KR101842936B1 - 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents
강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 식품 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 폐경기에서 나타나는 체중 및 내장 지방 증가를 억제하고, 에너지 소비를 증가시키며, 혈청 ALT/AST 레벨 감소 및 인슐린 저항성 감소 등의 효과를 나타내어 갱년기 또는 폐경기에서 나타나는 다양한 증상을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 여성의 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 개선 및 치료를 위한 식품 및 의약품 등에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
폐경기는 여성의 일생에서 생식 단계에서 비생식 단계로 넘어가는 과도기적 단계이다. 폐경기 동안 안면 홍조, 인지적 변화, 불안 및 우울증을 포함하는 다양한 증상들이 일반적으로 나타난다[1]. 이러한 증상들은 치명적인 질환은 아니지만 여성의 삶의 질을 저하시킨다. 폐경기 증상 외에 에스트로겐 결핍은 다양한 조직에서 PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α)의 발현을 감소시킴으로써 에너지, 글루코오스, 지질 및 골 대사를 저하시킨다[2]. 이는 폐경기 증상만큼 일상생활에 영향을 미치는 것은 아니지만 결국, 비만, 이상지질혈증, 제2형 당뇨, 골관절염 및 골다공증과 같은 대사 질환으로 발전될 수 있다[3]. 따라서, 폐경기 후 여성에서 대사 저하를 방지 및/또는 지연시킬 필요가 있다.
폐경기는 여성 호르몬, 특히 에스트로겐의 급격한 감소로 인해 발생한다. 호르몬 대체 치료법은 폐경기 증상 완화에 효과적이나, 유방암, 심혈관계 질환 및 치매에 대한 위험을 증가시킨다는 점에서 한계가 있다[4]. 이에 폐경기 증상 완화를 위해 대체적인 치료법에 대한 관심이 증가하고 있다. 식물화학 요법으로 아마씨, 레드 클로버, 세인트 존스 워트, 홉 또는 승마와 같은 식물 추출물이 가장 많이 이용된다[3, 5]. 이러한 식물 추출물은 에스트로겐과 유사한 화학 구조를 가지며, 에스트로겐 또는 항-에스트로겐 효과를 나타내는 식물 에스트로겐을 포함한다. 호르몬 대체 요법과 달리 식물 에스트로겐을 포함하는 식물 추출물이 건강상의 위험없이 폐경기 증상을 줄일 수 있다는 것이 알려져 있다[5]. 그러나, 많은 식물 추출물 요법은 폐경기 후 여성의 증상을 감소시키는데 충분한 효과를 나타내지 못한다[5]. 따라서, 여성의 삶의 질 향상을 위해 부작용 없이 폐경기 증상을 완화시킬 수 있는 대안을 모색할 필요가 있다.
전통적으로 다양한 식물이 폐경기 증상과 같은 여성 건강의 개선을 위해 사용되고 있다. 최근 연구에 따르면, 이러한 식물들이 폐경기 증상을 완화시키며[6, 7], 일부는 상업적으로 이용가능하다는 것이 알려졌다. 그러나, 그들은 일부 폐경기 후 증상을 개선할 뿐이다. 따라서, 다양한 폐경기 증상을 완화시킬 수 있는 식물 추출물에 대한 개발이 필요하다. 많은 식물들이 식물 에스트로겐을 포함하나, 서로 다른 기능들을 가지고 있으며, 식물들의 조합이 폐경기 증상을 완화시키는데 더 나은 효과를 나타낼 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
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본 발명자들은 갱년기 예방 및 개선 효능이 뛰어난 식물 추출물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물의 조합이 강화약쑥, 익모초 또는 치자 단일 추출물과 비교하여 현저히 향상된 갱년기 증상 완화 효과를 나타냄을 실험적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 갱년기 예방 및 개선 효능이 뛰어난 식물 추출물을 개발하고자 노력하였고 그 결과, 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물의 조합이 강화약쑥, 익모초 또는 치자 단일 추출물과 비교하여 현저히 향상된 갱년기 증상 완화 효과를 나타냄을 실험적으로 규명하였다.
본 발명에서 사용된 강화약쑥(Artemisia princeps Pamp)은 일반쑥에 비해 키가 크고, 잎사귀가 두터우며 잎끝이 둥글며, 대한민국 강화지역에서 자생하는 쑥을 말하며, 그 종류에는 대표적으로 사자발쑥과 싸주아리쑥이 있다. 강화약쑥은 위염, 위궤양에 효과가 우수한 성분인 유파티린(eupatilin)과 자세오시딘(jaceosidin)을 다른 종류의 쑥보다 많이 함유하고 있다. 강화약쑥은 사자발자국 형상을 하고 있어 사자발약쑥 또는 사자발쑥으로도 불린다.
본 발명에서 사용된 익모초(Leonurus japonicus Houtt)는 높이 약 1 m 되는 두해살이풀로서, 익모초 추출액은 중추신경 계통에 대한 진정작용이 있고, 레오누린 성분에 의한 심장강화 효과가 있어 심장경화증, 협심증, 심근염, 신경과민, 니코틴 중독에 의한 심근염에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이 외에도 고혈압, 산후 출혈, 월경불순, 녹내장, 발한해열, 찰과상 등에 효능을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 치자(Gardenia jasminoides Ellis)는 꼭두서니과의 상록 활엽 관목으로 9-11월에 타원형의 과실이 성숙하여 홍황색을 띄면 이를 채취하여 건조시켜 약용 및 염료용으로 사용한다. 특히 한방에서는 이뇨제, 해열제, 진정제 및 눈병, 황달 등에 치료에 사용되고, 지혈제로 중요하게 사용된다. 치자는 제니핀(genipin), 제니포시드(geniposide), 가르데노시드(gardenoside) 등의 이리도이드(iridoid) 배당체, 크로신(crocin), 크로세틴(crocetin) 등의 성분, 가르다닌(gardanin)의 플라보노이드(flavoniod)계 성분과 그 외에 콜린(choline), 우르솔릭산(ursolic acid) 등을 함유하고 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 “강화약쑥 추출물” 이란 상기 강화약쑥의 잎으로부터 적합한 용매를 사용하여 추출하여 얻는 추출물을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 “익모초 추출물” 이란 상기 익모초의 잎으로부터 적합한 용매를 사용하여 추출하여 얻는 추출물을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 “치자 추출물” 이란 상기 치자의 열매로부터 적합한 용매를 사용하여 추출하여 얻는 추출물을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 “강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물” 이란 상기 강화약쑥 추출물, 익모초 추출물 및 치자 추출물의 혼합물로 바람직하게는 강화약쑥 추출물, 익모초 추출물 및 치자 추출물을 2:1:1 중량비로 혼합한 것을 의미한다.
