KR20140047214A

KR20140047214A - 등심초 추출물을 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 치료 및 예방용 조성물

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Publication number: KR20140047214A
Application number: KR1020120111747A
Authority: KR
Inventors: 이은경; 정규태; 박나영; 박효현; 김선건; 이지언; 서주원
Original assignee: 재단법인 한국한방산업진흥원; 명지대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-09
Filing date: 2012-10-09
Publication date: 2014-04-22
Also published as: KR101448355B1

Abstract

본 발명은 등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 추출물은 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO 및 사이토카인 (IL-1, IL-6)생성, 비만세포에서 분비되는 β-HEX, COX-2 의존적인 PGD₂, LTC₄ 생성을 억제하는 항염증 효과를 확인함으로써, 염증질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물에 이용될 수 있다.

Description

등심초 추출물을 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 치료 및 예방용 조성물 {Composition comprising an extract of Juncus effusus L. var. decipiens Buchen. for preventing and treating inflammatory disease or allergic disease}

본 발명은 등심초 추출물을 함유하는 염증질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Ritchlin CT, et al., Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest, 2003, 111:821-31

[문헌 2] Prussin C, et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117:S450-S456

[문헌 3] Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med , 2008, 14(10):461-469

[문헌 4] Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2. Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91

[문헌 5] Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am J Physiol , 1994, 267:602-608

[문헌 6] Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res , 1988, 449:281-293

[문헌 7] Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1). Neuroscience , 2002, 110:351-360

[문헌 8] Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy. Eur J Pharmacol , 2006, 533:40-56; Kitamura S, Leukotriene(B4, C4, D4, E4). Nippon Rinsho , 2005, Sl8:28-33).

[문헌 9] 정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, 1998, pp 144-145

[문헌 10] Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory responses. Immune Network 2010, 10(5), 145-152

[문헌 11] Yang JH et al., Anti-inflammatory activity of ethylacetate fraction of Cliona celata, Immunopharmacol Immunotoxicol 2011, 33(2), 373-379

[문헌 12] Son JK et al, Ginkgetin, a Biflavone from Ginko biloba leaves, inhibits cyclooxygenases-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Biol Pharm Bull 2005, 28(12):2181-84

[문헌 13] Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621

대식세포(macrophages)는 미생물 및 바이러스 감염에 대한 특이적, 비특이적 면역반응에 중요한 역할을 한다. 외부자극에 의하여 활성화된 대식세포는 NO, PGE₂, 그리고 TNF-a, IL-1과 IL-6을 포함하는 전염증 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)과 같은 다양한 염증매개물질을 생성하여 방출한다(Ritchlin CT, et al., Mechanisms of TNF-alpha- and RANKL-mediated osteoclastogenesis and bone resorption in psoriatic arthritis. J Clin Invest, 2003, 111:821-31).

비만세포(mast cells)는 골수세포에서 유래되어 조직에서 성숙 분화된 후 항원-항체 및 각종 사이토카인 등에 의해 활성화되어 염증, 알레르기 반응에 관여한다(Puxeddu I, et al., Mast cells in allergy and beyond. Int J Biochem Cell B, 2003, 35:1601-1607). 활성화된 비만세포는 이미 만들어져 과립 내에 저장되어 있던 히스타민, 지질성 매개물질인 프로스타글란딘류(prostaglandines) 및 류코트리엔류(leukotriens)과 같은 ecosanoids를 생합성하여 알레르기 반응을 증가 시킨다고 알려져 있다(Prussin C, et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. J Allergy Clin Immunol, 2006, 117:S450-S456).

염증 및 알레르기 질환을 유도하는 핵심적인 매개물질인 프로스타글란딘류(prostaglandines), 류코트리엔류(leukotriens), 혈소판활성화인자(PAF) 등은 포스포리파아제 A₂(phospholipase A₂), 시클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxygenase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 생성된다(Harizi H, et al., Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology. Trends Mol Med , 2008, 14(10):461-469).

프로스타글란딘류는 특이한 세포표면 수용체와 결합하여 cAMP(경우에 따라서는 cGMP)의 세포내 농도를 증가시키는 작용을 한다. cAMP의 증가에 의한 효과는 세포 종류에 따라 다르며 PGA₂, PGB₂는 혈압을 강하시키고(Cicardo VH, Mechanism of the hypotensive effect of prostaglandins A2 and E2, Acta Physiol Lat Am 1981, 85-91; Liu F, et al., Prostaglandin B2-induced pulmonary hypertension is mediated by TxA2/PGH2 receptor stimulation. Am J Physiol , 1994, 267:602-608), PGD₂, PGE₁은 동통, 발열 등의 염증과정에 관여한다고 알려져 있다 (Gollman HM et al., Comparative pyrogenic potency of endogenous prostanoids and of prostanoid-mimetics injected into the anterior hypothalamic/preoptic region of the cat. Brain Res , 1988, 449:281-293; Collins, et al., Cutaneous sympathetic motor rhythms during a fever-like response induced by prostaglandin E(1). Neuroscience , 2002, 110:351-360).

