KR101823490B1 - 옥사미드 나노겔, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents
옥사미드 나노겔, 이의 제조방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔, 상기 나노겔의 제조방법, 상기 나노겔을 포함하는 초음파 영상용 조영제, 상기 조영제를 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물, 상기 조영제의 제조방법, 및 상기 초음파 진단용 조성물을 이용한 염증성 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔, 상기 나노겔의 제조방법, 상기 나노겔을 포함하는 초음파 영상용 조영제, 상기 조영제를 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물, 상기 조영제의 제조방법, 및 상기 초음파 진단용 조성물을 이용한 염증성 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.
초음파 영상은 우리 귀에는 들리지 않는 높은 주파수의 음파를 인체 표면에서 인체 내부로 보낸 후 내부에서 반사되는 음파를 수집하여 영상화시킨 것을 말한다. 초음파 검사(ultrasound examination, ultrasonography, sonography)는 초음파 영상을 실시간으로 얻기 때문에, 장기의 구조뿐 아니라 운동까지도 관찰할 수 있으며, 혈관 내부의 혈류도 측정할 수 있다. 인체에 해로운 방사선을 사용하지 않으며, 통증없이 신속하게 검사를 할 수 있어 환자가 가진 질환을 진단하거나 그 치료 경과를 판단하기에 매우 쉽고 편리한 영상검사법이다.
초음파검사는 환자의 몸을 얇은 단면으로 자른 형태의 2차원 영상을 실시간으로 보면서 몸 속의 병변을 찾는 검사이나, 최근에 초음파 기술이 발전되어 3차원으로 몸 속의 장기나 태아를 보여주는 3차원 초음파검사(3D ultrasonography)가 널리 행해지고 있으며, 3차원 영상의 움직임까지 표현되는 4차원 초음파검사(4D ultrasonography)도 이용되고 있다.
이러한 초음파 검사는 간, 담낭, 췌장, 비장, 콩팥 등의 상복부 장기나 방광, 자궁, 난소, 전립선 등의 골반강 장기 외에도 갑상선, 유방, 음낭, 근골격계, 심장 등 다양한 인체 장기를 검사할 수 있다. 일반적으로 초음파검사를 하는 이유는 통증이나 염증이 있을 때 원인을 찾기 위해 검사를 하기도 하고, 증상이 없는 환자에서 종양을 조기에 진단을 하기 위해 사용되기도 한다.
비침습적이고, 넓은 범위에 쉽게 적용할 수 있으며, CT나 MRI 등의 다른 영상 검사에 비해 비용이 저렴할 뿐만 아니라, 인체에 해로운 방사선을 사용하지 않아 무해하므로 반복검사에도 위험이 없는 장점이 있다. 그러나, 획득한 초음파 영상을 판독하는 것은 쉽지 않을 뿐더라, CT나 MRI와 달리 실시간으로 판단해야 하므로 검사자에 매우 의존적이다.
따라서, 이와 같은 초음파 영상을 질병의 진단에 활용하기 위해서는 판독을 용이하게 하여 검사자에 대한 의존성을 낮추고 검사의 정확성 및 신뢰성을 높이기 위해서는 보다 뚜렷하게 병변을 확인할 수 있도록, 초음파가 공기층을 투과하지 못하는 것에 착안하여 기포를 발생시키는 물질을 조영제를 사용하기도 한다.
