KR101861579B1 - 컴파운드 k를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 컴파운드 K가 각막의 손상을 억제하고, 손상에 의한 각막 세포의 사멸을 억제하는 것을 통해 각결막염 치료 효과가 있음을 확인하였고, 이에 본 발명의 컴파운드 K를 각결막염 치료제로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising compound K for preventing or treating of keratoconjunctivitis}

본 발명은 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

눈은 인간에게 가장 중요한 감각기관들 중 하나이다. 눈의 앞 표면은 각막(cornea) 또는 결막(conjunctiva)으로 되어 있고, 그 뒤쪽은 공막(sclera)으로 되어 있으며, 중간에 홍채(iris)와 모양체(ciliary body)로 구성되어 있다. 안쪽은 망막(retina)과 맥락막(choroid)으로 이루어져 있으며, 수정체(lens)와 유리체(vitreous body) 및 안방수(aqueous humor)는 굴절 매질에 해당된다. 눈의 기능적 장애 또는 상실은 생활의 질을 떨어뜨리는 가장 큰 요인이며, 노화와 더불어 안구 질환, 기타 질환 및 환경적 영향들에 의해 눈의 기능 저하 및 상실이 발생하므로 눈 건강을 유지 및 관리하는 것이 중요하다.

각결막염(keratoconjunctivitis)은 세균, 바이러스, 알레르기 또는 환경적 요인에 의해 각막과 결막에 발생하는 염증 질환으로서, 가장 일반적으로 발병되는 안구 질환이다(Lee, H.B., 2004). 감염성 각결막염은 바이러스나 세균에 감염되어 발생하는 것으로, 유행성 각결막염 또는 급성 각결막염으로 나뉘며, 병원균의 종류에 따라 바이러스성 각결막염, 세균성 각결막염, 진균성 각결막염, 클라미디아성 각결막염, 리케치아 각결막염 및 기생충성 각결막염 등으로 나뉜다. 감염성 각결막염은 결막에서부터 시작하여 각막까지 염증이 생기며, 심한 통증, 눈물, 화농성 눈곱이 생기고 심하면 시력의 감퇴가 일어난다. 이러한 감염성 각결막염은 전염성이 강하다.

비감염성 각결막염은 외부 손상에 의하여 발생하는 각결막염 또는 알레르기성 각결막염을 말한다. 외부 손상에 의한 각결막염은 직접적인 각막 손상, 산(acid)또는 염기(base)에 의한 손상, 화상에 의한 손상, 또는 콘택트렌즈 착용 등에 의해 나타날 수 있다. 알레르기성 각결막염은 결막에 알레르기 반응이 일어나는 질환으로서 고초열성 결막염, 춘계 각결막염 및 아토피성 각결막염 등의 즉시형 과민반응과 플릭텐성 각결막염(phlyctenulosis) 및 접촉성 안검염에 의한 결막염 등의 지연형 과민반응이 있다.

이러한 각결막염 치료 방법으로는 항생제를 이용한 치료와 항히스타민제, 글루코코르티코이드 등의 스테로이드제 또는 알레르기 예방 및 차단제 등을 사용하고 있다. 그러나 항생제의 경우에는 감염된 세균에 대한 살균력은 있으나 염증 억제 효과는 기대하기 어려우며, 스테로이드성 약물의 경우에는 장기간 사용에 따른 부작용들이 나타날 수 있다. 특히, 글루코코르티코이드 성분을 함유하는 약물을 장기적으로 사용할 경우에는 안압 상승으로 인한 녹내장, 백내장 또는 세균성 감염 등의 부작용을 유발하기 쉽다. 이에, 부작용이 없으면서 각결막염을 효율적으로 예방 및 치료할 수 있는 치료제의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

건강식품의 대명사로 불리우는 인삼의 주요 유효성분은 사포닌으로 인삼에만 들어있는 사포닌을 진세노사이드(ginsenoside)라고 한다. 이러한 진세노사이드는 비활성형 상태로 물에 대한 용해성이 높은 반면에 장내에서 흡수가 잘 되지 않아 생리학적 활성은 거의 없는 것으로 알려져있다. 그러나 이러한 비활성형 상태의 진세노사이드로부터 당이 떨어져 나가 활성형 상태로 전환되면 물에 잘 녹지 않는 대신 인체 내 흡수도가 높아져 생리학적 효과를 발휘하게 된다.

