KR101861413B1 - 팥껍질의 추출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1) 팥을 분쇄기로 2쪽으로 분쇄하여 물을 가한 후 실온에서 방치한 다음에 물을 제거하고 나서 다시 물을 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 건져낸 후에 건조하여 팥껍질을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질을 환류추출기를 사용하여 에탄올로써 추출한 후에 다시 에탄올을 가하고 재탕하여 팥껍질 추출액을 얻는 제 2단계; 3) 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출액을 감압증류기를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킨 후에 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 팥껍질의 추출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 팥껍질의 추출방법은 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 이루어지므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있는 등 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 팥껍질의 추출방법은 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 이루어지므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있는 등 효과를 갖는다.
Description
본 발명은 팥껍질의 추출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 팥껍질에 함유된 안토시아닌의 유출이 거의 없도록 에탄올로 추출하여 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 팥껍질의 추출방법은 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 이루어지므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있는 등 효과를 갖는 발명이다.
팥(赤豆)은 쌍떡잎식물이며, 장미목 콩과의 한해살이풀로서 중국, 한국, 일본 등 극동아시아의 온대지역에서 주로 재배되고 있어 동양이 원산지인 것으로 추정되며, 우리나라는 중국에서 전파되어 재배된 것으로 알려져 있다.
팥에는 비타민 B1이 풍부하여 쌀에 혼반(混飯)할 경우 쌀밥에 부족하기 쉬운 비타민을 공급하여 주며, 각기병(脚氣病)의 예방 뿐만 아니라 피로 회복에도 효과가 있으며, 단백질의 대부분이 글리신이고 발린을 제외한 필수아미노산이 풍부하며, 특히 쌀의 제한아미노산인 라이신 함량이 높아 혼식하면 아미노산 보조 효과로 단백질의 질을 향상시켜 준다고 알려져 있다.
한의학적으로는 팥은 성질이 평하고 맛이 달며, 이수소종(利水消腫), 이습퇴황(利濕退黃), 청열(靑熱) 해독 효능이 있어 수종(水腫), 각기(脚氣), 소변불리(小便不利), 창독(瘡毒) 등에 활용된다. 아울러 팥에 함유된 사포닌은 섬유질과 함께 통변(便通)을 돕는 효과가 있어, 독을 풀고 배변을 촉진하여 장을 깨끗이 해주며, 신장병(腎臟病), 각기병, 숙취 등에도 이용되고 있다.
또한 팥의 색소는 안토시아닌(anthocyanin)계의 시아니딘(cyanidin)으로 알려져 있으며, 이들 색소의 항산화 및 항종양효과는 이미 실험적으로 증명된 바가 있다. 특히 팥에 풍부한 프로안토시아닌(proanthocyanidins), 퀘르세틴 글리코사이드(quercetin glycoside)와 같은 폴리페놀 성분은 강력한 항산화 작용 및 항염증 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다.
팥 추출물과 관련한 종래기술로서, 하기 특허문헌 1에는 “지방산계 화장비누 조성물에서 팥 추출물을 0.01~5.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 지방산계 화장비누 조성물”이 개시되어 있으나, 이는 팥 추출물의 세정력 및 항산화력을 이용한 화장비누 조성물에 관한 것이다.
또한 하기 비특허문헌 1에는 “팥 에탄올 추출물(VA-E)이 세포수준에서 염증인자를 억제하는 효과를 확인하였던바, 동물병태 모델에서 유의성 있는 항 골관절염 효과가 나타남으로써, 관절염의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품의 개발에 있어서 기초적 자료를 제공”하는 것이다.
이에 본 발명자는 종래 기술과 달리 팥껍질을 비교적 저온에서 에탄올로 추출하여 분리함으로써 에너지비용을 대폭적으로 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
동의생리병리학회지 제26권 5호, 665~671, 2012. 10. 16.
본 발명은 팥껍질을 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 추출하여 분리할 수 있으므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과가 우수한 팥껍질 추출물을 간단히 분리할 수 있는 팥껍질의 추출방법의 제공을 그 과제로 한다.
본 발명은 1) 팥을 분쇄기로 2쪽으로 분쇄하여 물을 가한 후 실온에서 방치한 후에 물을 제거하고 나서 다시 물을 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 건져낸 후에 건조하여 팥껍질을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질을 환류추출기를 사용하여 에탄올로써 추출한 후에 다시 에탄올을 가하고 재탕하여 팥껍질 추출액을 얻는 제 2단계; 3) 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출액을 감압증류기를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킨 후에 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 팥껍질의 추출방법을 제공한다.
