KR101871507B1 - 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 규조류, 담녹조류 및 남조류를 포함하는 미세조류(microalgae)를 이용하여 포복성 무척추동물의 유생을 배양하는 방법 및 이에 사용되는 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 규조류, 담녹조류 및 남조류의 참전복 유생의 초기 먹이생물로서의 이용가능성을 보였으며, 이러한 결과는 참전복 이외의 포복성 무척추동물에도 확장될 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 참전복 유생을 포함한 포복성 무척추동물의 부착 및 변태 유발에 적합한 미세조류를 발견함으로써 각각의 포복성 무척추동물 유생에 적합한 미세조류 사료를 개발하는데 기여할 수 있다.

Description

포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물{Feed composition for culturing marine invertebrate larvae}

본 발명은 규조류, 담녹조류 및 남조류를 포함하는 미세조류(microalgae)를 이용하여 포복성 무척추동물의 유생을 배양하는 방법 및 이에 사용되는 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물에 관한 것이다.

전복이나 해삼과 같이 우수한 영양성분을 함유한 해양생물들에 대한 수요가 증가함에 따라 이들을 대량으로 생산할 수 있는 양식 기술들도 점차 발전하고 있다. 특히 전복은 고부가가치 어종으로 각광받고 있으며, 인공 종묘생산이 실시된 이후 해마다 양식면적이 늘어나고 있다. 종래 전복이나 해삼을 양식하는 방법은 어린 전복이나 해삼 유생을 육상 수조에서 일정 크기 이상 성장시킨 후 바다에 설치되어 있는 가두리 양식장으로 옮겨서 양식하는 방법이 주된 것이었다. 또한 전복은 자연 상태에서 암벽이나 암초가 있는 곳에서 주로 서식하는 부착성 어종이므로, 양식을 할 때에도 이러한 습성을 충족시키기 위하여 전복이 붙어서 생활할 수 있는 다양한 형태의 쉘터가 개발되고 있는 실정이다. 그러나, 아직 전복을 포함한 해양생물들에 대한 양식 기술은 초기단계라 할 수 있으며, 특히 초기 배양에 사용될 사료의 개발은 크게 실용화되어 있지 않다. 예를 들어, 전복의 경우 종래에는 양식 사료로서 미역, 다시마, 파래 등의 가공되지 않은 사료를 주로 사용하여 왔는데, 이러한 사료들은 장기간 저장시 부패, 악취, 유해미생물 등이 발생하며 저장비용도 높은 편이어서 안정적 공급이 어렵고 양식원가를 상승시켜 수익성이 떨어지는 문제가 있다. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 배합사료를 개발하려는 시도들이 국내외적으로 이루어지고 있다. 가령 대한민국 특허출원 제2009-0068453호("전복 초기 미립자 사료", 2009.07.27.출원)는 부착규조류의 분말과 미네랄 등을 혼합한 미립자 사료의 제조방법을 개시하고 있으며, 대한민국 특허출원 제2003-0085219호("락토바실러스 플란타룸을 유효성분으로 함유하는 어류양식용 사료 첨가제", 2003.11.27.출원)는 김치로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸을, 대한민국 특허출원 제2000-0047066호("양식어류의 사료첨가제용 미생물 제제 및 그 제조방법", 2000.08.14.출원)는 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 브레비스 및 엔테로코커스 훼시움 등을 각각 유효성분으로 함유하는 어류 양식용 사료첨가제에 관해 개시하고 있다. 그러나, 이러한 배합 또는 미생물 사료들에 대해 아직 양식 현장에서 이렇다 할 평가를 받고 있지는 못하는 실정이다.

한편, 미세조류의 생물학적인 막은 점액물질로 구성되어 있어 참전복(Haliotis discus hannai)과 같은 부착성 무척추동물 유생의 부착 기질로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 실제로 해양 미세조류는 양식 생물의 인공종묘생산을 위한 필수적인 먹이생물이다. 그러나 미세조류는 경제적, 기술적으로 대량배양이 어려우며, 먹이효율을 파악하기 어려운 문제점이 있다. 특히 포복성 무척추동물의 유생 사육을 위한 부착성 미세조류의 먹이효율에 대해서는 부유성 미세조류에 비해 상대적으로 충분한 연구가 되어 있지 않으며, 최근 대량 양식 기술이 개발된 전복의 경우에도 유생 시기에 적합한 부착성 미세조류의 선별과 대량 배양은 여전히 어려운 문제로 남아 있다. 그 이유는 부착하는 미세조류는 종에 따라 성장 특성이 다르고, 과다하게 부착할 경우 자체 무게를 견디지 못하고 탈락하므로 먹이부족 현상을 나타낼 수도 있기 때문이다. 부착 미세조류가 형성하는 막이 평면일 경우에는 참전복 유생의 높은 부착률을 유도하나 3차원적인 형상을 나타내는 종에서는 낮은 부착률을 보인다(Kawamura T and Kikuchi H. 1992. Effects of benthic diatoms on settlement and metamorphosis of abalone larvae. Suisanzoshoku 40, 403-409; Searcy-Bernal R. 1996. Boundary layers and abalone post-larval culture: preliminary studies. Aquaculture 140, 129-137; Roberts RD, Kawamura T and Handley CM. 2007a. Factors affecting settlement of abalone (Haliotis) larvae on benthic diatom films. J Shellfish Res 26, 323-334.). 또한, 일부 부착 규조류는 단단한 규각을 가지고 있어 유생의 낮은 소화율의 원인이 되기도 한다. 이와 같이 미세조류는 종에 따라 성장, 부착 및 영양 특성이 다르므로 파판에 부착된 양질의 미세조류 확보 여부는 참전복 종묘생산의 관건이라 볼 수 있다.

