KR101852885B1

KR101852885B1 - 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 ２―하이드록시에틸 １２―하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물

Info

Publication number: KR101852885B1
Application number: KR1020120064563A
Authority: KR
Inventors: 김순옥; 백병하; 이범진; 한효경; 이미경; 신은주; 이연희
Original assignee: 한국유니온제약 주식회사
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2018-04-27
Also published as: KR20130141271A

Abstract

본 발명은 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물에 관한 것으로, 상기 항생제 조성물은 항균 활성이 뛰어나며 특히 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주 및 다제약물 내성 균주에 대한 내성을 극복할 수 있다.

Description

세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 ２―하이드록시에틸 １２―하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물{Pharmacological composition for antibiotics comprising ceftriaxone or pharmaceutically acceptable salts thereof, sulbactam or pharmaceutically acceptable salts thereof and 2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate}

본 발명은 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물에 관한 것이다.

세프트리악손(ceftriaxone)과 같은 베타-락탐(β-lactam) 항생제가 당해 기술분야에 널리 사용되고 있다.

그런데 베타-락탐 항생제는 페니실린결합 단백 변화 또는 회피, 약물에 대한 외부 세포막의 투과성 저하, 베타-락타마제(β-lactamase) 생성, 세포막의 배출펌프(efflux pump)에 의한 약물배출 등에 의한 기전으로 베타-락타마제-매개 항생제 내성 균주가 출현하고 있어 새로운 항생제 개발이 요청되고 있다(Pfeifer Y. et al., Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens. Int. J. Med. Microbiology. 2010. vol. 300, 371-379쪽; Haekey PM and Jones AM, The changing epidemiology of resistance. J. Antimicrobial Chemotherapy, 2009. vol 64, suppl. I, i3-i10).

이러한 새로운 항생제 개발의 시도 중 하나로 베타-락탐 항생제와 베타-락타마제 억제제를 조합하여 처리하는 것이 보고되고 있다. 최근의 한 보고에 따르면 세프트리악손(ceftriaxone)과 베타-락타마제 억제제인 설박탐(sulbactam)을 조합하여 처리하면 세프트리악손을 단독으로 처리한 것에 비하여 광범위 스펙트럼 베타-락타마제(extended spectrum of β-lactamases 또는 ESBLs) 중의 일종인 CTX-M 효소를 생성하는 E. coli를 보다 효과적으로 저해할 수 있음이 밝혀졌다(Shahid et al., In vitro efficacy of ceftriaxone/sulbactam against Escheria coli isolates producing CTX-M-15 extended-spectrum β-lactamse. J. Antimicrobial Chememotherapy, doi:10. 1093/jac/dkm131).

상기와 같이 베타-락탐 항생제와 베타-락타마제 억제제를 조합하여 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주의 항생제 내성을 극복하려는 시도는 어느 정도는 성과를 거두고 있지만 여전히 다양한 기전에 의한 다제약물 내성(MDR:multidrug resistance) 균주가 발생하고 있으므로, 새로이 대두되고 있는 항생제 내성기전에 대항할 수 있는 방법이 개발되어야 할 필요가 있다(Mahamoud A. et al., Antibiotic efflux pumps in Gram-negative bacteria: the inhibitor response strategy. J. Antimicrobial Chemotherapy, 2007, vol 59. 1223-1229쪽).

특히 새로이 밝혀진 주요 내성기전으로서, 세균의 약물배출펌프가 과다발현 되어 세균에 유입된 항생제가 다시 세포 밖으로 배출되어 버림으로써 항생제가 세포내에서 유효농도를 유지하기가 어렵게 되는 경우를 주목할 필요가 있다. 세균의 약물배출펌프의 과다발현은 구조적으로 연관성이 없는 여러 종류의 항생제에 대해 내성을 나타내도록 하기 때문에 세균의 약물배출펌프를 억제하는 전략은 항생제에 대한 내성을 보다 완전하게 극복할 수 있도록 하는 데 유용한 전략이 될 수 있다.

이러한 이유로 최근에는 세균의 약물배출펌프를 억제할 수 있는 물질들을 개발하고자 하는 시도가 활발히 이루어지고 있다(Zhang et al., Efflux pump inhibitors: A strategy to combat p-glycoprotein and the norA multidrug resistance pump. Chem. Med. Chem. 2010. vol 5. 811-822쪽; Pages and Amaral, Mechanisms of drug efflux strategies to combat them: Challenging the efflux pump of gram-negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 2009, vol 1794, p826-833).

