 결함을 초래하지 않는 미량의 유기체를 검출한다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 하나 이상의 특정 유기체에 대해 공지된 소정의 수준보다 더 낮은 농도에서 검출된 임의의 유기체의 존재를 무시하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 (결함의) 그램 당 104 세포보다 낮은 수준으로 검출된 임의의 유기체의 존재를 무시하는 것을 포함한다. 하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 ml 당 104 세포보다 낮은 수준으로 검출된 임의의 유기체의 존재를 무시하는 것을 포함한다.
하나 이상의 구체예에서, 본 방법은 다르게는 종래 기술의 방법에 의해서 검출되지 않은 미생물을 검출할 수 있다. 예를 들어, 파울런트 (foulant)가 혐기성 또는 설페이트 환원 유기체의 침입에 의해 초래되는 경우에, 혐기성 조건하에 미생물에 의해 생성된 ATP의 양이 호기성 조건하에서보다 현저하게 더 적기 때문에 ATP 검출과 같은 방법은 생물학적 근원으로서 파울런트 근원을 정확하게 식별할 수 없을 것이다. 따라서, 파울런트 근원은 비정확하게 식별될 것이며, 항-생물학적 접근법이 아닌 n 화학적 접근법이 문제를 해결하고자 시도하는데 이용될 것이다. 또 다른 예에서, 플레이팅, ATP 검출 등과 같은 전통적인 접근법을 이용한, 펠트의 화학적 오염물로부터의 미생물의 분화는 이들 샘플이 이동 동안 건조되고 모든 생존가능한 유기체가 죽는다는 점으로 인해 사실상 불가능하다. DNA 접근법을 이용하면, 모든 생명체가 DNA를 함유하기 때문에 생물학적 침입을 항상 정확하게 나타낼 것이다.
다양성 지수는 전체 유기체 예컨대, 박테리아의 검출을 위한 PCR 예컨대, 비제한적으로 qPCR을 이용할 수 있다: 스핑고모나스 (Sphingomonas) 종; 에리트로박터 (Erythrobacter) 종; 슈도모나스 (Pseudomonas) 종; 부르크홀데리아 (Burkholderia) 종; 할리스코메노박터 (Haliscomenobacter) 종; 사프로스피라 (Saprospira) 종; 쉬레겔라 (Schlegelella) 종; 렙토트릭스 (Leptothrix) 종; 스패로틸루스 나탄스 (Sphaerotilus natans); 바실러스 (Bacillus) 종; 아녹시바실러스 (Anoxybacillus) 종; 사이토파가-플라보박테리움-박테로이데스 (Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides) 문의 구성원; 헤르페토시폰 (Herpetosiphon)을 포함하는 녹색 비유황 박테리아, 마이오터무스 종을 포함하는 다이노코커스-터무스 (Deinococcus-Thermus) 문의 구성원; 카탈라제-생성 박테리아, 아밀라제-생성 박테리아, 우레아제-생성 박테리아, 질화 박테리아, 진균류, 등등. 이들 기법들은 보존 서열을 기반으로 하는 표적 유기체의 검출 및 정량화를 허용하는 프라이머 및 표준 쌍을 이용한다. 프라이머는 진화에 걸쳐 고도로 보존된 미생물 게놈의 영역을 표적으로 하는 반면, 특이적 문 또는 속에 대한 프라이머는 게놈의 더욱 가변 영역을 표적으로 한다.
샘플중에 존재하는 관심 유기체를 정확하게 정량화 가능함은 그러한 유기체를 샘플중의 전체 박테리아 부하의 백분율로서 표현하는 것을 가능하게 한다. 다양성 지수는 또한, 수개의 표적 유기체의 상대 빈도로서 정량적으로 표현될 수 있다. 공정의 임의의 부분에 대한 다양한 지수는 기기 또는 공정이 잘 돌아가서 기준선이 생성되는 시점에 측정될 수 있다. 이어서, 불량한 기기 또는 공정 수행의 때때로 측정된 다양성 지수를 기준선과 비교하여, 미생물 개체군중의 변동을 찾고 어떠한 박테리아 그룹이 공정의 문제에 대한 책임이 있는지를 결정할 수 있다. 다양성 지수는 또한, 샘플 위치중에서 또는 기준선 대비 모니터링 데이타를 비교하기 위해 Shannon 다양성 지수 계산법을 이용하여 비교를 용이하게 하기 위해 정량화될 수 있다. 그 후, 처리 전략 및 공급 지점이 이에 따라 변화되어 문제를 해결할 수 있다.
