RO122247B1

RO122247B1 - Compoziţii farmaceutice de tizoxanidă şi nitazoxanidă

Info

Publication number: RO122247B1
Application number: ROA200500768A
Authority: RO
Inventors: Jean-Francois Rossignol
Original assignee: Romark Laboratories L.C.
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2009-03-30
Also published as: AR008355A1; CO4950538A1; ZA983849B; PL193556B1; RS50046B; ID24828A; YU57199A; LT99141A; RS20070379A; LT4751B; US5968961A; CU23318A7; BG65679B1; US6117894A; RS49831B

Abstract

Prezenta invenţie se referă la o compoziţie farmaceutică ce conţine ca agent activ cel puţin un compus ales dintre:un compus cu formula (I)şi un compus cu formula (II)pentru tratamentul infecţiilor convenţional patogene la persoane cu sistemul imunitar compromis sau diminuat şi pentru tratamentul infecţiilor cu trematode.

Description

Agentul activ este de preferință sub formă de particule având o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm și o dimensiune medie a particulei mai mare de 10 pm.

Invenția se referă de asemenea la compoziții farmaceutice stabilizate cu cel puțin un acid acceptabil farmaceutic.

Compozițiile farmaceutice sunt utile în mod special pentru tratamentul infecțiilor convențional patogene la persoane cu sistemul imunitar compromis sau diminuat, și pentru tratamentul infecțiilor cu trematode.

Există o necesitate urgentă în privința dezvoltării metodelor de tratament al unui număr de infecții cu paraziți și bacterii la oameni cu sistemul imunitar compromis (SIDA, pacienți cu cancer, vârstnici, îmbătrâniți, pacienți cu transplant de organe aflați sub tratament cu medicamente de inhibiție a imunității). O altă zonă de interes sunt infecțiile cu trematode, în special în climatele tropicale. Astfel este evidentă necesitatea unor compoziții farmaceutice care pot fi tolerate de oamenii cu sistem imunitar compromis, și care sunt stabile la depozitare chiar și în medii tropicale.

Mai specific, Toxoplasma gondii este un protozoar și este printre cauzele cele mai răspândite în lume ale infecțiilor latente, ale sistemului nervos central. Mulți oameni sănătoși sunt infestați cu parazitul, dar, de regulă, sistemul imunitar menține organismul sub control. T. gondii este cel mai comun patogen convențional al creierului pacienților cu SIDA. în prezent toxoplasmoza devine o problemă tot mai mare, nu numai din cauza pacienților cu SIDA, dar și din cauza utilizării tot mai extinse a medicamentelor care produc inhibiție a imunității (de exemplu așa cum sunt administrate pacienților cu transplant de organe). Toxoplasmoza este tratată uzual cu o combinație de pirimetamină și sulf adiazină. Deși medicamentele sunt eficiente, ele nu omoară chisturile parazitului, astfel că tratamentul trebuie continuat ca doză de menținere.

Toxicitatea forțează de multe ori întreruperea medicamentului, mai ales la cei imunodepresivi, ceea ce are ca rezultat recidivarea. Statisticile nu sunt favorabile, având o rată raportată a mortalității de aproximativ 70 procente la pacienții imunodeficitari și o supraviețuire medie de patru luni.

Criptosporidioza este cauzată de un parazit protozoar microscopic Cryptosptoridium parvum. La persoanele cu funcții imune normale, diareea cauzată de C. parvum poate fi intensă și prelungită, dar este autolimitată la pacienții cu SIDA, diareea criptosporidială este frecvent o amenințare a vieții. Este estimat că 15-20 procente dintre pacienții cu SIDA suferă de această stare. Până în prezent nu există o terapie efectiv eficientă sau agreată a criptosporidiozei. Patogenul identificat cel mai frecvent la pacienții cu SIDA este Enterocytozaan

RO 122247 Β1 bieneusi, un parazit microsporidian care a fost găsit la aproximativ un sfert dintre pacienți. 1 în prezent pare că acest minuscul parazit poate fi considerat că ar cauza o mare parte dintre multele cazuri neexplicate de malabsorbție, diaree și pierdere în greutate observată la 3 pacienții cu HIV. Până în prezent nu se cunoaște un tratament eficient.

Alte câteva specii de microsporidia care infestează pacienții HlV-pozitivi includ 5 Lacephalitozaon hellem și cuaiculiși o nouă specie denumită Sepiata intestinalis. Un raport recent sugerează că diseminarea infestărilor microsporadiene prezintă o importanță 7 crescută.

Infecția cu parazitul Isospora belii este nediferențiabilă clinic de criptosporidioză. 9 Comună mai ales în climatele tropicale, /. belii a fost raportată la mai puțin de 1 % dintre pacienții din SUA, deși în prezent incidența sa este probabil mai mare. 11

Pneumocystis carinii a fost clasificat în general ca un parazit protozoic; unele studii indică faptul că ar putea fi un fung, cu care împarte anumite secvențe genetice. P. carinii 13 infestează în mod uzual plămânii (Pneumocystis carinii Pneumonia (PCP)). S-a raportat că terapia are succes la aproximativ 40-60% dintre pacienți, cu probleme care includ toxicitatea 15 medicamentelor în special în cazul pacienților cu sistemul imunitar compromis. Printre manifestările foarte serioase ale infestării cu virusul imunodeficienței umane (HIV) la copii, 17 PCP ocupă un loc special din cauza incidenței sale lărgite, distribuției unice de vârstă și a mortalității frecvente. PCP este infectarea convențional patogenă comună cea mai impor- 19 tantă la copiii cu infecție HIV; incidența PCP între copii infectați cu HIV care nu primesc profilaxie este estimată ca fiind de cel puțin 12% în primul an de viață. Mulți dintre copii mor la 21 scurt timp după dezvoltarea PCP.

Mycobacterium Avium Complex (MAC) se referă la infecțiile cu o familie sau cu orga- 23 nisme microbacteriale foarte asemănătoare, Mycobacterium Avium și M. intracellulare.

Atunci când se produce MAL la perosoane care nu au sistemul imunitar compromis, de 25 regulă este sub forma unei infecții a tractului respirator. La pacienții cu SIDA, MAC este frecvent diseminată (HAC diseminată sau DMAC) și poate fi implicat orice sistem de organe. 27 într-un studiu recent a fost găsit MAC la 43% dintre pacienții care au supraviețuit timp de 2 ani după diagnosticarea SIDA. Nu este stabilită o terapie standard pentru MAC diseminată. 29 De regulă sunt prescrise combinații de medicamente și dacă au succes, este necesar ca tratamentul să fie continuat pe viată. Un tratament mai eficient reprezintă o necesitate 31 urgentă.

Cei infectați cu HIV sunt în mod particular susceptibili la infecții cu Mycobacterium 33 tuterculosis, și evoluția bolii este accelerată. Dacă tuberculoza extrapulmonară este neobișnuită în cazul pacienților care nu sunt infectați cu HIV, aceasta este frecventă în cazul per- 35 soanelor HlV-pozitive. CDC a eliberat câteva linii de ghidare pentru tratamentul TB, care se adresează în special TB rezistent la multiple medicamente (MDE-TB). Mortalitatea în rândul 37 pacienților cu SIDA, cauzată de MDR-TB, este foarte ridicată (aproximativ 80%) și progresarea bolii este extrem de rapidă. 39 în consecință, există o necesitate urgentă de dezvoltare a unei metode de tratament pentru aceste infecții foarte răspândite și periculoase pentru oameni și animale. 41

De asemenea, este necesar un medicament cu spectru larg, pentru simplificarea tratamentului infecțiilor cu trematode. în prezent, este necesar să fie diagnosticat patogenul 43 trematodic specific și apoi să fie prescrisă terapia medicamentoasă specifică pentru acea trematodă. Multe dintre țările mai puțin dezvoltate nu au echipamentul necesar pentu diag- 45 nosticarea trematodei specifice. Dezvoltarea unui medicament cu spectru larg de acțiune va elimina necesitatea diagnosticării. 47

RO 122247 Β1

Schistosama mansoni, trematodul sângelui, este agentul care cauzează Schistosomiazis, cea de-a doua boală parazitică tropicală, ca importanță, la om (după malarie) și cea mai importantă infecție cu trematodă la om. Schistosama haematabium este o altă specie importantă care infecteză omul. în lume, peste 200 de milioane de indivizi suferă de Shistosomiazis, incluzând câteva sute de mii de persoane în Statele Unite.

Fasciola hepatica, trematodul comun al ficatului, este în principal o boală a oilor, dar oamenii sunt gazde accidentale. Parazitul reușește să supraviețuiască în prezența unui răspuns imunologic viguros al gazdei. Pentru tratament a fost sugerat bithionol, dar acesta nu este aprobat pentru utilizare în Statele Unite.

în consecință, există necesitatea unei compoziții farmaceutice care este stabilă la depozitare chiar și în medii tropicale și care are un spectru larg de acțiune împotriva trematodelor.

S-a observat acum prin studii pe animale și prin studii clinice pe oameni că eficacitatea unui tratament, folosind compuși cu formulele I și II, depinde de dimensiunea particulelor de substanță activă medicamentoasă și de stabilitatea compușilor.

Compozițiile farmaceutice descrise sunt adecvate pentru tratamentul infecțiilor cu trematode la oameni și la animale, cauzate de Schistosoma cum arfi Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma mekongi, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum; Fasciola cum ar fi Fasciola hepatica și Fasciola gigantica, Fasciolopsis biski; și Dicrocoelium dendriticum, Heterophyes heterophyes și Metagonimus yokogawa.

Compozițiile farmaceutice sunt de asemenea eficiente pentru tratamentul celor cu sistemul imunitar compromis, al infecțiilor convențional patogene cu Cryptosporidium parvum, Isospora belii, Enterocytzoon bieneusi, Encephalitazoon intestinalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, Pneumocystis cariniiși Toxoplasma gondii.

Compoziția farmaceutică poate fi într-o formă adecvată administrării orale, cum ar fi o formă de dozare solidă, o suspensie lichidă sau o pastă.