그러나 약물배출펌프 억제제로서 임상에서 사용 허가된 예는 아직 없다. 이에 본 출원인은 이미 의약품의 첨가제로서 사용되고 있어서 안전성과 유효성이 확보되어 있는 물질 중에서 약물배출펌프 억제활성이 있는 성분을 연구하여 적합한 첨가제를 찾아낸 후 이를 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 항생제 조성물에 추가함으로써, 항균활성이 뛰어나며 특히 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주 및 다제약물 내성 균주에 대한 내성을 극복할 수 있는 항생제 조성물을 개발하고자 하였다.

Pfeifer Y. et al., Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens. Int. J. Med. Microbiology. 2010. vol. 300, 371-379쪽 Haekey PM and Jones AM, The changing epidemiology of resistance. J. Antimicrobial Chemotherapy, 2009. vol 64, suppl. I, i3-i10 Shahid et al., In vitro efficacy of ceftriaxone/sulbactam against Escheria coli isolates producing CTX-M-15 extended-spectrum β-lactamse. J. Antimicrobial Chememotherapy, doi:10. 1093/jac/dkm131. Mahamoud A. et al., Antibiotic efflux pumps in Gram-negative bacteria: the inhibitor response strategy. J. Antimicrobial Chemotherapy, 2007, vol 59. 1223-1229쪽. Zhang et al., Efflux pump inhibitors: A strategy to combat p-glycoprotein and the norA multidrug resistance pump. Chem. Med. Chem. 2010. vol 5. 811-822쪽. Pages and Amaral, Mechanisms of drug efflux strategies to combat them: Challenging the efflux pump of gram-negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 2009, vol 1794, p826-833.

본 발명의 목적은 항균활성이 뛰어나며 특히 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주 및 다제약물 내성 균주에 대한 내성을 극복할 수 있는 항생제 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)를 포함하는 항생제 조성물을 제공한다.

상기 세프트리악손의 약제학적 허용염은 소듐염일 수 있고, 상기 설박탐의 약제학적 허용염도 소듐염일 수 있다.

상기 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대한 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 20:1 내지 1:20 일 수 있다. 바람직하게는 상기 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대한 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 1:2의 중량비일 수 있다.

상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트는 약물의 세포 유출에 관여하는 약물배출펌프를 억제하는 효과가 있어서 감염된 세포로의 약물의 유입을 촉진함으로써 항균효과 증진에 기여할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 주사제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 또는 좌제의 형태로 제형화될 수 있으며, 바람직하게는 주사제로 제형화되어 사용될 수 있다.

본 발명의 항생제 조성물은 예를 들어 주사용 수성용매를 더 포함하여 주사제로 제형화될 수 있다. 상기 주사용 수성용매는 주사용 정제수(멸균수), 생리 식염수 또는 글루코오스 용액일 수 있다.

상기 주사제는 필요한 경우, pH 완충제 (예를 들어, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트 등), 등장화제 (예를 들어, 글루코스, 염화나트륨 등), 안정화제 (예를 들어, 소듐 히드로겐 술피트 등), 무통화제 (예를 들어, 글루코스, 벤질 알콜, 염산 메피바카인, 염산 크실로카인, 염산 프로카인, 염산 카르보카인 등), 보존제 (예를 들어, p-옥시벤조산 에스테르, 예컨대 메틸 p-옥시벤조에이트 등, 티메로살(thimerosal), 클로로부탄올, 벤질 알콜 등) 등의 첨가제를 함유할 수 있다.

상기 주사제의 pH는 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0 일 수 있다.

상기 주사제에서 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도 범위는 0.01(중량/부피)% ~ 10(중량/부피)%일 수 있고, 바람직하게는 0.1(중량/부피)~3(중량/부피)%일 수 있다. 상기 농도 범위 내에서는 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 다제약물 내성에 관여하는 약물배출펌프(efflux pump)에 대한 억제 효과는 농도 의존적으로 증가할 수 있다.

본 발명의 항생제 조성물은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염성 질병의 치료를 위한 약학적 활성 물질로서 사용할 수 있다.

본 발명의 항생제 조성물은 항균활성이 뛰어나며 특히 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주 및 다제약물 내성 균주에 대한 내성을 극복할 수 있다.