DNA의 정량화를 기반으로 하는 다양성 지수는 유기체의 생존도와 무관하게 공정에서 유기체의 존재 및 다양성을 측정한다. 리보핵산 (RNA), 특히 메신저 RNA (mRNA)는 단지 살아있는 유기체에 의해서만 생성되는 분자이며, 표적에 따라, 박테리아의 특이적 문 또는 속에 독특해지는 특성을 지닌다. 상기 기록된 유기체에 대해 독특한 mRNA 서열을 증폭시킴으로써, 어떤 박테리아가 이들의 생존가능한 형태로 존재하는지를 결정할 수 있게 된다. 이어서, 생존 유기체의 정확한 검출이 공정 용수의 처리 전략의 효율을 평가하는 도구로서 이용될 수 있다. 이는 다양성 지수와 생존도 지수를 비교함으로써 달성될 수 있다.
본 방법은 공정 샘플에 존재하는 생존 박테리아의 양 및 유형을 정량화할 것이다. 정량적 (실시간) 중합효소 연쇄 반응 방법이 메신저 리보좀 핵산 (mRNA)을 검출하는데 적용될 수 있다. mRNA는 DNA를 전사하며, 이는 리보좀으로 보내져서 번역으로서 공지된 프로세스에서 단백질 합성을 위한 청사진으로서 공급된다. mRNA는 살아있는 세포에 의해서만 생성된다. 살아있는 세포로부터의 RNA는 시중에서 입수가능한 키트를 사용하여 분리될 수 있다. mRNA 검출에는 정량적 중합효소 연쇄 반응에서 추가의 단계가 필요하다. 역전사효소가 반응 칵테일에 첨가되어 mRNA를 이의 상보적 DNA (cDNA)로 전사된다. 2 세트의 프라이머가 이러한 실험에 필요하다. 첫 번째는 특이적 mRNA를 표적으로 하는 반면, 두 번째는 역전사효소 반응에 의해 유도된 생성 cDNA를 증폭시키는데 사용된다.
실시예
상기는 하기 실시예를 참조로 하여 더욱 잘 이해될 수 있으며, 실시예는 예시의 목적으로 제시된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 #1
코팅된 자유 박판 압연기의 기기 헤드박스 중 하나에 지속적인 침착이 이루어 지며, 이는 최종 제품에 결함을 초래하는 것으로 간주되었다. 헤드박스 자체는 섬유질 성장 및 화학적 침착물의 축적으로 시달리고 있다. 현미경 및 화학 분석은 이러한 축적물내에 박테리아가 거의 또는 전혀 존재하지 않음을 보여주었다. 미생물이 문제의 근본적인 원인인 것으로 추정되었다. 그러나, 공정 샘플을 분석하는데 사용된 전통적인 모니터링 기법 (예를 들어, 표준 평판 계수 및 ATP 수준)은 증가된 수준의 미생물 활성을 나타내지 않았다. 구체적으로, 결과는 100 CFU/ml 이하 및 100 RLU (ATP) 이하를 나타내었다.