이에 본 발명자들은 과산화수소를 발생시키는 염증성 질환의 진단에 사용하기 위한 초음파 영상용 조영제를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔과 우수한 기체포집능을 갖는 화학종인 퍼플루오로헥산과 조합하여 사용하면 염증성 병변에서 CO2를 발생시킬 뿐만 아니라 이를 포집할 수 있으므로 초음파 영상의 신호 증강에 유리하여 암을 포함한 염증성 질환의 진단에 유용함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유기용매에 폴리아민계 고분자 및 비이온성 계면활성제를 용해시킨 고분자 용액을 교반하여 역미셀 분산액을 준비하는 제1단계; 및 상기 역미셀 분산액에 옥살릴할라이드를 첨가하여 옥사미드 결합에 의해 나노겔을 형성하는 제2단계를 포함하는, 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 포함하는, 초음파 영상용 조영제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초음파 영상용 조영제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 용해시킨 수용액을 초음파 분산시키는 단계를 포함하는, 초음파 영상용 조영제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 초음파 진단용 조성물이 투여된 개체에 대해 초음파 영상을 촬영하는 제1단계; 및 상기 초음파 영상을 판독하여 정상조직에 비해 증가된 신호가 검출된 부위에 염증성 질환이 발병한 것으로 판단하는 제2단계를 포함하는 염증성 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태는 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔를 제공한다.
본 발명의 제2양태는 유기용매에 폴리아민계 고분자 및 비이온성 계면활성제를 용해시킨 고분자 용액을 교반하여 역미셀 분산액을 준비하는 제1단계; 및 상기 역미셀 분산액에 옥살릴할라이드를 첨가하여 옥사미드 결합에 의해 나노겔을 형성하는 제2단계를 포함하는, 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 상기 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 포함하는, 초음파 영상용 조영제를 제공한다.
본 발명의 제4양태는 상기 초음파 영상용 조영제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제5양태는 상기 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 용해시킨 수용액을 초음파 분산시키는 단계를 포함하는, 초음파 영상용 조영제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제6양태는 상기 초음파 진단용 조성물이 투여된 개체에 대해 초음파 영상을 촬영하는 제1단계; 및 상기 초음파 영상을 판독하여 정상조직에 비해 증가된 신호가 검출된 부위에 염증성 질환이 발병한 것으로 판단하는 제2단계를 포함하는 염증성 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
당업계에 알려진 과산화수소와 반응하여 CO2를 발생시키는 물질의 예로는 옥살레이트 결합(R-O-(C=O)-(C=O)-O-R')을 포함하는 화합물이 대표적이다. 그러나, 상기 과산화수소가 옥살레이트 결합에 작용하여 CO2를 발생시키는 반응은 너무 빠르게 일어나므로 발생한 CO2를 포집하는 데 어려움이 있어 초음파 영상용 조영제로 사용하더라도 효율이 낮을 수 있다. 이에 본 발명자들은, 옥살레이트 결합보다는 반응성이 낮은 옥사미드 결합을 포함하는 물질을 이용하면 CO2 발생 속도를 조절할 수 있어 발생된 CO2를 용이하게 포집할 수 있으므로 초음파 영상용 조영제로 활용가능함을 발견하였다. 나아가, 다수의 아민기를 포함하는 폴리아민계 고분자를 역미셀 분산액으로 만든 후 옥살릴할라이드와 반응시키면 옥사미드 결합을 포함하는 나노미터 수준의 직경을 갖는 나노겔의 형태로 제공할 수 있어 이를 포함하여 투여가 용이하도록 수십 내지 수백 nm 수준의 크기를 갖는 입자 형태의 조영제를 제공할 수 있음을 발견하였다. 전술한 바와 같이, 상기 조영제는 염증성 병변에 투여시 이에 포함된 옥사미드 결합과 병변에서 발생하는 과산화수소의 반응에 의해 조절된 속도로 CO2를 발생시켜 마이크로 크기의 CO2 기체가 포집된 버블을 형성할 수 있고, 이때, 기체포집능이 우수한 퍼플루오로헥산을 더 포함하여 보다 높은 밀도로 CO2를 담지할 수 있어, 염증성 질환의 병변의 보다 정확한 진단이 가능함을 확인하였다.
본 발명은 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔을 제공한다.
