KR101859552B1

KR101859552B1 - 강황 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR101859552B1
Application number: KR1020150030833A
Authority: KR
Inventors: 남명수; 랜친핸드; 손지윤
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-05
Filing date: 2015-03-05
Publication date: 2018-05-21
Anticipated expiration: 2035-03-05
Also published as: KR20160108689A

Abstract

본 발명의 목적은 강황 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 상기 발효유는 TNF-α 및 IL-6와 NO 생성을 증가시키는 효과가 우수하여 면역증강용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

강황 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물 {Composition for immune enhancement comprising fermented milk with Curcuma longa L. powder}

본 발명은 강황(Curcuma longa L.) 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

생체는 다양한 외부인자(병원성 미생물 등)로부터 방어 작용을 하는데 이를 면역계라고 한다. 인체의 면역계는 감염에 대한 신체방어기전으로서, 태어날 때부터 가지고 있는 선천면역(innate immunity)과 생활 등에 적응되어 얻어지는 후천면역(acquired immunity)의 두 가지 메커니즘으로 구성되어 있다. 선천면역은 자연면역이라고도 하는 것으로, 항원(antigen)에 대하여 비특이적으로 반응하는 면역반응을 뜻하며, 후천면역은 외부 항원에 대하여 특이적으로 작용하여 면역반응을 나타내고, 면역 기억작용을 통하여 활성화된다.

선천면역은 감염 후 수 시간 내에 유도되어 작동하는 숙주의 가장 신속한 대응책으로, 선천면역계에서 생체 방어 기구의 최전선을 담당하는 대식세포(macrophage)는 인체 전반에 걸쳐 분포하며, 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 체액성면역(humoral immunity)과 세포성면역(cell-mediated immunity)에 관여하고, 대식세포가 활성화되면 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE₂(prostaglandin E₂), NO(nitric oxide), ROS(reactive oxygen species) 등을 분비한다.

특히, TNF-α는 염증반응에 관련된 사이토카인으로써 면역반응을 증강시키고 이물질을 감염부위로 유인하는 방어작용을 하며, IL-6는 항원자극을 받아 증식된 B 림프구의 항체 생산과 분비에 중요한 역할을 담당하여 B 세포 성장 및 분화 인자, T 세포 활성 보조 자극 등의 기능을 가진 것으로 알려져 있다(Lee, M. H., 2008; Kim, S. J., 1994).

선천면역반응은 만성감염을 조절하는 역할을 하며, 병원체 감염에 따른 선천면역의 방어기작의 하나로 면역인자가 분비되고, 이들 인자들에 의해 염증반응이 유발되어 병원체에 대한 방어가 이루어지기 때문에, 적정한 수준의 염증반응 유도 역시 다양한 전염병 병원체에 대한 예방 및 치료 방법이 될 수 있으며, 이를 유도시킬 수 있는 면역증강제제에 대한 연구 개발이 필요하다. 최근에는 이러한 면역작용을 천연물질로 증진시키려는 연구에 대한 관심이 부각되고 있다(Kim, H. S. et al., 2008).

강황(Curcuma longa L.)은 생강과에 속하는 다년생 초본식물로 인도가 원산지이며 타이완, 인도네시아, 일본, 우리나라 남부지역 등의 일부 지역에서 주로 경작하고 있다(Cha, Y. M., 2009). 강황은 뿌리줄기의 식물로 껍질이 단단한 코르크 층으로 이루어져 있어 코르크 층을 제거한 후 내부 줄기성분을 사용한다(Sung, K. C., 2010). 주요성분으로는 커큐민(curcumin)이 있으며, 미량의 진저론(zingiberone), 투메론(tumerone), 시네올(cineol) 등이 함유되어 있다. 또한, 강황에 함유된 무기성분으로는 칼륨(K)이 가장 많고 나트륨(Na), 칼슘(Ca), 티타늄(Ti), 리튬(Li), 구리(Cu) 등이 있다(Sung, K. C., 2011).