헤드박스로부터의 침착물 샘플을 qPCR 기법을 이용하여 수 개월 과정에 걸쳐 분석하여 다양성 지수를 발생시켰다. 헤드박스 침착물의 분석으로부터의 초기 qPCR 결과는 높은 수준의 미생물 부하뿐만 아니라 증가된 밀도의 개척물 및 적응물 바이오필름-형성제를 나타내었다 (도 1). 처리 전략은 펄퍼 및 브로크 사일로 (broke silo) 둘 모두에 대한 살생제 부가로 증강시켰다. 산화제-기반 바이오컨트롤 프로그램의 공급 속도를 또한 증가시켰다. 한달 후에 수집된 침착물의 분석은 헤드박스 침착물의 전체 박테리아 부하에서 작은 변화를 검출하였다 (도 1A). 개척 바이오필름-형성제의 수는 1-log 감소된 반면, 적응성 바이오필름-형성제의 밀도는 4-log 감소되었다 (도 1B 및 1C). 헤드박스 침착물의 양 및 시이트 결함 빈도는 계속해서 변화되지 않은 채 유지되었다. 스톡 (stock) 및 공정 용수 시스템의 전통적인 플레이팅 및 ATP 분석은 작은 생물학적 활성을 나타내었다. ATP 및 평판 계수 값은 각각 평균 100 RLU 미만 및 그램 당 100 콜로니-형성 유닛 (CFU/g)이었다.
처리 전략을 브로크 사일로 및 펄퍼로의 살생제 및 불안정화된 염소의 첨가를 통해 추가로 최적화시켰다. 마지막 세트의 변화 실행 후, 추가적인 샘플을 수집하고 분석하였다. 침착물의 전체 박테리아 부하는 거의 1-log 감소를 보여주었다 (도 1A). 최종 세트의 침착물 샘플은 일차 바이오필름-형성제의 밀도에서 거의 2-log의 감소를 보여주었다 (도 1B). 적응성 바이오필름-형성제는 거의-배경 수준으로 유지되었다 (도 1C). 또한, 미생물 개체군의 개선된 제어에도 불구하고, 결함 빈도, 결함 특성 및 헤드박스 침착은 변화되지 않은 채 유지되었다.
이러한 압연기로부터의 시이트 결함은 동일한 qPCR-기반 접근법을 이용하여 분석하였다. 결함에 존재할 수 있는 많은 박테리아가 건조기 섹션의 고온에 의해 치사되기 때문에 전통적인 플레이팅 및 ATP 방법을 이용하여 결함에서 박테리아 함량을 측정하는 것이 불가능하다. 화학적 분석은 시이트에 존재하는 박테리아에 대한 확정적인 답을 제공할 수 없는데 이는 닌히드린 염색에 의존적이기 때문이다. 이러한 접근법은 비-특이적이며, 거짓 양성 및 거짓 음성 결과를 유도하기 쉽다. 이러한 압연기로부터의 홀 및 시이트 결함의 DNA 분석은 매우 낮은 박테리아 밀도를 검출하였다 (도 2, 샘플 1-5). 일차 및 적응성 바이오필름-형성제는 이러한 압연기로부터 분석된 시이트 결함에서는 검출되지 않았다. 따라서, 박테리아 점액은 이러한 압연기에서 결함 및 품질 문제의 원인이 되는 것 같지 않았다. 이에 반해, 현저한 생물학적 침착이 이루어지는 압연기는 훨씬 더 높은 미생물 부하를 지닌 결함을 가졌다 (도 2, 샘플 6). 게다가, 유사한 박테리아 종들이 침착물 및 결함에서 확인되었다. 이들 결함의 닌히드린 염색은 미생물의 존재를 나타내는 양성 반응을 유도하지 않았다. 또 다른 경우에, 박테리아는 생물학적 결함으로 간주되는데 필요한 최소 밀도를 겨우 넘는 수준으로 시이트 결함에서 검출되었다. 그러나, 닌히드린 반응은 음성이었으며, 이는 결함이 미생물을 함유하지 않았음을 나타냈다 (도 2, 샘플 7). 헤드박스 침착물의 정량적 qPCR 시험은 처리 전략에 대한 각각의 수정 후 일차 및 적응성 바이오필름-형성제 둘 모두에서의 감소를 입증하였다. 이들 표적 유기체가 극적으로 감소하고, 결함 빈도 또는 침착물의 양이 감소하지 않았다는 점은, 박테리아가 이러한 기기 시스템에서 결함 문제에 대한 요인이 아닐 것 같음을 나타낸다. 일차 바이오필름-형성제는 기기 표면에서 서식하며, 다른 유기체 유형의 부착 및 증식에 유리한 환경을 발생시킨다. 이들 유기체가 존재하지 않다면, 박테리아는 우수한 성장 매질로서 작용할 수 있는 화학 잔해의 침착 후 기기 표면에 부착될 수 있다. 화학 첨가제 및 섬유가 헤드박스 내부에 침착되어, 미생물 서식에 적합한 미세환경을 유도했던 것으로 보인다. 시이트 결함 분석이 무시할만한 미생물 존재를 드러냈기 때문에, 미생물은 제품 품질에 대한 악영향 및 헤드박스의 침착물의 일차 근원에서 제외되었다. 기기 성능을 개선하고자 하는 노력은 바이오컨트롤에 중점을 두지 않았으며, 개선된 작동 조건 및 제품 품질을 허용하는 시스템의 더욱 양호한 기계적 제어에 중점을 두었다.