류코트리엔은 아라키돈산으로부터 생체에서 생성되는 국소 작용성 호르몬 그룹을 구성하며, 중요한 류코트리엔으로는 류코트리엔 B₄(LTB₄), 류코트리엔 C₄(LTC₄), 류코트리엔 D₄(LTD₄) 및 류코트리엔 E₄(LTE₄)가 있다. 이들 류코트리엔의 생합성은 효소 5-리폭시게나아제가 아라키돈산에 대하여 작용하여 류코트리엔 A₄로서 알려진 에폭사이드를 생성시킴으로써 시작되며, 이것은 연속적인 효소 반응 단계에 의해 다른 류코트리엔(LTB₄, LTC₄, LTD₄, LTE₄)으로 전환된다. 류코트리엔은 폐동맥질환, 예를 들면, 천식, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 알레르기성 비염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기 반응, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증 등의 염증 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 알레르기성 천식 치료제로서 주목을 받고 있는 약물들은 히스타민 유리억제, 류코트리엔 C₄ 생성 억제, 혈소판 활성화인자 생성 억제 활성을 동시에 가지는 약물들이다(Dahlen SE, Treatment of asthma with antileukotrienes: first line or last resort therapy. Eur J Pharmacol , 2006, 533:40-56; Kitamura S, Leukotriene(B4, C4, D4, E4). Nippon Rinsho , 2005, Sl8:28-33).

골풀과에 속하는 다년생인 등심초(Juncus effusus L. var. decipiens Buchen. = juncus decipiens ( Buchen .) Nakai)는 골풀 및 동속 근연식물의 줄기 속심 또는 전초로서, 호수초, 적수, 등심, 벽옥초, 수등심, 철등심, 저실초, 야석초라 불리며, 줄기 속심에는 섬유, 지방산, 단백질 등을 함유하고 줄기에는 다당류 성분이 함유된 것으로 알려져 있다(정보섭 및 신민교 저, 도해향약(생약)대사전, 영림사, 1998, pp 144-145).

그러나 상기 문헌 어디에도 등심초 추출물의 염증 질환 또는 알레르기 질환에 대한 효과에 대한 어떠한 개시 또는 교시된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 등심초 추출물이 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO 및 사이토카인 (IL-1, IL-6)생성, 비만세포에서 분비되는 β-HEX, COX-2 의존적인 PGD₂, LTC₄ 생성을 억제하는 항염증 및 항알레르기 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출 화합물, 보다 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 더 바람직하게는 50 내지 90% 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 염증 질환은 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병, 결장암 등을 비롯한 질환, 바람직하게는, 급성 또는 만성 염증질환, 관절염 또는 염증성 장 질환을 포함한다.

본원에서 정의되는 알레르기 질환은 비염, 천식, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염 등의 알레르기 및 알레르기 반응, 아토피성 피부염 등의 알레르기성 질환, 바람직하게는 비염, 천식, 접촉성 피부염 또는 비염 또는 아토피성 피부염을 포함한다.

이하, 본 발명의 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

예를 들어, 추출물은 원재료인 건조 상태의 등심초를 추출용매로서 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합 용매를 건조된 상기 원재료 중량의 약 1 내지 5배, 바람직하게는 2 내지 4배를 가하여, 5 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 90℃에서, 더 바람직하게는 실온 또는 80℃에서 10시간 내지 30시간, 바람직하게는 약 18 내지 25시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출법, 바람직하게는 냉침 추출법으로 추출한 후 여과하고 감압 농축하여 본 발명의 추출물을 수득가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 얻어진 등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기에서 제조된 등심초 추출물은 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO 및 사이토카인 (IL-1, IL-6)생성, 비만세포에서 분비되는 β-HEX, COX-2 의존적인 PGD₂, LTC₄ 생성을 억제하는 항염증, 또는 항알레르기 효과를 확인하였다.

본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물을 함유하는 제제는 비경구 투여, 예를 들어, 흡입형태의 스프레이(spray) 제제, 비강제, 등으로 투여됨이 바람직하다.