Scurtă descriere a desenelor

Pentru o înțelegere deplină a naturii și a obiectelor prezentei invenții, se vor face referiri în continuare, în descrierea detaliată, la desenele care o însoțesc, și în care:

- fig. 1 arată inhibiția procentuală și viabilitatea celulei gazdă a nitazoxanidei împotriva F. intestinalis;

-fig. 2 arată inhibiția procentuală și viabilitatea celulei gazdă a nitazoxanidei împotriva V. corneae;

- fig. 3 arată inhibiția procentuală și viabilitatea celulei gazdă a albendazolului împotriva F. intestinalis;

- fig. 4 arată inhibiția procentuală și viabilitatea celulei gazdă a albendazolului împotriva V. corneae;

- fig. 5 și 6 arată un grafic al valorilor OD obținute pentru fiecare adâncitură de cultură T. gondii vs concentrația medicamentului în cultură;

- fig. 7 este un grafic bazat pe testarea eficienței nitazoanidei împotriva creșterii micobacteriilor într-un mediu nutritiv lichid;

- fig. 8 arată procentul de particule active având o dimensiune mai mică de 0 pm.

Metoda de tratament al infecțiilor conform prezentei invenții cuprinde administrarea unei compoziții farmanceutice care conține ca agent activ cel puțin un compus selectat din grupul care constă din desacetil-nitazoxanidă cu formula I:

OH

NO (I)

RO 122247 Β1 și nitazoxanidă cu formula II: 1

Nitazoxanida (NTZ), compusul cu formula II este denumirea generică pentru 2-(aceto- 7 liloxi)-N-(5-nitro-2-tiazolil)benzamidă, un compus sintetizat pentru prima dată de Rossignol și Cavier în 1975.2 mg de nitazoxanidă pot fi dizolvate în 1 ml de DMSO. Nitazoxanida este 9 ușor absorbită oral.

Până acum nu s-a pus în evidență că, compușii cu formulele I și/sau II pot avea un 11 spectru larg de acțiune împotriva infecțiilor cu trematode sau că pot fi suficient de non-toxici pentru a fi tolerați chiar șt de oamenii cu sistem imunologic compromis. 13

Prepararea și anumite utilizări ale nitazoxanidei sunt dezvăluite în brevetul US 3950351 și în publicații ale prezentului inventator. Dezacetil-nitazoxanida este compusul 15 cu formula I la care se fac uneori referiri ca d-NTZ și este un metabolit al nitazoxanidei.

în WO 95/28393, invenția dezvăluie o metodă pentru obținerea compusului cu 17 formula II, pur, și de asemenea utilizarea compoziției care conține un amestec de compuși cu formulele I și II. 19

S-a observat acum că particulele solide ale compusului cu formula I, compusului cu formula II sau ale amestecului acestora, având o dimensiune a particulei între 170 și 520 pm 21 (dimensiunea medie a particulei = 352 pm), au eficiență limitată atunci când sunt administrate oral la oameni și la animale. Eficacitatea acestor particule este inferioară produselorfar- 23 maceutice existente și ca atare inacceptabilă pentru scopuri de reglementare sau comerciale. 25

De asemenea, s-a observat la câini că administrarea orală a unei singure doze de 50 mg per kilogram, de particule solide de compus cu formula I și de compus cu formula II, 27 având o dimensiune a particulei mai mică de 5 pm, a cauzat reacții adverse severe la animale. 29

S-a descoperit acum că pentru a avea un tratament eficient și sigur al infecțiilor cauzate de paraziți, bacterii, fungi și viruși la oameni și la animale, compozițiile farmaceutice 31 fie ca forme de dozare solide sau ca suspensii apoase trebuie să conțină doza eficientă a agentului activ sub formă de particule solide având o dimensiune a particulei mai mică de 33 200 pm și conținând compus cu formulele I și/sau II, dimensiunea medie a particulei pentru particulele solide active fiind mai mare de 10 pm. 35

Prezența unui conținut ridicat de particule de agent activ având o dimensiune mai mare de 200 pm față de conținutul de particule având o dimensiune cuprinsă între 5 și 37 200 pm reduce semnificativ activitatea chemoterapeutică a compușilor. De preferință, compozițiile farmaceutice conform invenției nu conțin mai mult de 5% în greutate de particule 39 active solide având o dimensiune mai mare de 200 pm. Cel mai de preferat, compozițiile farmaceutice conform invenției nu conțin substanțial particule active solide având o dimensiune 41 mai mare de 200 pm.

Prezența unui conținut ridicat de particule de agent activ având o dimensiune mai 43 mică de 5 pm față de conținutul de particule având o dimensiune cuprinsă între 5 și 200 pm poate produce efecte adverse la animale sau la oameni. în plus, s-a observat că particulele 45 având o dimensiune mai mică de 5 pm sunt mult mai ușor absorbite din tractul gastrointestinal în fluxul sanguin și ca atare nu sunt la fel de eficiente împotriva paraziților, 47 bacteriilor, fungilorși virușilor, care de regulă trăiesc în tractul gastro-intestinal al animalelor și al oamenilor. 49

RO 122247 Β1

Un om de știință, specialistîn domeniu, nu ar fi putut prevedea că dimensiunea particulelor de compus cu formula I și de compus cu formula II ar fi putut avea un impact atât de important asupra activității lor antimicrobiale la animale și la oameni. De exemplu, în studiile conduse de inventator, compușii antiparazitari, cum ar fi albendazol, mebendazol, niclosamidă, praziquantel și metronidazol, nu au prezentat o diferență atât de bine marcată a activității lor antiparazitare la animale sau oameni, care să fie dependentă de dimensiunea particulelor lor. în plus, un om de știință specialist nu ar fi putut prevedea că dimensiunile particulelor compusului cu formula I și ale compusului cu formula II ar fi putut avea un astfel de impact advers asupra abilității animalelor sau a oamenilor de a tolera administrarea agentului activ menționat.

Compusul (compușii) cu formulele I și II pot fi administrați fie sub o formă de dozare solidă sau ca suspensie apoasă, și este de preferat ca, compoziția farmaceutică să conțină doza eficientă de agent activ cu formulele I și/sau II sub formă de particule solide având o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm, dimensiunea medie a particulelor solide menționate fiind mai mare de 10 pm, așa cum este determinată cu un Coulter® Counter LS 100. Acest aparat folosește lumina laser la 750 nm, pentru a măsura prin difracția luminii particule cu diametrul de la 0,4 la 900 pm. Mostrele sunt măsurate în apă cu a mică cantitate de Triton X-100, cu scopul de a crește umectabilitatea și de a deflocula pulberea.

Este avantajos ca dimensiunea medie a particulelor să fie între 10 și 100 pm, de preferință între 20 și 50 pm. Exemple de compoziții preferate sunt:

- o compoziție pentru care mai puțin de 10% în greutate dintre particulele active solide menționate au o dimensiune a particulei mai mare de 100 pm;

- o compoziție pentru care cel puțin 50% în greutate dintre particulele active solide menționate au o dimensiune a particulei mai mică de 50 pm.

Este avantajos ca dimensiunea medie a particulelor active solide menționate să fie între 10 și 100 pm, de preferință între 20 și 50 pm. în concordanță cu un aspect preferat al compoziției, mai puțin de 10% dintre particulele active solide menționate au o dimensiune a particulei mai mică de 5 pm.

Agentul sau agenții activi utilizați în forma de dozare solidă sau în suspensie este avantajos să fie un amestec de particule solide de compuși cu formula I și cu formula II, cu o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm, conținutul în greutate al compusului cu formula I față de greutatea compușilor cu formula I și cu formula II ai amestecului menționat fiind cuprins între 0,5 și 20%, de preferință între 0,5 și 10%.

Această invenție se referă de asemenea la compozițiile farmaceutice descrise mai sus, pentru care este avantajos să conțină cel puțin un acid acceptabil farmaceutic. Exemple de astfel de acizi sunt: acid citric, acid glutamic, acid succinic, acid etansulfonic, acid acetic, acid tartric, acid ascorbic, acid metansulfonic, acid fumărie, acid adipic, acid malic și amestecuri ale acestora. Acidul citric este foarte potrivit. Prezența acidului menționat îmbunătățește stabilitatea agentului sau agenților activi.

Raportul dintre greutatea acidului acceptabil farmaceutic/greutatea particulelor active solide menționate este avantajos să fie între 0,01 și 0,5, de preferință între 0,03 și 0,2. în mod avantajos, cantitatea de acid este suficientă, pentru a ajusta pH-ul suspensiei între 2 și 6, de preferință între 3 și 5, și cel mai de preferat între 3,5 și 4,5.

Tehnicile de preparare și exemplele preferate, și de asemenea și formele de dozare lichide și solide ale compozițiilor farmaceutice sunt dezvăluite în WO/95/28393, al cărui conținut este încorporat aici prin referință. Compozițiile conțin, în mod avantajos, un agent de umectare și posibil un derivat de amidon ca aceia dezvăluiți în brevetul US 5578621, al cărui conținut este încorporat aici prin referință, pentru dezvăluirea posibililor agenți de umectare și derivați de amidon. Agentul de umectare așa cum este descris în US 5578621 servește ca un agent de dispersie.

RO 122247 Β1

Astfel de compoziții farmaceutice, fie ca forme de dozare solide sau lichide sau ca 1 paste sau unguente, pot conține opțional agenți activi suplimentari cum ar fi antibiotice, agenți anti-virali sau inhibitori pompă de protoni. Deși nu este avantajos, este de asemenea 3 posibil ca astfel de formulări farmaceutice să conțină particule active solide de compus cu formula I și/sau compus cu formula II care sunt mai mari de 200 pm. 5

Compozițiile pot conține excipienți cunoscuți ca atare, în scopul preparării formelor adecvate pentru administrare orală. 7

Avantajos, pentru a avea o eficiență excelentă împotriva unui spectru larg de paraziți, bacterii, fungi și viruși, factorul de distribuție a particulelor active solide menționate este 9 cuprins între 0,8 și 2, de preferință între 1,1 și 1,9, și cel mai de preferat mai mare de 1,5, factorul de distribuție menționat fiind calculat prin următoarea formulă: 11 ^90% ⁼ (Φθο% Φιο%)! (Φθο% ⁺ Φιο%) i 2) în care: 13

- F_go% este factorul de distribuție la 90%,

Φθο% ^es*^e dimensiunea maximă a particulei din fracția de particule corespunzătoare 15 la 90% din particulele active solide menționate, și

- φ_1ο«_/ο este dimensiunea maximă a particulei din fracția de particule corespunzătoare 17 la 10% din particulele active solide menționate.