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기타 본 발명을 구현하기 위한 구체적인 예들은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
발명에 따른 팥껍질의 추출방법은 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 이루어지므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있는 등 효과를 갖다.
도 1은 RAW264.7 세포주에서 팥껍질 추출물 및 팥 추출물의 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 RAW264.7 세포주에서 NO 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 RAW264.7 세포주에서 염증사이토카인 IL-6 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 RAW264.7 세포주에서 염증사이토카인 TNF-α 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 RAW264.7 세포주에서 NO 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 RAW264.7 세포주에서 염증사이토카인 IL-6 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 RAW264.7 세포주에서 염증사이토카인 TNF-α 생산량 변화를 나타내는 그래프이다.
이하에서는 본 발명의 구체적 내용을 바람직한 실시예와 비교예를 포함하고 도면을 참고하여 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명에 의한 팥껍질의 추출방법은 1) 팥을 분쇄기로 2쪽으로 분쇄하여 물을 가한 후 실온에서 방치한 다음에 물을 제거하고 나서 다시 물을 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 건져낸 후에 건조하여 팥껍질을 얻는 제 1단계; 2) 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질을 환류추출기를 사용하여 에탄올로써 추출한 후에 다시 에탄올을 가하고 재탕하여 팥껍질 추출물을 얻는 제 2단계; 3) 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출물을 감압증류기를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킨 후에 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
먼저, 본 발명에 의한 팥껍질의 추출방법 중에서 제 1단계는 준비단계로서, 팥을 분쇄기로 2쪽으로 분쇄하여 물을 가한 후 실온에서 방치한 다음에 물을 제거하고 나서 다시 물을 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 건져낸 후에 건조하여 팥껍질을 얻는 단계이다.
상기 팥은 잘 익은 국내산을 구입하여 한일분쇄기(FM-700SS, 한국)로 두 쪽으로 분쇄하여 20℃ 증류수를 가한 후에 실온(25℃)에서 5-6시간 동안 방치하면, 팥의 껍질과 속이 분리되어 껍질은 물 위로 떠오르게 된다. 이어서 증류수를 제거한 후에 다시 증류수를 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 스테인리스 체반으로 건져내어 한일GN06건조기(GN06, 한일)에서 24시간 동안 건조하여 건조된 팥껍질을 얻을 수 있다.
상기 제 1단계 중 팥은 10중량부이고, 상기 물은 20℃의 증류수 200중량부를 가한 후에 실온에서 5~6시간 동안 방치하고, 다시 20℃의 증류수 400중량부를 가하고, 상기 건조는 24시간 건조할 수 있다.
상기 제 2단계는 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질을 환류추출기를 사용하여 45℃에서 에탄올로써 추출한 후에 다시 에탄올을 가하고 재탕하여 팥껍질 추출액을 얻는 단계이다.
구체적으로는 상기 제 2단계 중 제 1단계에서 얻은 팥껍질은 55중량부이고, 에탄올은 70% 에탄올 10000중량부로써 45℃에서 60분간 추출한 후에 다시 70% 에탄올 10000중량부를 가하여 45℃에서 60분간 재탕하는 것이다.
제 3단계는 본 발명에 의한 팥껍질의 추출방법 중에서 마지막 단계로서, 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출액을 감압증류기를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킨 후에 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 단계이다.
상기 추출액을 둥근 플라스크에 넣고 감압농축기에 연결하여 온도를 제어하면서 진공펌프를 이용하여 감압하는 형태이고, 내부를 진공상태로 만들어 직접적으로 증류하는 방식으로 회전하면서 냉매를 순환하게 하여 증류되는 물질을 회수하는 방법으로 유기용매인 에탄올을 제거하는 농축과정을 거치고, 동결건조기(PF-10/ALPHA1-2LD, 독일)를 통하여 추출액을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시켜 급속동결 한 후에 동결된 추출물을 동결건조기에 넣고 챔버 온도 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 건조하였다.
이하에서 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하도록 한다.
<제조예> 팥껍질 제조
국내산 팥 10kg을 한일분쇄기(FM-700SS, 한국)로 두 쪽으로 분쇄하여 20℃ 증류수 200L를 가한 후에 실온(25℃)에서 5-6시간 동안 방치했다. 이어서 증류수를 제거한 후에 20℃ 증류수 400L를 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 스테인리스 체반으로 건져내어 한일GN06건조기(GN06, 한국)에서 24시간 동안 건조하여 건조된 팥껍질 550g을 얻었다.
상기 제조예에서 얻은 팥껍질을 추출용매인 에탄올의 농도를 하기 실시예에서와 같이 여러 가지로 달리하여 팥껍질 추출물을 제조하였다.