따라서 본 발명은 상기 제조방법으로 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 치료 및 예방을 위한 스프레이제제, 비강제 또는 점비제를 제공한다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.5 g/kg 내지 5 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 3 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 염증 질환 또는 알레르기 질환 예방을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.01 내지 95 %, 바람직하게는 1 내지 80 % 중량백분율로 포함한다.

또한, 염증 질환 또는 알레르기 질환 예방을 위한 목적으로 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

본 발명은 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료의 효과를 나타내는 상기 등심초 추출물을 포함하는 건강보조식품을 제공한다.

상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 등심초 추출물을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가제를 제공한다.

본 발명의 추출물은 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 등심초 추출물은 LPS 자극 후 대식세포에서 분비되는 NO 및 사이토카인 (IL-1, IL-6)생성, 비만세포에서 분비되는 β-HEX, COX-2 의존적인 PGD₂, LTC₄ 생성을 억제함을 확인하여, 각종 염증질환 및 알레르기 질환의 예방 및 치료용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 등심초 추출물에 대한 MTS 어세이법에 의한 세포생존율을 나타낸 도이고(도 1-A는 대식세포에서의 세포생존율, 도 1-B는 비만세포에서의 세포생존율임),
도 2-A, 2-B 및 2-C는 각각 등심초 추출물의 Nitrite 생성 억제 효과; IL-1b 생성 억제효과 및 IL-6 생성 억제효과 실험결과를 나타낸 도이며,
도 3-A, 3-B 및 3-C는 각각 등심초 추출물의 b-HEX 생성 억제 효과; PGD₂ 생성 억제 및 LTC₄ 생성 억제 효과 실험결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 생약추출물의 제조

(주)옴니허브(http://www.omniherb.com/)에서 구입한 등심초(150 g)를 75% 에탄올 15,000 ml에 60℃에서 24시간 침지시킨 후 실온에서 추출액을 수득하고, 다시 75% 에탄올 15,000 ml를 가하여 2회 더 추출하여 추출액을 모은 후, 상기 각 추출액을 여과한 여과물을 감압 회전농축기(Vaccum rotary evaporator; 일본 Nihon Seiko사, VR-205c)로 용매를 증발시키는 감압 농축 및 건조과정을 통하여 등심초 75% 에탄올 추출물 10.8 g(수율 : 7.2%, 이하, JE 추출물이라 함)을 수득하였다.

참조예 1. 실험준비

실험재료

세포 배양액인 RPMI-1640, Modifed Eagle Medium(MEM) non-essential amino acids solution, fetal bovine serum(FBS), streptomycine, penicillin 등의 세포배양용 시약들은 Hyclone사(Logan, UT, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 SCF(Stem cell factor, STEMCELL, Vancouver, Canada), LPS(Lipopolysaccharides, Sigma, St. Louis, MO, USA), IL-10(Recombinant Mouse IL-10, BD Pharmingen^TM, San Jose, CA, USA)을 구입하여 사용하였고, PGD₂ 및 LTC₄의 측정 kit은 Cayman사(Ann Arbor, MI, USA), IL 측정용 kit는 R&D System사(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.

세포배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100㎍/ml streptomycin을 포함한 DMEM(Hyclone)배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

쥐 골수 유래의 비만세포 (BMMC, mouse bone marrow-derived mast cells)는 BALB/C 마우스의 대퇴골에서 골수세포를 분리하여, 10% FBS, 100U/ml penicillin, 100㎍/ml streptomycine을 포함한 RPMI-1640 배지에 IL-3공급원으로 PWM-SCM(containing pokeweed mitogen-stimulated spleen cell-conditioned medium) 을 final 20 % 되도록 넣은 배양액으로 약 3주 정도 배양하여 90% 이상의 균질한 BMMC을 얻어 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양하였고, BMMC를 96-well plate에 일정한 수의 세포를 분주하여 실험하였다.

시료준비

실험에 사용하기 위한 시료로서 등심초 추출물을 DMSO 용매에 녹여 농도 3.1, 6.3, 12.5μg/㎖의 농도로 희석하여 사용하였다.

실험예 1. 세포 생존수 측정(MTS assay)

상기 실시예에서 얻은 시료의 MTS 어세이법에 의한 세포 생존율에 대한 효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Choi JH et al., Flowers of Inula japonica attenuate inflammatory responses. Immune Network 2010, 10(5), 145-152).

2 X 10⁵ cells/ml 농도의 대식세포(RAW 264.7 cells)와 1 X 10⁶ cells/ml 농도의 비만세포에 등심초 추출물을 농도별(12.5, 6.3, 3.1μg/㎖)로 처리하여 각각 24시간, 8시간 동안 배양한 후, 세포에 MTS용액(Promega, USA)을 처리하여 1시간 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 실험 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 처리한 등심초 추출물의 농도에서 독성을 나타내지 않았다.