Conform unui aspect specific al invenției, particulele unui compus cu formulele I 19 și/sau II sunt preparate prin metodele descrise anterior și sunt apoi măcinate astfel încât mai puțin de 10% din particulele active menționate sunt mai mari de 100 pm, mai puțin de 50% 21 din particulele menționate sunt mai mari de 50 pm și mai puțin de 10% din particulele active menționate sunt mai mici de 5 pm ca dimensiune, dimensiunea medie a particulei fiind între 23 20 și 50 pm. Particulele menționate sunt apoi granulate, folosind un amestec care conține particule active solide și cel puțin un agent de granulare. Exemple de agenți de granulare 25 sunt: polivinilpirolidonă, apă, alcool, sucroză hidroxilceluloză și amestecuri ale acestora. Avantajos, se adaugă cel puțin un acid acceptabil farmaceutic în timpul procesului de 27 granulare.

Invenția se referă la forme de dozare solide, cum ar fi tablete, tablete dispersabile, 29 tablete acoperite, matrice etc. Forma de dozare conform invenției conține, de exemplu:

- particule active solide cu o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm, mai 31 puțin de de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mare de 100 pm, mai puțin de 50% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mare de 50 pm și mai 33 puțin de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mică de 5 pm, dimensiunea medie a particulei fiind între 20 și 50 pm; 35

- cel puțin un agent de granulare;

- cel puțin un agent de umectare; 37

- cel puțin un derivat de amidon, și

- cel puțin un acid acceptabil farmaceutic, care este adăugat de preferință în cursul 39 procesului de granulare.

Formele de dozare lichide, cum arfi suspensiile apoase conform invenției, conțin, de 41 exemplu:

- ca agent activ, particule solide conținând un compus cu formula I și/sau un compus 43 cu formula II având o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm, mai puțin de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mare de 100 pm, mai puțin de 50% dintre 45 particulele menționate având o dimensiune mai mare de 50 pm și mai puțin de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mică de 5 pm și 47

- cel puțin un agent de granulare;

RO 122247 Β1

- cel puțin un agent de umectare;

- cel puțin un acid acceptabil farmaceutic, pH-ul suspensiei fiind între 2 și 6, de preferință între 3 și 5, și cel mai de preferat între 3,5 și 4,5;

- cel puțin un agent de îngroșare, spre ezemplu o gumă Xantan, gumă aguar, celuloză cristalină, gumă carruba, carboximetilceluloză sau un amestec al acestora.

Formele de paste și unguente conform invenției, adecvate pentru administrare orală, conțin, de exemplu:

- ca agent activ, particule solide conținând un compus cu formula I și/sau un compus cu formula II având o dimensiune a particulei mai mică de 200 pm, mai puțin de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mare de 100 pm, mai puțin de 50% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mare de 50 pm și mai puțin de 10% dintre particulele menționate având o dimensiune mai mică de 5 pm și

- cel puțin un agent de umectare;

- cel puțin un agent de îngroșare, spre exemplu o gumă xantan, gumă aguar, celuloză cristalină, gumă carruba, carboximetilceluloză sau un amestec al acestora.

Formele de paste și de unguente pentru aplicare topicală sau intravaginală conțin, de exemplu:

- cel puțin un agent de umectare;

- alcool cetilic și/sau derivați de gliceridă și/sau propilenglicol;

Descrierea preparării compozițiilor farmaceutice

Se macină compus cu formula I, pur și uscat, și compus cu formula II, pur și uscat, și se dimensionează cu ajutorul unei site.

După măcinare, particulele de compus cu formula I, cu formula II și amestecurile acestora au distribuția dimensiunilor particulelor așa cum este dată în fig. 8. Fig. 8 arată procentul de particule având o dimensiune mai mică de φ pm.###

Din figura menționată se observă că:

- mai puțin de 10% în greutate dintre particule au o dimensiune a particulei mai mică de aproximativ 5 pm;

- mai puțin de 10% în greutate dintre particule au o dimensiune a particulei mai mare de aproximativ 70 pm;

- dimensiunea medie a particulei este de aproximativ 40 pm;

- factorul de distribuție al particulelor este de aproximativ 1,73, factorul de distribuție menționat fiind calculat cu formula următoare:

F9o% ⁼ (Φθο% Φιο%) ! (Φθο% ⁺ Φιο%) ! 2) în care:

Fg₀% este factorul de distribuție la 90%,

RO 122247 Β1

- 090% ^este dimensiunea maximă a particulei din fracția de particule corespunzătoare 1 la 90% din particulele active solide menționate, și

- φ₁₀._/ο este dimensiunea maximă a particulei din fracția de particule corespunzătoare 3 ia 10% din particulele active solide menționate.

Exemple specifice de astfel de compoziții sunt dezvăluite în următoarele tabele: 5

Tabelul 1 7

Exemple de compoziții de tablete dispersabile pentru administrare orală, conținând compus cu formula II și compus cu formula I ca agenți activi 9

Nitazoxanidă (99%) + dezacetil-nitazoxanidă (1%)	200 mg
Celuloză microcristalină
Avicel pH 102, vândut de FMC-USA	116 mg
Crospovidonă	25 mg
Stearat de magneziu	3 mg
Bioxid de siliciu coloidal	5 mg
Acid citric	10 mg
Aroma de căpșuni no. 877720, vândută de Robertet	10 mg
Zaharinat de sodiu	2 mg

Tabelul 2 21

Exemple de compoziții de tablete acoperite pentru administrare orală, conținând compus cu formula II și compus cu formula I ca agenți activi 23

Nitazoxanidă	500 mg
Amidon de porumb	60 mg
Amidon de porumb pregelatinizat	70 mg
Hidroxipropil metilceluloză	5 mg
Sucroză	20 mg
Amidon glicolat de sodiu	30 mg
Acid citric	25 mg
Talc	8 mg
Stearat de magneziu	7 mg

Acoperiri:

Soluție caldă de zahăr sau un film de acoperire care este sprayat pe tablete sau 35 granule conținând 500 mg de agent activ.

RO 122247 Β1

Tabelul 3

Exemplu de suspensie apoasă pemtru administrare orală, conținând compus cu formula II și compus cu formula I ca agenți activi. pH-ul suspensiei a fost de aproximativ 4,1

Nitazoxanidă (98%) + dezacetil-Nitazoxanidă (2%)	2 mg
Apă distilată	100 ml
Benzoat de sodiu	0,2 g
Zaharoză	30,5 mg
Guma Xantan	0,2 g
Celuloză microcristalină și carboximetilceluloză de sodiu
Avicel RC-591, vândut de FMC-USA	0,8 g
Acid citric	0,2 g
Citrat de sodiu dihidrat	50 mg
Aromă de căpșuni No. 877720, vândută de Bobertet	125 mg
Colorant roșu No. 33 D și C	1 mg

Tabelul 4

Exemplu al unei paste pentru administrare orală, conținând compus cu formula II și compus cu formula I ca agenți activi

Nitazoxanidă (98%) + dezacetil-Nitazosanidă (2%)	500 mg
Ulei mineral	10g
Zahăr brun	ig
Celuloză microcristalină și carboximetilceluloză de sodiu
Avicel RC-591 vândut de FMC	0,8 g
Acid citric	0,2 g

Tabelul 5

Exemplu al unei formulări de pastă sau unguent pentru aplicare intravaginală sau topică, pasta sau unguentul menționat conținând compus cu formula II și compus cu formula I ca agenți activi

Nitazoxanidă (98%) + dezacetil-Nitazoxanidă (2%)	8g
Cremafor A6	2g
Cremafor A25	1,5g
Ulei mineral	7g
Luvitol EHO	7g
Glicerol monoester	4g
Alcool cetilic	3g

RO 122247 Β1

Tabelul 5 (continuare) 1

Simeticon	0,5 g
Germaben II	ig
Propilenglicol	3,5 g
Apă distilată	62,5 g

Compozițiile farmaceutice conform invenției sunt compoziții care au un spectru larg 7 de acțiune asupra paraziților, bacteriilor fungilor și a virușilor, în special când sunt administrate oral. 9

Eficacitatea și siguranța compozițiilor farmaceutice dezvăluite anterior aici sunt excelente la animale și la oameni. Mai ales, în studiile clinice la oameni se observă că, 11 compozițiile farmaceutice descrise aici anterior sunt în mod semnificativ mai eficiente în tratamentul infecțiilor cu paraziți decât unele formulări care utilizează compus activ având 13 dimensiunile particulelor între 170 și 520 pm (dimensiunea medie a particulei = 352 pm), chiar atunci când particulele dimensionate mai mare au fost administrate la pacienți în doze 15 până la de trei ori mai mari și pentru perioade de timp mai lungi. Exemple de rate de vindecare obținute sunt prezentate mai jos în tabelul 6. 17

Tabelul 6 19

Comparație între rezultatele studiilor clinice umane folosind compușii cu formula I și formula II având dimensiunile particulelor în domeniul cuprins între 170 și 520 pm 21 (dimensiunea medie a particulelor = 352 pm) și rezultatele obținute folosind compușii cu formula I și formula II având dimensiunile particulelor în domeniul de la 5 la 200 pm 23 (dimensiunea medie = 34 pm)

Compus cu formula (I) (98%) + Compus cu formula (II) (2%) 25

Parazit	Diemensiunile particulelor 170 la 520 pm Doza = 15 la 50 mg/kg/zi timp de 3 la 7 zile Nr. vindecați/Total = % Rata de vindecare	Diemensiunile particulelor 5 la 200 pm Doza = 15 la 50 mg/kg/zi timp de 3 zile Nr. vindecați/Total = % Rata de vindecare
Blastocystis hominis	12/27 = 44%	10/10 = 100%
Entamoeba histolytica	29/47 = 62%	106/133 = 80%
Giardia lamblia	11/37 = 30%	50/73 = 68%
Ascaris lumbricoides	3/69 = 4%	144/179 = 80%
Trichuris trichiura	7/48= 15%	58/79 = 73%

Pentru fiecare dintre paraziții listați în tabelul 6, ratele de vindecare proporționale au fost semnificativ mai bune pentru pacienții tratați cu particule active între 5 și 200 pm decât 39 pentru cei tratați cu particule active cu dimensiuni în domeniul de la 170 la 520 pm, semnificația statistică fiind în fiecare caz p<0,02 (folosind un test standard X²). Rezultatele au fost 41 aceleași și în cazul în care dozele de particule de agent activ cu dimensiuni mai mari și durata tratamentului a fost deseori mai lungă decât cea administrată pacienților care au 43 primit compoziții farmaceutice de agent activ având dimensiunile mai mici de 200 pm. Nu au fost raportate efecte adverse serioase pentru fiecare grup de pacienți. 45

RO 122247 Β1

Rezultate similare cu cele descrise anterior pentru studiile umane au fost de asemenea observate la testele pe animale.