본 발명의 조성물에서의 유효성분인 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 분리하는 방법은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건하에서 통상적인 용매를 사용하여 분리할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 이용되는 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 강화약쑥, 익모초 및 치자에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌글리콜 또는 부틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 에탄올, 부탄올, 부틸렌글리콜, 에틸 아세테이트 또는 이의 조합을 강화약쑥, 익모초 또는 치자에 처리하여 수득한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물을 강화약쑥, 익모초 또는 치자에 처리하고 환류 추출하여 수득한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 유효성분은 천연식물재료인 강화약쑥, 익모초 및 치자로부터 추출한 추출물로서 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물이 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 폐경기 동물모델에서 피부 온도 증가를 억제시키고, 체중 및 내장 지방 증가를 억제시키며, 에너지 소비를 증가시키고, 인슐린 저항성을 감소시킬 뿐 아니라 간이 손상되는 경우 증가되는 효소인 ALT 및 AST에 대한 발현을 감소시키고, 간의 중성지방 축적을 감소시킨다. 또한, 지방산 산화에 관여하는 유전자인 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha), CPT-1(carnitine palmitoyl transferase-1) 발현을 증가시키고, 지방산 합성에 관여하는 유전자인 SREBP-1c(Sterol regulatory element binding protein-1c), FAS(fatty acid synthase) 및 ACC(Acetyl-CoA carboxylase) 발현을 감소시킨다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 강화약쑥, 익모초 또는 치자 단일 추출물을 폐경기 동물 모델에 투여한 경우와 비교하여 본 발명의 강화약쑥, 익모초 및 치자 혼합추출물을 투여한 경우, 체중 및 내장 지방 증가 억제, 에너지 소비율 증가, 혈청 ALT/AST 레벨 감소, 인슐린 저항성 감소, 지방산 산화 관련 유전자의 발현 증가 및 지방산 합성 관련 유전자의 발현 감소 효과가 현저히 우수한 것으로 나타났으며, 강화약쑥, 익모초 또는 치자 혼합추출물은 에스트로겐을 투여한 양성 대조군과 동등 또는 그 이상의 효과를 나타냈다. 따라서, 본 발명의 조성물은 체중 증가를 억제하고, 인슐린 저항성을 감소시키며 간조직에서 지방합성에 중추적 역할을 하는 유전자의 발현을 감소시키고, 지방산 산화를 촉진하는 유전자의 발현을 시킴으로써 갱년기 또는 폐경기에서 나타나는 다양한 증상(예컨대, 비만, 당뇨병, 지방간 등)을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있으며, 건강기능식품 및 약학적 조성물로서 활용이 가능하다.
또한, 본원발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 강화약쑥, 익모초 또는 치자 단일 추출물의 효과 이상의 상승적 효과를 나타냄을 발견하고 특허청구한 것으로 본원발명 조성물의 효과는 강화약쑥, 익모초 또는 치자 단일 추출물에 의해 달성되는 효과로부터 예측할 수 없는 효과의 현저성을 갖는다.
본 명세서에서, 사용되는 용어 “갱년기 또는 폐경기 증상”은 폐경기 여성에게서 호르몬 생산의 감소로 인하여 발생하는 증상을 의미하고, 갱년기 또는 폐경기 증상은 일반적으로, 안면홍조, 발한, 피부건조, 질 건조증, 질 위축, 하부 요도 위축, 성교통, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 체중증가, 내장지방증가, 지방간, 피부노화, 운동능력 감소, 신경과민, 불안, 우울증, 현기증, 수면장애, 집중장애, 단기 기억장애, 활력저하, 성욕 감퇴, 근육통, 당뇨병 또는 골다공증 등이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 갱년기 또는 폐경기 증상은 안면홍조, 체중증가, 내장지방증가, 지방간 또는 당뇨병이다.
본 발명의 식품조성물은 식품, 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 천연소재의 가공 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물과 갱년기에 의해 유발되는 질환 또는 증상의 예방 또는 개선의 효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 30 중량% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.
상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 갱년기에 의해 유발되는 질환 또는 증상 예방 및 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물의 약학적으로 유효한 양으로는 0.01 내지 100 mg/day/kg 체중이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환의 종류 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 갱년기 또는 갱년기 관련 질환 또는 증상의 예방 및 치료의 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물은 여성의 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 개선 및 치료를 위한 식품 및 의약품 등에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 개선 또는 치료용 식품 조성물 및 약제학적 조성물을 제공한다.
(b) 본 발명의 조성물은 폐경기에서 나타나는 체중 및 내장 지방 증가를 억제하고, 에너지 소비를 증가시키며, 혈청 ALT/AST 레벨 감소 및 인슐린 저항성 감소 등의 효과를 나타내어 갱년기 또는 폐경기에서 나타나는 다양한 증상을 효과적으로 예방, 개선 및 치료할 수 있다.
(c) 본 발명의 조성물은 여성의 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 개선 및 치료를 위한 식품 및 의약품 등에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 실험기간 중 1주 및 8주째에 실험동물의 꼬리 피부 온도를 측정한 결과이다.
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄. 1주 및 8주째에 꼬리 피부 온도를 적외선 온도계를 이용하여 측정함. 막대 및 에러 바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
a,bp < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 2는 실험기간 중 8주째에 DEXA를 이용하여 체성분을 측정한 결과이다.
8주째에 DEXA를 통해 복부 및 다리에서 제지방량(A) 및 지방량(B)을 측정하였음. 막대 및 에러 바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
a,b,cp < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 3은 ITT 동안 혈청 글루코오스 레벨 및 글루코오스와 인슐린의 곡선하면적을 측정한 결과이다.
OGTT 3일 후, 6시간 동안 금식시킨 후 인슐린을 복강투여(0.75 U/kg 체중)한 후 90분 동안 매 15분마다 혈청 글루코오스 레벨을 측정함. ITT 동안 1기(0-30분) 및 2기(30-90분)에서 혈청 글루코오스의 곡선하면적. 바 및 에러바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
*일원 분산분석에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 4는 간에서 지방산 대사 및 인슐린 시그널링에 관여하는 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다.
실험 종료 시, 지방산 산화(A) 및 합성(B)에 관여하는 간 유전자의 mRNA 레벨을 실시간 PCR로 측정함. 바 및 에러바는 평균 ± SD로 나타냄(n=6).