컴파운드 K(compound K)는 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성 물질로 활성형 상태의 진세노사이드이나, 그 제조가 상당히 까다로워 대량으로 제조하기 어려운 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은, 인삼류 사포닌 성분 중 하나인 컴파운드 K를 고순도로 제조하는 방법을 개발하였으며, 이를 통해 분리한 컴파운드 K를 이용하여 안구 질환 치료 효과를 확인하는 과정에서, 컴파운드 K의 각결막염 치료 효과가 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래선행기술인 한국공개특허 제2013-0117063호에는 컴파운드 K를 포함하는 안구 건조증 개선용 조성물이 기재되어 있고, 한국공개특허 제2009-0123195호에는 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 시력 개선용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 각결막염 치료 효과는 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한 한국등록특허 제1717672호에는 컴파운드 K를 포함하는 점안용 제제가 기재되어 있으나, 본 발명의 각결막염 치료 효과가 전혀 기재 및 언급되어 있지 않다.

한국공개특허 제2013-0117063호, 프로토파낙사디올계 화합물을 포함하는 외용제 조성물, 2013. 10. 25. 공개. 한국공개특허 제2009-0123195호, 시력 개선용 조성물, 2009. 12. 02. 공개. 한국등록특허 제1717672호, 난용성 유효 약리성분을 가용화시켜 균질용액으로 형성되는 주사제 또는 점안용 제제 그리고 이의 제조방법, 2017. 03. 13. 등록.

Lee, H.B., Common eye diseases in the primary health care, J. Korean Med. Assoc., 47(6), 535-542, 2004.

본 발명의 목적은 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 컴파운드 K(compound K)를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 약학 조성물은 컴파운드 K, 계면활성제, 키토산 및 염기성 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 컴파운드 K에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계; 상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 열처리 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계; 상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및, 상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조된 약학 조성물일 수 있다.

상기 제1단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100) 및, 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 제2단계의 열처리 가용성 키토산은, i) 수용성 키토산을 pH 1인 용액에 녹여 고온증기멸균하는 단계; 및 ii) 상기 i) 단계의 용액에 염기성 용액을 넣어 중성화 시키는 단계; 를 통해 제조된 것일 수 있다.

상기 제3단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 컴파운드 K는 0.5~20㎎/㎏을 투여할 수 있다.

상기 각결막염은 감염성 각결막염 또는 비감염성 각결막염일 수 있다.

상기 약학 조성물은 정제, 과립제, 산제 또는 액제 제형일 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 컴파운드 K는 인삼의 사포닌 성분인 진세노사이드 중 하나로, 진세노사이드의 최종 대사물질이자 생리활성 물질로, 인삼 추출물로부터 분리할 수 있다.

상기 인삼은 산삼, 산양삼, 배양근, 수인삼, 화기삼, 전칠삼 및 인삼의 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나 이에 한정되지 않는다.

상기 인삼 추출물은 인삼을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다. 바람직하게는 에탄올이다.

또한, 상기 인삼 추출물은 컴파운드 K의 함량을 증가시키기 위해 가수분해효소를 처리하여 컴파운드 K의 함량 비율이 50% 이상인 인삼 농축물일 수 있다. 상기 가수분해효소 처리는 1회 이상 반복하여 수행할 수 있고, 가수분해효소 처리 횟수가 증가할수록 컴파운드 K의 함량 비율이 높은 인삼 농축물을 얻을 수 있다.

상기 가수분해효소는 펙티나아제(pectinase), β-글리코시다제(β-glucosidase), α-글루코시다제, 셀룰라아제(cellulase), 셀루클라스트(celluclast), 비스코자임(viscozyme) 등이며, 바람직하게는 펙티나아제이다. 그러나 이에 한정되지 않는다.

상기 컴파운드 K는 인삼 추출물을 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수 있으며, 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 실리카겔 진공 액체 컬럼 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피(preparative reversed-phase high performance chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 컴파운드 K는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.

상기 약학 조성물은 컴파운드 K, 계면활성제, 키토산 및 염기성 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물은 컴파운드 K에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계; 상기 1차 혼합물에 에탄올 넣은 후, 열처리 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계; 상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및, 상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계; 로 이루어진 과정을 통해 제조한 약학 조성물일 수 있다.

상기 약학 조성물의 제조 과정은 난용성 물질인 컴파운드 K를 가용화 시키기 위한 방법일 수 있다.

상기 가용화(solubilization)는 물에 잘 녹지 않은 물질의 용해도가 증가하는 현상을 말하는 것으로, 난용성 물질인 본 발명의 컴파운드 K의 용해도를 높이기 상기 가용화 방법을 이용할 수 있다.