예컨대, 상기 폴리아민계 고분자는 선형 또는 가지형 폴리(C1-4 알킬렌)이민일 수 있다. 상기 폴리이민계 고분자는 가지형 폴리에틸렌이민(branched-polyethyleneimine; bPEI)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 옥사미드 결합은 총 아민기의 수의 대해 10 내지 50몰%의 비율로 형성된 것일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 비율로 즉, 총 아민기의 수에 대해 10몰% 미만 또는 50몰% 초과로 옥사미드 결합을 포함하는 경우 안정한 나노겔의 형성이 불가할 수 있다.
본 발명에 따른 나노겔은 유기용매에 폴리아민계 고분자 및 비이온성 계면활성제를 용해시킨 고분자 용액을 교반하여 역미셀 분산액을 준비하는 제1단계; 및 상기 역미셀 분산액에 옥살릴할라이드를 첨가하여 옥사미드 결합에 의해 나노겔을 형성하는 제2단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 제1단계는 1,000 내지 3,000rpm으로, 15분 내지 3시간 교반하여 수행할 수 있고, 상기 제2단계는 10 내지 35℃에서, 1,000 내지 3,000rpm으로, 6시간 내지 24시간 교반하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 보유한 자성교반기의 최대 속도인 1,700 rpm으로 교반하여 상기 제1단계 및 제2단계를 수행하였으나, 이에 제한되지 않는다.
제2단계로부터 수득한 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔을 C1-4 알코올로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 알코올로는 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 세척 후에는 형성된 나노겔을 회수하기 위하여, 7,000 내지 15,000 rpm으로 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세척하는 단계는 수 회 반복하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 상기 고분자 용액은 폴리아민계 고분자를 0.02 내지 0.04 g/mL 농도로 함유할 수 있다.
예컨대, 상기 비이온성 계면활성제는 폴리아민계 고분자의 질량에 대해 1.5 내지 5배의 중량비(w/w)로, 옥살릴할라이드는 폴리아민계 고분자의 질량에 대해 0.3 내지 1배의 부피비(v/w)로 각각 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 포함하는, 초음파 영상용 조영제를 제공할 수 있다.
예컨대, 상기 과불소화 화합물은 불소를 다수 포함하며 상온에서 액체 상태인 화합물로서 기체 포집성을 갖는 예컨대, 기체 용해도가 높은 화학종일 수 있다. 상기 과불소화 화합물의 비제한적인 예는 퍼플루오로펜탄(perfluoropentane), 퍼플루오로헥산(perfluorohexane), 퍼플루오로옥틸브로마이드(perfluorooctylbromide) 및 퍼플루오로-15-크라운-5-에테르(perfluoro-15-crown-5-ether)를 포함한다.
예컨대, 본 발명의 조영제는 30 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 입자 형태일 수 있다.
본 발명의 조영제는 과산화수소와 반응하여 이산화탄소를 발생시키고, 발생된 이산화탄소를 포집한 채로 팽창하여 마이크로 버블을 형성할 수 있다. 본 발명의 조영제는 이산화탄소를 포집하여 작게는 2 μm로부터 100 μm까지의 직경을 갖는 마이크로 버블로 팽창할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예컨대, 본 발명의 조영제는 근적외선 형광체를 더 포함할 수 있고, 상기 근적외선 형광체의 형광으로부터 이산화탄소의 존재를 검출할 수 있다. 예컨대, 상기 근적외선 형광체는 Cy5.5일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 유사 형광체를 제한없이 사용할 수 있다. 한편, 상기 근적외선 형광체는 물리적 및/또는 화학적 상호작용에 의해 조영제에 결합될 수 있다. 예컨대, 상기 근적외선 형광체는 폴리아민계 고분자의 아민기에 공유결합을 형성하여 부착될 수 있도록 비닐술폰기, N-히드록시숙신이미딜기(N-hydroxysuccinimidyl; NHS), 또는 이소티오시아네이트기(isothiocyanate; ITC)를 포함하는 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가, 본 발명은 상기 초음파 영상용 조영제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물을 제공할 수 있다. 예컨대, 고체상태의 조영제를 생리식염수와 같은 적절한 용매에 분산시켜 투여가능한 형태로 제공할 수 있다. 예컨대, 주사제의 형태로 염증성 질환이 발병하였을 것으로 의심되는 부위에 직/간접적으로 주사하여 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물을 사용하여 진단할 수 있는 염증성 질환은 염증을 주병변으로 하는 질병으로 병변에서 과산화수소를 발생시키는 질환을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 간염, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증일 수 있다. 나아가, 상기 염증성 질환은 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 기관지, 후두, 인두, 흉부, 골, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 방광, 자궁, 자궁경부, 유방, 난소, 고환, 이외의 생식기관, 피부, 갑상선, 혈액, 림프절, 신장, 간, 췌장, 뇌, 중추신경계에서 발병하는, 고형종양 또는 혈액전염성 종양 등의 암 질환을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 초음파 영상용 조성물은 본 발명의 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 용해시킨 수용액을 초음파 분산시키는 단계를 통해 제조할 수 있다.