세프트리악손은 칼슘을 함유하는 용액과 혼합하였을 때 침전이 형성되는 것으로 알려져 있어 링거액과 같은 칼슘 함유 수액과 배합하는데 문제가 있으나, 본 발명의 항생제 조성물은 칼슘함유 용액 중에서도 세프트리악손의 침전형성을 저해할 수 있어 유리하다.

본 발명은 또한 (a) 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 함유된 제1 구획;

(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 키트 제제를 제공한다.

상기 키트 제제에서 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말일 수 있다. 예를 들어, 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 공지의 동결건조 방법에 의해 동결건조된 분말일 수 있다.

상기 키트 제제에서 상기 주사용 수성용매는 주사용 정제수일 수 있다. 또한, 상기 키트제제에서 상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도 범위는 0.01(중량/부피)% ~ 10(중량/부피)%일 수 있고, 바람직하게는 0.1(중량/부피)~3(중량/부피)%일 수 있다.

상기 키트 제제는 분할 벽에 의해 나뉘어진 2개의 일체형 구획으로 이루어진 백을 포함할 수 있고, 상기 분할 벽은 제1 구획에 포함된 성분과 제2 구획에 포함된 성분을 용이하고 균일하게 혼합되게 하기 위하여 상기 제1 및 제2 구획이 서로 용이하게 통하도록 하는 방식으로 이루어 질 수 있다.

(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 주사용백을 제공한다.

상기 주사용백에서 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말일 수 있다. 예를 들어, 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 공지의 동결건조 방법에 의해 동결건조된 분말일 수 있다.

상기 주사용백에서 상기 주사용 수성용매는 주사용 정제수일 수 있다. 또한, 상기 주사용백에서 상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도 범위는 0.01(중량/부피)% ~ 10(중량/부피)%일 수 있고, 바람직하게는 0.1(중량/부피)~3(중량/부피)%일 수 있다.

상기 주사용백은 분할 벽에 의해 나뉘어진 2개의 일체형 구획으로 이루어진 백을 포함할 수 있고, 상기 분할 벽은 제1 구획에 포함된 성분과 제2 구획에 포함된 성분을 용이하고 균일하게 혼합되게 하기 위하여 상기 제1 및 제2 구획이 서로 용이하게 통하도록 하는 방식으로 이루어 질 수 있다.

(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 주사기를 제공한다.

상기 주사기에서 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말일 수 있다. 예를 들어, 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 공지의 동결건조 방법에 의해 동결건조된 분말일 수 있다.

상기 주사기에서 상기 주사용 수성용매는 주사용 정제수일 수 있다. 또한, 상기 주사기에서 상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도 범위는 0.01(중량/부피)% ~ 10(중량/부피)%일 수 있고, 바람직하게는 0.1(중량/부피)~3(중량/부피)%일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물을 세균에 감염된 포유류를 포함하는 대상체에 투여하는 세균감염 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 항생제 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 항생제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 내피 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강내 투여, 경막내 투여될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 포유류는 인간을 제외할 수 있다.

본 발명에 따른 항생제 조성물은 예를 들어, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 감염된 대상체의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 항생제 조성물은 일일 1회 또는 일정한 시간 간격을 두고 일일 2회 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 항생제 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

상기 항생제 조성물은 세프트리악손을 기준으로 성인 및 12세 이상의 경우 1일 1회, 1~2g 을 투여하며 1일 1회 4g까지 증량하여 투여할 수 있다. 생후 14일 이내 신생아의 경우 체중 kg 당 20~50 mg을 1일 1회 투여하며 체중 kg 당 50mg을 초과해서는 안 된다. 유아 및 어린이(생후 15일~ 12세)의 경우 체중 kg 당 20~80 mg을 1일 1회 투여한다.

본 발명에 따른 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물은 항균 활성이 뛰어나며 특히 벡타-락타마제-매개 항생제 내성 균주 및 다제약물 내성 균주에 대한 항균활성이 뛰어나다.

도 1은 로다민 123의 세포축적에 대한 제제학적 첨가제의 영향을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 로다민 123의 세포축적에 대한 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 영향을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 세프트리악손의 세포내유입에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세프트리악손 소듐을 각각 물, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹여 냉장 보관을 하였을 때의 세프트리악손의 안정성을 나타내는 그래프이다.
도 5는 설박탐 소듐을 각각 물, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹여 냉장 보관을 하였을 때의 설박탐의 안정성을 나타내는 그래프이다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1

세프트리악손 소듐(Ceftriaxone Sodium, Kyongbo Pharmaceutical Co., LTD., Korea) 500 mg과 설박탐 소듐(Sulbactam Sodium Sterile USP, Aurobindo Pharma LTD., India) 250 mg을 각각 무게를 달아 폴리프로필렌 재질의 시험관에 담고 여기에 0.01(중량/부피)% 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(Solutol HS®15(BASF chemical Co.)) 액을 1 mL 가하여 혼합하였다.