상기 제1단계의 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 트리톤 X-100, 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 계면활성제는 난용성 물질 대비 0.01중량% 이상으로 첨가될 수 있다.

상기 제2단계의 열처리 가용성 키토산은, 수용성 키토산의 용해성을 증가시키고, 균일성을 높이기 위한 것으로, i) 수용성 키토산을 pH 1인 용액에 녹여 고온증기멸균하는 단계; 및 ii) 상기 i) 단계의 용액에 염기성 용액을 넣어 중성화 시키는 단계; 를 통해 제조할 수 있다.

상기 pH 1인 용액은 아세트산(acetic acid)일 수 있다. 바람직하게는 0.1M 아세트산이다.

상기 열처리 가용성 키토산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~10%[w/v]가 포함될 수 있다. 열처리 가용성 키토산의 함량이 0.1% 미만일 경우에는 분산력을 부여하기 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 10% 초과일 경우에는 과도한 점성으로 오히려 균일성이 떨어지며, 제조 용량이 증가하면 혼합하기도 어렵고, 경제적으로도 바람직하지 못하다.

상기 제3단계의 염기성 아미노산은 용해 보조제로 활용하는 것으로, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다.

상기 염기성 아미노산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~4%[w/v]가 포함될 수 있다. 염기성 아미노산의 함량이 0.1% 미만일 경우에는 용해성을 보조하기가 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 4% 초과일 경우에는 과도한 점성으로 인해 겔화가 될 수 있으며, 경제적으로도 바람직하지 못하다.

상기 약학적 조성물은 상기 컴파운드 K 및 부형제를 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 컴파운드 K는 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 컴파운드 K에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 상기 컴파운드 K의 양이 0.5㎎/㎏ 내지 20㎎/㎏가 되도록 투여할 수 있다. 바람직하게는 0.5㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏이며, 가장 바람직하게는 0.5㎎/㎏ 내지 2㎎/㎏이다. 상기 컴파운드 K를 0.5㎎/㎏ 미만으로 투여하는 경우에는 각결막염 치료 효과가 거의 없고, 20㎎/㎏ 초과로 처리하는 경우에는 투여 부위의 염증반응이나 과민반응이 나타날 수 있어, 바람직하지 못하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사, 피부 도포 및 점안에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

상기 각결막염은 감염성 각결막염 또는 비감염성 각결막염일 수 있다.

상기 감염성 각결막염은 바이러스성 각결막염, 세균성 각결막염, 진균성 각결막염, 클라미디아성 각결막염, 리케치아 각결막염 및 기생충성 각결막염일 수 있다.

상기 비감염성 각결막염은 외부 손상에 의한 각결막염 및 알레르기성 각결막염 일 수 있다.

상기 외부 손상은 직접적인 각막 손상, 산(acid) 또는 염기(base)에 의한 손상, 화상에 의한 손상 또는 콘택트렌즈 착용에 의한 손상일 수 있다.

상기 알레르기성 각결막염은 고초열성 결막염, 춘계 각결막염, 아토피성 각결막염, 플릭텐성 각결막염 또는 접촉성 안검염일 수 있다.

본 발명은 컴파운드 K를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 컴파운드 K가 각막의 손상 및 각막 세포의 사멸을 억제하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 컴파운드 K를 이용하여 각결막염 치료 효과가 우수한 치료제를 개발 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 컴파운드 K의 단독 피크를 보여주는 것으로, 인삼 추출물로부터 컴파운드 K가 분리되었다는 것을 알 수 있다.
도 2는 본 발명의 컴파운드 K의 각결막염 치료 효과를 보여주는 것으로, (A)는 각결막염 손상에 따른 검은 점의 정도를 관찰한 결과를, (B)는 전체 안구의 검은 점의 정도를 5등급으로 나누어 분석한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 컴파운드 K의 각막 세포의 사멸 억제 효과를 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 컴파운드 K의 제조>

실시예 1-1. 1차 CKS의 제조

본 발명에서 사용된 인삼은 산양삼으로 함양군에 소재하는 심마니산삼영농조합으로부터 구입하여 사용하였다.

산양삼을 공기가 제거되어 증기로 채워진 자동온습도조절 장치를 이용하여 121℃에서 10분간 다공성 선반에 적재하여 수분이 밑으로 떨어지도록 하여 과량의 수분을 제거하면서, 1.1㎏/㎠ 압력 하에서 증기에 노출시켜 열처리하였다. 열처리된 산양삼을 통기 밸브를 열어 공기를 주입하면서 90℃ 이하로 식히고, 다시 동일한 조작을 2회 더 반복하여, 활성형 인삼을 제조하였다.