în plus, reacțiile adverse observate la câini după administrarea orală a unei singure doze de 50 miligrame per kilogram de compus cu formula I și de compus cu formula II nu se observă în studiile extinse la animale folosind compus cu formula I și compus cu formula II având o dimensiune a particulelor între 5 și 200 pm (mediu >10 pm) chiar și atunci când aceeași doză sau doze mai mari de compuși se administrează zilnic timp de 90 zile sau mai mult.

Mai mult, compușii menționați sunt stabili (chiar și atunci când sunt supuși la temperaturi de 40°C și umiditate relativă de 65% timp de șase luni sau în cazul suspensiilor lichide, dacă sunt suspendate în apă, în aceste condiții, timp de 3 luni), asigurând astfel că ingredientele active nu se degradează și că se menține eficacitatea compoziției pe o perioadă de timp după preparare, care este corespunzătoare pentru scopurile medicale și cele comerciale.

în continuare, se va demonstra eficacitatea compozițiilor farmaceutice.

Exemplul 1. Cryptosporidium parvum într-un trial clinic preliminar, 30 de pacienți cu SIDA, cu diaree cronică cryptosporidială, sunt tratați pe cale orală cu nitazoxanidă, de la 500 la 2000 mg pe zi. Dacă diareea continuă, pacienții primesc în plus, timp de încă patru săptămâni, nitazoxanidă până la 2000 mg pe zi.

Douăzeci și opt de persoane fac o terapie completă două sau mai multe săptămâni și 16 dintre aceștia sunt evaluabili pentru un răspuns terapeutic până într-a opta săptămână de tratament. în acest ultim grup, 12 persoane prezintă o reducere de 50 procente sau mai mult a frecvenței mișcării intestinale zilnice și 10 indivizi prezintă o reducere marcantă sau eradicare a parazitului în fecale, organismul devenind nedetectabil la patru persoane. Șase pacienți se bucură atât de îndeplinirea criteriilor clinice, cât și a răspunsului parazitologic.

Pacienții care primesc doze de medicament mai mari, perioade mai îndelungate, par să aibă șanse mai mari pentru un răspuns pozitiv.

Un studiu al nitazoanidei pentru SIDA corelată cu diaree cryptospodială a demonstrat scăderea mișcării intestinale printre persoanele care au luat 500,1000, 1500 sau 2000 mg de medicament zilnic. Participanții la trial au o medie CD4+ numărată de 42 celule/mm²(domeniu 0-303 celule/mm²), o medie de 6,7 mișcări intestinale zilnic, pentru o durată medie de 15 luni, oochiste de Cryptosporidium parvum în fecale și fără alți patogeni enterici aparenți. Aproape la toți participanții terapia cu azitromicină sau paromomicină a eșuat.

După 23 de săptămâni, 9 din 13 au un răspuns clinic complet (unu la trei au format predominant mișcări intestinale zilnic), și 4 la 13 au un răspuns clinic parțial (cel puțin o scădere de 50 procente a mișcării intestinale zilnice sau o schimbare a consistenței fecalelor, astfel încât 75 procente sunt stabilizați). Până la sfârșitul studiului, 8 din 11 au parazitul complet eradicat și ceilalți trei prezintă o reducere substanțială a nivelului de oochiste. Este o tendință de obținere a unui răspuns mai bun la doze de 1000 mg zilnic sau mai mari și cu o terapie mai îndelungată. Doi dintre participanții la trial prezintă erupție de urticarie pe piele; mai mult de 90 procente au aderat la regimul de studiu pentru mai mult de patru săptămâni.

Exemplul 2. Cryptosporidium parvum

Doza informativă in vitro

Nitazoxanida se dizolvă în dimetisulfoxid steril (DMSO) și se testează împotriva infectării monostraturilor de celule cu C. parvum la concentrații de 100 pg/ml, 10 pg/ml, 1 pg/ml și 0,1 pg/ml. Se efectuează al doilea trial în care este testată nitazoxanida la o concentrație suplimentară de 20,2,0,2 și 0,02 pg/ml. Aceste concentrații se ating prin diluții în serie cu mediu DMEM complet pentru a rezulta o concentrație finală de DMSO de 0,5%. Mediul de control a contactat de asemenea 0,5% DMSO.

RO 122247 Β1

Pentru experiment se folosește o cultură de celule MDBKF5D2 Cells crescute în 1 camere de 7 mm, și ca Cryptosporidium parvum: oochiste GCH1, 5x10⁴ per adâncitură, și este condus pentru a compara paromomicina (control pozitiv) cu nitazoxanida (madicament 3 experimental). Materialele includ (1%) Ser de Iepure Sporozit Imun Anti Cryptosporidium parvum și (1 %) Anticorp Fluorescein-Conjugat Capră Anti-lepure. 5

Testul de toxicitate

200 pl de mediu conținând nitazoxanida la concentrații de 100,10,1 și 0,1 pg/ml se 7 introduc în două adâncituri ale unei plăci cu 96 de adâncituri, conținând monostraturi de celule MDBKF5D2 confluente și două adâncituri fără monostraturi. Medicamentul se 9 incubează pe monostraturi la 37“C și 8% CO₂. La 24 (trial 1) și la 48 h (trial 2), se adaugă în fiecare adâncitură MTS (soluția lui Owen), PMS la concentrații de 333 pg/ml și respectiv 11 25 pM. Placa se reintroduce în incubator la întuneric, pentru a se dezvolta timp de 2 h. La două ore se transferă câte 100 pl din fiecare supernatant pe o nouă placă macrotiter și se 13 citesc în cititorul ELISA la 490 nm. Rezultatele sunt înregistrate și analizate. Toxicitatea procentuală este calculată prin scăderea densității optice medii (OD) a supernatantelor 15 medicamentului din densitatea optică medie (OD) a supernatantelor mediului de control (fără medicament), împărțit la OD a mediului de control și înmulțit cu 100. 17

ODmediu - ODmedicament 19

----------------------------------x 100

ODmediu 21

Analiza Inact. Oochistelor C. parvum 23

5x10⁴ oochiste C. parvum per adâncitură sunt incubate în nitazoxanidă (100, 20,10,

2, 1,0,2, 0,1 și 0,02 pg/ml) la 37°C (8% CO₂) pe monostraturi de celule MDBKF5D2 con- 25 fluente. Nivelul infecției în fiecare adâncitură este analizat prin analiză de imunofluorescență la 24 și 48 h. Procentul de inhibiție este calculat prin scăderea numărului mediu de paraziți 27 numărați 10 loturi în adânciturile cu medicament de testat din numărul mediu de paraziți numărați/10 loturi în mediul de control (fără medicament), împărțit prin numărul din mediul 29 de control și apoi înmulțit cu 100.

Număr în mediul de control - Număr în medicament 31

Număr în mediul de control

Rezultate: 33

Trial 1:24 h 35

Compus	Concentrație 1	Medie (+ SD)*	Toxicitate procentuală	Inhibiție procentuală
Mediu infectat	0	983,5 (±128,2)	0	0
Paromomocin	2 mg/ml	482 (±47,1)	23,8	51
NTZ	100 pg/ml	Pierdut	88,1	NA**
	10 pg/ml	55,5 (±13,5)	65,1	94,4
	1 pg/ml	224,5 (±28,5)	8,3	77,2
	0,1 pg/ml	474,5 (±29,5)	19,3	51,8

*Paraziți numărați/10 loturi 43 **Nu este disponibil datorită toxicității

RO 122247 Β1

Trial 2: 48 h

Compus	Concentrație	Medie (+ SD)*	Toxicitate procentuală	Inhibiție procentuală
Mediu infectat	0	2231,25 (+90,03)	0	0
Paromomocină	2 mg/ml	580 (+33,42)	40,8	74,01
NTZ	20 pg/ml	68,75 (+13,77)	92,87	96,92
	2 pg/ml	113,75 (+21,36)	24,93	94,90
	0, 2 pg/ml	1020 (+158,48)	16,56	54,29
	0,02 pg/ml	1041 (+191,46)	21,23	53,33

‘Parazit Numărat/10 Loturi

Impactul nitazoxanidei asupra oochistelor C. parvum inact.

în trialul 1, nitazoxanida la concentrații de 10, 1 și 0,1 are ca rezultat o inhibiție a nivelului paraziților de 94,4,77,2 și respectiv 51,8%, și un nivel al toxicității celulelor de 65,1, 8,3 și respectiv 19,3%. Deși la 10 pg/ml se produce o inhibiție aproape completă a parazitului, a fost evident un rating ridicat al toxicității. La 1 pg/ml de nitazoxanidă, inhibiția parazitului și toxicitatea celulară este favorabilă comparativ cu paromomicina la o concentrație de 2 mg/ml (77,2% inhibiție a parazitului și 8,3% toxicitate pentru nitazoxanidă la 1 pg/ml comparativ cu 51% inhibiție a parazitului și 23,8% toxicitate celulară pentru paromomicina la 2 mg/ml).

în trialul 2, medicamentul este modificat pentru a se obține o distribuție a dozei mai bună cu minimul de toxicitate. în consecință, culturile au rămas viabile timp de 48 h în loc de 24 h ca în trialul 1. Incubația timp de 48 h are ca rezultat creșterea relativă a toxicității celulare așa cum este evident din examinarea paromomicinei în ambele trialuri. Concentrația de 20 Mg/ml de nitazoxanidă este încă prea toxică la 48 h de incubație, deși monostratul de celule părea să fie încă intact. Este posibil ca toxicitatea ridicată care trebuie să afecteze funcțiunea celulei să aibă impact asupra infectării/dezvoltării parazitului. La 2 pg/ml de nitazoxanidă, este o inhibiție considerabilă a infecției cu parazit cu o toxicitate celulară relativ scăzută. Diluțiile următoare au ca rezultat o inhibiție semnificativă și o toxicitate scăzută. La o concentrație a medicamentului de 2 pg/ml, toxicitatea celulară moderată și activitatea inhibitoare de 94,90% au indicat că nitazoxanida la 2 pg/ml este superioară paromomicinei pentru infecțiile cu C. parvum in vivo la 2 mg/ml (de exemplu o concentrație de 1000 de ori mai mare).