예컨대, 상기 수용액은 나노겔, 과불소화 화합물 및 비이온성 고분자 계면활성제를 1:(0.05 내지 0.2):(1.5 내지 3)의 중량:부피:중량비로 포함할 수 있다.
이때, 상기 수용액은 0.05 내지 0.2 g/mL의 농도로 나노겔을 포함할 수 있다.
또한, 상기 수용액은 근적외선 형광체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 근적외선 형광체는 나노겔의 중량에 대해 0.03 내지 0.1의 중량비로 사용할 수 있다.
본 발명의 제6양태는 상기 초음파 진단용 조성물이 투여된 개체에 대해 초음파 영상을 촬영하는 제1단계; 및 상기 초음파 영상을 판독하여 정상조직에 비해 증가된 신호가 검출된 부위에 염증성 질환이 발병한 것으로 판단하는 제2단계를 포함하는 염증성 질환의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 염증성 질환이나 산화 작용에 의해 유발되는 질환이 발명하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔은 과산화수소와 반응하여 조절된 속도로 CO2를 발생시킬 수 있으므로, 기체포집능이 우수한 퍼플루오로헥산과 함께 나노입자로 제조하여 초음파 영상용 조영제로 유용하게 활용할 수 있으며, 상기 초음파 영상용 조영제는 암 질환을 포함한 염증성 질환의 진단에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔의 적외선 분광 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 비교예로서, (a) 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)의 겔화반응에 의한 옥사미드 벌크겔의 합성방법 및 (b) 상기 겔화 반응 전과 후의 PEI의 광학이미지를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔의 구성 및 작동원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제의 투과전자현미경(transmission electron microscope; TEM) 이미지 및 이로부터 산출한 수화된 상태의 크기 분포를 나타낸 도이다.
도 5는 (a) 옥사미드기의 과산화수소 감응성 CO2 생성 및 화학발광 반응 기전 및 (b) 옥사미드 나노겔 탑재 나노 조영제의 과산화수소 감응성 화학발광 이미지를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔의 과산화수소 감응에 따른 기포 형성을 (a) 광학현미경 및 (b) 극저온 주사전자현미경(cryo-SEM)으로 관찰한 이미지, 및 (c) CO2 형성을 질량분광법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 이용한 (a) 초음파 영상 가공실험 이미지 및 (b) 이로부터 검출된 초음파 신호 강도를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 투여한 (a) 간염모델 마우스 및 (b) 암모델 마우스에서 해당 조직의 초음파 영상 이미지 및/또는 신호강도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 비교예로서, (a) 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)의 겔화반응에 의한 옥사미드 벌크겔의 합성방법 및 (b) 상기 겔화 반응 전과 후의 PEI의 광학이미지를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔의 구성 및 작동원리를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제의 투과전자현미경(transmission electron microscope; TEM) 이미지 및 이로부터 산출한 수화된 상태의 크기 분포를 나타낸 도이다.