상기에서 제조된 활성형 인삼 60g을 1㎜ 이하의 입자로 잘게 파쇄하여 건조한 후, 80%[v/v] 에탄올(주정알코올) 300㎖을 첨가하고 열을 가해 추출물을 얻었다. 추출물을 500㎛ 입자 여과지를 이용해 고형물을 제거하여 활성형 진세노사이드를 확보하였다.

상기에서 확보한 활성형 진세노사이드를 회전 농축기(rotatory evaporator)로 농축하여 활성형 진세노사이드 농축물을 획득하였다. 획득한 활성형 진세노사이드 농축물을 95%[v/v] 에탄올을 이용하여 0.23%[w/v]의 활성형 진세노사이드 현탁액을 제조한 후, 오염에 의해 유해균이 발생하는 것을 방지하기 위해 50℃ 이상이 유지되도록 하여 보관하였다.

2.4% 펙티나아제(pectinase)(상품명 Rapidase, DSM food, 네덜란드)가 포함된 수용액(효소액)을 온도 자동장치를 이용하여 50℃로 온도를 유지하고, 튜브 연동식 펌프(Peristaltic pump)를 이용하여 상기 활성형 진세노사이드 현탁액을 효소액에 50㎖/min의 속도로 한 방울씩 연속하여 주입하였다. 효소액과 활성형 진세노사이드 현탁액 혼합물을 원심 분리하여 침전물을 수거한 후, 수거한 침전물을 95%[v/v] 에탄올로 현탁하고 여과지를 이용하여 여과하여 여액을 수득한 후, 농축하여 농축물(1차 CKS로 명명) 1~1.4g을 확보하였다.

실시예 1-2. 2차 CKS의 제조

상기 실시예 1-1에서 제조한 1차 CKS를 95%[v/v] 에탄올로 현탁하여 1.0%[w/v]의 1차 CKS 현탁액을 제조하고 50℃ 이상으로 유지하였다.

상기 1차 CKS 현탁액을 이용하여, 상기 실시예 1-1의 펙티나아제 처리 과정을 동일하게 수행하여 2차 CKS를 제조하였다. 이때, 2차 CKS는 사용한 1차 CKS의 무게 대비 90% 정도로 회수된 것을 확인하였다.

실시예 1-3. 3차 CKS의 제조

상기 실시예 1-2에서 제조한 2차 CKS를 95%[v/v] 에탄올로 현탁하여 1.0%[w/v]의 2차 CKS 현탁액을 제조하고 50℃ 이상으로 유지하였다.

상기 2차 CKS 현탁액을 이용하여, 상기 실시예 1-1의 펙티나아제 처리 과정을 동일하게 수행하여 3차 CKS를 제조하였다. 이때, 3차 CKS는 사용한 2차 CKS의 무게 대비 80% 정도로 회수된 것을 확인하였다.

실시예 1-4. 4차 CKS의 제조

상기 실시예 1-3에서 제조한 3차 CKS를 95%[v/v] 에탄올로 현탁하여 1.0%[w/v]의 3차 CKS 현탁액을 제조하고 50℃ 이상으로 유지하였다.

상기 3차 CKS 현탁액을 이용하여, 상기 실시예 1-1의 펙티나아제 처리 과정을 동일하게 수행하여 4차 CKS를 제조하였다. 이때, 4차 CKS는 사용한 3차 CKS의 무게 대비 80% 정도로 회수된 것을 확인하였다.

실시예 1-5. 진세노사이드 종류 및 함량 분석

상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-4의 처리 단계에 따른 진세노사이드의 성분 및 함량 변화를 확인하였다.

상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-4에서 제조한 각 단계별 CKS를 95%[v/v] 에탄올로 현탁하여 1%[w/v]의 현탁액을 제조하였다. 각각의 현탁액을 이용하여 아세토나이트릴:물(4:1→1:0[v/v])의 농도구배 용출 조건에 따른 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)[Agilent C₁₈ 컬럼, 4.6×250㎜, 5㎛ 입자 크기, 유속 1㎖/분, UV 탐지: 203㎚]를 수행하여 진세노사이드의 성분 및 함량 변화를 분석하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

CKS	진세노사이드 함량 (%)
	컴파운드 K	F2	Rd	Rg3
1차 CKS	52	2.69	34.4	2
2차 CKS	75	2	14	1.8
3차 CKS	85	1.5	4	0.5
4차 CKS	92	0	0.1	0.1

상기 표 1에서 보여주듯이, 펙티나아제 처리 횟수가 증가할수록 컴파운드 K의 함량이 증가하고, 다른 종류의 진세노사이드의 함량이 감소하는 것을 확인함으로써, 상기 제조 과정을 통해 컴파운드 K의 함량이 90% 이상인 인삼 농축액 제조 방법을 확립할 수 있었다.