Exemplul 3. Cryptosporidium parvum

Informare despre doze și depozitare in vitro

Stocuri de nitazoxanidă și de dezacetil-nitazoxanidă (NTZ și NTZdes) sunt testate împotriva monostraturilor celulare infectate cu sporozite excizate la concentrații de 10,1,0,1, și 0,01 pg/ml. Fiecare compus este dizolvat în 100% dimetilsulfoxid (DMSO) și diluat la concentrația dorită cu DMEM steril. Fiecare concentrație de nitazoxanidă și mediile de control au un conținut de 0,025% DMSO ca o constantă.

Experimentul folosește o cultură de celule MDBKF5D2 Cells crescută în camere de 7 mm, și ca Cryptosporidium parvum: oochiste GCH1,5x 10⁴ per adâncitură, și este condus pentru a compara paromomicina (control pozitiv) cu nitazoxanida (medicament experimental). Materialele includ (1%) Ser de Iepure Sporozit Imun Anti-Cryptosporidium parvum și (1%) Anticorp Fluorescein-Conjugat Capră Anti-lepure.

RO 122247 Β1

Analiza de testare a toxicității

I

200 μΙ de mediu conținând soluție de nitazoxanidă la concentrațiile premenționate și mediile de control (martor) adecvate sunt introduse în două adâncituri ale unei plăci cu 96 de adâncituri, conținând monostraturi de celule MDBKFD2 confluente și două adâncituri fără monostraturi. Medicamentul este incubat pe monostraturi la 37°C și 8% CO₂. La 48 h sunt adăugate în fiecare adâncitură MTS (soluția lui Owen) și FMS la concentrații de 333 pg/ml și respectiv 25 μΜ. Placa este reintrodusă în incubator la întuneric, pentru a se dezvolta timp de 2 h. La 2 h se transferă câte 100 μΙ din fiecare supernatant pe o nouă placă macrotiter și se citesc în cititorul ELISA la 490 nm. Rezultatele sunt înregistrate și analizate. Toxicitatea procentuală este calculată prin scăderea densității optice medii (OD) a supernatantelor medicamentului din densitatea optică medie (OD) a supernatantelor mediului de control (fără medicament), împărțit la OD a mediului de control și înmulțit cu 100.

ODmediu - ODmedicament x 100

ODmediu

Scorurile de citotoxicitate sunt atribuite după cum urmează: 0,5%toxicitate=0,6-25% toxicitate = 1,26 - 50% toxicitate = 2, 51-75% toxicitate = 3 și 76-100% toxicitate = -4. Ca un standard, scorurile de citotoxicitate de 0 sau 1 ar fi considerate ca niveluri acceptabile de toxicitate. Scorurile de toxicitate de 2, 3 sau 4 sunt considerate un nivel ridicat de toxicitate față de monostratul de celule.

Analiza Inact. Oochistelor C. parvum

5x10⁴ oochiste C. parvum per adâncitură sunt incubate în concentrațiile menționate anterior de nitazoxanidă la 37°C (8% CO₂) pe monostraturi de celule MDBKF5D2 confluente. Nivelul infecției în fiecare adâncitură este analizat prin analiză de imunofluorescență computerizată la 48 h. Procentul de inhibiție este calculat prin scăderea numărului mediu de paraziți numărati/lot în adânciturile cu medicament de testat din numărul mediu de paraziți numărați/lot în mediul de control (fără medicament), împărțit prin numărul din mediul de control și apoi înmulțit cu 100.

Număr în mediul de control - Număr în medicament x 100

Număr în mediul de control

Rezultate:

Analiza oochistelor C. parvum (48 h)

Medica- mente	Conc.	Parazit	±SD	Tox/OD	±SD	% Inhib	% Tox	Scor
Medii apoase	0	681,58	±271,02	2,024	±0,18	0	0	0
Paromomi- cină	2000	115,75	±44,65	1,219	±,009	83,02	39,79	2
Mediu DMSO 0,025%	0	628,50	±171,94	1,799	±1,45	0	0	0

RO 122247 Β1

Tabel (continuare)

Medica- mente	Conc.	Parazit	±SD	Tox/OD	±SD	% Inhib	% Tox	Scor
NTZ	10	11,75	±7,33	,413	±0,13	98,13	77,07	4
	1	39,67	±13,13	1,618	±,326	93,69	10,09	1
	0,1	643,42	±229,73	1,878	±,154	<0	<0	0
	0,01	714,33	±194,79	1,617	±,072	<0	10,12	1
NTZdes nou	10	13,75	±6,66	,337	±,005	97,81	81,27	4
	1	39,92	±13,49	1,710	±,033	93,65	4,97	0
	0,1	649, 86	±152,19	1,505	±,119	<0	16,29	1
	0,01	749,33	±139,49	1,721	±,144	<0	4,36	0

Conc. - yg/ml; Parazit - Media paraziților numărați/lot (12 loturi analizate): % Inhib - Inhibiția procentuală a infecției cu paraziți; % Tox - Toxicitatea procentuală a celulelor de către medicament.

Se poate observa din cele anterioare că activitatea Inhibitoare a NTZdes este aceeași ca a NTZ din exemplul 2.

Ambele, nitazoxanida și dezacetil nitazoxanida, sunt egale ca eficiență in vitro împotriva Cryptosporidium parvum atunci când sunt testate în paralel cu o inhibiție de 98 și 94%, obținută pentru 10 și respectiv 1 pg/ml din fiecare compus. Pentru nitazoxanidă, 1 pg/ml este concentrația cea mai scăzută care a dat mai mult de 90% inhibiție, în timp ce inhibiții de 50% se pot obține cu concentrații de nitazoxanidă mai scăzute, cum ar fi 0,2, 0,1 și 0,02 pg/ml. în aceleași condiții experimentale, paromomicina utilizată ca și control pozitiv este de 2000 de ori mai puțin eficientă cu concentrații de inhibare cuprinse în domeniul de la 51 la 83% la o concentrație de 2000 pg/ml.

Exemplul 4. E. intestinalis și V. cornea

Celule 2RK-13 (linie de celule din rinichi de iepure) sunt adăugate la o placă de cultură cu 24 de adâncituri la o concentrație de 2,6 x 105 celule per adâncitură (1,0 ml mediu; KPM11640 cu 2 mM L-glutamină și 5% ser fetal bovin inactivat termic). Vasele sunt incubate la 37’C într-un incubator cu CO₂ peste noapte timp, în care adânciturile sunt confluente (cu o dublare, se vor estima 5x10⁵ celule per adâncitură).

La celulele gazdă se adaugă organisme Septata intestinalis (țesut derivat de cultură) la un raport de 3:1 comparativ cu celulele gazdă estimate sau la 15x10⁶ organisme per adâncitură. Acest raport are ca rezultat infectarea a aproximativ 50% dintre celulele gazdă).

Medicamentele sunt dizolvate în DMSO, apă sau metanol (în funcție de solubilitate), pentru a genera stocuri de 1,0 mg/ml. Stocurile sunt depozitate la -70’C. Diluțiile folosite în experimente sunt făcute în medii de cultură de țesut complete. Toate diluțiile sunt testate în adâncituri triplicat.

Mediul este înlocuit la fiecare trei la patru zile (conținând medicamente proaspăt diluate).

în ziua a șasea (după adăugarea parazitului și a medicamentului), celulele sunt examinate pentru toxicitate. Celulele de control care au primit medicamente, dar nu și paraziți, sunt examinate pentru confluență, morfologie a celulelor și prezență a celulelor moarte sau plutitoare. Celulele incubate numai cu paraziți sunt examinate pentru a confirma că paraziții sunt infecțioși (adică prezența de vacuole parazitoforus). Celulele incubate cu parazit și medicamente sunt evaluate ca toxicitate a celulelor gazdă și numărul relativ de vacuole parazitoforus (adică ridicat, mediu sau scăzut).

RO 122247 Β1 în ziua a zecea, la adânciturile de cultură se adaugă 100 μΙ de SDS 10% (0,5% con- 1 centrație finală) pentru distrugerea membranelor celulelor gazdă și pentru a cauza eliberarea microsporidiilor. Numărul total de paraziți prezenți în fiecare adâncitură este determinat prin 3 numărarea unui alicot pe un hemacitometru. Rezultatele sunt exprimate ca procent de inhibiție (relativ la celulele infectate care nu au primit medicament). 5

Rezultatele sunt redate în fig. 1-4.

Exemplul 5. Toxoplasma gondii 7

Nitazoxanida și dezacetil nitazoxanida sunt testate împotriva parazițilorși specific la tulpina RH de Toxoplasma gondii, menținută prin treceri în serie în șoareci. Culturile de 9 celule de MRC5 fibroblaste (Brio-Merieux, Franța), cultivate în microplăci cu 96 de adâncituri, sunt inoculate cu T. gondii. La fiecare adâncitură de cultură, cu excepția a 8 adâncituri de 11 control (controale negative), se adaugă 200 de tachizoite proaspăt recoltate. După 4 h de incubare, în culturi se adaugă diluțiile de medicament. 13

Nitazoxanida (WFZ) și dezacetil nitazoxanida (dNTZ) sunt testate la concentrații din domeniul cuprins între 8x10^ și 40 mg/l. Medicamentele sunt dizolvate inițial în DMSO la o 15 concentrație de 2 mg/ml, apoi în mediile de cultură se prepară diluții înseriate. Nu se observă precipitare. 17

Diluțiile de medicamente sunt adăugate în culturi (8 adâncituri pentru fiecare diluție), apoi plăcile de cultură sunt incubate timp de 72 h. Culturile sunt apoi fixate cu metanol rece. 19 Evaluarea creșterii T. gondii este realizată prin ELISA, folosind anticorp anti T. gondii de iepure marcat cu peroxidază. Valorile densității optice sunt înregistrate pentru fiecare 21 adâncitură.

Rezultatele sunt prezentate prin reprezentarea grafică a valorilor OD obținute pentru 23 fiecare adâncitură de cultură, vs concentrația medicamentului în cultură. Analiza statistică a constat în analiza regresiei interval de siguranță de 95% și determinarea curbelor doză - 25 răspuns din valorile OD generate pentru fiecare medicament.