참전복의 경우 후기 유생의 사육에 관해서는 비교적 많은 보고가 있었으나, 부착 직후 초기 유생의 사육 등에 관한 보고는 충분하지 않은 실정이다. 또한 참전복 유생의 먹이효율에 대한 연구도 규조류에 주로 국한되어 있다.

이에 본 발명자들은 참전복의 초기 유생을 실험 생물로 선정하고, 그 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있는 규조류를 포함한 담녹조류 및 남조류 등의 다양한 미세조류를 대상으로 성장률과 부착률을 조사하고, 이들 미세조류로 사육한 참전복 초기 유생의 부착률, 변태율 및 초기 생존율 등을 비교 조사하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 부착률 및 성장률이 높은 미세조류를 포함한 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 부착률 및 성장률이 높은 미세조류를 이용하여 포복성 무척추동물의 유생을 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 미세조류(microalgae)를 포함하는 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 규조류, 담녹조류 및 남조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 미세조류 또는 미세조류 그룹일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 군으로부터 선택되는 미세조류가 둘 이상인 경우 바람직하게는 규조류 및 담녹조류로 이루어진 그룹, 규조류 및 남조류로 이루어진 그룹, 또는 규조류, 담녹조류 및 남조류로 이루어진 그룹이 될 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 포복성 무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼류, 성게류 및 군소류를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 전복류, 더욱 바람직하게는 참전복(Haliotis discus hannai)이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 미세조류는 Rhaphoneis sp. (KMMCC-628), Navicula sp. (KMMCC-841), Nitzschia sp. (KMMCC-962), Amphora sp. (KMMCC-773), Tetraselmis hazeni (KMMCC-62) Tetraselmis sp. (KMMCC-40) 및 Oscillatoria splendida (KMMCC-98) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 조류일 수 있으며, 바람직하게는 Rhaphoneis sp., Tetraselmis hazeni, 및 Oscillatoria splendida로 이루어진 군으로부터 선택되어 질 수 있다.

또한, 본 발명은 미세조류를 이용한 포복성 무척추동물 유생의 배양방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 규조류, 담녹조류 및 남조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 미세조류를 일정 농도로 배양하는 단계; 상기 배양이 이루어진 배양기에서 배양액만을 제거하고 여과해수를 채우는 단계; 및 상기 여과해수를 채운 배양기에 포복성 무척추동물 유생을 접종하는 단계를 포함할 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 포복성 무척추동물에는 전복류, 소라류, 해삼류, 성게류 및 군소류가 포함될 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포복성 무척추동물은 참전복이 될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 미세조류는 Rhaphoneis sp., Tetraselmis hazeni, 및 Oscillatoria splendida로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 조류일 수 있다.

본 발명은 규조류, 담녹조류 및 남조류의 참전복 유생의 초기 먹이생물로서의 이용가능성을 나타냈으며, 이러한 결과는 참전복 이외의 포복성 무척추동물에도 확장될 수 있을 것으로 예상된다. 따라서 참전복 유생을 포함한 포복성 무척추동물의 부착 및 변태 유발에 적합한 미세조류를 발견함으로써 각각의 포복성 무척추동물 유생에 적합한 미세조류 사료를 개발하는데 기여할 수 있다.

도 1은 다양한 미세조류 종(KMMCC-628: Rhaphoneis sp., KMMCC-77: Phaeodactylum tricornutum, KMMCC-841: Navicula sp., KMMCC-962: Nitzschia sp., KMMCC-773: Amphora sp., KMMCC-267: Cylindrotheca closterium, KMMCC-62: Tetraselmis hazeni, KMMCC-40: Tetraselmis sp., KMMCC-98: Oscillatoria splendida)들로 배양한 참전복(Haliotis discus hannai) 유생의 접종 후 4일 및 6일째의 변태율(%)을 보여준다. 막대그래프 위의 문자들은 유의차를 나타낸다(P<0.05).
도 2는 변태 후 참전복 유생의 생존율(%)을 보여준다(KMMCC-628: Rhaphoneis sp., KMMCC-77: Phaeodactylum tricornutum, KMMCC-841: Navicula sp., KMMCC-962: Nitzschia sp., KMMCC-773: Amphora sp., KMMCC-267: Cylindrotheca closterium, KMMCC-62: Tetraselmis hazeni, KMMCC-40: Tetraselmis sp., KMMCC-98: Oscillatoria splendida). 15일째의 다른 문자들은 유의차를 나타낸다(P<0.05).