실시예 1-6. 컴파운드 K의 제조

상기 실시예 1-4에서 제조한 4차 CKS를 95%[v/v] 에탄올로 현탁한 후, 에탄올:물(0:1→9.5:0.5[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography)를 수행하여 분획물 20개를 얻었다. 각각의 분획물을 상기 실시예 1-5와 동일한 방법을 이용하여 진세노사이드의 성분 및 함량을 분석하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보여주는 것과 같이, 14번째 분획물에서 컴파운드 K의 단일 피크가 나타나는 것을 확인하였고, 이를 통해 단일 물질의 컴파운드 K가 분리된 것을 알 수 있었다.

<실시예 2. 컴파운드 K 가용화 용액 제조>

본 발명의 난용성 성분인 컴파운드 K를 가용화시킨 용액을 제조하였다. 이때, 본 발명자의 한국등록특허 제10-1717672호에 기재된 방법을 참고하였다.

키토산을 pH 1인 0.1M 아세트산 용액에 넣고 용해하여 5%[w/v]의 키토산 용액을 만든 후, 고온증기멸균 처리하였다. 그 후 다시 6N NaOH를 이용하여 pH가 7.0이 되도록 중성화시켜 열처리 가용성 키토산 용액을 제조하였다.

상기 실시예 1-6에서 제조한 컴파운드 K 1g에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80) 0.1g을 넣고 균일하게 혼합한 후, 95%[v/v] 에탄올 1㎖을 넣고 섞어주었다. 여기에 상기에서 제조한 열처리 가용성 키토산 용액 5g을 넣어 혼합하고, 염기성 아미노산인 라이신 또는 아르기닌 1.5g과 정제수 약 90㎖을 첨가하여 혼합한 후, 6M HCl 또는 6M NaOH를 이용하여 pH가 8.6이 되도록 맞춘 후, 정제수를 총 부피가 100㎖이 되도록 넣어주었다. 이 용액을 고온증기멸균 처리를 통해 무균 조작과 함께 에탄올 성분을 휘발시켜 컴파운드 K 가용화 용액을 제조하였다.

<실시예 3. 컴파운드 K의 각막 손상 치료 효과 확인>

본 발명의 컴파운드 K의 각결막염 치료 효과를 확인하기 위해 마우스의 각막 손상을 유도하고, 컴파운드 K의 투여에 따른 손상 회복을 확인하였다. 이때, 각막의 손상을 위해서 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)을 이용하였다. 염화벤잘코늄은 소독제로 사용되고 있으나, 염화벤잘코늄이 눈에 들어가면 각막의 손상 및 각막염을 일으킬 수 있고, 고농도의 경우에는 각막에 매우 심각한 손상을 일으킬 수 있다는 것이 알려져 있다.

ICR 마우스를 정상군, 대조군, 실험군으로 나누고, 정상군에는 아무것도 처리하지 않았고, 대조군에는 생리식염수를, 실험군에는 상기 실시예 2의 컴파운드 K 가용화 용액을 각각 0.5㎎/㎏(실험군 1) 또는 1㎎/㎏(실험군 2)이 되도록 오전 10시경에 경구투여하고, 오후 2시에는 대조군과 실험군에 0.2% 염화벤잘코늄 1㎕를 마우스의 한쪽 눈에 투여하여 각막의 염증을 유도하였다. 이러한 과정을 14일간 반복하였다. 14일 후에 마취약(576.8㎎/10㎖의 Ketamine HCl 0.6㎖, 2% Xylazine 0.15㎖, 멸균된 PBS 6.75㎖)을 마우스 20g을 기준으로 250㎕를 복강 주사하여 마취시켰다. 마취 3분 후에 암실에서 플루오레세인(fluorescein) 1㎕를 마우스의 눈에 점안하여 형광 염색시켰다. 플루오레세인을 점안하고, 마우스의 눈을 3회 깜박거리게(blink) 한 후, 검안경(opthalmoscope, Germany)을 이용하여 검경하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 플루오레세인(fluorescein)이 각막의 손상부위로 흡수되면 형광이 없어지고 검은색으로 보이므로, 암실에서 청색광을 내는 전극이 달린 검안경으로 눈의 검은 점(block spot)의 정도를 관찰함으로써 각막의 손상 정도를 확인할 수 있다.