실시예 #2
코팅된 자유 박판 압연기는 수 년 동안 경쟁 산화제-기반 바이오컨트롤 프로그램을 사용하였다. 미생물 성장 제어가 적절하게 감지되었다; 그러나, 향상된 공정 효율을 위해 시이트 파손을 추가로 감소시킬 기회가 있다. 프로그램은 여러 단계로 시행되고 최적화되었다. 공정 전반에 걸쳐 박테리아 밀도는 여전히 낮게 유지되며, 시이트 파손 감소가 기록되었다. 평균 파손 수/일은 평균 1.2 파손/일로부터 0.42 파손/일로 감소되었다.
최적화된 프로그램의 시행 후 약 2년째에, 공정 조건이 더욱 변화가능하게 되었으며, 바이오컨트롤 제품의 농도 증가가 동일한 수준의 제어를 유지하는데 요구되는 것으로 관찰되었다. 전통적인 모니터링 도구 예컨대, 평판 계수 및 ATP 측정을 이용한 시스템 조사 결과, 공정 용수 시스템의 박테리아 밀도는 여전히 낮게 유지되며, 헤드박스 및 브로크 시스템 (broke system)에서 증가가 전혀 또는 거의 관찰되지 않았음을 나타내었다. 그러나, 압연기는 구멍 및 결함의 심각한 발생을 겪고 있었다. 전통적인 모니터링 기법은 바이오컨트롤 프로그램 성능이 변화가 없는 것으로 나타낸 반면, 온-라인 활성 모니터는 미생물 활성 증가를 검출하였다 (도 3).
기기 침착물 및 시이트 결함의 qPCR 분석을 이용한 다양성 지수 분석은 개척 및 적응성 바이오필름-형성제의 존재를 모두 확인하였다. 결함에서 전체 박테리아의 밀도는 그램 당 약 1.8x107 세포였다 (도 3). 이러한 증거는 결함 및 품질 문제에서 미생물의 역할을 나타낸다. 기기는 부식성 분출 (caustic boilout) 처리되며, 그 후, 온라인 활성 모니터는 미생물 활성의 감소 및 더욱 안정한 ORP 값을 입증하였으며, 이는 개선된 프로그램 성능 및 자구성을 나타낸다. 시이트 결함중의 미생물의 양은 분출 후 107 세포/g로부터 105 세포/g로 감소되었다 (도 3). 이는 qPCR이 전통적인 기법을 사용하여 검출될 수 없는 시이트 결함에 대한 미생물 원인제공을 검출할 수 있음을 확인시켜 준다. 또한, qPCR은 최종 제품에 대한 바이오컨트롤 프로그램의 효능을 평가하는데 이용될 수 있다.