도 5는 (a) 옥사미드기의 과산화수소 감응성 CO2 생성 및 화학발광 반응 기전 및 (b) 옥사미드 나노겔 탑재 나노 조영제의 과산화수소 감응성 화학발광 이미지를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔의 과산화수소 감응에 따른 기포 형성을 (a) 광학현미경 및 (b) 극저온 주사전자현미경(cryo-SEM)으로 관찰한 이미지, 및 (c) CO2 형성을 질량분광법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 이용한 (a) 초음파 영상 가공실험 이미지 및 (b) 이로부터 검출된 초음파 신호 강도를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 옥사미드 나노겔을 투여한 (a) 간염모델 마우스 및 (b) 암모델 마우스에서 해당 조직의 초음파 영상 이미지 및/또는 신호강도를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
역미셀방법
매개
옥사미드
나노겔의
제조
가지형 폴리에틸렌이민(branched-polyethyleneimine; bPEI, 분자량 600, Sigma-Aldrich, 미국) 1.4 g을 액상 비이온성 계면활성제 트윈 80(tween80, Sigma-Aldrich, 미국) 1 g에 용해시킨 뒤, 시클로헥산(cyclohexane, 대정화금, 대한민국) 15mL과 혼합하였다. 상기 혼합물을 상온에서 1시간 동안 고속 교반하여 균일한 역미셀 분산액을 제조하였다. 상기 역미셀 분산액에 옥살릴클로라이드 0.2 mL을 첨가하고, 상온에서 12시간 더 교반하여 옥사미드 나노겔의 형성을 유도하였다. 에탄올(대정화금, 대한민국)로 세정하여 역미셀 상태로 분산된 옥사미드 나노겔로부터 잔류 유기물과 유기용매를 제거하였다. 구체적으로, 역미셀 상태의 옥사미드 나노겔 분산액을 과량의 에탄올에 부어 옥사미드 나노겔 표면의 트윈 80을 제거하는 동시에 옥사미드 나노겔은 선택적으로 침전되도록 유도하였다. 침전된 옥사미드 나노겔을 회수하여 과량의 에탄올에 재분산시키고, 10,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 옥사미드 나노겔을 침전시켰다. 상기 에탄올을 이용한 재분산 및 침전에 의한 세척과정을 3회 반복하여 수행하였다. 정제된 옥사미드 나노겔은 상온에서 진공건조하였다. 옥사미드 나노겔에 포함된 옥사미드 결합을 확인하기 위하여, 적외선 스펙트럼을 측정하여 형성된 옥사미드 나노겔의 화학구조를 분석하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
비교예
1: 폴리에틸렌이민의
겔화반응을
이용한
옥사미드
벌크겔의
제조
bPEI을 디클로로메탄(dichloromethane, 대정화금, 대한민국)에 50중량% 농도로 용해시킨 후, 상기 bPEI 대비 50중량%의 옥살릴클로라이드(oxalyl chloride)를 첨가하였다. 이후 상온에서 1분 동안 고속 교반하여 도 2a에 개시한 겔화반응을 유도하여 옥사미드 벌크겔을 제조하였다.
옥사미드 벌크겔 형성여부를 확인하기 위하여, bPEI의 겔화반응 중 상변화를 관찰하였다(도 2b). 또한, 적외선 분광법을 통해, 옥사미드 결합의 형성여부를 확인하고, 옥사미드 벌크겔의 화학구조를 분석하였으며, 기록한 적외선 스펙트럼을 도 1에 나타내었다.