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄. 1주 및 8주째에 꼬리 피부 온도를 적외선 온도계를 이용하여 측정함. 막대 및 에러 바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
a,bp < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 2는 실험기간 중 8주째에 DEXA를 이용하여 체성분을 측정한 결과이다.
8주째에 DEXA를 통해 복부 및 다리에서 제지방량(A) 및 지방량(B)을 측정하였음. 막대 및 에러 바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
a,b,cp < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 3은 ITT 동안 혈청 글루코오스 레벨 및 글루코오스와 인슐린의 곡선하면적을 측정한 결과이다.
OGTT 3일 후, 6시간 동안 금식시킨 후 인슐린을 복강투여(0.75 U/kg 체중)한 후 90분 동안 매 15분마다 혈청 글루코오스 레벨을 측정함. ITT 동안 1기(0-30분) 및 2기(30-90분)에서 혈청 글루코오스의 곡선하면적. 바 및 에러바는 평균 ± SD로 나타냄(n=12).
*일원 분산분석에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
도 4는 간에서 지방산 대사 및 인슐린 시그널링에 관여하는 유전자의 mRNA 발현 정도를 측정한 결과이다.
실험 종료 시, 지방산 산화(A) 및 합성(B)에 관여하는 간 유전자의 mRNA 레벨을 실시간 PCR로 측정함. 바 및 에러바는 평균 ± SD로 나타냄(n=6).
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 이하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예
방법 및 재료
APP, LJH 및 GJE 물 추출물 제조
강화약쑥(Artemisia princeps Pamp, 이하 ‘APP’, 강화사자발약쑥, 약쑥 또는 쑥이라고도 함), 익모초(Leonurus japonicus Houtt, 이하 ‘LJH’) 및 치자(Gardenia jasminoides Ellis, 이하 ‘GJE’)는 한국에서 재배되었으며, APP 잎, LJH 잎 및 GJE 열매는 강화사자발약쑥 법인(강화, 한국)에서 구입하였다. 건조시킨 APP 잎, LJH 잎 및 GJE 열매(2 kg)는 3회에 걸쳐 물로 80℃에서 3시간 동안 환류 추출하고, 추출물을 여과한 다음 동결건조하였다. APP 잎, LJH 잎 및 GJE 열매의 수득율은 각각 14.8, 15.5 및 20.4%였다. 건조한 추출물은 메탄올에 용해시켰다. 페놀성 화합물의 총 함량은 Folin-Ciocalteu reagent[16]을 이용하여 측정하고, 갈산 mg 당량g- 1으로 표현하였다. 추출물을 에탄올에 용해시키고, 총 플라보노이드 함량은 종전에 기술된 방법[17]을 수정하여 측정하였다. 루틴은 표준으로 사용하였다.
생리활성 화합물의 분석
Acquity UPLC BEH C18 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μ을 포함하는 Acquity UPLC system(Waters, Miliford, MA, USA)을 이용하여 분석하였다. Waters Xevo TQ 삼중4극 질량분광계를 이용하여 ESI(electrospray ionization) 모드에서 질량분석을 실시하였다. 지시 화합물(indicator compound)을 정량하기 위해 APP, LJH 및 GJE 추출물 각각을 메탄올에 용해시켰다.
APP에서 유파티린(eupatilin) 및 자세오시딘(jaceosidin)을 분석하기 위해 APP를 포함하는 메탄올(1:10, v/v)에 피리딘(pyridine)을 첨가한 다음, 그 혼합물을 UPLC에 주입하였다. 70% 메탄올 및 0.1% TFA의 등용매 이동상은 1.5 ml/분의 유속으로 사용되었다. 컬럼 온도는 35℃이고, 주입 부피는 20 μL이며, UV 검출은 285 nm에서 수행하였다.
GJE에서 제니포사이드(geniposide) 및 우르솔릭산(ursolic acid)을 분석하기 위해 아세토니트릴(acetonitrile): 메탄올: 물(45:45:10 v/v/v)의 등용매 이동상을 0.4 mL/분의 유속으로 사용하였다. 주입 부피는 5 μL이고, 컬럼 온도는 35℃로 유지하였다. 탠덤 MS는 네거티브 ESI 모드에서 실시하였고, MassLynx 4.1(Waters) 소프트웨어를 이용하여 처리하였다. 우르솔릭산의 정량은 m/z 445.4의 SIM(single ion monitoring) 모드에서 실시하였다. 검출기는 35 V의 콘 전압, 3.0 kV의 모세 전압으로 작동시켰다. 탈용매 유속 및 가스 온도는 각각 800 L/h 및 500℃로 설정하고, 소스 온도는 150℃로 설정하였다.
LJH에서 스타키드린(stachydrine)을 분석하기 위해 이동상을 (A) 0.1% 포름산 수용액 및 (B) 0.1% 포름산을 포함하는 아세토니트릴로 구성하고, 0.6 mL/분의 유속으로 실시하였다. 분석 조건은 다음과 같다: 99% A의 초기 조건, 99-70% B에서 0-3분, 99% A에서 3-5분. 주입 부피는 2 μL이고, 컬럼 온도는 30℃를 유지하였으며, 총 러닝 타임은 5분이었다. 질량 분석계는 포지티브 ESI 모드에서 작동하였고, MRM(multiple reaction monitoring) 모드를 이용하여 스캔하였다. MRM 트랜지션은 m/z 144.1→58.1, 84.1에서 모니터링하였다. 모세 전압, 콘 및 충돌에너지는 각각 3.5 kV, 33 V 및 22 V로 설정하였다. 탈용매 및 콘을 위한 가스 유량은 800 및 50 L/h로 설정하였다.
실험동물 및 디자인
8-10주령(219±13 g) 자성 Sprague-Dawley 랫트에 대하여 난소 절제(ovariectomy, OVX)를 실시하고, 랫트를 제어된 환경(12시간 낮밤 주기, 23℃)의 스테인레스 스틸 케이지에 개별적으로 수용하였다. 모든 수술 및 실험 절차는 호서대학교 동물실험윤리위원회로부터 승인을 받아 실시하였다. OVX 랫트는 5개 그룹으로 무작위 분리하였다. 실험동물은 8주 동안 물을 자유롭게 섭취하였으며, 각각 할당된 사료를 소비하였다. 고지방식이는 40 En%(energy percent) 탄수화물, 20 En% 단백질 및 40 En% 지방으로 구성된 수정된 반-정제 AIN-93 제제[18]를 이용하였다. 주요 탄수화물, 단백질 및 지방 소스는 전분 플러스 설탕, 카제인(우유 단백질) 및 라드(CJ Co, 서울)였다.