실시예 #3
성능 문제를 겪은 두 제지 압연기로부터의 펠트 샘플로서, 기기상 침착물 및 시이트 결함으로서의 이들 자체를 나타낸 샘플을 qPCR을 사용하여 분석하였다. 각 샘플을 미생물 존재에 대해 평가하였다. 일단 각 샘플이 고용량의 박테리아를 함유하는 것으로 결정되면, 그 후, 샘플을 적응성 및 일차 바이오필름-형성제의 존재에 대해 분석하였으며, 이러한 형성제들은 기기 효율 및 제품 품질에 대한 문제에 대한 원인을 제공하는 것으로 공지된 스핑고모나다세아 패밀리, 마이오터무스, 게오터무스 (Geothermus), 및 슈도산토모나스를 포함하였다. 두 압연기 모두는 보통 수준의 적응성 바이오필름-형성제를 함유하였으나, 압연기 1은 압연기 2의 일차 바이오필름 형성제보다 2배 많았다 (도 4). 적응성 바이오필름 형성제의 수준이 문제에 대한 원인을 제공할 것 같지 않음을 나타내는 범위에 있기 때문에, 적응성 바이오필름 형성제의 수준은 정상으로 결정되었다. 다양성 지수는 압연기 2에서의 개척물 바이오필름-형성제의 수준이 거의 배경 수준임을 보여주었다. 압연기 2에서 높은 수준의 개척물 바이오필름-형성제는 펠트에서의 바이오필름 형성을 암시하며, 이는 펠트 플러깅 및 시이트로부터의 저하된 수분 제거로 이어진다. 펠트 상의 바이오필름의 존재는 다른 물질의 증가된 침착을 유도할 수 있으며, 이는 이어서 시이트 상에 재침착될 수 있다. 압연기 1에서의 증가된 수준의 개척물 바이오필름-형성제는, 어디에서 이들 유기체가 기원하는 지를 측정하는데 공정의 다른 부분 예컨대, 샤워 물, 첨가제, 저장 상자 등의 추가적인 분석이 필요함을 시사하였다.
이러한 실험 결과는, 침착, 결함 및 파괴가 만연되게 유지되고 있으나, 통상적인 플레이팅 기법 및 산화제 잔류물은 적합한 살생제 용량 및 미생물 성장의 제어를 나타낼 수 있음을 입증한다. PCR 및 qPCR 방법을 포함하는 다양성 지수의 이용은 공업 용수 시스템에서 미생물 성장 및 바이오필름 형성에 대한 더욱 정확한 정보를 제공한다. 이들 전략은 미생물의 침착물 형성에 대한 기여도를 신속하게 분석하게 하며, 미생물을 함유하는 침착물이 결함에 기여하는지의 여부를 신속하게 결정하는데 이용될 수 있다.
qPCR 기반 다양성 지수는 시이트 결함에 대한 신속한 분석을 허용하여 미생물의 품질 문제에 대한 기여도를 측정할 수 있게 한다. 이러한 새로운 접근법은 문제의 더욱 적극적인 진단을 허용하여 향상된 기기 효율 및 제품 품질을 유도하는 것으로 입증되었다.
본 발명이 많은 다양한 형태로 포함될 수 있지만, 본 발명의 특히 바람직한 구체예가 본원에서 더욱 상세히 기술되었다. 이러한 기재내용은 본 발명의 원리의 예시이며, 본 발명을 예시된 특정 구체예로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 과학 논문 및 임의의 그 밖의 참조 문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 추가로, 본 발명은 본원에 기술되고/거나 본원에 통합된 다양한 구체예의 일부 또는 전부의 임의의 가능한 조합을 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 기술되고/거나 본원에 통합된 다양한 구체예중 어느 하나 또는 일부를 특정하게 배재시킨 임의의 가능한 조합을 포함한다.
본 기재내용은 설명을 위한 것이며 전부를 아우르는 것은 아니다. 본 설명은 당업자에게 많은 대안 및 변형을 시사할 것이다. 모든 이러한 대안 및 변형은 청구범위내에 포함되는 것으로 의도되며, 여기에서 용어 "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는"을 의미한다. 본 기술분야에 익숙한 업자들은 본원에 기술된 특정 구체예의 다른 등가물을 인지할 수 있을 것이며, 이러한 등가물은 또한 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 기술된 모든 범위 및 변수는 본원에 포함된 임의의 및 모든 부분범위, 및 종료점 사이의 모든 수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, "1 내지 10"으로 언급된 범위는 최소 값 1과 최대값 10 사이 (이 두 수도 내포됨)의 임의의 및 모든 부분범위를 포함하는 것으로 간주되어야 한다; 즉, 최소 값 1 또는 그 초과에서 시작되며 (예를 들어, 1 내지 6.1), 10 또는 그 미만의 최대 값 (예를 들어, 2.3 내지 9.4, 3 내지 8, 4 내지 7)으로 끝나는 모든 부분범위, 및 최종적으로 이러한 범위 내에 함유된 각각의 수 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10.