상기 제조예에서 얻은 팥껍질 55g을 채취한 다음 70% 에탄올을 추출용매로 하여 환류추출기(heating Mantle, MS-DM609/20L)를 사용하여 45℃에서 상기 용매 1L 가하여 60분 추출한 후에 70% 에탄올 1L를 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기(N-1200A, EYELA. CO. LTD, 일본)를 이용하여 에탄올을 제거하여 농축시킴으로써 추출액을 얻고, 상기 추출액을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시켜 급속 동결한 후에 동결된 추출물을 동결건조기(PF-10/ALPHA 1-2LD, 독일)에 넣고 챔버 온도 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 건조하여 팥껍질 추출물 17.2g을 수득하였다.
실시예 1과 비교하여 70% 에탄올을 사용하는 대신에 30% 에탄올을 사용하는 점만 다를 뿐 나머지는 동일하게 하여 팥껍질 추출물 10.2g을 얻었다.
실시예 1과 비교하여 70% 에탄올을 사용하는 대신에 50% 에탄올을 사용하는 점만 다를 뿐 나머지는 동일하게 하여 팥껍질 추출물 15.5g을 얻었다.
실시예 1과 비교하여 70% 에탄올을 사용하는 대신에 85% 에탄올을 사용하는 점만 다를 뿐 나머지는 동일하게 하여 팥껍질 추출물 18.2g을 얻었다.
<비교예>
국내산 팥 100g을 한일분쇄기(FM-700SS, 한국)로 두 쪽으로 분쇄하여 환류추출기(heating Mantle, MS-DM609/20L)에 넣고 45℃에서 70% 에탄올 1L 가하여 60분간 추출한 후 다시 70% 에탄올 1L을 가하여 같은 조건으로 60분 동안 재탕하였다. 그 후 감압증류기(N-1200A, EYELA. CO. LTD, 일본)를 이용하여 유기용매인 에탄올을 제거하여 농축시킴으로써 추출액을 얻고, 상기 추출액을 -70℃ 냉동고에서 24시간 냉동시켜 급속 동결한 후에 동결된 추출물을 동결건조기(PF-10/ALPHA 1-2LD, 독일)에 넣고 챔버 온도 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 건조하여 건조된 팥 추출물 13.2g을 수득하였다.
<실험예> 팥껍질 및 팥 추출물의 항염 효과
1) 세포주 및 세포배양
본 실험에 사용된 본 실험에서 사용된 RAW264.7 세포주는 해동하여 10% FBS-DMEM(Cellgro, 미국) 배지에서 3일동안 배양하고 5% FBS-DMEM 배지로 교체 후 4일 동안 배양하였다. 1% 이하의 FBS는 RAW264.7 세포의 활성화에 영향을 주지 않으므로, 모든 실험에서는 1% FBS-DMEM 배지에서 안정화시킨 RAW264.7 세포를 in vitro 모델로 사용하였다. 그리고 RAW264.7 세포주를 10% FBS, 10% T-stim(미국), 0.05mM 2-mercaptoethanol과 2mM L-glutamine(Sigma, 미국) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM 배지에 부유시켜 37℃, 5% CO2, 95% 대기에서 배양하였고, 세포는 주 2∼3회씩 계대배양하였다.
2) MTT법에 의한 세포 독성(cytotoxicity) 측정
실시예 1 내지 4의 팥껍질 추출물 및 비교예의 팥 추출물이 생쥐 RAW 264.7 세포에 세포독성을 나타내는지 확인하고자, MTT assay를 시행하였으며 그 내용은 다음과 같다. 각각 RAW 264.7 세포를 96-well plates에 1×106 cells/㎖ 농도로 100㎕씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200, 400, 800㎍/㎖)로 제조한 후에 세포에 처리하여 24시간 동안 동시 배양하였다. 24시간 후 DMEM의 10분의 1에 해당하는 MTT 용액(0.5㎎/㎖)을 가하고 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시킨 다음 상층액을 제거하였다. 그런 다음 암조건에서 30분간 건조한 후에 DMSO를 100㎕ 분주하여 1시간 동안 혼합한 다음 ELISA reader(Molecular device, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포생존률은 다음 식에 의해 산출하였다.