72마리의 OVX 랫트를 무작위적으로 6개 그룹으로 분리하였다: 대조군, APP, LJH, GJE, APP+LJH, APP+LJH+GJE 및 17β-에스트라디올(양성 대조군). 실험동물에 대하여 각각 2% 덱스트로스, 2% APP, 2% LJH, 2% GJE 또는 2% APP+LJH+GJE(10:5:5, w:w:w)를 포함하는 고지방식이를 제공하였다. 본 발명에서 사용된 식물 추출물의 용량은 인간에 대하여 약 3-5 g/일에 해당한다. 양성 대조군의 식이는 17β-에스트라디올 + 2% 덱스트로스를 체중 kg 당 30 μg 포함한다.
꼬리 온도 측정
꼬리 온도는 적외선 온도계(BIO-152-IRB, Bioseb, Chaville, France)를 이용하여 실험 기간 중 1주 및 8주째 수면 주기 동안 측정하였다. 10분 간격으로 3회 측정하고, 동물에 대한 평균값을 각 주(week)에 대한 데이터로 사용하였다[19].
간접 열량 측정법을 통한 에너지 소비량 측정
할당된 식이를 7주간 제공한 후, 밤 주기가 시작되기 전 6시간 동안 랫트를 절식시키고 에너지 소비량을 측정하였다. 에너지 소비량은 평균 산소 소비량(VO2) 및 평균 이산화탄소 생산량(VCO2)을 측정하는 간접 열량 측정법을 통해 평가하였다: 랫트를 컴퓨터-제어 O2 및 CO2 측정 시스템(Biopac Systems Inc., Goleta, CA)이 장착된 대사 챔버(기류 = 800 ml/분)에 30분 동안 두었다. 호흡 지수(respiratory quotient, RQ) 및 휴식 에너지 소비량은 Niwa et al [19]에 기재된 방정식을 이용하여 계산하였다. 실험 후, 데이터는 1분 간격으로 평균내고 VO2 및 VCO2 값은 대사성 체형(kg0 .75)[20]에 맞게 교정하였다. 탄수화물 및 지방 산화량은 상대적인 산화 비율 및 산화된 기질 그람 당 소비된 산소량인 비-단백질 산소 소비량으로부터 산출하였다[20].
경구
당부하
검사(Oral glucose tolerance test,
OGTT
) 및 인슐린 저항성 검사(insulin tolerance test, ITT)
에너지 소비량 측정 2일 후, 하룻밤 동안 실험동물을 절식시키고 2 g 글루코오스/kg 체중을 경구 투여하여 OGTT를 실시하였다. 글루코오스 투여 후, 혈액 샘플을 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 및 120분에 꼬리에서 수득하고, Glucose Analyzer II(Beckman, Palo Alto, CA)를 이용하여 혈청 글루코오스 레벨을 측정하였다. 혈청 인슐린 레벨은 0, 20, 40, 60, 90 및 120분에 radioimmunoassay kit(Linco Research, Billerica, MA)를 이용하여 측정하였다. OGTT 동안 혈청 글루코오스 및 인슐린 레벨의 총 곡선하면적의 평균은 사다리꼴 방식을 이용하여 계산하였다. 한편, 인슐린은 글루코오스 투여 후 두 단계로 방출되기 때문에 혈청 글루코오스 및 인슐린 레벨을 두 부분으로 나누었다[21, 22]. 글루코오스 내성 조건에서 인슐린은 글루코오스 투여(초기) 후 15-30분에 최고치를 나타내나, 비내성 조건에서는 인슐린 방출이 지연된다. 본 발명에서 초기는 0-40분, 2기는 40-120분으로 정의된다.
OGTT 3일 후, 6시간 동안 절식시킨 다음 ITT를 실시하였다. 인슐린을 복강 내 투여(0.75 U/kg 체중)한 후 90분 동안 15분마다 혈청 글루코오스 레벨을 측정하였다. 혈청 글루코오스 레벨은 꼬리를 통해 수득한 혈액에서 측정하였다. 이 후에 2일 동안 물과 식이를 자유롭게 제공한 후, 하룻밤 동안 절식시킨 다음 희생시켰다.
체성분 측정
랫트를 희생시킨 당일, 흡광계(pDEXA Sabre; Norland Medical Systems Inc., Fort Atkinson, WI)를 이용하여 DEXA(dual-energy X-ray absorptiometry)를 통해 체성분을 측정하였다. 농도계는 제조사에서 제공한 팬텀을 이용하여 매일 보정하였다[6]. 실험동물을 엎드린 자세로 놓고 케타민 및 자일라진(각각 100 및 10 mg/kg 체중)으로 마취한 후, 테잎으로 뒷다리가 외선(external rotation)을 유지하도록 하였다. 엉덩이, 무릎 및 발목 관절은 90°굴곡을 나타낸 상태로 체성분을 측정하였다. 스캐닝을 완료한 후, 우측 대퇴골 및 요추골에 대하여 BMD(bone mineral density)를 확인하였다. 소동물의 체성분을 평가하는데 적합한 소프트웨어를 pDEXA에 장착하였다. 마찬가지로 복부 지방량 및 복부, 엉덩이 및 다리에 대한 제지방량을 DEXA로 측정하였다.
DEXA 분석을 마친 후, 꼬리에서 혈액 샘플을 채취하였다. 혈액을 원심분리한 다음, 비색 분석법 키트(Asan Pharm., 서울, 한국)를 이용하여 트리글리세리드, 총 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 혈청 레벨을 측정하여 지질 프로파일을 확인하였다. 또한, 간 기능은 비색 분석법 키트(Asan Pharm.)를 이용하여 AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)를 측정함으로써 평가하였다. 혈청 렙틴 레벨은 방사면역측정 키트(Linco Research)를 이용하여 측정하였다. 인슐린 저항성은 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가 추정치를 이용하여 평가하였다(HOMA-IR) [HOMA-IR = 공복 인슐린(μ× 공복 글루코오스(mM) / 22.5].