실시예 2

세프트리악손 소듐 500 mg과 설박탐 소듐 250 mg을 각각 무게를 달아 폴리프로필렌 재질의 시험관에 담고 여기에 0.1(중량/부피)% 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(Solutol HS®15(BASF chemical Co.)) 액을 1 mL 가하여 혼합하였다.

실시예 3

세프트리악손 소듐 1 g과 설박탐 소듐 0.5 g 및 Solutol HS®15 0.01~0.3 g을 부가하여 주사용 증류수 10 mL에 용해시켰다. 그런 다음 그 제제를 0.22 미크론 필터를 이용하여 멸균여과하고 무균 조건 하에서 멸균 바이알에 넣었다. 그런 다음 이 액을 -70^oC에서 동결시킨 다음 동결건조기를 이용하여 12시간 이상 건조하여 동결건조분말 주사제로 제제화하였다.

실시예 4

세프트리악손 소듐 1 g과 설박탐 소듐 0.5 g을 무균상태에서 주사용 유리바이알에 충전하여 주사제로 제조하였다. 그리고 따로 Solutol HS®15 0.01~0.3 g을 주사용증류수 10 mL에 녹인 다음 0.22 미크론 필터를 이용하여 멸균여과하고 무균 조건 하에서 멸균 바이알에 넣었다. 사용할 때 바이알에 무균의 0.1~3(중량/부피)% Solutol HS®15 수용액을 가하여 녹였다.

실시예 5

두 개의 구획이 분할벽에 의해 분리되어 있고 용이한 조작에 의해 서로 통할 수 있는 연질 백을 준비하였다, 상기 연질 백 내의 두 구획 중의 하나에 세프트리악손 소듐 1 g과 설박탐 소듐 0.5 g을 충전하고, 다른 구획은 무균의 0.1~3(중량/부피)% Solutol HS®15 수용액 충전하여 두어, 백 제품(키트 제제)를 제조하였다.

사용할 때 백에서 무균의 0.1~3(중량/부피)% Solutol HS®15 수용액 충전된 구획 측을 밀어서 분할벽을 개방시키고 펌핑(pumping) 작업을 2 또는 3회 수행하여 세프트리악손 소듐 1 g과 설박탐 소듐 0.5 g과 무균의 0.1~3(중량/부피)% Solutol HS®15 수용액을 혼합하였다.

실험예 1. 주사제용 첨가제류의 약물배출펌프(efflux pump) 억제 효과 평가

주사제로 사용가능한 일반적으로 안전하다고 인정된(Generally recognized as safe -listed; GRAS-listed) 약제학적 첨가제 중 아스코르브산(ascorbic acid), 니코틴아마이드(nicotinamide), 카르복시 메틸 셀룰로오스 소듐(Carboxy methyl cellulose sodium) 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트[Solutol HS®15(BASF chemical Co.)]의 in vitro 약물배출펌프검색시스템을 이용하여 주사제용 첨가제류의 약물배출펌프(efflux pump) 억제 활성을 평가하였다.

(1) 세포배양

대표적인 약물배출펌프의 하나인 P-당당백질(P-glycoprotein, P-gp)이 과다발현되어 있는 NCI/ADR-RES 세포(National Cancer Institute, US)를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)와 페니실린(50 IU/ml)/스트렙토마이신 (50 μg/ml)이 포함된 RPMI 1640 배지(Seolin Science Co.)를 사용하여 배양하였다. 모든 배양세포들은 항상 37℃에서 5% CO₂와 90% 상대 습도(relative humidity) 하에서 유지하였다.