O placă se colorează cu Giemsa, pentru a se examina efectul citoparic în culturi. 27

Se realizează trei experimente separate. în fiecare experiment se folosesc două plăci de cultură pentru fiecare compus; în fiecare placă de cultură se folosesc câte 8 adâncituri 29 duplicate, pentru fiecare concentrație de medicament.

Rezultate 31 în trei seturi de experimente s-au obținut rezultate similare. Reprezentările grafice ale rezultatelor câte unui experiment reprezentativ pentru fiecare medicament sunt arătate în 33 fig. 5 a, b, c și 6 a, b, c.

Nitazoxanida (fig. 5 a. b. c.) 35

Nu se observă efect inhibitor pentru concentrații cuprinse în domeniul între 10⁴ mg/l și 0,3 mg/l. Un efect semnificativ se observă pentru concentrații >0,6 mg/l cu o inhibiție 37 completă a creșterii Toxoplasma pentru concentrații >2,5 mg/l. în plus pentru concentrații >2,5 mg/l, se observă o toxicitate marcantă pe monostratul de celule. 39

Examinarea microscopică a monostratului arată că NTZ, la o concentrație de 1,25 mg/l induce efect citopatic pe celulele parazitate, cu creșterea vacuoleler parazitofore 41 și reducerea numărului de paraziți intracelulari. Prin analiza de regresie concentrația de inhibiție de 50% este estimată la 1,2 mg/l. 43

Dezacetil nitazoxanida (fig. 7 a. b. c)

Rezultate similare se obțin cu dezacetil nitazoxanida: nici un efect pentru concentrații 45 cuprinse între 10⁴ și 0,3 mg/l, inhibiție pentru concentrații 0,6 mg/l și o toxicitate marcată pentru concentrații >2,5 mg/l. Concentrația de inhibiție de 50% a putut fi estimată la 1,2 mg/l. 47

RO 122247 Β1

Rezultatele obținute sunt reproductibile pentru trei experimente separate cu evaluarea efectului inhibitor al medicamentului pe culturi repetate pentru fiecare concentrație de medicament.

Pentru ambele NTZ și dezacetil NTZ, se observă o inhibiție marcată a creșterii Taxoplasma la concentrații de aproximativ 1,2 mg/l, cu alterarea vacuolelor parazitofore, dar fără o alterare marcată a parazitului însuși.

Aceste rezultate indică faptul că aceste medicamente prezintă o activitate bună împotriva T. gondii și că se poate preconiza un efect terapeutic in vivo, bazat pe obținerea unei concentrații de aproximativ 1 mg/l în ser sau țesuturi.

Exemplul 6. Mycobacteria

S-a observat că nitazoxanida are activitate antimicrobială împotriva organismelor TB. Tabelele următoare arată o probă a MIC pentru nitazoxanidă și tizoxanidă împotriva Mycrobacterium intracellular, realizată prin tehnica diluției cu agar. Aceste rezultate sunt bazate pe câteva experimente, fiecare dintre acestea cu o durată de circa 3 săptămâni, pentru metoda de diluție cu agar, folosind agar Middlebrook. Datele obținute indică faptul că nitazoxanida are un MIC împotriva Mycrobacteria de 2 pg/ml și tizoxanida are un MIC de 4 pg/ml, folosind o tulpină standard de Mycrobacterium intracellular de la ATCC și proba standard de diluție cu agar.

MIC ale nitazoxanidei și tizoxanidei la Mycobacteria intracellular

MIC
Nitazoxanida	2 pg/ml
Tizoxanida	4 pg/ml

‘MIC au fost determinate prin diluția standard cu agar, folosind agar Middlebrook 7H11, timp de 3 săptămâni. S-a folosit M. intracellular ATCC 13950, o tulpină standard.

Fig. 7 este un grafic bazat pe proba eficienței nitazoxanidei împotriva creșterii microbacteriiior într-o suspensie lichidă. Am folosit proba HTS colorimetrică, care ne-a permis să determinăm creșterea în 4 h și nu în 3 săptămâni ca în cazul metodei de numărare cu agar. Așa cum se poate vedea din datele din fig. 7, atunci când nitazoxanida este adăugată la 72 h după inițierea culturii, are un efect imediat asupra continuării creșterii în comparație cu creșterea în mediul de control singur. Doza de 3 pg/ml de nitazoxanidă oprește creșterea pentru următoarele 24 h, apoi este o creștere slabă în următoarele 2 zile. Doza de 50 pg/ml este complet bacteriostatică în cele 144 h de cultură.

Exemplul 7. Cryptosporidium parvum

Efectul nitazoxanidei este testat împotriva Cryptosporidium parvum pe șoareci infectați experimental. Nitazoxanida este furnizată de Romark Laboratories, L.C. din Tampa, Florida.

Doza umană totală (1 g/zi, timp de 7 zile i.e. 7 g) este modificată pentru utilizare la șoareci, conform cu Paget și Barnes. Doza umană este înmulțită cu 0,0026 pentru șoareci (cântărind aproximativ 20 g), pentru a se obține cantitatea totală dorită de medicament penru fiecare gazdă, dimineața și seara, timp de 7 zile consecutiv. Fiecare șoarece a primit 2,6 mg/zi (7000 mg x 0,0026/7). Dozele au fost administrate pe gură, folosind o seringă din plastic echipată cu un ac de tip rotunjit.

Douăzeci (20) de șoareci sugari de 2 zile sunt infectați prin administrarea orală a 100.000 de oochiste de Cryptosporidium parvum obținute de la viței proaspăt fătați infectați, înainte de a fi administrate la șoareci, oochistele sunt concentrate, folosind o soluție de zahăr, conform tehnicii descrise de Fayer și Ellis. în fiecare zi s-au obținut și s-au examinat tampoane rectale de la fiecare șoarece, folosind tehnica de colorare Niehl-Neelsen, modificată descrisă de Graczyk și colab. Eliminarea de oochiste a apărut în fecale la două zile după infectarea

RO 122247 Β1 orală a animalelor. în a treia zi care a urmat după infectarea animalelor, 10 șoareci au primit 1,3 mg de nitazoxanidă, dimineața și seara, timp de 7 zile consecutiv, în timp ce ceilalți 10 șoareci rămași au fost păstrați ca și controale netratate. S-au obținut tampoane rectale zilnic pe timpul celor 7 zile de tratament și tot zilnic pe timpul a încă 7 zile care au urmat după terminarea tratamentului. Oochistele au fost suspendate în ulei și numărate per 100 de loturi la microscop.

Rezultate

Rezultatele din tabelul următor indică foarte clar că nitazoxanida administrată la o doză zilnică de 2,6 mg/zi timp de 7 zile consecutiv este eficientă împotriva Cryptosporidium parvum, prin reducerea numărului de oochiste din fecalele șoarecilor infectați în comparație cu animalele de control. Medicamentul determină scăderea eliminării oochistelor prin fecale la 6 din 10 șoareci tratați, la sfârșitul celei de-a treia zile de tratament. La sfârșitul tratamentului, în a 7-a zi, are loc o reducere completă a eliminării de oochiste, toate animalele tratate având un rezultat negativ la examinarea fecalelor comparativ cu șoarecii netratați de control. Acest efect a durat cel puțin 7 zile după tratament, așa cum este arătat prin rezultatul negativ al examinărilor din zilele 3 și 7, după terminarea tratamentului.

Nr. de oochiste detectate per câmp de imersie în ulei
	în a 3 zi de tratament	în ultima zi de tratament	în a 3 zi posttratament	în ultima zi posttratament
Șoarece nr.	Grup de control	Grup tratat	Grup de control	Grup tratat	Grup de control	Grup tratat	Grup de control	Grup tratat
1	3,0	0,0	5,0	0,0	4,0	0,0	2,0	0,0
2	4,0	0,0	4,0	0,0	3,0	0,0	1,0	0,0
3	6,0	0,0	5,0	0,0	4,0	0,0	0,5	0,0
4	3,0	2,0	3,0	0,0	2,0	0,0	1,0	0,0
5	8,0	2,0	3,0	0,0	3,0	0,0	0,5	0,0
6	3,0	0,0	4,0	0,0	5,0	0,0	2,0	0.0
7	3,0	0,0	5,0	0,0	4,0	0,0	1,0	0,0
8	5,0	1,0	5,0	0,0	1,0	0,0	0,5	0,0
9	3,0	3,0	3,0	0,0	2,0	0,0	1,0	0,0
10		0,0	5,0	0,0	2,0	0,0	0,5	0,0
Total	35	8,0	4,2	0,0	30	0,0	10	0,0
Medie	3,5	0,8	4,2	0,0	3,0	0,0	1,0	0,0
Efica- citate		60%		100%		100%		100%

Exemplul 8. Mycobacterium

Nitazoxanida este comparată cu antibioticul izoniazidă. Protocolul folosește ca tulpină de Mycobycterium BCG (Bacille de Calmette et Guerin). Sensibilitatea acestei tulpini este aceeași cu a M. tuberculosis, dar această tulpină este mai inofensivă și nu necesită nivelul ridicat de izolare ca cel al unui agent tuberculosic.

RO 122247 Β1

Șoarecilor li se administrează 4 mg/șoarece per zi, în 0,2 ml de ulei de floareasoarelui. Rezultatele obținute pentru șoarecii tratați cu nitazoxanidă sunt comparate cu cele ale grupului care a primit izoniazidă.

	10⁷	10⁵
	Splină	Ficat	Plămâni	Splină	Ficat	Plămâni
Nitazo-	1 575 000	1 575 000	57 500	68 250	70 000	50
xanidă	800 000	1 550 000	122 500	65 000	87 500	75
	875 000	1 550 000	30 000	75 000	35 000	150
	950 000	750 000	75 000	60 000	60 000	50
IMH	475 000	1 050 000	11 000	20 000	21 250	50
	255 000	750 000	5 750	15 250	27 500	125
	200 000	975 000	4 000	60 000 20 000	52 500 37 500	50 50
PBS	1 500 000	2 125 000	92 500	102 500	195 000	750
	1 525 000	1 800 000	98 000	140 000	175 000	800
	1 925 000	1 750 000	177 500	98 000	150 000	500
	1 675 000	1 800 000	117 500	105 000	150 000	750

Exemplul 9. Fasciola hepatica

Eficacitatea nitazoxanidei și a dezacetil-nitazoxanidei a fost testată in vitro împotriva Fasciloa hepatica.