3) RAW264.7 대식세포 배양 및 NO 생산량 분석
10% FBS가 포함된 2㎖의 DMEM 배지와 RAW 264.7 세포(2×105 cells/well)를 24-well culture plate에 넣고 standard incubator conditions(37℃, humidified, 5% CO2 /95% air environment)에서 24시간 배양한 다음, 상층액을 제거하였다. RAW264.7 세포가 배양된 각 well에 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200㎍/mL)로 처리하고 1시간 후에 각 well에 0.1㎍/㎖ 농도로 LPS를 처리하고 24시간 동안 동시 배양한 다음 상청액을 분리하여 냉동실에 보관하여 사용하였다. ELISA 측정은 생쥐 NO(Intron, 한국) ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 각 well에 배양상청액을 100㎕씩 넣었으며, 2시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. NO 생성량을 측정하기 위한 시약인 Griess시약은 용액 A(0.2% Naphthylethylene diamine dihydrochloride in D.W.)와 용액 B(2% Sulfonylamide in 5% H3PO4)를 제조하고 냉암소에 보관하며, 사용 직전에 두 용액을 1:1로 혼합하여 혼합용액을 사용하였다. 배양이 종료된 후 배양 상층액 100㎕를 96well plate에 분주하고 다시 혼합용액 100㎕를 분주한 뒤 ELISA reader를 사용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였고, 표준검량곡선은 아질산나트륨을 0~80μM 사이에서 측정하였다.
4) 염증사이토카인 ELISA 측정
RAW264.7 세포주에 96-well plate에 2×105/㎖로 0.2㎖씩 분주하고 24시간 동안 sub-culture한 후에 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200㎍/mL)로 처리하고, 1시간 후에 각 well에 0.1㎍/㎖ 농도로 LPS를 처리하고 16시간 동안 동시 배양한 다음 상청액을 분리하여 냉동실에 보관하여 사용하였다. 생쥐 IL-6,와 TNF-α(eBioscience, 미국) ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 코팅 antibody를 microwell에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었으며 각 well을 wash buffer로 세척하고 assay diluent를 200㎕씩 넣어서 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. 표준품을 희석하고 상청액을 20배 희석한 후에 microplate를 세척하고, 각 표준품과 상청액을 100㎕ 씩 넣었으며 2시간 동안 well을 막은 후에 실온에서 배양하였다. Microplate를 세척하고 working detector를 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였으며, microplate를 세척하고 substrate solution을 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 30분 동안 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. Stop solution을 각 well에 50㎕씩 넣고 microplate 분광광도계에서 흡광도 450㎚로 측정하였다.
4) 통계분석
모든 실험 결과의 통계처리는 SAS 통계 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 그 결과는 평균값과 표준오차로 표시하고 통계적 유의성(P < 0.05)은 ANOVA로 검증하였다.
<실험 결과 분석>
1) 세포독성 측정
RAW264.7 대식세포주에서 실시예 1 내지 4 및 비교에의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200, 400, 800㎍/mL)의 세포독성을 측정한 결과, 대조군(0㎍/mL)에 비하여 24시간 배양에서 10㎍/㎖에서 800㎍/㎖까지 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(도 1).
2) LPS로 유도한 팥껍질 주정추출물 및 팥 주정추출물이 NO 생성에 미치는 영향
실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200㎍/mL)로 처리하여 RAW264.7 세포주에서 NO의 생성에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여 Griess 반응을 통한 세포 상층액의 NO 생성을 측정한 결과 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물에서는 대조군(LPS-CT)에 비하여 실시예 1의 추출물이 농도 의존적으로 통계학적으로 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). 즉, 생쥐 RAW264.7세포주에서 LPS에 의해 유도된 NO 생산량에서 대조군에 비하여 50%이상 억제되는 농도가 실시예 1의 추출물은 100㎍/ml 이상에서부터이고, 실시예 4는 200㎍/ml 이상에서, 실시예 3은 150㎍/ml 이상에서, 실시예 2는 200㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다. 또한 비교예 1은 NO 생산량에서 대조군에 비하여 50% 이상 억제되는 농도가 200㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다[도 2].
이러한 결과는 같은 처리농도에서 비교예보다 더, 그리고 실시예 4, 실시예 3, 실시예 2보다 더 실시예 1이 NO 생성을 억제하는 항염효과가 가장 현저하게 크다는 것을 알 수 있었다.
3) LPS로 유도한 팥껍질 추출물 및 팥 추출물이 IL-6 생성에 미치는 영향
실시예 1 내지 4 및 비교에의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200㎍/mL)로 처리하여 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의한 염증사이토카인 IL-6 생산량에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여 배양상층액에서 IL-6 ELISA kit로 측정한 결과. 그 결과 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물에서는 대조군(LPS-CT)에 비하여 실시예 1이 농도 의존적으로 통계학적으로 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). 즉, 생쥐 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의한 염증사이토카인 IL-6 생산량에서 대조군(LPS-CT)에 비하여 50%이상 억제되는 농도가 실시예 1은 10㎍/ml 이상에서부터이고, 실시예 4는 50㎍/ml 이상에서, 실시예 3은 80㎍/ml 이상에서, 실시예 2는 180㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다. 또한 비교예는 LPS에 의한 염증사이토카인 IL-6 생산량에서 대조군(LPS-CT)에 비하여 50% 이상 억제되는 농도가 160㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다[도 3].