강황은 독특한 향기와 맛, 천연의 황색을 가진 특성 때문에 강황주, 강황차, 강황음료, 강황카레, 강황면 등의 식품에 이용되어 왔다. 또한, 설기 떡의 품질 특성(Lee, M. H. et al., 2011), 쌀밥의 저장성에 미치는 영향(Lim, Y. S. et al., 2007), 계육 소시지의 제조 조건 최적화(Yun, E. A. et al., 2013), 두부의 저장성에 미치는 영향(Park, K. M., 2007) 등에 대한 식품 연구에서도 보고되었다.

강황의 생리활성 기능에 대한 연구로는 항균작용(Lee, K. W., 2005), 항산화작용(Kim, H. J. et al., 2011; Lee, B. S., 2006), 혈압강하작용(Park, H. S. et al., 2011), 비만억제작용(Yang, C. Y. et al., 2011; 한국공개특허 제2012-0002131호), 항바이러스제(한국등록특허 제962334호), 항염증(Chainani-Wu, N., 2003), 위염 치료제(한국등록특허 제506426호), 면역조절(Yoo, S. A. et al., 2014) 등의 다양한 보고가 개시되어 있으며, 본 발명자들은 강황 분말을 함유한 발효유가 면역반응에 관련된 TNF-α 및 IL-6와 NO 생성을 증가시키는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제506426호 (강황 추출물을 함유한 위염, 위궤양 예방 및 치료를 위한조성물, 2005년 07월 28일, 등록) 한국등록특허 제962334호 (울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제, 2010년 06월 01일, 등록) 한국공개특허 제2012-0002131호 (울금 추출물을 함유하는 비만 치료 또는 예방용 조성물, 2012년 01월 05일, 공개)

Cha, Y. M., Influence that safflower and turmeric affects on hair dyeinh, Kwang Ju Girl University, MS. Dissertation, 2009. Chainani-Wu, N., Safety and anti-inflammatory activity of curcumin. A component of turmeric (Curcuma longa), J. Altern. Complement. Med., 9(1), 161-168, 2003. Kim, H. J. et al., Antimicrobial activity and antioxidant effect of Curcuma longa, Curcuma aromatic and Curcuma zedoaria, Kor. J. Food Preserv., 18, 219-225, 2011. Kim, H. S. et al., Preparation and characteristics of bread by medicinal herb composites with immunostimulating activity, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 37, 109-116, 2008. Kim, S. J., Immunology, Korea Medical Publishing, 119-131, 1994. Lee, B. S., Extraction process of gingerol from ginger by ultrasonication and it's antioxidant effect, Cheon Buk University, MS. Dissertation, 2006. Lee, K. W., Antibacterial activity of the Zingiberaceae plant extract against microorganisms, Yonsei University, MS. Dissertation, 2005. Lee, M. H., Lippincott's Illustrated Reviews : Immunology, Shinilbooks, 41-53, 2008. Lee, M. H. et al., The quality characteristics of Curcuma longa L. powder Sulgitteok, Kor. J. Culin. Res., 17, 184-192, 2011. Lim, Y. S. et al., Effects of turmeric (Curcuma aromatica Salab.) extract on shelf life of cooked rice, Kor. J. Food Preser., 14, 445-450, 2007. Park, H. S. et al., Physiological activities of extracts from Fomitella fraxinea on brown rice added rice bran, pine needle and turmeric powder, Kor. J. Mycol., 39, 105-110, 2011. Park, K. M., et al., Effect of turmeric (Curcuma aromatica Salab.) on shelf life of tofu, Kor. J. Food Preser., 14, 136-141, 2007. Sung, K. C., A study on the pharmaceutical characteristics and analysis of natural ginger extract, J. Kor. Oil Chemists' Soc., 27, 266-272, 2010. Sung, K. C., A study on the pharmaceutical & chemical characteristics and analysis of natural curcumin extract, J. Kor. Oil Chemists' Soc., 28, 393-401, 2011. Yang, C. Y. et al., Effects of fermented turmeric extracts on the obesity in rats fed a high-fat diet, J. Anim. Sci. and Tech., 53, 75-81, 2011. Yoo, S. A. et al., Immunomodulatory effects of fermented Curcuma longa L. extracts on RAW 264.7 cells, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 43(2), 216-223, 2014. Yun, E. A., et al., Optimized processing of chicken sausage prepared with turmeric (Curcuma longa L.), Kor. Food Cult., 28, 204-211, 2013.