본 발명은 전복을 포함한 포복성 무척추동물의 양식에 효과적으로 이용될 수 있는 미세조류(microalgae) 사료에 관한 것이다. 본 발명자들은 기존의 연구들을 토대로 경제적으로 중요성을 갖는 대표적인 포복성 무척추동물인 전복류 중 참전복(Haliotis discus hannai)을 실험 대상으로 선정하고, 그 초기 유생을 이용하여 부착기질 및 먹이생물로 이용될 수 있는 다양한 미세조류들의 성장률과 부착률을 조사한 후, 상대적으로 높은 성장률과 부착률을 나타내는 미세조류들을 선별하고, 이들 미세조류로 사육한 참전복 초기 유생의 부착률, 변태율 및 초기 생존율 등을 비교 조사하였다.

참전복 유생은 부화 후 약 96시간 이내에 기질에 부착하고 변태를 진행하며, 변태가 이루어진 개체는 바로 부착규조류를 먹이로 섭취하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 참전복 초기 유생의 먹이로 활용하기 위하여 성장이 빠르고 부착률이 높은 미세조류를 일차적으로 조사하였다(표 2). 규조류는 일반적으로 다른 미세조류에 비하여 부착률이 높은 종이 많으나 모든 미세조류는 부착기질에 어느 정도 부착한다. 또 영양학적인 관점에서 규조류는 일반적으로 지질의 함량이 높고 담녹조류는 단백질이, 남조류는 미네랄이 풍부하다. 따라서 본 연구에서는 규조류를 포함한 담녹조류와 남조류 가운데 먹이효율이 우수한 다양한 미세조류 종을 파악하는데 보다 중점을 두었다. 규조류의 성장형태는 점액질의 유무, 부착 형태, 운동성의 관점에서 8가지 형태로 나누어 설명할 수가 있고, 그 중 전복의 초기 먹이생물로써 유용한 것은 점액물질을 분비하면서 운동성이 적고 평면상의 모양인 것으로 알려져 있다(Kawamura T. 1994. Taxonomy and ecology of marine benthic diatoms. Marine Fouling 10, 7-25; Roberts RD, Kawamura T and Handley CM. 2007. Factors affecting settlement of abalone (Haliotis) larvae on benthic diatom films. J Shellfish Res 26, 323-334.).

본 발명의 일실시예에서 다양한 미세조류의 부착률과 성장률을 조사한 결과, 규조류의 부착률은 종에 따라 14 ~ 97%, 그 외 담녹조류와 남조류는 6 ~ 90%의 큰 범위의 차이를 보였다. 성장률도 규조류는 150 ~ 2,302%, 그 외 종류에서도 275 ~ 1,378%로 종에 따라 큰 차이를 보였다. 본 발명의 일실시예에서 규조류는 담녹조류나 남조류에 비해 전체적으로 부착률이 높았지만, 담녹조류의 Tetraselmis sp. (KMMCC-40)와 남조류의 O. splendida와 L. taylorii (KMMCC-30)는 83 ~ 90%의 높은 부착률을 보였다. 규조류에서는 Navicula 와 Amphora 류가 다른 속에 비해 생체량과 부착률이 높았다. 이와 같은 미세조류 종에 따른 성장률과 부착률의 조사 결과는 앞으로 부착성 유생의 먹이생물 개발 또는 부착 미세조류의 대량배양에 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.

규조류 가운데 Cocconeis scutellum 와 Navicula ramosissima 는 H. virginea와 H. discus hannai 유생에 높은 부착률을 유도한다고 보고되었다 (Kawamura T and Kikuchi H. 1992. Effects of benthic diatoms on settlement and metamorphosis of abalone larvae. Suisanzoshoku 40, 403-409; Roberts RD, Kawamura T and Handley CM. 2007. Factors affecting settlement of abalone (Haliotis) larvae on benthic diatom films. J Shellfish Res 26, 323-334). 본 발명의 일실시예에서 Rhaphoneis sp.는 24시간째에 98%의 가장 높은 부착률을 보였고 T. hazeni도 80%의 높은 부착률을 보였다. 96시간째에는 이 두 종이 유의적인 차이없이 65% 이상의 부착률을 보였던 점으로 보아, 담녹조류인 T. hazeni도 참전복 유생의 부착기질로 매우 적합한 종으로 판단된다(P<0.05). 변태율의 경우 참전복 유생은 Rhaphoneis sp.에서 57%로 가장 높았고 T. hazeni와 남조류 O. splendida는 다른 규조류보다도 높은 20 ~ 30%의 변태율을 보였다.

본 발명의 실시예에 따른 실험 결과 Rhaphoneis sp., T. hazeni, O. splendida가 참전복 유생의 부착과 변태에 가장 적합한 종으로 판단된다. 한편, P. tricornutum와 C. closterium 등의 규조류는 성장률이 높긴 하나 참전복 유생의 부착기질로는 적합하지 않은 것으로 평가될 수 있다. 본 실험에서 P. tricornutum와 C. closterium은 각각 344 um, 305 um까지 성장하고 전 개체가 사망한 것으로 보아 이 두 종의 규조류는 참전복 유생의 초기 먹이생물로 적합하지 않은 것으로 나타났다. 이와 같이 참전복 유생은 미세조류 종에 따라 큰 차이의 먹이효율을 보였는데, 이는 각 미세조류의 크기와 모양, 부착형태, 부착률, 부착강도 및 영양가 등이 유생의 부착과 성장에 영향을 주었기 때문으로 판단된다.