F. hepatica mature sunt recoltate din duetele biliare a 3 ficați de viței proaspăt fătați condamnați datorită fasciolozei la Louisiana Veterinary medical Diagnostic Laboratory la Hardy's Meat Packers Bunkie, LA. Trematodele se spală în soluție salină sterilă timp de o oră, apoi se transferă în soluție sterilă salină sau în RPMI (pH 7,4) un timp suplimentar de încă 3 h. Trematodele se mențin apoi în ser steril RPMI-iepure (50:50 v/v) sau RPMI (pH 7,4) steril peste noapte, la 37°C cu 5x CO₂.

Cultura in vitro se face conform cu metoda Ibarra și Jenkins (Z. Parasitenkd. 70:655661,1984) modificată. Folosind tehnica sterilă, trematodele sunt spălate de două ori timp de 2-3 min în soluție Hank tamponată salin (pH 7,2) și plasate individual în două adâncituri ale unei plăci de cultură Linbro cu șase adâncituri, conținând alicoturi de 10 ml din diluțiile desemnate ale medicamentului în mediul de cutură. Ultima a constat din ser steril 50:50 v/v RPMI-iepure cu 2x Rabbit Blood plus 100 ppm Penicillin și 100 ppm Streptomycin. Se folosesc numai trematodele care au activitate și morfologie normale.

Soluțiile stoc de NTZ sau de metabolit al acesteia D-NTZ furnizate de Romark se dizolvă în DMSO (2000 pg/ml) și se diluează în mediul de cultură, folosind baloane volumetrice de 100 ml, pentru a produce concentrațiile specificate de medicament (100, 50, 25, 10, 5, 3, 1 pg/ml). Două trematode de control se includ în fiecare replicat, una în mediul de cultură nemediat cu RBC și una în mediul de cultură nemedicat cu RBC.

Trematodele sunt examinate în privința efectelor tratamentului cu medicament evidențiate prin moarte, tulburări de motilitate, sau schimbări morfologice comparativ cu trematodele netratate de control, folosind un panou iluminat din spate și lentile luminoase cu mărire de 3 x.

RO 122247 Β1

Rezultate 1

Experiment 1. Pentru D-NTZ, trematodele din tratamentele cu 50 și 100 pg sunt muribunde sau moarte în timp de o oră. Patru din 7 trematode în tratamentul cu 25 pg sunt 3 muribunde, două sunt active, și una este apatică din prima oră; toate au murit cu excepția a două trematode care au fost apatice până la trei ore și dintre acestea numai una a rămas 5 în viață după patru ore. La 10 pg, se observă reducerea activității la 1,3 și 4 h și toate sunt muribunde sau moarte până la 7 h. O activitate redusă pentru unele trematode individuale 7 se observă până la 24 h în grupurile cu 5 și 3 pg, cu oarecare reducere la 3 pg; toate sunt moarte în adânciturile cu 3 și 5 pg până la 50 h, cu excepția unei trematode apatice în 9 fiecare grup. O oarecare încetinire a activității se observă în grupul de 1 pg la 42-74 h și numai 3 trematode active și una muribundă rămân în viață la 91 h; la 115 h rămâne numai 11 o trematodă apatică în grupul de 1 pg. în grupul de control cu RBC se observă mortalitate la 66 h (o trematodă), 91 h (o trematodă) și 115 h (patru trematode). în grupul de control fără 13 RBC, toate sunt în viață la 91 h și una este moartă la 115 h.

Experiment 2. Pentru NTZ se observă o activitate ceva mai mare prin efectele inițiale 15 asupra scorului de motilitate și mortalitate în 8 replicate comparativ cu rezultatele pentru DNTZ. în grupurile cu 100, 50 și 25 pg, toate trematodele sunt moarte sau muribunde, cu 17 excepția unei trematode la o oră, în grupul de 25 pg, care moare la 3 h. Se observă o reducere a motilității corelată cu doza în fiecare dintre celelalte grupuri medicate, începând de 19 la o oră. La 10 pg numai o trematodă supraviețuiește la 16 h. în grupul de 5 pg, numai 3 trematode sunt active la ora 6 și nici una nu este activă la ora 16. Până la 23 h în grupul de 21 pg numai 2 trematode apatice rămân în viață; acestea mor până la 41 h. în grupul de 1 pg, o trematodă este moartă până la 16 h, trei până la 41 h și cinci până la 74 h; 3 trematode 23 rămân active la 91 h și o trematodă are activitate la 115 h. în grupul de control cu RBC 7 din 8 trematode sunt în viață la 74 h, 3 la 91 h și două supraviețuiesc la 115 h. în grupul de 25 control fără RBC, 6 din 8 trematode au activitate la 74 h, 4 sunt active la 91 h și două rămân active la 115 h. 27

Moartea trematodelor în grupurile cu doze ridicate (25, 50 și 100 pg) este rapidă și asociată cu contracție și torsionare ventrală. La niveluri de medicație mai scăzute, mai 29 multe trematode au o perioadă de încetinire și sunt mai relaxate și netede când sunt muribunde sau moarte. Contaminarea devine limitantă asupra rezultatelor experimentale în 31 anumite replicate începând cu ora 91. Pentru experimentul cu D-NTZ, dezvoltarea excesivă majoră a bacteriilor sau fungilor și mortalitatea asociată se produc în două plăci replicate 33 până la ora 115. Pentru experimentul cu NTZ, dezvoltarea excesivă și mortalitatea pe toate plăcile replicate se produc până la 91 h (două replicate) și 115 h (5 replicate). Ora 139 de 35 observație nu poate fi luată în considerare din cauza contaminării generale a majorității plăcilor. 37

Concluzii

Eficiența trematodicidă puternică a nitazoxanidei este sugerată de experimentele cu 39 toate medicamentele testate. în cazul nitazoxanidei se observă o activitate trematodicidă împotriva F. hepatica oarecum mai mare decât în cazul dezacetilnitazoxanidei, metabolitul 41 principal, care este gândit să fie activ la nivel hepatic.

Moartea rapidă a trematodelor se produce în timp de o oră, la medicație cu D - NTZ 43 in vitro la rate >50 pg, în timp de 4 h la 25 pg și până la 6-7 h la 18 pg. 10 pg poate fi un tratament unic, cu o rată de eliberare adecvată a medicamentului țintă, dacă datele farma- 45 cocinetice indică că nivelurile țesuturilor se mențin timp >6-8 h, după un singur tratament.

RO 122247 Β1

Pentru ambii compuși se observă activitate trematodicidă puternică până la 71 h (3 zile), pentru doze de 3 și 5 pg. O perioadă de supraviețuire prelungită care se apropie, dar nu este egală cu a trematodelor de control nemedicate, se observă la nivelul de dozare de 1 pg; eliberarea medicamentului la acest nivel către trematodele din țesutul hepatic timp de 3 la 4 zile poate avea astfel un efect terapeutic inadecvat asupra paraziților.

Exemplul 10. Fasciola gigantica

Nitazoxanida este testată împotriva Fasciola gigantica imatură și matură la iepuri infectați experimental.

Metacercarii închistate de Fasciola gigantica (EMC) se colectează pe folie de celofan după 28-35 de zile de la infectarea L. calludi spirale cu Fasciola gigantica miracidium, folosind tehnica descrisă de Abdel-Ghany, în care spiralele se expun zilnic la lumină artificială timp de 30 min, în apă de robinet curată, declorinată. Metacercariile închistate (EMC) rezultate se păstrează la 4°C în frigider timp de 5 la 8 zile, până când se utilizează pentru infectarea animalelor experimentale.

Patruzeci (40) de iepuri Boscat, cântărind 1,5 la 2 kg fiecare, se includ în studiu și sunt alocați pentru două grupe de tratament de 20 de animale.

Animalele din Grupul 1 se infectează oral cu 35-40 metacercarii închistate înfășurate în foaie de lăptucă și împinse la rădăcina limbii animalelor. Gurile animalelor se mențin închise cu mâna până când metacercariile închistate sunt înghițite, acest Grup 1 de animale este folosit penru a testa eficacitatea nitazoxanidei împotriva stadiilor imature (în vârstă de 4-5 săptămâni) de Fasciola gigantica.

Animalele din Grupul 2 se infectează oral așa cum este indicat anterior, cu 10-15 metacercarii închistate și se folosește pentru testarea eficienței nitazoxanidei împotriva trematodelor în stadiu de maturitate incipientă (în vârstă <10 săptămîni).

Zece animale din Grupul 1 primesc 35 mg de nitazoxanidă, dimineața și seara, timp de 7 zile consecutiv, 4 săptămâni după infectarea acestora la stadiul imatur al ciclului parazitului. Celelalte zece animale rămase din Grupul 1 se mențin netratate pentru control.

Zece animale din Grupul 2 primesc 35 mg de nitazoxanidă, dimineața și seara, timp de 7 zile consecutiv, la 10 săptămâni după infectarea acestora la stadiul matur al parazitului. Celelalte zece animale rămase din Grupul 2 se mențin netratate pentru control.

Toate animalele se hrănesc cu rații uscate până la terminarea experimentului.

La șapte zile după administrarea ultimei doze de nitazoxanidă, toți iepurii din fiecare grup se sacrifică. Suprafața ficatului se examinează pentru prezența scizurilor (fisurilor) necrotice migrante în special la stadiul imatur al ciclului parazitului. Aceste suprafețe necrotice se examinează folosind două ace chirurgicale pentru a extrage trematodele juvenile migrante, conform tehnicii descrise de El-Bahy. Ficații se taie în bucăți mici, în special în jurul fisurilor migrante și se macerează sub un microscop pentru extragerea trematodelor existente. Cavitatea abdominală și suprafețele viscerale se spală cu apă caldă. Apa este apoi colectată, sitată și examinată pentru identificarea trematodelor juvenile. Toți paraziții colectați și de asemenea părțile lor se colectează atât din animalele tratate, cât și din cele netratate, atât din ambele Grupuri 1 și 2. Trematodele vii apar colorate intens, translucide, prezentând tegumente intacte, ușor de extras din țesutul ficaților folosind apă caldă, în timp ce trematodele moarte sunt gri prin pierderea culorii și prezintă suprafață necrotică ruptă. Eficiența nitazoxanidei se calculează folosind formula de mai jos:

a-b % eficienta----------x 100 a

RO 122247 Β1 în care:

a = numărul de trematode recuperate din fecale în animalele de control, b = numărul de trematode recuperate din fecale în animalele tratate.