이러한 결과는 같은 처리농도에서 비교예보다 더, 그리고 실시예 2 내지 4보다 더 실시예 1이 염증사이토카인 IL-6 생산량을 억제하는 항염효과가 가장 현저하게 크다는 것을 알 수 있었다.
4) LPS로 유도한 팥껍질 추출물 및 팥 추출물이 TNF-α 생성에 미치는 영향
실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 각 농도별(0, 10, 100, 200㎍/mL)로 처리하여 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의한 염증사이토카인 TNF-α 생산량에 어떠한 영향을 주는지 알아보기 위하여 배양상층액에서 TNF-α ELISA kit로 측정하였다. 그 결과 실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물에서는 대조군(LPS-CT)에 비하여 실시예 1이 농도 의존적으로 통계학적으로 유의성 있게 억제되었다 (p<0.001). 즉, 생쥐 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의한 염증사이토카인 TNF-α 생산량에서 대조군(LPS-CT)에 비하여 50% 이상 억제되는 농도가 실시예 1은 15㎍/ml 이상에서부터이고, 실시예 4는 90㎍/ml 이상에서, 실시예 3은 70㎍/ml 이상에서, 실시예 2는 170㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다. 또한 비교예 1은 LPS에 의한 염증사이토카인 TNF-α 생산량에서 대조군(LPS-CT)에 비하여 50% 이상 억제되는 농도가 실시예 1, 2, 4 모두는 185㎍/ml 이상에서 약 50% 이상 억제되었다[도 4].
이러한 결과는 같은 처리농도에서 비교예보다 더, 그리고 실시예 2, 3, 4보다 더 실시예 1이 염증사이토카인 TNF-α 생산량을 억제하는 항염효과가 가장 현저하게 크다는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명에 따른 팥껍질의 추출방법은 실시예 1에서와 같이, 에탄올을 이용하여 추출이 비교적 저온인 45℃에서 단시간인 2시간에 이루어지므로 에너지 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 항염증 효과를 갖는 추출물을 간단한 방법으로 분리할 수 있는 등 효과를 갖다.
이상과 같이, 본 발명을 비록 한정된 실시예에 의해 설명하였으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.
Claims (6)
1) 팥 10중량부를 분쇄기로 2쪽으로 분쇄하여 20℃의 증류수 200중량부를 가한 후 실온에서 5~6시간 동안 방치한 다음에 증류수를 제거하고 나서, 다시 20℃의 증류수 400중량부를 가하여 상층에 부유된 팥껍질을 건져낸 후에 24시간 건조하여 팥껍질을 얻는 제 1단계;
2) 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질 55중량부를 환류추출기를 사용하여 70% 에탄올 10000중량부로써 45℃에서 60분간 추출한 후에 다시 70% 에탄올 10000중량부를 가하고 45℃에서 60분간 재탕하여 팥껍질 추출액을 얻는 제 2단계;
3) 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출액을 진공펌프를 이용하여 감압농축기의 내부를 진공상태로 한 후에 에탄올을 직접 증류함으로써 회수하여 제거하고, 농축시킨 후에 -70℃에서 24시간 냉동시켜 급속 동결한 후 동결된 추출물을 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 팥껍질의 추출방법.
2) 상기 제 1단계에서 얻은 팥껍질 55중량부를 환류추출기를 사용하여 70% 에탄올 10000중량부로써 45℃에서 60분간 추출한 후에 다시 70% 에탄올 10000중량부를 가하고 45℃에서 60분간 재탕하여 팥껍질 추출액을 얻는 제 2단계;
3) 상기 제 2단계에서 얻은 팥껍질 추출액을 진공펌프를 이용하여 감압농축기의 내부를 진공상태로 한 후에 에탄올을 직접 증류함으로써 회수하여 제거하고, 농축시킨 후에 -70℃에서 24시간 냉동시켜 급속 동결한 후 동결된 추출물을 40℃, 진공압력 10Torr 이하에서 72시간 동안 동결 건조시켜 팥껍질 추출물을 얻는 제3단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 팥껍질의 추출방법.
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논문1: 호서대학교 대학원* |
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