전복 유생은 변태 후, 적어도 2일 안에 입이 열리고 먹이를 섭취하기 시작하는데, 미세조류 이외에도 박테리아나 다른 세포외 물질을 섭취한다. 그러나 이와 같은 초미세 먹이보다는 규조류와 같은 미세조류에서 더욱 빠른 성장을 하는 것으로 보고된 바 있다(Garland CD, Cooke SE, Grant JF and McMeekin TA. 1985. Ingestion of the bacteria and the cuticle of crustose (non-articulated) coralline algae by post-larval juvenile abalone (Haliotis ruber Leach) from Tasmanian waters. J Exp Mar Biol Ecol 91, 137-149; Takami H, Kawamura T and Yamashita Y. 1997. Contribution of diatoms as food sources for post-larval abalone Haliotis discus hannai on a crustose coralline alga. Moll Res 18, 143-151; Roberts RD, Kawamura T and Nicholson CM. 1999. Growth and survival of post-larval abalone (Haliotis iris) in relation to development and diatom diet. J Shellfish Res 18, 243-250.). 또한, 참전복 유생은 각장 800 um에 이르기까지 영양원으로써 규조류 세포내의 물질보다 세포외 분비물을 효과적인 영양원으로 이용한다는 보고가 있다(Kawamura T and Takami H. 1995. Analysis of feeding and growth rate of newly metamorphoed abalone Haliotis discus hannai fed on four species of benthic diatom. Fish Sci 61, 357-358; Roberts RD, Revsbech NP and Damgaard LR. 2007. Effect of water velocity and benthic diatom morphology on the water chemistry experienced by post larval abalone. J Shellfish Res 26, 745-750.).

변태 후 참전복 유생의 입이 열렸을 때의 구경은 불과 10 um이므로 미세조류의 크기는 먹이 조건으로 중요하다(Kawamura T, Roberts RD and Nicholson CM. 1998. Factors affecting the food value of diatom strains for post-larval abalone Haliotis iris. Aquaculture 160, 81-88.). 본 실험에 사용된 미세조류 가운데 Rhaphoneis sp.를 제외한 다른 미세조류들은 모두 10 um 이상의 것이다. 본 실험에서 Rhaphoneis sp.의 먹이 효율이 가장 좋았던 이유는 유생이 변태 직후 직접 섭취할 수 있는 10 um이하의 소형 크기였기 때문이기도 하다.

변태 직후에는 난황으로부터 영양물질을 공급받으므로 먹이 종류에 따른 성장의 차이를 초기에는 관찰하기 어렵다(Kawamura T, Roberts RD and Nicholson CM. 1998. Factors affecting the food value of diatom strains for post-larval abalone Haliotis iris. Aquaculture 160, 81-88.). 또한, 유생 초기에는 소화 기관의 발달이 미약하여 먹이의 이용능력이 확실하지 않다(Roberts RD, Kawamura T and Nicholson CM. 1999. Growth and survival of post-larval abalone (Haliotis iris) in relation to development and diatom diet. J Shellfish Res 18, 243-250). 참전복 유생은 변태 후 10일 동안은 난황이 주 영양원이고 각장 400 um까지는 외부의 영양 공급이 없이도 성장한다(Takami H, Kawamura T and Yamashita Y. 2000. Starvation tolerance of newly metamorphosis abalone Haliotis discus hannai. Fish Sci 66, 1180-1182.). 본 연구에서도 Rhaphoneis sp.를 제외한 다른 종들과 먹이를 주지 않은 대조구 사이에서 변태 후 초기에서는 큰 차이를 확인하지 못하였는데 그 이유는 유생이 초기에는 다른 미세조류보다 난황을 영양분으로 이용하기 때문으로 판단된다. 미세조류를 먹이로 공급하지 않은 대조구에서 실험 종료시 500 um 정도까지 성장한 개체가 관찰되었고 생존율도 36%로 나타났던 이유도 해수내에 존재하는 미세한 박테리아나 용존 유기물 등이 미흡한 영양원으로 이용되었기 때문으로 판단된다.