실험예 2. Nitric oxide ( NO ) 및 전염증성 사이토카인 생성량 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 nitric oxide(NO) 및 전염증성 사이토카인 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Yang JH et al., Anti-inflammatory activity of ethylacetate fraction of Cliona celata. Immunopharmacol Immunotoxicol 2011, 33(2), 373-379).

RAW 264.7 세포(5Ｘ10⁵cells/well)를 24 well plate에 전 배양하여, DMEM 배지로 교체한 후 등심초 추출물을 6.25, 12.5, 25, 50 μg/ml의 농도로 1 시간동안 전 처리한 후에 LPS 100ng/ml을 각 well에 처리하여 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 24시간동안 배양한 후 상층액을 수거하여 100μl에 동량의 Griess 시약(G4410, Sigma)을 섞어 반응시킨 후 ELISA reader(Sunrise-Basic Tecan, TECAN)로 540 nm에서 흡광도를 측정하고 sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 NO의 생성량을 그래프로 나타내었다. 또한 수거한 상층액으로 전염증성 사이토카인 (TNF-α)을 ELISA kit (R&D System, USA)를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 등심초 추출물의 NO생성 저해 효과를 확인하기 위해 추출물을 전 처리한 결과, 3.1㎍/ml, 6.3㎍/ml, 12.5㎍/ml 농도에서 nitrite의 생성량이 각각 3.2mM, 2.4mM, 1.5mM의 농도로 저해효과를 나타내었다. 또한 도 2B, 2C에 나타난 바와 같이, 사이토카인을 정량한 결과 LPS를 처리한 세포상층액에서는 IL-1b의 경우 742pg/ml, IL-6의 경우 273pg/ml로 크게 증가되었으나, 등심초 추출물(3.1㎍/ml, 6.3㎍/ml, 12.5㎍/ml)을 전 처리한 세포상층액에서 IL-1b의 경우 501, 232, 105pg/ml, IL-6의 경우 268, 205, 101pg/ml로 사이토카인 생성에 대하여 농도의존적인 억제활성을 나타냄을 확인하였다.

실험예 3. β- hexaminidase (β- Hex ) 방출 억제 측정

상기 실시예의 얻은 BMMC의 탈과립 지표(marker)물질인 β-Hex 효소 활성 측정을 통해 탈과립의 정도를 확인하기 위하여, 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 하였다(Son JK et al, Ginkgetin, a Biflavone from Ginko biloba leaves, inhibits cyclooxygenases-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Biol Pharm Bull 2005, 28(12):2181-84).

2Ｘ10⁵ cells/well의 BMMC에 등심초 추출물을 농도 별로 처리 하여 37℃, 5% CO₂조건 하에서 30분 동안 전배양한 후에 KL(100ng/ml) (c-kit ligand, STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)로 자극하여 15분간 배양하고 3000rpm, 4℃ 에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 β-hex 기질[100mM citrate buffer (citric acid 0.955%, sodium citrate dihydrate 1.478%, pH 4.5), 1.3mg/ml p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide]와 1:2(w/v)의 혼합비로 혼합시키고 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨 후에 0.2M glycine(pH 10.7) (Sigma 사)으로 반응을 정지시켜 ELISA 판독기(Tecan System, San Jose, CA, USA)를 사용하여 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 그 측정값을 분비율(release %)로 환산하였다.

본 실험 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이 등심초 추출물은 1.6, 3.1, 6.3, 12.5 ㎍/ml의 농도에서 각각 18, 36, 59, 74% 저해를 하였으며, β-Hex에 대한 IC₅₀는 4.98 ㎍/ml이었다.

실험예 4. COX -2 의존적인 프로스타글란딘 PGD ₂ 생성 억제 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 COX-2 의존적인 프로스타글란딘 PGD₂ 생성에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch Pharm Res 2008, 31:617-621).

COX-2-dependent PGD₂ 생성량(generation)을 측정하기 위하여, BMMC에 1 mg/ml 아스피린(aspirin)을 2시간 처리하여 COX-1을 불활성 시킨 후에 1×10⁶ cells/ml에 등심초 추출물을 농도별로 1시간 처리한 후 LPS, IL-10, SCF 세가지를 각각 100㎍/ml, 100ng/ml, 10ng/ml 농도로 처리하여 6시간 동안 배양하고, 3000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리기(Centrifuge 5415R, Eppendorf)로 분리하여 상층액을 취하여 유리된 PGD₂를 PGD₂-MOX-EIA kit(Cayman)를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, LPS, IL-10 및 SCF에 의해 자극된 세포에서는 PGD₂의 생성량이 급격히 증가(99pg/ml)하였으며, 등심초 추출물로 전 처리한 결과 PGD₂의 생성량의 생성량은 3.1㎍/ml, 6.3㎍/ml, 12.5㎍/ml 세 농도에서 PGD₂ 생성량이 91pg/ml, 84pg/ml, 55pg/ml로 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였다.