(2) 로다민 123 축적 분석(Rhodamin 123 accumulation assay)

NCI/ADR-RES 세포를 24-웰 플레이트에 2.5x10⁵/웰로 시딩(seeding)하고 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양 후에 각각의 웰로부터 배지를 제거하고 세포를 pH 6.5 uptake buffer (조성: 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM D-글루코오스, 5 mM MES)로 3번 씻어주었다. 각각의 웰에 약물용액 (로다민 123 (8 ug/mL) 또는 로다민 123 (8 ug/mL) + 각각의 주사제용 첨가제류)를 넣고 90분간 배양하였다. 약물용액을 제거하고 ice-cold phosphate-buffered saline(PBS)으로 3번 세척하였다. 각각의 웰에 lysis buffer (0.1% TritonX + 0.3% NaOH)를 넣고 10분간 반응시켰다. 상층액을 96 웰 형광측정용 플레이트에 옮긴 후 각 샘플의 형광강도(fluorescence intensity)를 분광분석기(spectrophotometer)(Spectra Max M2e, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다(여기 파장(excitation wave length)과 발광 파장(emission wave length)은 각각 497nm 와 526nm 임). 각 샘플의 단백질의 양은 BCA(bicinchoninic acid) protein assay kit(Sigma Chemical Co.)을 이용하여 측정하였다.

(3) 결과

대표적인 약물배출펌프의 하나인 P-당당백질(P-gp)의 기질화합물인 로다민 123의 세포축적에 대한 제제학적 첨가제의 영향을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 x축은 대조군(control)과 각각의 제제학적 첨가제를 나타내며 y축은 대조군을 100%로 볼 때의 rhodamin 123의 세포축적의 백분율을 나타낸다. 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 세프트리악손의 세포내유입에 미치는 영향을 측정한 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 x축은 대조군(control)과 농도별 Solutol HS®15를 나타내며 y축은 대조군을 100%로 볼 때의 로다민 123의 세포축적의 백분율을 나타낸다.

도 1에서 나타낸 바와 같이, 실험에 이용된 첨가제 중에서 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트[Solutol HS®15(BASF chemical Co.)]가 세포내 약물 축적을 증가시키는데 효과적임을 알 수 있었다. 이는 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 NCI-ADR/RES 세포에 과다 발현되어 있는 P-gp를 억제하여 로다민 123의 세포 밖으로의 유출을 감소시키기 때문인 것임을 알 수 있었다. 또한 이러한 억제효과는 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 잘 알려진 P-gp 억제제인 사이클로스포린 A(cyclosporin A)와 유사한 정도로 약물배출펌프에 대한 억제효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2에서 나타낸 바와 같이 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트는 1 ug/mL 만큼의 낮은 농도에서도 억제효과가 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 2. 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 항생제의 세포 내 유입(cellular uptake)에 미치는 영향 평가

2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 본 발명에 따른 복합제제의 일 성분이 세프트리악손의 세포 내 유입에 미치는 영향을 평가하였다.

(1) 세포배양

NCI/ADR-RES 세포(National Cancer Institute, US)를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)와 페니실린(50 IU/ml)/스트렙토마이신 (50 μg/ml)이 포함된 RPMI 1640 배지(Seolin Science Co.)를 사용하여 배양하였다. 모든 배양세포들은 항상 37℃에서 5% CO₂와 90% 상대 습도(relative humidity) 하에서 유지하였다.

(2) 세포내유입 실험 (cellular uptake study)

NCI/ADR-RES 세포를 6-웰 플레이트에 4x10⁵/웰로 시딩(seeding)하고 24일 동안 배양하였다. 24일간 배양 후에 각각의 웰로부터 배지를 제거하고 세포를 pH 6.5 uptake buffer (조성: 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 5 mM D-글루코오스, 5 mM MES)로 3번 씻어주었다. 각각의 웰에 약물용액 (세프트리악손(10 ug/mL) 또는 세프트리악손(10 ug/mL) + Solutol HS®15 (20 ug/mL))을 넣고 20분간 배양하였다. 약물용액을 제거하고 ice-cold phosphate-buffered saline(PBS)으로 3번 세척하였다. 각각의 웰에 1 mL의 물을 넣고 30분간 가볍게 흔들어주면서 방치하였다. 각각의 웰로부터 세포를 긁어내어 일정량 (800 uL)을 각각 마이크로튜브로 옮긴 후 5분간 초음파분해(sonication) 하였다. 단백정량용으로 시료의 일부 (100 uL)를 취하여 분석 시까지 냉장 보관하고 나머지 시료에는 아세토니트릴(acetonitrile) (1400 mL)을 가한 후 강하게 혼합 (vortex)한다.