상기와 같이 본 발명의 실시예를 통하여 참전복 유생의 부착 및 변태 유발에 적합한 미세조류를 개발함에 있어 규조류 이외에 담녹조류나 남조류도 참전복 유생의 초기 먹이생물로 가능성이 있음을 알 수 있었으며, 특히 담녹조류의 높은 단백질과 남조류의 풍부한 미네랄은 참전복 유생의 성장 변태시 주구각 형성과 성장에 좋은 영향을 미칠 것으로 판단된다. 본 발명의 실시예에 따른 실험 결과, 참전복 유생 사육에 가장 적합한 미세조류는 규조류의 Rhaphoneis sp.라 할 수 있으나 담녹조류의 T. hazeni와 남조류의 O. splendida도 Rhaphoneis sp.와 함께 혼합하여 활용할 경우 더 큰 효과를 거둘 수 있다는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은 규조류, 담녹조류 및 남조류로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 미세조류를 포함하는 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물에는 상기 미세조류 이외에도 종래 포복성 무척추동물의 먹이로 알려져 있는 생물, 영양분 또는 그것을 재료로 한 사료 첨가물을 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 전복 유생 배양용 사료 조성물에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 파래류 분말, 북양백색어분, 대두박, 콘글루텐밀, 소맥분, 감자전분 및 선인장 줄기 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 북양백색어분(魚粉)은 고가의 카제인을 대체할 수 있는 경제적인 동물성 단백질원으로 제공될 수 있으며, 이를 보충하기 위하여 대두박과 콘글루텐밀 등을 사용할 수 있다. 상기 소맥분과 감자전분은 탄수화물원으로 사용될 수 있으며, 선인장 줄기는 식이섬유질이 풍부한 점착제로서 값비싼 알긴산 나트륨을 대체하여 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 사료 조성물에는 비타민, 미네랄, 라이신 등이 포함될 수 있다. 상기 비타민은 아스코르브산, a-토코페릴 아세테이트, 티아민 , 피리독신, 니아신, Ca-D-pantothenate, myo-inositol, D-biotin, folic acid, p-amino benzoic acid, 비타민 K3, 비타민 A, 비타민 D3, choline chloride, cyanocobalamin 등이 포함된 혼합물을 셀룰로오스에 희석시켜 사용될 수 있으며, 상기 미네랄은 NaCl, MgSO47H2O, NaH2PO42H2O, KH2PO4, CaH4(PO4)2H2O, Ferric citrate, ZnSO47H2O, Calactate, CuCl, AlCl36H2O, KIO3, Na2Se2O3, MnSO4H2O, CoCl26H2O 등이 포함된 혼합물의 형태로 첨가될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 배양용 사료 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 배양용 사료에 있어 미세조류 또는 사료 첨가물의 조성은 각각의 생물종에 특이적으로 성장률, 생존율 및 부착률 등을 고려하여 결정될 수 있으며, 특히 전복은 사료를 치설을 통하여 갉아먹기 때문에 사료의 수중 보존시간도 고려할 필요가 있다. 한편, 본 발명에 따른 배양용 사료 조성물은 포복성 무척추동물 유생 양식의 주 사료로 제공되는 것으로서, 그 사용 함량은 수온 및 대상 유생의 밀도에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

미세조류의 선별

<1-1> 미세조류의 성장률 및 부착률 측정

미세조류는 부경대학교 한국해양미세조류은행에서 보유하고 있는 종 중에서 참전복의 먹이생물로 이용 가능할 것으로 판단되는 31종의 미세조류(규조류 24종, 담녹조류 3종, 남조류 4종)를 분양받아 미세조류의 성장률과 부착률을 조사하였다(표 1 참조).

본 발명의 실시예에 사용된 미세조류

그룹	KMMCC NO.	종(Species)	길이(Length) (um)
A	493	Achnanthes sp.	27±3.9
	931	Amphiprora gigantea var. sulcata	42±6.7
	714	Amphora delicatissima	18±2.3
	935	Amphora delicatissima	25±2.7
	716	Amphora lineata	22±1.5
	773	Amphora sp.	23±3.3
	823	Amphora sp.	12±1.0
	939	Amphora veneta var. coffeaeformis	19±3.0
B	941	Navicula annexa	21±1.8
	905	Navicula cancellata	23±2.2
	893	Navicula elegans	14±1.2
	17	Navicula incerta	39±1.7
	919	Navicula viridis	19±1.9
	957	Navicula sp.	11±1.2
	841	Navicula sp.	16±4.2
C	900	Caloneis schroder	21±2.5
	833	Cocconeis californica	24±9.1
	267	Cylindrotheca closterium	34±3.9
	26	Nitzschia dissipata	26±1.0
	962	Nitzschia sp.	24±1.0
	77	Phaeodactylum tricornutum	17±1.8
	847	Pleurosigma angulatum	56±8.6
	628	Rhaphoneis sp.	9±1.7
	268	Trachyneis aspera	26±3.3
D	62	Tetraselmis hazeni	15±3.8
	109	Tetraselmis sp.	13±2.6
	40	Tetraselmis sp.	13±2.4
E	30	Lyngbya taylorii	4±0.6*
	98	Oscillatoria splendida	2±0.3*
	34	Phormidium luridum	2±0.2*
	180	Trichodesmium erythraeum	5±0.2*

KMMCC : Korea Marine Microalgae Culture Center. * : width (um)

미세조류의 성장률과 부착률을 측정하기 위하여 14 L 원형 아크릴 수조에 부착기질로서 19x16x0.1cm 의 아크릴 파판 5장을 넣고 10 L의 f/2 배지(Guillard RRL and Ryther JH. 1962. Studies of marine plankton diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve). Gran Can J Microbiol 8, 229-239.)를 채운 후, 충분히 배양된 대수 성장기의 미세조류를 10% 되게 접종하였다. 수조내의 부착기질의 면적은 수조벽면(1,583 cm²)과 바닥(451cm²) 그리고 파판(3,075cm²)으로 총 부착면적은 5,109 cm²였다. 미세조류는 23℃, 40 umol m^-2s^-1, 연속조명의 조건에서 2주간 통기 배양으로 실험하였다.