실시예
2:
옥사미드
나노겔을
포함하는 초음파 영상용
나노조영제의
제조
상기 실시예 1에 따라 제조한 옥사미드 나노겔 10 mg을 비닐술폰기를 포함하는 근적외선 형광체인 Cy5.5(0.5 mg, Bioacts, 대한민국), 기체포집능을 갖는 화학종인 퍼플루오로헥산(1 μL, Sigma-Aldrich, 미국), 및 고분자 계면활성제인 플루로닉 F-68(20 mg, Sigma-Aldrich, 미국)이 혼합 용해된 1 mL의 수용액에 첨가한 후, 초음파 분산시켜 근적외선 형광 및 기체포집 특성을 부여한 옥사미드 나노겔 함유 나노조영제를 제조하였다. 제조된 옥사미드 나노조영제를 원심분리하여 1 mL 생리식염수(pH 7.4)에 재분산시켜 결합되지 않은 Cy5.5를 제거하였다. 상기와 같이 세척하여 최종적으로 수득한 옥사미드 나노겔을 포함하는 초음파 영상용 나노조영제는 0 내지 5℃에서 냉장보관하였다.
이상과 같이 제조한 옥사미드 나노겔을 포함하는 초음파 영상용 나노조영제의 설계 모식도를 도 3에 나타내었다. 투과전자현미경 및 동적광산란법을 이용하여 제조된 나노조영제의 구조 및 형태를 분석하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 과산화수소에 감응하여 나노조영제에 포함된 옥사미드 결합이 효과적으로 해리되어 CO2를 발생시키는 것을 확인하기 위하여, 도 5a에 개시한 옥사미드기의 화학발광 기작을 매개로 발생하는 Cy5.5의 근적외선 형광을 관찰하고, 그 결과를 도 5b에 나타내었다. 실질적으로 옥살레이트 결합의 경우 과산화수소와의 반응성이 높으므로 과산화수소에 노출시 옥살레이트 결합이 빠르게 분해되면서 화학발광 현상을 나타내기도 하지만, 도 5a에 나타난 과산화수소에 의한 옥사미드 결합의 해리는 반응성이 낮으므로 과산화수소에 노출되어도 화학발광 현상을 관찰하기 어려울 수 있다. 다만, 본 발명의 경우 나노겔의 옥사미드 결합은 아민기를 다수 포함하는 폴리에틸렌이민 네트워크에 포함되어 있어 이에 포함된 아민기들이 염기성 환경을 제공할 수 있으므로, 이에 따른 염기-촉매화 효과에 의해 과산화수소에 의한 옥사미드 결합의 해리 반응을 촉진시킬 수 있고, 따라서, 아민기에 의해 매개되는 염기-촉매화 기작에 의해 중성 pH에서는 과산화수소에 의한 옥사미드 결합의 해리에 따른 화학발광 현상이 관찰된 반면, 산성의 pH 하에서는 이러한 염기-촉매화 효과가 배제되므로 과산화수소에 의한 옥사미드 결합의 해리에 따른 화학발광을 관찰할 수 없었다. 이는 도 5b의 좌측 도면에서 확인할 수 있다.
실시예
3:
옥사미드
나노겔을
포함하는
나노조영제의
미세기포
생성능
평가 및 이를 이용한 초음파 신호 검출
3-1. 과산화수소 감응에 의한
옥사미드
나노겔을
포함하는
나노조영제의
미세기포
생성능
옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제가 과산화수소에 감응하여 옥사미드 결합의 해리에 의한 미세기포를 생성하는지 확인하기 위하여, 실시예 2에 따라 제조된 나노조영제의 수분산액에 최종 90 μM 농도가 되도록 과산화수소를 첨가한 뒤, 광학현미경으로 미세기포의 생성을 실시간으로 관찰하고, 그 결과를 도 6a에 나타내었다. 또한, 나노조영제의 수분산액에 위와 동일한 농도로 과산화수소를 첨가한 직후 액체질소에 침지하여 발생하는 미세기포를 동결시켜 극저온-주사전자현미경(cryo-SEM)으로 관찰하고, 그 결과를 도 6b에 나타내었다. 나아가, 상기 발생하는 미세기포가 CO2를 함유하는 것을 확인하기 위하여, 건조상태의 옥사미드 나노겔 400 mg에 30% 과산화수소 수용액을 2 내지 3방울 떨어뜨린 후, 질량분광기(HPR20, Hiden Analytical, 영국)를 이용하여 CO2 분압을 측정하고, 그 결과를 도 6c에 나타내었다.