각각의 마이크로튜브를 원심분리기에 넣고 4℃에서 10분간 원심분리를 수행한 후 상층액을 취하여 감압 하에서 건조하였다. 고체상태로 건조된 시료는 분석 시까지 냉동보관 하였다. 각각의 시료중의 약물의 농도는 LC/MS/MS(API 5000 Mass Spectrometer, AB SCIEX, MA, USA)였다. 또한 각각의 시료중의 단백질의 양은 BCA protein assay kit(Sigma Chemical Co.)을 이용하여 측정하였으며, 최종적으로 LC/MS/MS분석을 통해 정량한 시료중의 약물 농도는 단백질의 양에 따라 보정하였다.

(3) 결과

2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트가 세프트리악손의 세포내유입에 미치는 영향을 측정한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 x축은 대조군(세프트리악손 처리군)과 세프트리악손 + Solutol HS®15 처리군을 나타내며 y축은 대조군을 100%로 볼 때의 세프트리악손의 세포내유입 백분율을 나타낸다.

도 3에서 나타낸 바와 같이 Solutol HS®15가 세프트리악손의 세포내 축적을 현저하게(약 2배) 증가시킴을 알 수 있었다. 이는 Solutol HS®15가 NCI-ADR/RES 세포에 과다 발현되어 있는 P-gp를 억제하여 세프트리악손의 세포 밖으로의 유출 (cellular efflux)을 감소시키기 때문인 것으로 생각되었다. 따라서 Solutol HS®15를 제제학적 첨가제로 사용할 경우 약물배출펌프가 과다발현된 내성세균에서의 세프트리악손의 항균활성이 증진할 수 있을 것으로 판단되었다.

실험예 3. 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 약물배출억제(efflux pump inhibition, EPI) 효과 평가

2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(Solutol HS®15)의 약물배출억제 효과 확인을 위해 세프트리악손 단독의 항균 활성과 배출 펌프 억제제(efflux pump inhibitor) 각각을 세프트리악손과 병용 처리하였을 때 항균 활성에 따른 억제환의 지름의 변화를 측정하였다.

(1) 실험방법

Muller-Hinton 고체배지 (MH; BBL, Sparks, MD, USA, 조성 (1 L), Beef extract powder - 2.0 g, Acid digest of casein - 17.5 g, starch - 1.5 g, Agar - 17 g))와 약물 배출억제제로 알려져 있는 CCCP(carbonyl cyanide-3-chlorophenyl hydroazone), PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide)와 Solutol HS®15을 첨가한 Muller-Hinton 고체배지를 준비하였다. 멸균하여 50℃로 식힌 Muller-Hinton 고체배지에 최종 농도가 CCCP는 5 μM/ml, PAβN은 20 μg/ml, 그리고 Solutol HS®15은 10 μg/ml과 20 μg/ml이 되도록 첨가하여 평판배지를 제조하였다. 또한 첨가하지 않은 Muller-Hinton 고체배지도 함께 제조하였다. 실험용 균주 현탁액은 대수기까지 배양한 실험 균주를 0.85 % 멸균 생리식염수에 Macfarland 0.5의 탁도로 현탁하여 준비하였다. 멸균 면봉을 이용하여 균주 현탁액을 취하여 각각의 배지의 표면에 고르게 펴서 바른 후 배지를 37℃에서 20 분간 두었다 꺼냈다. 균의 현탁액이 스며든 배지의 표면에 항생제디스크를 올려놓은 후 37℃에서 하룻밤 배양 후 억제환의 지름을 측정하였다. 세프트리악손 디스크는 30 μg의 항생제를 함유하도록 사용 당일에 제조하였다. 같은 조건으로 3반복 실험하였다.

(2) 시험균주

시험균주는 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(CCARM, Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, Seoul Women's University)으로부터 분양받은 Escherichia coli CCARM 1108, 1120 및 1121 세 균주를 사용하였고, 대조군으로 미국종균협회(American Type Culture Collection, ATCC)에서 분양받은 ATCC 25922를 사용하였다. 시험에 사용한 CCARM 균주는 선행 연구(Yoosun Jung, Hyunjin Hong, Hyeran Nam, and Yeonhee Lee. 2002. Isolation of norfloxacin resistant Escherichia coli from Han river and characterization of resistance mechanism. J. Microbiol. 40:63-69.)에서 배출 펌프를 가지고 있는 것으로 확인된 균주이다.

(3) 결과

세프트리악손 단독의 항균 활성과 배지에 CCCP, PAβN와 Solutol HS®15의 2가지 농도로 각각 첨가하였을 때의 항균 활성에 의한 억제환의 지름은 표 1과 같았다.