2주간 배양된 미세조류의 성장률과 부착률을 측정하기 위해 먼저 부착되지 않은 세포를 GF/C 필터로 수거하고, 수조의 바닥, 벽면 및 파판에 부착되어 있는 세포를 부드러운 붓을 이용해 탈락시켜서, 부착되지 않은 세포와 부착된 세포를 각각 GF/C 필터로 여과하여 수확하였다. 수확한 미세조류는 60℃ 건조기에서 2시간 각각 건조시킨 후, mg 단위로 건조중량을 측정하였다. 미세조류의 부착률과 성장률은 다음 공식으로 계산하였다.

부착률(%) = 부착된 미세조류 중량/총 미세조류 중량x100

성장률(%) = (n₁-n₀) / n₀x100 (n₁: 최종 수확량(mg), n₀: 최초 접종량(mg))

모든 실험 결과는 One-way ANOVA test를 실시하였으며, 평균간의 유의성(P<0.05)은 Duncan's multiple range test (Duncan DB. 1955. Multiple-range and multiple F test. Biometrics 11, 1-42.)로 하였다. 모든 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., 2008; Ver. 17) program을 사용하였다.

<1-2> 결과

그룹별 미세조류의 성장률과 부착률을 조사한 결과(표 2), A 그룹 규조류의 생체량은 Amphiprora gigantea var. sulcata (18.1 mg)와 Amphora sp. (KMMCC-823, 12.1 mg) 사이에만 유의적인 차이가 있을 뿐, 나머지 종에서는 유의적인 차이가 없었다(P<0.05). 그러나 부착률에서는 Amphora sp. (KMMCC-773)가 97%로 유의적으로 가장 높았고, Achnanthes sp.는 14%로 가장 낮았다. 성장률은 Amphora sp. (KMMCC-823)와 A. veneta var. coffeaeformis가 각각 642%와 593%로 최고값을, Achnanthes sp.는 150%로 최저값을 나타내었다(P<0.05).

미세조류의 최종 총 생체량(mg), 증가율 및 부착률(%)

그룹	종(Species)	최종 총 생체량	증가율	부착률
A	Achnanthes sp.	12.8±5.4ab	150±106.9e	14±1.9e
	Amphiprora gigantea var. sulcata	18.1±1.4a	363±36.2cd	44±3.5c
	Amphora delicatissima	17.0±2.2ab	254±45.8de	66±6.1b
	Amphora delicatissima	16.8±0.4ab	240±7.2de	39±11.1cd
	Amphora lineata	16.8±0.4ab	430±11.2c	31±5.3cd
	Amphora sp. (KMMCC-773)	17.3±0.1ab	498±2.4bc	97±1.6a
	Amphora sp. (KMMCC-823)	12.1±1.6b	642±100.1a	24±10.9de
	Amphora veneta var. coffeaeformis	15.9±0.4ab	593±15.5ab	42±5.4c
B	Navicula annexa	22.9±1.9a	487±49.1c	64±7.5ab
	Navicula cancellata	25.3±4.4a	359±79.6c	43±2.6c
	Navicula elegans	25.5±6.0a	843±222.7b	57±4.9b
	Navicula incerta	26.1±4.5a	592±112.1bc	71±8.6a
	Navicula viridis	23.2±1.1a	606±32.4bc	71±5.1a
	Navicula sp. (KMMCC-957)	21.3±0.1a	1,826±6.4a	69±5.1ab
	Navicula sp. (KMMCC-841)	23.2±1.1a	838±45.7b	72±0.2a
C	Caloneis schroder	15.1±0.4a	262±30.1def	72±4.8bc
	Cocconeis californica	8.0±0.0c	217±25.4ef	69±1.8bc
	Cylindrotheca closterium	13.7±0.7b	2,302±128.5a	24±3.6e
	Nitzschia dissipata	8.4±0.5c	161±3.6f	67±2.8c
	Nitzschia sp.	16.1±0.5a	1,057±2.0b	30±1.3de
	Phaeodactylum tricornutum	6.7±0.0d	901±53.9c	37±5.3d
	Pleurosigma angulatum	6.2±0.3d	257±43.0def	77±3.9ab
	Rhaphoneis sp.	8.4±0.1c	389±67.0d	80±2.4a
	Trachyneis aspera	7.2±1.0cd	360±76.7de	36±0.9d
D	Tetraselmis hazeni	13.6±1.8a	275±42.5b	69±12.1a
	Tetraselmis sp. (KMMCC-109)	12.5±1.3a	432±44.6ab	17±1.0b
	Tetraselmis sp. (KMMCC-40)	15.2±3.7a	593±149.0a	87±0.1a
E	Lyngbya taylorii	10.1±0.7bc	676±52.6a	83±3.7a
	Oscillatoria splendida	14.5±0.2a	863±10.9a	90±1.2a
	Phormidium luridum	7.7±2.8c	1,378±539.4a	11±4.8b
	Trichodesmium erythraeum	12.3±0.4ab	996±31.6a	6± 1.0b

각각의 미세조류 그룹에 의한 같은 항목의 다른 문자들은 유의차를 의미(P<0.05).