본 발명의 목적은 강황 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는데 있다. 보다 자세하게는, TNF-α 및 IL-6와 NO 생성을 증가시키는 효과가 있는 강황 분말을 함유하는 발효유의 면역증강용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 강황(Curcuma longa L.) 분말을 0.5 내지 10 중량%로 함유하는 발효유에 관한 것이다.

상기 발효유는 원유에 강황 분말을 혼합하여 유산균으로 발효함으로써 얻을 수 있다.

상기 유산균은 비피도박테리움 비피더스(Bifidobacterium bifidus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 중 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 강황 분말이 0.5 내지 10 중량%로 함유된 발효유를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 강황 분말이 0.5 내지 10 중량%로 함유된 발효유를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 건강기능식품에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 강황 분말을 0.5 내지 10 중량%로 함유하는 발효유에 관한 것이며, 바람직하게는 강황 분말 1 내지 5 중량%를 함유하는 발효유에 관한 것이다. 보다 더 바람직하게는 강황 분말 1 내지 3 중량%를 원유에 혼합하여 유산균으로 발효함으로써 얻을 수 있으며, 상기 유산균은 비피도박테리움 비피더스(Bifidobacterium bifidus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus) 중 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 발효유는 그대로 사용하거나 동결 건조 또는 분무 건조 등을 통해 분말로 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명은 강황 분말을 함유하는 발효유의 면역증강용 약학 조성물을 제공한다. 상기 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형으로 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말을 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 투여될 수 있다. 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 면역증강용 건강기능식품을 제공한다. 상기 강황 분말을 함유하는 발효유 또는 이의 분말은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 강황 분말을 포함하는 발효유 또는 이의 분말을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 강황 분말을 함유하는 발효유 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다. 상기 발효유는 TNF-α 및 IL-6와 NO 생성을 증가시키는 효과가 우수하여 면역증강용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유에 대한 세포생존율을 확인하는 MTT 어세이의 결과이다.
도 2는 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유가 유산균수(도 2A) 및 점도(도 2B)를 증가하는 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
도 3은 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유가 TNF-α(도 3A) 및 IL-6(도 3B)의 단백질 발현을 증가하는 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
도 4는 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유가 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현을 증가하는 효과가 있음을 나타내는 결과이다.
도 5는 본 발명의 강황 분말을 함유하는 발효유가 NO의 생성을 증가하는 효과가 있음을 나타내는 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 강황 분말을 함유하는 발효유의 제조>

실시예 1-1. 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유

본 발명에서 사용된 강황 분말은 농협 하나로마트(Jindo NH, Jindo, Korea)에서 구입하였으며, 원유는 충남대학교 동물자원연구센터에서 제공하는 것을 사용하였다. 상기 원유에 강황 분말을 1 중량%로 혼합하여 85℃에서 10분간 반응한 뒤, 10%[w/v] 탈지유(서울우유, Korea)에서 배양한 유산균 배양액 2 중량%를 첨가하여 37℃, 8시간 동안 발효하였다(원유 970g, 강황 10g, 유산균 20g). 상기 유산균으로는 Chrischan-Hansen사에서 제조한 비피도박테리움 비피더스(Bifidobacterium bifidus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)가 혼합된 제품(Hoersholm, Denmark)을 사용하였다.

실시예 1-2. 강황 분말 2 중량%를 함유하는 발효유

실시예 1-1과 동일하게 발효유를 제조하되 강황 분말을 1 중량%로 첨가하는 대신 2 중량%를 첨가하여 강황 분말 2 중량%를 함유하는 발효유를 제조하였다(원유 960g, 강황 20g, 유산균 20g).