이는 본 발명의 바람직한 및 대안적 구체예의 설명을 완전하게 한다. 당업자는 등가물이 본원에 첨부된 청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된, 본원에 기술된 특정 구체예의 다른 등가물을 인지할 수 있다.

Claims (15)

  1. 산업 공정 시스템에서 미생물 침입을 다루는 방법으로서,
    산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 1 측정을 수행하는 단계,
    산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 2 측정을 수행하는 단계로서, 이러한 확인은 후속 다양성 지수를 적어도 부분적으로 규정하며, 하나 이상의 제 2 측정은 제 1 측정(들) 후에 수행되는 단계,
    두 유기체의 임의의 상대적 농도 변화를 주목하는 단계,
    측정된 유기체 중 하나의 상대 농도가 소정의 한계량 (threshold amount)을 초과하는 경우, 이러한 변화가 산업 공정 시스템에 대한 원치 않는 효과와 관련되어 있는지를 결정하는 단계; 및
    개선책을 시행하여 원치 않는 효과를 개선하는 단계를 포함하고,
    전체 생물학적 개체군이 동일하게 유지되는 경우라도, 하나 이상의 유기체의 정체(identity)와 무관하게, 이들의 상대 농도가 이전 측정 대비 한계를 초과하는 양만큼 증가한 경우, 살생 처리가 시스템에 부가되고,
    한계량 (threshold amount)이 시스템으로부터 취해진 유체 ml 당 104 세포, 또는 산업 공정의 최종 제품 또는 산업 공정으로부터의 고체 샘플의 그램 당 104 세포인 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 제 1 및 제 2 측정이 DNA 분석, PCR 분석, qPCR 분석 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택된 하나 이상의 항목에 의해 수행되는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 유기체 중 하나가 개척물 (pioneer)인지 적응물 (adaptor)인지를 확인하고, 이러한 하나의 유기체가 개척물이며 후속 지수에서 이의 농도가 한계를 초과할 만큼 증가한 경우, 개선책은 개척물을 표적으로 하는 살생 요법을 적용하는 것을 포함하며, 개척물 형성제가 검출되지 않는 경우, 개선책은 미생물의 정착을 촉진하는 비-생물학적 벡터 (vector)를 확인하고 제거하는 것을 포함하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 유기체 중 하나가 개척물인지 기회감염물 (opportunist)인지를 확인하고, 이러한 하나의 유기체가 개척물이며 후속 지수에서 이의 농도가 한계를 초과할 만큼 증가한 경우, 개선책은 개척물을 표적으로 하는 살생 요법을 적용하는 것을 포함하며, 개척물이 검출되지 않는 경우, 개선책은 미생물의 정착을 촉진하는 비-생물학적 벡터를 확인하고 제거하는 것을 포함하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 다양성 지수 변화를 산업 시스템에서 발생한 또 다른 사건에 연관시키는 단계로서, 그 다른 사건이 하나 이상의 공급 물질의 공급원 교체, 하나 이상의 공급 물질의 종류 교체, 시스템의 적어도 일부를 작동시키는 속도 변화 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 샘플 중의 전체 세포 농도가 제 1 및 제 2 측정 사이에 변화되지 않은 채 유지되는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 측정들이, 침착물이 그 위에 형성된 시스템의 일부에서 수행되며, 침착물은 임의의 유의한 생물학적 구성요소를 함유하지 않는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 측정이 시스템 전반에 걸쳐 복수의 위치에 대해 수행되며, 지수가 전체 시스템 개체군을 비교하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 제 3 다양성 지수 측정이 제 2 측정 후 및 개선책 시행 후에 수행되며, 개선책의 효능이 제 3 다양성 지수 측정에서 측정된 바와 같은 2개 이상의 유기체의 상대적 농도 변화에 의해 평가되는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 샘플 중의 전체 세포 농도가 제 1 및 제 2 측정 사이에 변화되지 않은 채 유지되며, 제 1 및 제 2 유기체의 정체가 공정 설비 또는 최종 제품에 임의의 원치 않는 효과를 초래하는 것으로 공지되어 있지 않으며, 한계 변화가 검출되는 경우 유효한 살생제가 시스템에 부가되어 제 1 및 제 2 유기체를 치사시키는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 유기체 중 하나가 살생제에 내성인 포자를 형성할 수 있으며, 그 유기체의 상대량이 한계를 초과하여 증가하는 경우, 처리는 영양 세포를 갖는 공정 영역을 표적으로 하여 포자형성을 방지하는 방법.