B 그룹 Navicula 속의 생체량은 21.3 ~ 26.1 mg으로 종간의 유의적인 차이가 없었다. 그러나 부착률에서는 N. incerta, N. viridis, Navicula sp. (KMMCC-841)가 71 ~ 72%로 N. cancellata, N. elegans보다 유의적으로 높았다(P<0.05). 성장률에서는 Navicula sp. (KMMCC-957)가 1,826%로 유의적으로 가장 높았다(P<0.05).

C 그룹 규조류의 생체량은 Nitzschia sp.와 Caloneis schroder가 15 ~ 16 mg으로 유의적으로 가장 높았고 Phaeodactylum tricornutum과 Pleurosigma angulatum은 6 mg으로 가장 낮았다(P<0.05) 부착률에서는 Rhaphoneis sp.와 P. angulatum이 77 ~ 80%로 가장 높았고, 생체량이 비교적 높았던 C. closterium은 24%로 가장 낮았다. 그러나 성장률에서는 C. closterium이 2,302%로 가장 높았다(P<0.05).

D 그룹 담녹조류 3종의 생체량은 12 ~ 15 mg으로 유의적인 차이가 없었고, Tetraselmis sp. (KMMCC-40)의 부착률은 83%로 다른 Tetraselmis sp. (KMMCC-109, 13%)에 비하여 유의적으로 매우 높은 부착률을 보였고, 성장률도 593%로 최고값을 나타내었다.

E 그룹 남조류의 생체량은 Ocillatoria splendida가 14.5 mg으로 가장 높았고 Phormidium luridum은 7.7 mg으로 가장 낮았다. 부착률에서는 O. splendida와 Lyngbya taylorii가 각각 90%와 83%로 유의적으로 가장 높았으나 Trichodesmium erytheaeum은 6%로 매우 낮았다. 그러나 성장률은 676 ~ 1,378%로 4종 모두 유의적인 차이를 보이지 않았다(P<0.05).

<실시예 2>

참전복 유생의 부착률, 변태율 및 생존율 조사

<2-1>

수온 21℃에서 난과 정자를 수정시킨 후 56시간이 지난 참전복 veliger 유생을 실험에 사용하였다. 상기 실시예 1에서 부착률과 성장률이 높았던 9종의 미세조류를 대상으로 조사하였다. f/2 배지 10 mL를 6-well tissue culture chamber에 넣고, 각 종의 미세조류를 약 10% 접종량 수준으로 접종한 후, 20℃, 40 umol m^-2s^-1 연속조명하에서 10일간 정체 배양하였다.

유생 실험은 각 미세조류가 배양, 부착된 chamber를 유생 사육조로 사용하였다. Chamber에 유생을 넣기 전, 배양액을 제거하고 남아 있는 배지의 성분을 없애기 위해서 부착된 미세조류가 탈락되지 않도록 여과해수로 충분히 행궈준 후, 10 mL의 여과해수를 채우고 유생을 30개체씩 접종하였다. 참전복 유생의 실험을 시작할 때 chamber에 부착한 각 미세조류의 밀도는 약 5~10x10⁴ cells/mL 되게 유지하였다. 유생은 20℃, 40 umol m^-2s^-1, 광주기는 8(L):16(D) 조건에서 15일간 사육하였고 유생의 부착이 완료된 시점부터는 매일 5 mL 씩 여과해수로 교환해 주었다. 대조구로는 미세조류가 없이 여과해수만 채웠고 모든 실험구는 6반복으로 하였다.

유생의 부착 및 변태는 해부현미경으로 확인하였다. 면반으로 부착기질에 부착한 유생을 부착 개체로, 부착후 유각이 없어지고 주구각이 생긴 유생을 변태한 개체로 간주하였다. 유생의 변태가 진행되기에 충분한 시간이 흐른 후에도 변태가 되지 않은 유생은 모두 제거하였다. 유생의 부착률은 7반복, 변태율과 변태후 생존율은 2반복으로 조사하였다. 유생의 생존은 해부현미경으로 매일 체크하여 죽은 개체는 즉시 제거하였다. 10초 동안 어떤 움직임도 없어 고정되어있거나, 심장의 뜀을 관찰할 수 없는 개체는 죽은 개체로 간주하여 변태 후 생존율을 측정하였다.

부착률(%) = (부착 직후 개체수 / 초기 접종 개체수) x100

변태율(%) = (변태 직후 개체수 / 부착 직후 개체수) x100

생존율 (%) = (생존 개체수 / 변태 직후 개체수) x100

모든 실험 결과는 One-way ANOVA test를 실시하였으며, 평균간의 유의성(P<0.05)은 Duncan's multiple range test (Duncan, 1955)로 하였다. 모든 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., 2008; Ver. 17) program을 사용하였다.

<2-2>

상기 실시예 1에서 부착력이 높고 성장이 빠른 9 종류의 미세조류를 선택하여 참전복 유생에 대한 먹이효율을 조사하였다. 유생은 실험 시작 1 시간 후부터 부착기질에 대한 반응을 보이며 부착활동을 시작하였다. 부착률은 전반적으로 12시간이 지났을 때 전 실험구에서 높게 나타나기 시작하여 24시간 때에는 기장 높았으며 그 이후에는 부착 유생의 사망으로 지속적으로 감소하는 경향을 보였다. 그러나 대조구에서는 96시간이 될 때까지 조금씩 꾸준히 증가하는 경향을 보였다(표 3).