혈액을 채취한 후, 인간 레귤러 인슐린(순수 인슐린; 5 U/kg 체중)을 하대정맥에 투여하였다. 10분 후, 랫트를 희생시키고 간 및 비복근(gastrocnemius)과 같은 조직 및 사두근(quadriceps muscles)을 신속하게 모은 다음, 액체 질소에 냉동시키고 추후 실험을 위해 -70℃에 보관하였다. 부고환 및 복막후 지방량과 절제한 자궁의 무게를 측정하였다. 자궁 지수는 체중으로 나눈 자궁 중량으로 산출하였다.
간 및 골격근에서 트리글리세리드 함량
클로로포름-메탄올(2:1, vol/vol)을 이용하여 간 및 비복근, 대퇴사두근으로부터 트리아실글리세롤을 추출하고, 클로로포름에 재현탁시켰다[23]. 클로로포름을 증발시킨 후, 잔류물은 0.1% triton X-100을 포함하는 PBS로 현탁시키고, 현탁액을 초음파 처리한 다음 5분간 끓였다. 현탁액의 트리아실글리세롤 함량은 Trinder kit(Asan)를 이용하여 측정하였다.
RNA 분리 및 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)
각 실험군으로부터 무작위로 4마리 랫트의 간을 선택하였다. 간 조직에 페놀의 단상 용액 및 구아니딘 아이소타이오사이안산염(Trizol reagent, Gibco-BRL, Rockville, MD)을 처리한 다음, 이소프로필 알코올로 침전시켜 총 RNA를 분리하였다. superscript III 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하고, Taq DNA 합성효소를 이용하여 cDNA에 대하여 PCR을 수행하였다. 동량의 cDNA를 사이버그린 믹스와 혼합하고, 실시간 PCR 기기(BioRad, Richmond, CA)를 이용하여 분석하였다. 관심 유전자의 발현 레벨은 하우스 키핑 유전자인 β-액틴으로 보정하였다. 랫트 PGC-1α(proliferator-activated receptor-gamma coactivator), CPT-1(carnitine palmitoyltransferase-1), ACC(acetyl CoA carboxylase), SREBP-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c), FAS(fatty acid synthase) 및 β-액틴 유전자를 검출하기 위해 사용한 프라이머는 서열목록 제1서열 내지 제12서열에 개시되어 있다.
면역블롯 분석
동결시킨 4마리 랫트의 간 조직을 2 mM EDTA, 137 mM NaCl, 1% NP40, 10% 글리세롤, 12 mM α-글리세롤 인산염 및 단백질분해효소 억제제를 포함하는 20 mM Tris 버퍼(pH 7.4)로 용해시켰다. 30-50 μg의 단백질을 포함하는 간 조직의 용해물을 SDS-PAGE에 전기영동하고, 인산화된 Akt 및 GSK-1β(glycogen synthase kinase-1β) 그리고 Akt, GSK-1β, PEPCK(phosphoenolpyruvate carboxykinase) 및 β-액틴에 특이적인 항체를 이용하여 면역블롯팅을 실시하였다. 단백질 발현 정도는 Imagequant TL(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 측정하였다. 실험군 당 2개 샘플의 3세트에 대하여 평가하였다(n=6).
통계학적 분석
모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 나타냈다. SAS 소프트웨어(SAS institutes, Cary, NC, USA)를 이용하여 통계학적 분석을 실시하였다. 다른 시간 포인트에서 측정한 변수들을 독립변수로서 시간 및 실험군 그리고 시간 및 실험군 간의 상호작용에 대하여 이원 분산분석을 실시하였다.
실험 종료 시 결과를 측정하였을 때, 실험군(APP, LJH, GJE, APP+LJH+GJE, 양성 대조군 및 대조군)의 효과를 결정하기 위해 일원 ANOVA를 이용하였다. 실험군 사이의 주요 효과에 대한 유의한 차이는 Tukey's 시험에서 p<0.05로 확인하였다.
실험결과
총 페놀성 화합물, 플라보노이드, 및 생리활성 성분의 함량
총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 APP 및 LJH와 비교하여 GJE에서 약 3배 높았다(표 1). APP, LJH 및 GJE의 물 추출물에 대한 지시 화합물은 각각 유파티린 및 자세오시딘, 스타키드린, 및 제니포사이드 및 우르솔릭산이다. 물 추출물에서 상기 화합물에 대한 각 함량은 지시 화합물로 사용하기에 충분하였다(표 1).
| 총 폴리페놀(mg/g) | 총 플라보노이드(mg/g) | ||||
| Artemisia princeps Pamp (APP) | 7.4±0.6 | 3.3±0.2 | |||
| Leonurus japonicas Houtt (LJH) | 6.8±0.4 | 2.4±0.1 | |||
| Gardenia jasminoides Ellis fruit (GJE) | 21.2±0.7 | 18.4±0.9 | |||
| 함량(mg/g) | |||||
| APP에서 유파티린 | 1.34±0.11 | GJE에서 게니포사이드 | 4.72±0.33 | ||
| APP에서 자세오시딘 | 0.88±0.09 | GJE에서 우르솔릭산 | 0.02±0.01 | ||
| LJH에서 스타키드린 | 1.50±0.23 | ||||
값은 평균±SD임(n=3).
꼬리 피부 온도
에스트로겐 결핍은 혈관 운동 장애로 인한 피부 온도 증가를 유발하며, OVX 랫트에서 꼬리 피부 온도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 시험물질 처리 1주째에는 처리에 따른 꼬리 피부 온도에 변화가 없었으나, 8주째에는 양성 대조군에 비해 대조군에서 랫트의 꼬리 피부 온도가 증가한 것으로 나타났다(도 1). APP, APP+LJH 및 APP+LJH+GJE는 OVX 랫트에서 양성 대조군만큼 꼬리 피부 온도 증가를 억제시켰다(도 1).