도 2에서 보여주듯이, 염화벤잘코늄 처리를 통해 각결막염을 유도한 대조군의 경우에는 각결막염에 의한 각막의 손상으로 인해 검정색으로 보이는 부분이 많은 반면에, 본 발명의 컴파운드 K를 투여한 실험군의 경우에는 검정색으로 보이는 부분이 대조군에 비해 감소된 것을 알 수 있었다(A). 또한, 각막의 손상으로 인해 나타나는 전체 안구의 검정색을 5등급으로 나누었을 때, 정상군은 1이고, 대조군은 2.25로 나타났으며, 본 발명의 컴파운드 K를 0.5㎎/㎏으로 투여한 실험군 1은 1.5이고, 1㎎/㎏으로 투여한 실험군 2는 1.25로, 대조군에 비해 검정색이 감소한 것을 알 수 있었다(B).

이를 통해, 본원발명의 컴파운드 K가 각막의 손상을 억제함으로써 각결막염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 4. 컴파운드 K의 각막 세포 사멸 억제 효과 확인>

본 발명의 컴파운드 K의 각결막염 치료 효과를 확인하기 위해 TUNEL(Terminal dUTP nick end labeling) 어세이 분석을 수행하였다. TUNEL 어세이는 DNA의 단편화 정도를 검출하여 세포 자살(apoptotic signaling)을 분석하는데 주로 사용하는 방법으로, 본 발명의 각막 세포의 사멸률을 분석하기 위해 이용하였다.

상기 실시예 3의 방법과 동일하게 마우스에 컴파운드 K 및 염화벤잘코늄을 처리하여 마우스의 각막 손상을 유도하였다. 각막 손상이 유도된 마우스를 안락사 시킨 후, 안구를 적출하여 포르말린에 담근 후, 파라핀으로 고정하였다. 파라핀으로 고정시킨 안구 조직에서 파라핀을 제거하고 탈수시킨 후, Roche사의 In Situ Cell Death Detection Kit, POD를 이용하여 TUNEL 어세이를 수행하였다. TUNEL 어세이 결과에서 갈색으로 염색된 세포가 많을수록 사멸된 세포가 많다는 것을 의미한다. 이때, TUNEL 어세이는 Roche 사에서 제공한 매뉴얼에 따라 수행하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보여주듯이, 염화벤잘코늄 처리를 통해 각결막염을 유도한 대조군의 경우에는, 정상군에 비해 갈색으로 염색된 세포의 수가 증가한 반면에, 본 발명의 컴파운드 K를 투여한 실험군의 경우에는 컴파운드 K의 투여량에 따라 갈색으로 염색된 세포의 수가 감소하는 것을 확인하였고, 특히나 1㎎/㎏의 컴파운드 K를 투여한 실험군 2의 경우에는 정상군과 비슷한 수준의 조직 검사 결과를 보여주고 있다.

이를 통해, 본원발명의 컴파운드 K가 각막 손상에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 각결막염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (9)

1. 컴파운드 K(compound K)를 유효성분으로 포함하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 컴파운드 K, 계면활성제, 키토산 및 염기성 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제2항에 있어서,
   상기 약학 조성물은,
   컴파운드 K에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계;
   상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 열처리 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계;
   상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및,
   상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계;
   로 이루어진 과정을 통해 제조된 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 제1단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 제2단계의 열처리 가용성 키토산은,
   i) 수용성 키토산을 pH 1인 용액에 녹여 고온증기멸균하는 단계; 및,
   ii) 상기 i) 단계의 용액에 염기성 용액을 넣어 중성화 시키는 단계;
   를 통해 제조된 것을 특징으로 하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제3항에 있어서,
   상기 제3단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 각결막염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 컴파운드 K는 0.5~20㎎/㎏로 투여하는 것을 특징으로 하는 각결막염 치료용 약학 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 각결막염은 감염성 각결막염 또는 비감염성 각결막염인 것을 특징으로 하는 각결막염 치료용 약학 조성물.
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 약학 조성물은 정제, 과립제, 산제 또는 액제 제형인 것을 특징으로 하는 각결막염 치료용 약학 조성물.
   
   
   
   
   
   
   

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