Rezultate

Rezultatele studiului așa cum sunt indicate în tabelul 7 arată o scădere marcată a numărului de trematode imature, recuperate din ficatul iepurilor în grupul tratat comparativ cu grupul de control. Procentele medii de reducere se calculează ca 46,77% (domeniu: 4060%).

Tabelul 7

Eficiența nitazoxanidei împotriva F. gigantica imatură (vârsta 4 săptămâni), la iepuri infectați experimental

Nr. de trematode extrase din ficat
Nr. iepure	Control netratat	Iepuri tratați	Eficientă % 1
1	7	4	42%
2	7	4	42%
3	6	3	50%
4	8	4	50%
5	5	3	40%
6	5	2	60%
7	5	3	40%
8	6	3	50%
9	8	4	50%
10	5	3	40%
Medie	6,2	3,3	46,77%

în stadiul de maturitate incipientă a infecției acestora, nitazoxanida prezintă un efect complet (reducere de 100%) și la examinarea ficatului iepurilor tratați nu se văd viermi, în comparație cu animalele de control netratate, așa cum este arătat în tabelul 8.

Tabelul 8

Eficiența nitazoxanidei împotriva F. gigantica în stadiu de maturitate incipientă (vârsta 10 săptămâni), la iepuri infectați experimental

Nr. de trematode extrase din ficat
Nr. iepure	Control netratat	Iepuri tratați	Eficiență %
1	4	0,0	100%
2	4	0,0	100%
3	3	0,0	100%
4	3	0,0	100%
5	2	0,0	100%

RO 122247 Β1

Tabelul 8 (continuare)

Nr. de trematode extrase din ficat
6	2	0,0	100%
7	2	0,0	100%
8	3	0,0	100%
9	3	0,0	100%
10	3	0,0	100%
Medie	2,9	0,0	100%

Nitazoxanida administrată ca doză zilnică de 70 mg/zi timp de 7 zile consecutiv are eficiență moderată împotriva Fasciola gigantica în stadiul imatur al parazitului și are eficiență totală împotriva stadiului de maturitate incipientă a parazitului.

Exemplul 13. Schistosoma

Nitazoxanida este testată împotriva Schistosoma mansoni și Schistosoma hematobium, la șoareci infectați experimental.

Patruzeci (40) de șoareci albi, cântărind 30 la 50 g, sunt alocați pentru două grupuri de tratament de câte 20 de animale per grup. Primul grup este infectat cu 300 - 500 de încercării active de Schistosoma mansoni, suspendate în 0,25 ml de apă distilată administrate la fiecare șoarece prin injecție intraperitoneală. Al doilea grup este infectat în același mod, dar cu cercării de Schistosoma hematobium. Aceste două grupuri se mențin un timp total de 70 de zile în laborator.

Șaptezeci de zile după infectarea animalelor, zece șoareci din fiecare grup se tratează cu nitazoxanidă ca doză de 1,3 mg cu administrare orală, dimineața și seara, timp de 7 zile consecutiv. La șapte zile după terminarea tratamentului, toți șoarecii se sacrifică și viermii se extrag din ficatul fiecărui animal, prin perfuzie cu apă călduță (37°C). Schisostomele extrase se numără la animalele tratate și la cele de control. Eficiența nitazoxanidei se calculează folosind formula de mai jos:

a-b % eficiența--------x 100 a

în care:

Rezultate

Rezultatele din tabelele 9 și 10 indică clar că nitazoxanida administrată într-o doză zilnică de 2,6 mg/zi timp de 7 zile consecutiv este mai eficientă împotriva Schistosoma hematobium, unde se observă o reducere a viermilor de 82,85% comparativ cu animalele de control, în timp ce pentru Schistosoma Mansoni, reducerea viermilor atinge numai 59,91% față de șoarecii de control. Rezultatele sunt în concordanță cu cele raportate de Abaza și alții, pentru pacienți pentru care nitazoxanida nu a fost eficientă împotriva S. mansoni, așa cum este arătat prin numărătoarea pozitivă a ouălelor post-tratamentului cu nitazoxanidă.

RO 122247 Β1

Tabelul 9

Eficiența nitazoxanidei împotriva Schistosoma mansoni matură, (vârsta 13 săptămâni) la șoareci

Nr. de trematode extrase din ficat
Nr. șoarece	Control netratat	Șoareci tratați
1	21	10
2	29	9
3	32	10
4	26	11
5	24	13
6	19	10
7	20	9
8	24	12
9	22	8
10	30	7
Total	247	99
Medie/șoarece	24,7	9,9
Eficiență		59,91

Tabelul 10

Eficiența nitazoxanidei împotriva Schistosoma hematobium matură (vârsta 13 săptămâni), la șoareci

Nr. de trematode extrase din ficatul
Nr. șoarece	Control netratat	Șoareci tratați
1	18	3
2	16	3
3	14	2
4	19	2
5	12	4
6	10	4
7	13	2
8	12	2
9	17	0,0
10	9	2
Total	140	24
Medie/șoarece	14	2,4
Eficiență		82,85

Claims

Revendicări

1. Suspensie lichidă de agent activ pentru administrare orală, care conține:

- ca agent activ, particule solide din cel puțin un compus ales din grupul constând din: un compus cu formula I:

OH (I) și un compus cu formula II:

(Π) în care agentul activ este sub formă de particule active având o mărime a particulelor mai mică de 200 pm și o mărime medie a particulei mai mare de 10 pm și

- cel puțin un acid farmaceutic acceptabil, pH-ul suspensiei fiind între 2 și 6.
2. Compoziție farmaceutică care conține ca agent activ cel puțin un compus ales din grupul constând din: un compus cu formula I:

OH

NO (I) și un compus cu formula II:

:N o - co - CH.

no₂ S nh-co și în plus conține, pentru îmbunătățirea stabilității, o cantitate de acid farmaceutic acceptabil.
3. Compoziție farmaceutică conform revendicării 2, în care acidul farmaceutic acceptabil este ales din grupul constând din acid citric, acid glutamic, acid succinic, acid etansulfonic, acid acetic, acid tartric, acid ascorbic, acid metansulfonic, acid fumărie, acid adipic, acid malic și amestecurile acestora.
4. Compoziție conform revendicării 3, în care acidul farmaceutic acceptabil este acidul citric.
5. Compoziție conform revendicării 3, în care acidul farmaceutic acceptabil este acidul ascorbic.
6. Compoziție farmaceutică care conține ca ingredient activ cel puțin un compus ales din grupul constând din:

un compus cu formula II:

(II)

RO 122247 Β1 și conține în plus un acid farmaceutic acceptabil în cantitate suficientă, pentru a asigura pH- 1 ul compoziției farmaceutice între 2 și 6, atunci când această compoziție farmaceutică este în contact cu apa, în care raportul în greutate al acidului farmaceutic acceptabil față de corn- 3 poziția farmaceutică este între 0,01 și 0,5.
7. Compoziție conform revendicării 6, în care raportul în greutate al acidului 5 farmaceutic acceptabil față de compoziția farmaceutică este între 0,03 și 0,2.
8. Compoziție conform revendicării 3, în care aceasta este sub formă de dozare 7 solidă și în care particulele active sunt granulate în prezența a cel puțin unui agent de granulare, pentru a se forma particule solide granulate active. 9
9. Compoziție conform revendicării 6, în care, înainte de granulare, particulele active au o mărime a particulei mai mică decât 200 pm și o mărime medie a particulei mai mare 11 decât 5 pm.
10. Compoziție conform revendicării 9, în care mărimea medie a particulei dintre 13 particulele active este între 10 și 100 pm.
11. Compoziție conform revendicării 8, în care particulele solide granulate active 15 cuprind de la 2 până la 99,97% în greutate compusul activ menționat și de la 0,03 până la

10% în greutate agentul de granulare menționat. 17
12. Compoziție conform revendicării 8, în care agentul de granulare este ales din grupul constând din polivinilpirolidonă, apă, alcool, zaharoză, hidroxiceluloză și amestecurile 19 acestora.
13. Compoziție conform revendicării 8, în care în particulele solide granulate active, 21 raportul în greutate acid farmaceutic acceptabil/greutate agent activ este între 0,01 și 0,5.
14. Compoziție conform revendicării 8, în care acidul farmaceutic acceptabil este ales 23 din grupul constând din acid citric, acid glutamic, acid succinic, acid etansulfonic, acid acetic, acid tartric, acid ascorbic, acid metansulfonic, acid fumărie, acid adipic, acid malic și 25 amestecurile acestora.
15. Compoziție conform revendicării 3, în care compoziția menționată este sub formă 27 de suspensie de particule solide ale cel puțin unui compus cu formula I și formula II într-un lichid. 29
16. Compoziție conform revendicării 15, în care înainte de formarea suspensiei menționate, particulele active sunt granulate în prezența a cel puțin unui agent de granulare, 31 pentru a se forma particule solide granulate active.
17. Compoziție conform revendicării 15, în care lichidul menționat este apa. 33
18. Compoziție conform revendicării 15, în care pH-ul suspensiei este între 2 și 6.
19. Compoziție conform revendicării 15, în care pH-ul suspensiei este între 3 și 5. 35
20. Compoziție conform revendicării 3, în care compoziția menționată este sub formă de pastă, care cuprinde particule active ale cel puțin unui compus cu formula I și formula II, 37 un agent de umectare și un agent de îngroșare.
21. Compoziție conform revendicării 20, în care acidul farmaceutic acceptabil este 39 ales din grupul constând din acid citric, acid glutamic, acid succinic, acid etansulfonic, acid acetic, acid tartric, acid ascorbic, acid metansulfonic, acid fumărie, acid adipic, acid malic și 41 amestecurile acestora.
22. Compoziție conform revendicării 20, în care particulele active au o mărime a parti- 43 culei mai mică decât 200 pm, mai puțin de 10% în greutate dintre aceste particule au o mărime mai mare de 100 pm, mai puțin de 50% dintre aceste particule au o mărime mai 45 mare de 50 pm, și mai puțin de 10% în greutate dintre aceste particule au o mărime mai mică decât 5 pm. 47