[표 1]

상기 표 1에서, ^a ,항생제 30 ㎍/디스크; ^b , CCCP 1 mM 첨가 배지에 항생제 30 ㎍/디스크; ^c, PAβN 20 ㎍/ml 첨가 배지에 항생제 30 ㎍/디스크; ^d , Solutol HS®15 10 ㎍/ml 첨가 배지에 항생제 30 ㎍/디스크; ^e , Solutol HS®15 20 ㎍/ml 첨가 배지에 항생제인 경우의 억제환 지름 (mm)를 나타낸다.

상기 표 1의 항균력 측정배지에 약물 배출억제제를 첨가하였을 경우의 항균활성 억제환과 이들을 첨가하지 않은 배지에서의 세프트리악손의 항균활성 억제환의 변화결과를 정리하면 표 2와 같다. 또한 이에 따른 변화가 유의적 차이가 나타나는 지를 카이제곱분석방법을 사용하여 분석하여 정리하면 표 3과 같다. 세프트리악손에 Solutol HS®15를 첨가할 경우 CCCP 또는 PAβN와 같은 배출 펌프 억제제를 첨가한 것과 같이 항균억제환의 크기가 유의적으로 증가시킴을 확인할 수 있었다, 따라서 Solutol HS®15를 제제학적 첨가제로 사용할 경우 약물배출펌프가 과다발현된 내성세균에서의 세프트리악손의 항균활성이 증진될 수 있음을 확인할 수 있었다.

[표 2]

[표 3]

실험예 4. 세프트리악손 소듐과 설박탐 소듐 용액 중 안정성에 대한 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 영향 평가

세프트리악손 소듐 500 mg과 설박탐 소듐 250 mg을 폴리프로필렌 재질의 시험관에 담고 여기에 물, 0.01% Solutol HS®15 액 또는 0.1 % Solutol HS®15 액을 1 mL 가하여 녹였다. 그런 다음 이 액을 당일에 (Day 0)에 0.45 μm 필터를 통하여 여과한 후, 물을 가지고 희석하여 HPLC정량을 실시하였다. 또한 이렇게 여과된 나머지 액을 냉장보관하면서 1일째 및 2일째에 HPLC로 정량하였다. 표준액시료는 HPLC 분석을 실시하는 날마다 새로이 제조하여 사용하였다.

(1) HPLC 시스템

Shiseido Nanospace SI-2

시료주입량: 5 μL

칼럼: Cadenza CD-C18 (Imtakt Corp. Japan, ODS, 3μm, 공경(pore size): 12 μm, 150x4.6 mm)

이동상: TBAH(tetrabutylammonium hydroxide) 완충액, pH 7.0 : 아세토니트릴 70:30

유속: 500 μL/min

검출파장: 220 nm

칼럼온도: 40℃

(2) 결과

세프트리악손 소듐을 각각 물, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹여 냉장 보관을 하였을 때의 세프트리악손의 안정성을 도 4에 나타내었다. 도 4에서 x축은 냉장 보관 후의 일수(Days)를 나타내며 y축은 냉장보관 초기의 세프트리악손 양을 100%로 볼 때의 세프트리악손 양의 백분율을 나타내고 5회 반복실험의 결과를 나타낸다. 설박탐 소듐을 각각 물, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹여 냉장 보관을 하였을 때의 설박탐의 안정성을 도 5에 나타내었다. x축은 냉장보관 초기의 설박탐 양을 100%로 볼 때의 설박탐 양의 백분율을 나타내고 5회 반복실험의 결과를 나타낸다.

세프트리악손과 설박탐은 물이나, 0.01(중량/부피)% 및 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15에 녹여 냉장보관할 때 실험한 2일까지 안정하게 유지되었다(도 4 및 도 5 참조). 세프트리악손의 경우, 물에 녹였을 경우에는 2일째에 초기량(0일째)의 106.7±8.6%로, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹였을 때에는 102.6±5.3%로, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹였을 때에는 104.6±9.5%로 유지되었다. 설박탐도 이와 유사하게 물에 녹였을 때에는 2일째에 초기량의 96.9±8.4%, 0.01(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹였을 때에는 93.7±7.1%로, 0.1(중량/부피)% Solutol HS®15 액에 녹였을 때에는 94.3±8.3%로 유지되었다.