실시예 1-3. 강황 분말 3 중량%를 함유하는 발효유

실시예 1-1과 동일하게 발효유를 제조하되 강황 분말을 1 중량%로 첨가하는 대신 3 중량%를 첨가하여 강황 분말 3 중량%를 함유하는 발효유를 제조하였다(원유 950g, 강황 30g, 유산균 20g).

실시예 1-4. 강황 분말 10 중량%를 함유하는 발효유

실시예 1-1과 동일하게 발효유를 제조하되 강황 분말을 1 중량%로 첨가하는 대신 10 중량%를 첨가하여 강황 분말 10 중량%를 함유하는 발효유를 제조하였다(원유 880g, 강황 100g, 유산균 20g).

<비교예 1. 강황 분말 무첨가 발효유>

실시예 1-1과 동일하게 발효유를 제조하되 강황 분말을 넣지 않은 강황 분말 무첨가 발효유를 제조하였다.

<비교예 2. 강황 분말 3 중량% 혼합 발효유>

비교예 1의 강황 분말 무첨가 발효유에 강황 분말이 3 중량%가 되도록 혼합하였다.

<비교예 3. 3%[w/v] 강황 분말액>

정제수에 강황 분말이 3 중량%가 되도록 혼합하여 강황 분말액을 제조하였다(물 970g, 강황 분말 30g).

<비교예 4. 3%[w/v] 강황 추출액>

강황 200g을 물 2ℓ에 혼합하여 90℃에서 10시간 동안 추출하여 얻은 액상을 동결 건조시켜 강황 추출물을 제조하였고, 정제수에 상기 강황 추출물이 3 중량%가 되도록 혼합하여 강황 추출액을 제조하였다.

<비교예 5. 강황 추출물 3 중량%를 함유하는 발효유>

실시예 1-3과 동일하게 발효유를 제조하되 강황 분말 대신 강황 추출물을 첨가하였다. 상기 강황 추출물로는 강황 200g을 물 2ℓ에 혼합하여 90℃에서 10시간 동안 추출하여 얻은 액상을 동결 건조한 것을 사용하였다.

<실험예 1. 세포생존율 측정>

본 발명의 실시예 1-1 내지 1-4에서 제조한 강황 분말 1 내지 10 중량%를 함유하는 발효유의 세포생존율을 측정하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Co., USA) 어세이를 실시하였다.

RAW 264.7 세포(KRIBB, Korea)를 96웰 플레이트(96well microtiter plate)에 1×10⁴세포가 되도록 각 웰에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 강황 분말 1 내지 10 중량%가 함유된 발효유의 상등액을 1/10[v/v]로 희석하여 각 웰에 0.5㎕씩 처리하고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, MTT 용액을 10㎕씩 넣고 흡광도 측정기(ELISA reader, Promega, Madison, WI, USA)로 450㎚에서 흡광도를 측정하여 도 1에 나타내었으며, 이때, 강황 분말 함유 발효유 대신 대식세포를 활성화시키는 LPS(lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich Co., USA)를 처리하는 군 및 비교예 1의 강황 분말 무첨가 발효유를 처리하는 군도 함께 실시하여 나타내었다.

도 1의 MTT 어세이의 결과, RAW 264.7 세포에 강황 분말을 함유하는 발효유를 처리한 군은 농도에 관계없이 대조군(무처리군)과 유사한 세포생존율 결과를 나타내어, 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다. 또한, 도 1에는 나타내지 않았지만 실시예 1-4의 강황 분말 10 중량%를 함유하는 발효유도 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.

<실험예 2. 강황 분말을 함유하는 발효유의 유산균수 및 점도 확인>

본 발명의 실시예 1-1 내지 1-3의 강황 분말 1 내지 3 중량%를 함유하는 발효유의 0~8시간 배양액을 4시간 간격으로 채취하여 유산균수 및 점도를 측정하였다.