여러 미세조류 종들에 대한 참전복(Haliotis discus hannai) 유생의 부착률(%)

미세조류	접종 후 시간
	1 hrs	6 hrs	12 hrs	24 hrs	48 hrs	72 hrs	96 hrs
Control	4.4±1.7ab	19.8±5.3cd	35.8±7.5e	36.4±9.2f	35.0±3.6d	38.8±4.7c	39.3±4.8de
Rhaphoneis sp.	4.9±2.1a	21.7±5.9bcd	51.1±11.5bc	98.3±1.9a	95.3±3.1a	86.8±3.6a	65.3±9.7ab
Phaeodactylum tricornutum	6.4±2.0a	5.7±2.1e	31.1±7.4e	42.2±14.9ef	34.8±14.3d	23.0±12.5d	21.2±9.3f
Navicula sp. (KMMCC-841)	5.3±3.0a	34.5±4.8a	53.3±7.0abc	65.7±5.9cd	64.5±6.6bc	64.4±6.4b	52.6±12.1c
Nitzschia sp.	4.9±1.7a	28.2±7.2ab	61.1±5.4ab	91.2±2.6a	87.3±5.6a	45.1±5.9c	49.7±7.0cd
Amphora sp. (KMMCC-773)	2.1±2.5bcd	27.7±7.5b	33.2±8.5e	64.8±5.5cd	65.8±7.1bc	59.4±4.0b	39.2±6.3de
Cylindrotheca closterium	1.6±1.8cd	16.1±3.1d	20.8±7.7f	46.2±3.2e	30.8±10.5d	29.4±9.2d	23.9±7.8f
Tetraselmis hazeni	4.3±1.8ab	25.2±8.6bc	48.6±13.3cd	79.6±7.1b	58.1±9.1c	64.8±10.6b	68.6±10.7a
Tetraselmis sp.(KMMCC-40)	0.6±1.3d	4.0±1.4e	38.7±9.5de	57.3±6.9d	37.6±10.5d	40.2±9.0c	34.6±10.5e
Oscillatoria splendida	3.9±1.4abc	17.2±4.4d	63.2±5.9a	69.0±3.5c	69.8±5.9b	66.3±7.3b	56.8±5.7bc

동일한 열의 다른 문자들은 유의차를 의미(P<0.05).

24시간이 지난 후, P. tricornutum을 제외한 모든 실험구의 부착률은 대조구 보다 높게 나타났으며, Rhaphoneis sp.과 Nitzschia sp.가 각각 98%와 91%로 가장 높았다(P<0.05). 그 외에는 Tetraselmis hazeni가 80%로 높게 나타났다. 96시간이 지난 후 유생의 부착률은 T. hazeni와 Rhaphoneis sp.가 각각 69%와 65%로 유의적으로 가장 높은 반면, P. tricornutum와 C. closterium은 대조구보다도 낮은 결과를 보였다(P<0.05). Nitzschia sp.의 실험구는 24시간째는 91%로 Rhaphoneis sp.와 같은 수준의 높은 부착률을 보였으나, 그 후로 급격히 감소하여 96시간째 부착률은 50%로 크게 감소하였다.

유생의 변태율은 Rhaphoneis sp. 실험구에서 실험 4일과 6일째에 각각 39%와 57%로 다른 실험구에 비해 유의적으로 가장 높았고(P<0.05) 다음으로는 O. splendida, T. hazeni의 순이었다. C. closterium,은 실험 4일과 6일째 각각 0.5%와 1.5%의 변태율을 보여 대조구보다도 유의적으로 낮았다(도 1).

변태 후 15일째 유생의 생존율을 보면, Rhaphoneis sp.을 공급한 실험구에서 67%로 다른 실험구보다 유의적으로 높았다(P<0.05, 도 2). 또한 15일째의 생존율은 Rhaphoneis sp., T. hazeni (42 %) 및 O. splendida (35%)를 제외한 다른 모든 실험구는 대조구보다도 낮은 값을 나타내었다(P<0.05). C. closterium과 P. tricornutum에서는 각각 2일과 4일째에 전 개체가 사망하였다. 낮은 생존율로 미세조류 종에 따른 유생의 성장 차이는 분석되지 못했다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 규조류로서 Rhaphoneis sp.를 포함하는, 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 포복성 무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼류, 성게류 또는 군소류인 것을 특징으로 하는 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 포복성 무척추동물은 참전복(Haliotis discus hannai)인 것을 특징으로 하는 포복성 무척추동물 유생 배양용 사료 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 규조류로서 Rhaphoneis sp.를 배양하는 단계;
   상기 배양이 이루어진 배양기에서 배양액만을 제거하고 여과해수를 채우는 단계; 및
   상기 여과해수를 채운 배양기에 포복성 무척추동물 유생을 접종하는 단계를 포함하는, 포복성 무척추동물 유생의 배양방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 포복성 무척추동물은 전복류, 소라류, 해삼류, 성게류 또는 군소류인 것을 특징으로 하는 포복성 무척추동물 유생의 배양방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 포복성 무척추동물은 참전복(Haliotis discus hannai)인 것을 특징으로 하는 포복성 무척추동물 유생의 배양방법.
9. 삭제

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