실험예 5. 류코트리엔 ( Leukotriene , LT ) 생성량 측정

상기 실시예에서 얻은 시료의 류코트리엔(Leukotriene, LT) 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 기존 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Hua JM et al., 14.5-Methoxy-8-(2-hydroxy-3-buthoxy-3-methylbutyloxy)-psoralen isolated from Angelica dahurica inhibits cyclooxygenase-2 and 5-lipoxygenase in mouse bone marrow-derived mast cells. Arch . Pharm . Res . 2008, 31:617-621).

LT 생성을 확인하기 위해 1Ｘ10⁶ cells/ml BMMC에 등심초 추출물을 농도 별로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 1시간 동안 배양하고 SCF를 50ng/ml농도로 15분간 자극하여 3000 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리기(Centrifuge 5415R, Eppendorf)로 상층액을 분리하였다. 그 상층액 중 LTC₄ 함량을 LTC₄-EIA kit(Cayman)를 이용하여 측정하였다.

본 실험 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, SCF에 의해 자극된 세포에서는 LTC₄의 생성량이 급격히 증가(9.5ng/ml)하였다. 등심초 추출물의 LTC₄생성 저해 효과를 확인하기 위해 전 처리한 결과, LTC₄의 생성량은 0.8㎍/ml, 1.6㎍/ml, 3.1㎍/ml 세 농도에서 생성량이 각각 6.2ng/ml, 5.3ng/ml, 5.1ng/ml 로 농도 의존적으로 저해되었음을 확인하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

JE 추출물 ----------------------------------------- 20 mg

유당 --------------------------------------------- 100 mg

탈크 ---------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 10 mg

옥수수전분 ---------------------------------------- 100 mg

유당 ---------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 --------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 10 mg

결정성 셀룰로오스 ----------------------------------- 3 mg

락토오스 ----------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 ----------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 10 mg

만니톨 -------------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ------------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄ _,12H₂O ---------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 20 mg

이성화당 -------------------------------------------- 10 g

만니톨 ----------------------------------------------- 5 g

정제수 ---------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 스프레이제제의 제조

성분 및 함량 (100ml 중) (비중: 0.812g/ml)

JE 추출물 : 0.9g

글리세린 : 6.30g

스테비오사이드 (100%): 0.020g

무수에탄올 : 74.8g

통상의 스프레이 제제의 제조방법에 따라 상기 원료약품 중 글리세린 6.30g, 무수에탄올 70.0g 및 AR5 추출물 0.9g을 먼저 혼합 용해시키고, 별도로 스테비오사이드 (순도100%) 0.02g을 정제수 0.1g에 녹인 액을 상기 용액에 첨가한 후 무수에탄올 4.8g을 첨가하여 전체를 100ml로 하여 스프레이 병에 넣고 마개를 한 다음 사용 시에는 별도로 첨부 포장한 분무 장치를 마개와 교체 조립한 다음 스프레이제제로 제조한다.

제제예 7. 건강 식품의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 1000 ㎎

비타민 혼합물 ----------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ---------------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C --------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ----------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ----------------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------------ 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 --------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ------------------------------------------ 15 ㎎

제2인산칼슘 ------------------------------------------ 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 -------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 --------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 8. 건강 음료의 제조

JE 추출물 ------------------------------------------ 1000 ㎎

구연산 --------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 --------------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 -------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매에 가용한 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 염증 질환은 급성 또는 만성 염증질환, 만성 기관지염 및 관련 폐쇄성 기도 질환, 상기도염 및 비염, 관절염 또는 염증성 장 질환, 통증, 동맥경화, 심장병 질환, 다발성 경화증, 파킨슨씨 병, 알쯔하이머 병, 또는 결장암인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 알레르기 질환은 비염, 천식, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 또는 아토피성 피부염인 약학 조성물.
등심초 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 또는 환 형태인 건강기능식품.
염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 치료의 효과를 나타내는 등심초 추출물을 포함하는 건강보조식품.
제 7항에 있어서, 상기 건강보조식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 형태인 건강보조식품.
염증 질환 또는 알레르기 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 등심초 추출물을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가제.