유산균수는 10진 희석법으로 측정하였으며, BCP(brom cresol purple, Eiken Chemical Co. Ltd., Japan) 고체 배지에 시료를 접종하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에 콜로니 카운터(colony counter, Gallenkamp Co. Ltd., England)를 사용하여 유산균수를 측정하였다. 또한, 점도 측정은 발효유를 4℃에서 24시간 동안 냉각한 후 점도계(BM type, Tokimec. Inc., Japan)를 이용하여 시료를 스핀들(spindle) No. 1, 2, 3으로 60rpm에서 1분 동안 측정하여 cP(Centi Poise) 값으로 나타내었으며, 이를 유산균수와 함께 도 2에 나타내었다.

도 2를 참고하면, 강황 분말의 첨가량이 증가함에 따라 발효유의 유산균수 및 점도가 증가하는 것으로 확인되어, 강황 분말의 첨가는 유산균 증식 및 점도 향상 효과에 영향을 미치는 것임을 확인할 수 있다.

<실험예 3. 강황 분말을 함유하는 발효유의 면역인자 확인>

실험예 3-1. 강황 분말을 함유하는 발효유의 TNF -α 및 IL-6의 단백질 발현

RAW 264.7 세포를 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10%[v/v] FBS(fetal bovine serum, Gibco, Rockville, MD, USA)와 1%[v/v] 페니실린/스트렙토마이신(100U/㎎, Sigma-Aldrich Co., USA)을 첨가하고, 24웰 플레이트(Sigma-Aldrich Co., USA)에 각 웰이 4×10⁵/㎖가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂와 대기습도가 유지되는 배양조건에서 24시간 배양하였다. 이후, RAW 264.7 세포에 본 발명의 실시예 1-1 내지 1-4의 강황 분말 함유 발효유의 배양액 및 비교예 1 내지 5는 50㎍/㎖로 처리하였으며, LPS(lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich Co., USA)의 경우에는 1㎍/㎖로 처리하여 24시간 배양하였다.

상기 세포 배양액의 상층액을 모아 ELISA 키트(enzyme-linked immune-sorbent assay kit, BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 TNF-α와 IL-6의 단백질 발현을 측정하였으며 이는 표 1 및 도 3에 나타내었다.

조건		TNF-α(pg/㎖)	IL-6(ng/㎖)
대조군(무처리군)		12500	220
LPS		341000	1200
실시예 1-1	강황 분말 1 중량% 함유 발효유	210000	520
실시예 1-2	강황 분말 2 중량% 함유 발효유	280000	790
실시예 1-3	강황 분말 3 중량% 함유 발효유	339000	950
실시예 1-4	강황 분말 10 중량% 함유 발효유	340000	930
비교예 1	강황 분말 무첨가 발효유	38000	190
비교예 2	강황 분말 3 중량% 혼합 발효유	45000	230
비교예 3	3%[w/v] 강황 분말액	31000	90
비교예 4	3%[w/v] 강황 추출액	33000	110
비교예 5	강황 추출물 3 중량% 함유 발효유	110000	460

표 1 및 도 3의 결과를 참고하면, 강황 분말 1 내지 10 중량%를 함유하는 발효유는 대조군에 비해 TNF-α의 단백질 발현은 16~27배 및 IL-6의 단백질 발현은 2~4배 더 증가된 것으로 확인되며 이 효과는 LPS와 거의 유사한 것임을 알 수 있다. 또한, 비교예 1의 강황 분말 무첨가 발효유에 비해서는 TNF-α의 단백질 발현의 경우 5~9배 및 IL-6의 단백질 발현은 2~5배 증가하는 효과를 나타내어 강황 분말 함유 발효유의 면역증강 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 3-2. 강황 분말을 함유하는 발효유의 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현

TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 분석을 위해 실험예 3-1의 조건으로 각 시료가 처리된 RAW 264.7 세포에 1㎖의 TRizol(Invitrogen Co., USA)을 넣고 10분 동안 방치한 뒤, 클로로포름(chloroform)을 넣고 10초 동안 혼합하였다. 이후, 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 얻어진 상층액에 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 12,000rpm에서 10분 동안 원심분리한 뒤, 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)을 DEPC(diethyl pyrocarbonate)를 처리한 증류수 60㎕에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. 상기 RT-PCR은 Madison 키트(Madison, WI, USA; Oligo dT, dNTP mix, Ribonuclease inhibitor, M-MLV Reverse Transcriptase, M-MLV RT 5x buffer)를 사용하였으며 반응 조건은 다음과 같다.