또한, 에스트로겐 결핍은 자궁 크기를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 자궁 지수는 양성 대조군 랫트와 비교하여 대조군 랫트에서 약 3배 감소하였다(표 2). 실험결과, APP, LJH, GJE 및 APP+LJH+GJE 처리 랫트에서는 에스트로겐을 처리한 랫트(양성 대조군)와 달리 자궁의 증식이 나타나지 않았다.
| 대조군 (n=12) |
APP (n=12) |
LJH (n=12) |
GJE (n=12) |
APP+LJH+GJE (n=12) |
양성 대조군(n=12) | |
| 체중(g) | 355±18a | 360±25a | 362±19a | 357±18a | 340±19b | 333±18b |
| 증가 체중(g) | 96.9±7.7a | 99.1±9.4a | 101.2±7.3a | 96.4±9.8a | 70.3±7.3b | 74.1±7.9c |
| 자궁 주위 지방 (g) | 11.2±1.1a | 8.9±0.9b | 9.2±0.9b | 8.5±0.9b | 6.6±0.7c | 6.1±0.7c |
| 자궁 주위 지방 및 체중의 비율 | 0.032±0.007a | 0.025±0.004b | 0.025±0.005b | 0.23±0.004b | 0.019±0.004c | 0.018±0.004c |
| 후복막강 지방(g) | 13.3±1.4a | 12.2±1.3a | 13.0±1.4a | 11.8±1.2a | 8.7±1.0b | 8.2±0.8b |
| 후복막강 지방 및 체중의 비율 | 0.037±0.008a | 0.034±0.005a | 0.036±0.007a | 0.033±0.006a | 0.026±0.005b | 0.025±0.005b |
| 자궁 지수 | 0.56±0.06c | 0.56±0.06c | 0.62±0.07c | 0.55±0.06c | 0.91±0.09b | 1.53±0.14a |
| 공복 렙틴 레벨 (ng/mL) | 3.4±0.6a | 3.8±0.6ab | 3.9±0.6ab | 3.8±0.6ab | 4.1±0.6b | 4.3±0.7b |
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함(OVX-CON); APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
에너지 대사
17β-에스트로겐(양성 대조군)을 투여한 OVX 랫트보다 OVX 랫트에서 체중 증가가 높게 나타났다. 또한, 자궁 주위 및 후복막강 지방 패드도 대조군 랫트보다 OVX 랫트에서 높게 나타났다(표 2). 17β-에스트라디올은 일부 부작용을 나타내기 때문에 에너지 대사 악화를 완화시키는 대안적인 치료법이 필요하다. APP+LJH+GJE는 양성 대조군만큼 OVX 랫트에서 체중 증가를 억제시켰다(표 2). 또한, APP, LJH, GJE 및 APP+LJH+GJE 처리 시 자궁주위 및 복막후강 지방 패드의 양은 대조군보다 낮았으며, APP+LJH+GJE는 양성 대조군과 유사한 효과를 나타냈다(표 2). APP+LJH+GJE의 혈청 렙틴 레벨은 양성 대조군과 유사하였다(표 2). 이러한 결과는 에스트로겐이 렙틴 분비에 중요한 역할을 하며, 에스트로겐 결핍이 렙틴 분비 손상을 유도한다는 것을 의미한다.
체중 및 체지방량은 에너지 섭취와 에너지 소비의 합계로 균형을 이룬다. 모든 실험군의 랫트에서 식품 섭취량은 약 20 g/일로 유의한 차이가 없었다. 식품 섭취에 기초하여, 랫트에서의 일일 식물 추출물 소비량을 산출하였다. US FDA [23]에서 제안된 6.2 변환 계수를 이용하여 인간에 대한 등가량으로 조정하였을 때, 인간의 일일 사용량은 식물 물 추출물 혼합물의 약 3-5 g이었다. OVX 랫트에서 체중 및 내장지방의 증가는 에너지 섭취의 변화없이 에너지 소비 감소에 의해 발생한 것이다(표 3). 또한, OVX 랫트에서 탄수화물 산화는 양성 대조군보다 높았으나, 지방 산화는 양성 대조군보다 낮았다(표 3). OVX 랫트에 있어서 추출물 투여에 의한 에너지 섭취 변화는 없었다.
APP+LJH+GJE는 OVX 랫트 사이에서 대조군보다 높은 에너지 소비율을 나타냈고, 일일 에너지 소비량이 양성 대조군 보다 우수하였다(표 3). 일일 에너지 소비량에서 탄수화물 산화는 양성 대조군 랫트에서 보다 대조군 랫트에서 높았던 반면, 지방 산화는 탄수화물 산화와 대조적인 결과를 보였다(표 3). APP, LJH 및 GJE 단독 투여 시에도 OVX 랫트에서 탄수화물 및 지방 산화가 증가되었으나, APP+LJH+GJE에서의 탄수화물 및 지방 산화가 가장 높게 나타났으며, 이는 양성 대조군 보다 우수한 수준이었다(표 3).
| 대조군 (n=12) |
APP (n=12) |
LJH (n=12) |
GJE (n=12) |
APP+LJH+GJE (n=12) |
양성 대조군 (n=12) |
|
| 칼로리 섭취 (Kcal/일) |
95.4±10 | 104±11 | 103±11 | 103±12 | 103±10 | 92±10 |
| 에너지 소비 (kcal/ kg0 .75/일) |
106±12c | 111±11bc | 119±12b | 121±11b | 137±13a | 131±13a |
| 호흡률 | 0.84±0.11 | 0.81±0.10 | 0.82±0.09 | 0.82±0.9 | 0.80±0.09 | 0.79±0.09 |
| 탄수화물 산화 (mg/ kg0.75/분) |
5.3±0.7a | 4.3±0.6b | 4.8±0.6ab | 4.6±0.5b | 4.5±0.5b | 4.1±0.6b |
| 지방 산화 (mg/ kg0.75/분) |
6.2±0.8c | 7.6±0.8b | 8.0±0.9b | 8.1±0.9b | 10.3±1.2a | 9.7±1.1a |
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함(OVX-CON); APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
체성분
지방 주위 및 후복막강 지방 패드 양과 일치하는 복부 및 다리 지방량을 DEXA로 측정한 결과, 양성 대조군 랫트와 비교하여 대조군 랫트에서 현저히 높게 나타났다(도 2a). 복부 지방량은 대조군 < APP < LJH < GJE < APP+LJH+GJE < 양성 대조군의 내림차순으로 저하되었다. 다리 지방량은 양성 대조군보다 APP+LJH+GJE에서 더 감소되었다(도 2a).
지방량과 달리 복부 및 다리의 제지방량은 양성 대조군 랫트보다 대조군 랫트에서 낮았다. 제지방량은 OVX 랫트에서 APP, LJH, GJE 및 APP+LJH+GJE에 의해 증가되었으며, APP+LJH+GJE군에서 복부 및 다리의 제지방량은 양성 대조군과 유사했다(도 2b).
지질 프로파일 및 간 기능 지수
LDL 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 총 혈청 레벨은 17β-에스트라디올 투여 랫트에서 보다 대조군 랫트에서 높은 반면, HDL 콜레스테롤 레벨은 대조군 랫트에서 더 낮았다(표 4). APP 및 APP+LJH+GJE 투여는 혈청 LDL 콜레스테롤 레벨 증가를 억제하며, APP+LJH+GJE는 양성 대조군과 비슷한 수준으로 혈청 HDL 콜레스테롤을 증가시킨다. APP 및 APP+LJH+GJE는 대조군보다 낮은 혈청 트리글리세리드 레벨을 나타냈다(표 4). 따라서, APP+LJH+GJE 투여는 OVX 랫트의 순환계에서 지질 대사에 대하여 유익한 효과를 나타낸다.