상기 실험 결과로부터 판단해볼 때, 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 주사용제에 첨가한다고 하더라도 세프트리악손이나 설박탐의 안정성에 유의할 만한 부정적인 영향을 미치는 않음을 확인할 수 있었다. 또한 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트는 0.1(중량/부피)% 정도의 농도는 세프트리악손과 설박탐에 대한 주사용제로 사용가능함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 인 비트로(in vitro) 항균력 평가

(1) 실험방법

본 발명에 따른 항생제 조성물의 항균력을 측정하기 위하여 CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute)의 방법에 따른 Minimal Inhibitory Concentration (MIC) 시험을 수행하였다. 서울여자대학교 항생제 내성 균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes(CCARM), Seoul Women's University)으로부터 분양받은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa, 기탁번호: CCARM 2148)의 MIC 시험은 Muller Hinton Ⅰ 배지(MH; BBL, Sparks, MD, USA)를 사용한 평판배지희석법으로 수행하였다. 시료는 세프트리악손, 설박탐과 Solutol HS®15로 이들을 각각 배수 희석하여 배지와 혼합 후 최종 농도가 0.25 ㎍/㎖ ~ 128 ㎍/㎖되도록 제조하였다. 또한 배지 내 최종 농도가 세프트리악손의 1/2이 되도록 설박탐을 혼합하여 배지를 제조하였다. Solutol HS®15이 일정 농도 (20 ㎍/㎖)가 혼합된 배지에 세프트리악손, 세프트리악손 + 설박탐을 첨가하여 최종 농도가 0.25 ㎍/㎖ ~ 128 ㎍/㎖되도록 제조하였다. 설박탐은 세프트리악손 농도의 1/2이 되도록 첨가하였다.

(2) 결과

인 비트로(in vitro) 항균력 평가 결과는 하기 표 4와 같다.

[표 4]

상기 표 4에서, 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 세프트리악손, 설박탐, Solutol HS®15, 세프트리악손 + 설박탐 및 세프트리악손 + 설박탐 + Solutol HS®15 처리 시의 MIC 값을 나타낸다 (MIC 값은 균주의 성장을 억제할 수 있는 최소 농도임).

Solutol HS®15은 측정한 균주에 대해 측정 최고 농도인 128 ㎍/ml에서 항균 활성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 세프트리악손 + 설박탐 + Solutol HS®15 처리 시의 MIC 값은 각각 세프트리악손, 설박탐, 세프트리악손 + 설박탐 처리 시의 MIC 값보다 1/4, 1/8, 1/2로 감소하여 2 내지 8배의 병용효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

Claims

세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate)를 포함하는 항생제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세프트리악손의 약제학적 허용염은 소듐염이고, 상기 설박탐의 약제학적 허용염이 소듐염인 항생제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대한 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 20:1 내지 1:20인 항생제 조성물.
제3항에 있어서, 상기 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 대한 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 중량비는 1:2인 항생제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항생제 조성물은 주사용 수성용매를 더 포함하여 주사제로 제형화된 것인 항생제 조성물.
제5항에 있어서, 상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도는 0.01(중량/부피)% ~ 10(중량/부피)%인 항생제 조성물.
제6항에 있어서, 상기 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트의 농도는 0.1(중량/부피)% ~ 3(중량/부피)%인 항생제 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염성 질병의 치료를 위한 약학적 활성 물질로서 사용하기 위한 항생제 조성물.
(a) 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 함유된 제1 구획;
(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 키트 제제.
제9항에 있어서, 상기 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말인 것인 키트 제제.
제9항에 있어서, 상기 주사용 수성용매는 주사용 증류수인 키트 제제.
(a) 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 함유된 제1 구획;
(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 주사용백.
제12항에 있어서, 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말인 것인 주사용백.
제12항에 있어서, 상기 주사용 수성용매는 주사용 증류수인 주사용백.
(a) 세프트리악손(ceftriaxone) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐(sulbactam) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이 함유된 제1 구획;
(b) 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트(2-hydroxyethyl 12-hydroxyoctadecanoate) 및 주사용 수성용매가 함유된 제2 구획을 포함하며, 상기 제1 구획 및 제2 구획이 사용 시 서로 통할 수 있도록 구성되어 있는 주사기.
제15항에 있어서, 상기 세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 분말인 것인 주사기.
제15항에 있어서, 상기 주사용 수성용매는 주사용 증류수인 주사기.
세프트리악손 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 설박탐 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 2-하이드록시에틸 12-하이드록시옥타데카노에이트를 포함하는 항생제 조성물을 인간을 제외한 세균에 감염된 포유류를 포함하는 대상체에 투여하는 세균감염 치료 방법.
제18항에 있어서, 상기 세균은 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)인 세균감염 치료 방법.