  13. 산업 공정 시스템에서 미생물 침입을 다루는 방법으로서,
    산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 하나 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 1 측정을 수행하는 단계,
    하나 이상의 유기체의 농도가 그 유기체에 대한 소정의 한계를 초과하는지를 결정하는 단계,
    초과하는 경우, 한계 초과 유기체가 적응물인지 또는 개척물인지를 결정하는 단계,
    적응물인 경우, 살생제에 대한 유기체의 내성을 고려한 개선 전략을 시행하는 단계,
    개척물인 경우, 유기체가 적응물인 경우보다 낮은 용량 (dosage)의 살생제를 사용하는 개선 전략을 시행하는 단계를 포함하고,
    한계량 (threshold amount)이 시스템으로부터 취해진 유체 ml 당 104 세포, 또는 산업 공정의 최종 제품 또는 산업 공정으로부터의 고체 샘플의 그램 당 104 세포인 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 측정이 또한 수행되어,
    산업 공정 시스템을 침입하는 모든 미생물의 완전 개체군을 결정하고,
    하나 이상의 유기체의 농도가 미생물의 전체 개체군 대비 그 유기체에 대한 소정의 한계를 초과하는지를 결정하고,
    초과하는 경우, 한계 초과 유기체가 적응물인지 또는 개척물인지를 결정하고,
    적응물인 경우, 살생제에 대한 유기체의 내성을 고려한 개선 전략을 시행하고,
    개척물인 경우, 유기체가 적응물인 경우보다 낮은 용량의 살생제를 사용하는 개선 전략을 시행하고,
    한계량 (threshold amount)이 시스템으로부터 취해진 유체 ml 당 104 세포, 또는 산업 공정의 최종 제품 또는 산업 공정으로부터의 고체 샘플의 그램 당 104 세포인 방법.
  15. 산업 공정 시스템에서 미생물 침입을 다루는 방법으로서,
    산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 1 측정을 수행하는 단계,
    산업 공정 시스템의 적어도 한 부분에 존재하는 2개 이상의 유기체의 상대 농도를 확인하는 하나 이상의 제 2 측정을 수행하는 단계로서, 이러한 확인은 후속 다양성 지수를 적어도 부분적으로 규정하며, 하나 이상의 제 2 측정은 제 1 측정(들) 후에 수행되는 단계,
    두 유기체의 임의의 상대적 농도 변화를 주목하는 단계,
    측정된 유기체 중 하나의 상대 농도가 소정의 한계량 (threshold amount)을 초과하는 경우, 이러한 변화가 산업 공정 시스템에 대한 원치 않는 효과와 관련되어 있는지를 결정하는 단계; 및
    개선책을 시행하여 원치 않는 효과를 개선하는 단계를 포함하고,
    상기 방법은 다양성 지수 변화를 산업 시스템에서 발생한 또 다른 사건에 연관시키는 단계로서, 그 다른 사건이 하나 이상의 공급 물질의 공급원 교체, 하나 이상의 공급 물질의 종류 교체, 시스템의 적어도 일부를 작동시키는 속도 변화 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 단계를 추가로 포함하고,
    한계량 (threshold amount)이 시스템으로부터 취해진 유체 ml 당 104 세포, 또는 산업 공정의 최종 제품 또는 산업 공정으로부터의 고체 샘플의 그램 당 104 세포인 방법.
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