* RT-PCR 반응 조건 : 45℃에서 30분(1 사이클); 94℃에서 5분(1 사이클); 94℃에서 30초, 55~62℃에서 30초, 72℃에서 1분(24~27 사이클); 72℃에서 5분(1 사이클).

RT-PCR에 사용된 프라이머(primer) 서열은 하기 표 2에 나타내었으며, 각 PCR 산물은 2%[w/v] 아가로스 젤(agarose gel)에 주입하고 100V 조건에서 15분 동안 전기영동을 수행하여 도 4에 나타내었다.

Gene	Primer	Sequence
GAPDH	Forward	CCATCACCATCTTCCAGGAG
GAPDH	Reverse	ACAGTCTTCTGGGTGGCAGT
TNF-α	Forward	ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGC
TNF-α	Reverse	CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTC
IL-6	Forward	GATGCTACCAAACTGGATATAATC
IL-6	Reverse	GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG

도 4를 참고하면, 강황 분말 1 내지 3 중량% 함유 발효유가 LPS 처리군과 동일한 수준의 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 효과를 나타내고, 이는 ELISA에 따른 단백질 발현 결과와 동일한 경향을 나타내어 면역증강용 조성물로서의 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

실험예 3-3. 강황 분말을 함유하는 발효유의 NO 생성 확인

실험예 3-1의 조건으로 각 시료가 처리된 세포의 24시간 세포 배양액의 상층액을 수거한 후, 상기 상층액 50㎕와 동량의 그리스 시약(griess reagent, Sigma-Aldrich Co., USA)을 혼합하고, 15분 후 540㎚에서 흡광도를 측정하여 표 3 및 도 5에 나타내었다.

조건		NO(μM)
대조군(무처리군)		18
LPS		62
실시예 1-1	강황 분말 1 중량% 함유 발효유	63
실시예 1-2	강황 분말 2 중량% 함유 발효유	69
실시예 1-3	강황 분말 3 중량% 함유 발효유	82
실시예 1-4	강황 분말 10 중량% 함유 발효유	85
비교예 1	강황 분말 무첨가 발효유	16
비교예 2	강황 분말 3 중량% 혼합 발효유	19
비교예 3	3%[w/v] 강황 분말액	10
비교예 4	3%[w/v] 강황 추출액	11
비교예 5	강황 추출물 3 중량% 함유 발효유	33

표 3 및 도 5를 참고하면, 강황 분말 1 내지 10 중량% 함유 발효유는 대조군(무처리군)에 비해 NO의 생성이 3~5배 증가하고, 비교예 1의 강황 분말 무첨가 발효유에 비해 4~5배 더 증가하는 효과가 있음이 확인되어, 대식세포의 활성을 증가시켜 면역 활성의 지표가 되는 NO의 생성을 증진시키므로 면역증강용 조성물로서 효과가 우수함을 확인할 수 있다.

<실시예 4. 독성실험>

실시예 4-1. 급성독성

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유를 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스를 20마리를 준비하였고, 각 군별로 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유를 1.0g/㎏의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 상기 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유를 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.

실시예 4-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유를 1.0g/㎏의 농도로 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(vital scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으나 특이한 이상은 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 약학적 제제>

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 야채주스 제조

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-5. 과일주스 제조

본 발명 실시예 1-1의 강황 분말 1 중량%를 함유하는 발효유의 동결 건조 분말 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

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원유에 강황 분말 0.5 내지 10 중량%를 혼합한 다음 비피도박테리움 비피더스(Bifidobacterium bifidus), 스트렙토코쿠스 테르모필루스(Streptococcus thermophilus) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)의 혼합 유산균으로 발효한 강황 분말이 함유된 발효유를 유효성분으로 포함하며, TNF-α 및 IL-6을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 면역증강용 건강기능식품.
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