3-2. 과산화수소 감응에 의한
옥사미드
나노겔을
포함하는
나노조영제
매개 초음파 신호 검출
실시예 2에 따라 제조한 나노조영제에 의한 초음파 신호를 관찰하기 위하여, 한천을 3중량% 농도로 물에 용해시킨 후, 상온에서 냉각시켜 한천겔(agar-gel) 몰드를 제작하고, 몰드의 측면에는 부피 500 μL의 원기둥 형태의 빈 공간을 형성하였다. 상기 형성된 빈 공간에 300 μL의 나노조영제를 넣은 후, 최종 90 μM 농도가 되도록 과산화수소를 첨가하고, 초음파 영상 장비(Vevo770, High-Resolution Micro-Imaging System; Visualsonics, 캐나다)를 이용하여 40 MHz 진동수로 초음파 영상을 실시하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7a는 초음파 영상을, 도 7b는 이로부터 추출한 정량적인 신호 강도를 나타낸다. 도 7에 나타난 바와 같이, 과산화수소 첨가 전과 후의 초음파 신호는 육안으로 용이하게 구분할 수 있을 만큼 현저한 차이를 나타내었으며, 수치상으로 보아도 약 5배 정도 신호가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4: 염증성 질환 모델에서
옥사미드
나노겔을
포함하는
나노조영제의
미세기포 생성능 평가 및 이를 이용한 초음파 신호 검출
4-1.
옥사미드
나노겔을
투여한 간염 마우스 모델의 초음파 영상
5주령의 수컷 마우스(오리엔트바이오, 대한민국)에 1 mg의 여드름균(P. acnes)을 분산시킨 100 μL 생리식염수를 정맥주사하고, 7일 후 1 μg의 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)를 포함하는 200 μL 생리식염수를 추가로 정맥주사하여 간염 마우스 모델을 제작하였다. 상기 간염이 유발된 마우스를 초음파 영상 장비의 패드에 고정시킨 후, 실시예 2에 따라 제조한 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제 200 μL를 카테테르 주사기로 간 조직에 직접 주사하였다. 상기 나노조영제 전/후 초음파 영상을 실시하고, 그 결과를 도 8a에 나타내었다. 도 8a에 나타난 바와 같이, 초음파 영상을 통해 정상 조직과 간염 유발된 간 조직을 육안으로 구분할 수 있을 정도임을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제가 염증성 질환의 초음파 진단에 있어서 조영제로 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
4-2.
옥사미드
나노겔을
투여한 암 마우스 모델의 초음파 영상
5주령의 수컷 마우스(오리엔트바이오, 대한민국)의 왼쪽 허벅지 부위에 1×106개의 SCC7 세포를 피하주사하여, 암 마우스 모델을 제작하였다. 암세포를 이식하고 10 내지 15일 후, 고형암이 형성되었음을 확인하고, 상기 실시예 2에 따라 제조한 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제 50 μL를 형성된 암 조직에 직접 주사하였다. 상기 나노조영제 전/후 초음파 영상을 실시하고, 그 결과를 도 8b에 나타내었다. 도 8b에 나타난 바와 같이, 주사 전과 후 초음파 영상 신호는 약40% 더 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 차이는 영상으로부터 육안으로도 확인 가능하였다. 이는 본 발명에 따른 옥사미드 나노겔을 포함하는 나노조영제가 암 질환의 초음파 진단에 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
Claims (27)
- 삭제
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- 유기용매에 폴리아민계 고분자 및 비이온성 계면활성제를 용해시킨 고분자 용액을 교반하여 역미셀 분산액을 준비하는 제1단계; 및
상기 역미셀 분산액에 옥살릴할라이드를 첨가하여 옥사미드 결합에 의해 나노겔을 형성하는 제2단계를 포함하는, 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔의 제조방법.