식물 추출물 치료제의 주요 부작용은 간 손상이 일반적이다. AST 및 ALT는 다양한 체내 조직에서 발견되며, ALT 및 AST의 혈청 레벨 증가는 임상학적으로 간세포 손상에 대한 진단 평가의 방법으로 이용된다. 혈청 AST 레벨은 양성 대조군 랫트보다 대조군 랫트에서 높게 나타났으며, 대조군, APP, LJH, GJE, APP+LJH+GJE 및 양성 대조군의 내림차순으로 감소되었다. APP+LJH+GJE는 양성대조군 만큼 혈청 AST 레벨을 감소시켰다(표 4). 혈청 ALT 레벨은 양성 대조군 랫트보다 대조군 랫트에서 높게 나타났으며, APP+LJH+GJE는 양성대조군 만큼 혈청 ALT 레벨을 감소시켰다(표 4).
| 대조군 (n=12) |
APP (n=12) |
LJH (n=12) |
GJE (n=12) |
APP+LJH+GJE(n=12) | 양성 대조군(n=12) | |
| 총 콜레스테롤(mg/dL) | 109.9±10.3a | 101.3±10.4ab | - | - | 108.5±10.9a | 99.4±9.5b |
| LDL 콜레스테롤(mg/dL) | 56.3±6.4a | 50.7±5.7b | - | - | 53.4±7.4ab | 45.2±5.6b |
| HDL 콜레스테롤(mg/dL) | 32.3±3.3b | 34.2±3.7ab | - | - | 36.9±3.6a | 38.3±3.7a |
| 트리글리세리드(mg/dL) | 107.1±10.4a | 81.4±8.8b | - | - | 80.3±8.1b | 79.6±8.5b |
| AST(IU/L) | 123±9a | 111±12ab | 109±14b | 108±11b | 90±15c | 87±14c |
| ALT(IU/L) | 39.8±4.6 | 41.5±5.9 | 40.1±6.8 | 40.6±5.1 | 35.6±5.2 | 35.5±5.5 |
| 글루코오스(mg/dL) | 100.3±11.4a | 87.5±10.4b | 92.8±11.3ab | 91.6±10.5ab | 93.0±10.8ab | 94.9±10.7ab |
| 인슐린(ng/mL) | 1.87±0.28a | 1.29±0.25b | 1.30±0.24b | 1.27±0.18b | 1.15±0.22c | 1.14±0.25c |
| HOMA-IR | 10.4±1.8a | 6.3±0.8bc | 6.7±0.8b | 6.5±0.8b | 5.9±0.7c | 6.0±0.7c |
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함(OVX-CON); APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
글루코오스 대사
양성 대조군 랫트와 비교하여 OVX 랫트에서 공복 혈당 레벨이 더 높았으나, 현저한 차이는 없었다(표 4). 그러나, 대조군 랫트와 비교하여 APP 랫트에서 공복 혈당 레벨이 현저히 낮았다. 공복 상태에서 혈청 인슐린 레벨은 양성 대조군 랫트보다 OVX 랫트에서 더욱 높았으나, 식물 추출물을 투여한 모든 OVX 랫트에서는 대조군 랫트보다 그 수치가 낮았다(표 4). 인슐린 저항성 지수인 HOMA-IR은 양성 대조군보다 OVX군에서 높았다. HOMA-IR은 대조군 > APP+LJH > APP > APP+LJH+GJE > 양성 대조군의 내림차순으로 감소되었다(표 4). APP+LJH+GJE는 양성 대조군과 유사한 수준으로 HOMA-IR 증가를 감소시켰다.
인슐린 저항성은 ITT로 결정할 수 있다. ITT에서 AUC의 1기(0-30분) 동안 혈청 글루코오스 레벨의 감소는 인슐린 저항성과 관련되어 있다. ITT의 2기(40-90분)에서 혈청 글루오코스 레벨은 유지되며, 서서히 증가한다. ITT의 1기 및 2기에서 혈청 글루코오스 레벨의 AUC는 양성 대조군보다 대조군에서 높았고, APP+LJH+GJE는 1기에서 가장 많이 감소되었다(도 3). AUC의 2기는 양성 대조군 보다 대조군에서 높았다. APP, APP+LJH 및 APP+LJH+GJE는 ITT 동안 2기에서 양성 대조군과 유사한 AUC를 나타냈다(도 3). 이러한 결과는 APP+LJH+GJE가 인슐린 저항성을 가장 많이 감소시킨다는 것을 의미한다.
간 및 골격근에서 지질
고지방식이는 세포내 트리글리세리드 저장을 증가시켜 인슐린 저항성을 유도하므로 간 및 골격근에서의 세포내 트리글리세리드 함량을 측정하였다. 간에 저장된 트리글리세리드 함량은 양성 대조군 보다 대조군에서 높았다(표 5). 트리글리세리드 함량은 대조군 < APP = APP+LJH < APP+LJH+GJE = 양성 대조군의 내림차순으로 낮았다. 다리의 주요 골격근인 비복근(gastrocnemius) 및 대퇴사두근(quadriceps muscle)에서 트리글리세리드는 양성 대조군 랫트 보다 대조군 랫트에서 더 많이 저장되었다. APP+LJH+GJE를 투여한 랫트에서 골격에서의 트리글리세리드 저장이 낮았으며, 이는 양성 대조군과 유사한 수준이었다(표 5).
| 대조군 (n=12) |
APP (n=12) |
LJH (n=12) |
GJE (n=12) |
APP+LJH+GJE(n=12) | 양성 대조군 (n=12) |
|
| 간(mg/g 조직) | 0.86±0.10a | 0.75±0.09b | 0.74±0.07b | 0.72±0.08b | 0.61±0.09c | 0.57±0.08c |
| 비복근(mg/g 조직) | 1.25±0.21a | 1.18±0.18ab | 1.10±0.22ab | 1.09±0.18ab | 1.02±0.17b | 0.93±0.17b |
| 대퇴사두근 (mg/g 조직) |
2.62±0.39a | 2.24±0.36b | 2.18±0.27b | 2.21±0.28b | 2.01±0.28c | 1.93±0.29c |
대조군, OVX 랫트에 2% 덱스트린을 포함하는 고지방식이를 제공함(OVX-CON); APP, OVX 랫트에 2% APP 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; LJH, OVX 랫트에 2% LJH 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; GJE, OVX 랫트에 2% GJE 물 추출물을 포함하는 고지방식이를 제공함; APP+LJH+GJE, APP:LJH:GJE=2:1:1 혼합물 2%; 양성 대조군, OVX 랫트에 17β-에스트라디올+2% 덱스트로스를 30 μg/kg 체중 포함하는 고지방식이를 제공함. 값은 평균 ± 표준편차로 나타냄.
a,b,cTukey 시험에 의해 p < 0.05에서 모든 실험군 사이에 유의한 차이가 있음.