- 제5항에 있어서,
제1단계는 1,000 내지 3,000rpm으로, 15분 내지 3시간 교반하여 수행하는 것인 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 제2단계는 10 내지 35℃에서, 1,000 내지 3,000rpm으로, 6시간 내지 24시간 교반하여 수행하는 것인 제조방법.
- 제5항에 있어서,
제2단계로부터 수득한 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔을 C1-4 알코올로 세척하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 고분자 용액은 0.02 내지 0.04 g/mL 농도로 폴리아민계 고분자를 함유하는 것인 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 비이온성 계면활성제는 폴리아민계 고분자의 질량에 대해 1.5 내지 5배의 중량비(w/w)로 사용하는 것인 제조방법.
- 제5항에 있어서,
상기 옥살릴할라이드는 폴리아민계 고분자의 질량에 대해 0.3 내지 1배의 부피비(v/w)로 사용하는 것인 제조방법.
- 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 포함하는, 초음파 영상용 조영제.
- 제12항에 있어서,
상기 조영제는 30 nm 내지 1000 nm의 직경을 갖는 입자 형태인 것인 조영제.
- 제12항에 있어서,
상기 조영제는 과산화수소와 반응하여 이산화탄소를 발생시키고, 발생된 이산화탄소를 포집한 채로 팽창하여 마이크로 버블을 형성하는 것인 조영제.
- 제12항에 있어서.
상기 조영제는 근적외선 형광체를 더 포함하는 것인 조영제.
- 제15항에 있어서,
상기 조영제는 형광으로 이산화탄소의 존재를 검출 가능한 것인 조영제.
- 제12항의 초음파 영상용 조영제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 초음파 진단용 조성물.
- 제17항에 있어서,
상기 염증성 질환은 간염, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 인플루엔자 감염증, 또는 머리, 목, 눈, 입, 인후, 식도, 기관지, 후두, 인두, 흉부, 골, 폐, 결장, 직장, 위, 전립선, 방광, 자궁, 자궁경부, 유방, 난소, 고환, 이외의 생식기관, 피부, 갑상선, 혈액, 림프절, 신장, 간, 췌장, 뇌, 중추신경계에서 발병하는, 고형종양 및 혈액전염성 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 암 질환인 것인 조성물.
- 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔; 과불소화 화합물; 및 비이온성 고분자 계면활성제를 용해시킨 수용액을 초음파 분산시키는 단계를 포함하는, 초음파 영상용 조영제의 제조방법.
- 제19항에 있어서,
상기 수용액은 나노겔, 과불소화 화합물 및 비이온성 고분자 계면활성제를 1:(0.05 내지 0.2):(1.5 내지 3)의 중량:부피:중량비로 포함하는 것인 제조방법.
- 제19항에 있어서,
상기 수용액은 0.05 내지 0.2 g/mL의 농도로 나노겔을 포함하는 것인 제조방법.
- 제19항에 있어서,
상기 수용액은 근적외선 형광체를 더 포함하는 것인 제조방법.
- 제22항에 있어서,
상기 근적외선 형광체는 나노겔의 중량에 대해 0.03 내지 0.1의 중량비로 포함하는 것인 제조방법.
- 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된, 옥사미드 결합에 의해 가교결합된 폴리아민계 고분자를 포함하는 나노겔.
- 제12항에 있어서, 상기 폴리아민계 고분자는 선형 또는 가지형 폴리(C1-4 알킬렌)이민인 것인, 초음파 영상용 조영제.
- 제12항에 있어서, 상기 폴리아민계 고분자는 가지형 폴리에틸렌이민인 것인, 초음파 영상용 조영제.
- 제12항에 있어서, 상기 옥사미드 결합은 총 아민기의 수의 대해 10 내지 50몰%의 비율로 형성된 것인, 초음파 영상용 조영제.
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