지방산 산화 및 합성과 관련된 유전자의 발현 및 간 인슐린 시그널링
지방산 산화 및 합성이 트리글리세리드 저장과 관련되어 있으므로 지방산 산화 및 합성과 관련된 유전자의 발현을 측정하였다. 간에서의 지방산 대사는 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha)와 연관되어 있다. PGC-1α의 발현은 다른 투여군과 비교하여 대조군에서 낮았으며, APP+LJH+GJE는 대조군과 비교하여 PGC-1α 발현을 증가시킨다(도 4a). PGC-1α 발현 조절과 함께 CPT-1(Carnitine palmitoyltransferase I)의 간 발현, 지방산의 미토콘드리아 수송 및 지방산 산화의 주요 조절자는 양성 대조군 랫트 보다 대조군 랫트에서 낮게 나타났다(도 4a). 이러한 결과는 지방산 산화가 대조군과 비교하여 APP+LJH+GJE에서 증가된다는 것을 나타낸다. 지방산 합성의 조절 효소인 간 SREBP-1c(Sterol regulatory element binding factor 1c), FAS(Fatty acid synthase) 및 ACC(Acetyl-CoA carboxylase)의 발현은 양성 대조군 보다 대조군 랫트에서 높았다(도 4b). APP+LJH+GJE를 투여한 OVX 랫트에서 CPT-1 발현은 높았고, FAS 발현은 낮았다. 또한, SREBP-1c 및 ACC 레벨은 양성 대조군 랫트와 유사한 수준이었다(도 4b).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> KIM, JONG BIN
<120> Composition for Preventing, Treating or Improving Menopausal
Syndrome comprising Extracts from Artemisia princeps Pamp,
Leonurus japonicus Houtt and Gardenia jasminoides Ellis as An
Active Ingredient
<130> PN160166
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Beta-actin Forward Primer
<400> 1
actattggca acgagcggtt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Beta-actin Reverse Primer
<400> 2
tgtcagcaat gcctgggtac a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> CPT-1 Forward Primer
<400> 3
ctggtgggcc acaaattacg 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> CPT-1 Reverse Primer
<400> 4
aggtagatat attcttccca ccagtca 27
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> FAS Forward Primer
<400> 5
aggtgctaga ggccctgcta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> FAS Reverse Primer
<400> 6
gtgcacagac accttcccat 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> SREBP-1c Forward Primer
<400> 7
ggagccatgg attgcacatt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> SREBP-1c Reverse Primer
<400> 8
aggaaggctt ccagagagga 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> ACC Forward Primer
<400> 9
acactggctg gctggacag 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> ACC Reverse Primer
<400> 10
cacacaactc ccaacatggt g 21
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> PGC-1a Forward Primer
<400> 11
acatcgcaat tctccctt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> PGC-1a Reverse Primer
<400> 12
ctcttgagcc tttcgtgctc 20
Claims (10)
- 강화약쑥(Artemisia princeps Pamp), 익모초(Leonurus japonicus Houtt) 및 치자(Gardenia jasminoides Ellis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 강화약쑥 추출물은 강화약쑥 잎 추출물, 익모초 추출물은 익모초 잎 추출물, 치자 추출물은 치자 열매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 강화약쑥, 익모초 및 치자에 처리하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 갱년기 또는 폐경기 증상은 안면홍조, 발한, 피부건조, 질 건조증, 질 위축, 하부 요도 위축, 성교통, 질염, 방광염, 배뇨통, 급뇨, 체중증가, 내장지방증가, 지방간, 피부노화, 운동능력 감소, 신경과민, 불안, 우울증, 현기증, 수면장애, 집중장애, 단기 기억장애, 활력저하, 성욕 감퇴, 근육통, 당뇨병 또는 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 피부 온도 증가, 체중 증가 또는 내장 지방 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 에너지 소비를 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린 저항성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 ALT(alanine aminotransferase) 또는 AST(aspartate aminotransferase) 레벨을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1 alpha) 및 CPT-1(carnitine palmitoyl transferase-1)의 발현을 증가시키고, SREBP-1c(Sterol regulatory element binding protein-1c), FAS(fatty acid synthase) 및 ACC(Acetyl-CoA carboxylase)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 강화약쑥(Artemisia princeps Pamp), 익모초(Leonurus japonicus Houtt) 및 치자(Gardenia jasminoides Ellis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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| KR1020160073972A KR101842936B1 (ko) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020160073972A KR101842936B1 (ko) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170141318A KR20170141318A (ko) | 2017-12-26 |
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|---|---|---|---|
| KR1020160073972A KR101842936B1 (ko) | 2016-06-14 | 2016-06-14 | 강화약쑥, 익모초 및 치자 추출물을 유효성분으로 포함하는 갱년기 또는 폐경기 증상의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR102124986B1 (ko) * | 2019-04-22 | 2020-06-22 | (주)에프앤디넷 | 익모초 추출물 또는 레오누린을 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물 |
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| KR102355798B1 (ko) * | 2020-06-30 | 2022-01-26 | 주식회사농심 | 복합 식물 추출물을 포함하는 여성 갱년기 증상 치료 또는 완화용 조성물 |
-
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 석사학위논문(김장선, ‘Ameliorative effects of Leonurus sibiricus on post-menopausal obesity in mice’, 경희대학교)(2015년 02월) |
| 석사학위논문(조현지, ‘난소절제 흰 쥐에서 강화약쑥의 공급이 생화학적 골 대사 지표에 미치는 영향’, 경희대학교)(2014년 08월) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR102124986B1 (ko) * | 2019-04-22 | 2020-06-22 | (주)에프앤디넷 | 익모초 추출물 또는 레오누린을 함유하는 근육 질환 예방 또는 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물 |
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