KR101454236B1 - Ｇｄ-ＰＥＩ 나노겔 및 이를 포함하는 조영제 또는 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Gd-PEI 나노겔 및 이를 포함하는 조영제 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 무정형이고 유연한 성질을 가지므로 RES 시스템을 효과적으로 통과할 수 있고, 최소한의 세포 독성을 나타내며, 우수한 인 비보 종양 표적화가 가능하므로, 조영제 및 약물 전달체로서의 높은 생의학적 잠재력을 갖는다.

Description

Ｇｄ-ＰＥＩ 나노겔 및 이를 포함하는 조영제 또는 약제학적 조성물{Gd-PEI Nanogel and Contrast Agent or Pharmaceutical Composition Comprising the Same}

본 발명은 Gd-PEI 나노겔 및 이를 포함하는 조영제 또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.　　

유기 및 무기 성분의 하이브리드화는 계면에서 상보적으로 상승효과적인 통합을 가능하게 하기 때문에, 많은 연구의 대상이 되어왔다.¹ 대표적인 하이브리드 물질로는 금속 이온과 유기 리간드 사이의 조화에 의하여 형성되는 금속-유기 킬레이트가 있다. 금속-유기 프레임워크(MOFs)는, 높은 다공도 및 구조의 다양성으로 인하여, 넓은 범위의 잠재적인 적용을 구비한 가장 흥미로운 발견 중의 하나이다.^2,3 생의학 영상화 및 약제학적 적용에 있어서, 나노스케일 금속-유기 프레임워크(나노MOFs)는 전도 유망한 나노플랫폼으로서 최근 많은 주목을 받고 있다.^4-8 나노MOFs의 일차적인 생의학적 적용은 약물 전달체로서 높은 잠재력을 보여주었지만, 그들의 인 비보에서의 사용, 특히 종양 표적화와 관련한 사용은 아직 연구된 바가 없다.

혈액을 순환하고 있는 나노물질들은, 증가된 투과성 및 보유성(EPR) 효과에 의하여, 수동적으로 종양을 표적화할 수 있는 잠재력을 가지는데, 이는 혈관 구조 및 림프 배수의 결함을 갖는 종양 조직 중에 축적되고 보유되는 성향에 의존한다.^9-11 그러나, 전신으로 투여된 견고한/결정형의 하이브리드 코어들(예컨대, 나노MOFs 및/또는 다른 하이브리드 나노물질들)은, 항오염 표면 보호막에도 불구하고, 망내피 시스템(RES)에 의하여 배재되는데, 이로 인하여 그들의 혈중 순환시간이 짧아지며, 그에 따라 종양 축적이 제한되게 된다.^8,12,13 RES 필터링을 최소화할 수 있는 것으로 일반적으로 알려진 방법은 견고한 코어의 크기를 10 nm 이하로 낮추는 것이다.^14-16 그러나 몇몇 케이스에서, 사이즈 감소는 코어의 크기에 의존적인 활성화 기능(예컨대, 드럭 로딩 용량, EPR 효과 또는 횡축 자기화 이완도 등)에 대한 부작용을 나타냄으로써, 나노물질의 용도를 제한할 수 있다.^{4-6,9-11,17,18} 구조적인 변형능력을 구비하는 연성의 물질은 리포좀 및 폴리머 나노입자들에서 관찰되는 바와 같이, 사이즈 감소를 필수적으로 동반하지 아니하고도, RES 천공들을 통과하여 지나갈 수 있는 것으로 알려져 있다.¹⁹ 몇몇 MOFs는 결정형임에도 불구하고, 외부적 자극에 대해 반응하여, 일정 정도는 유연할 수 있다고 보고되고 있다.^7,20-25 그러나 그러한 유연성에도 불구하고, 결정형의 나노MOFs는 인 비보 투여된 경우 RES 기관에 의하여 신속하게 배제되는 것으로 관찰된다.^17,18

한편, 가돌리늄은 원소번호 64의 희토류원소에 속하며 자연상태에서 7종의 동위원소가 존재한다. 가돌리늄은 자성이 강하고 중성자를 흡수하는 힘이 다른 원소보다 월등히 크다는 장점을 지니고 있어 MRI 조영제로 사용되고 있다. 또한 중성자 흡수능을 이용하여 중성자 항암치료제로의 사용도 시도되고 있다. 하지만 대부분 조영제와 마찬가지로 가돌리늄 조영제도 투여 후 구토, 설사, 어지러움증 등의 단점을 지니고 있으며 체내에서 독성을 일으키기도 하기 때문에 환자들이 거부감을 가진다. 이러한 가돌리늄의 부작용을 제거하고 혈관체류 시간이 짧은 가돌리늄의 혈관체류 시간을 증진시키기 위한 연구가 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 특허번호 제10-1080499호

본 발명자들은 가돌리늄을 타이트 킬레이션하고, RES 시스템을 효과적으로 통과하여 독성 또는 부작용 없이 전신 종양 표적화가 가능한 생체적합성 가돌리늄 조영제 내지 약물 전달체를 개발하기 위하여 연구 노력하였고, 그 결과 가돌리늄이 폴리에틸렌이민 망상 구조속에 함침된 코어 구조를 포함하는, 무정형이면서 유연한 가돌리늄-PEI 나노겔을 제조해냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 가돌리늄-PEI 하이브리드 나노겔을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Gd-PEI 나노겔을 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Gd-PEI 나노겔을 포함하는 암 또는 종양 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 가돌리늄-PEI 하이브리드된 나노겔의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 하나의 관점은 PEI(폴리에틸렌이민)의 망상 구조 내부에 가돌리늄(Gd)이 함침되어 있는 구형의 코어를 포함하는 Gd-PEI 나노겔을 제공하는 것이다.

기존에 알려진 산화철 나노입자(SPION)와 같이 견고한 구조를 갖는 결정형의 나노하이브리드가 RES 시스템에 의하여 신속하게 배재되는 점을 보완하기 위하여, 본 발명자들은 무정형이며 유연한 하이브리드 코어를 가지는 "연성" 대체물의 신규한 개념을 고안해내었다.

본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 유연하고 무정형인 것을 특징으로 한다. 이러한 무정형의 유연한 네트워트 망상 구조는, 탄성적 변형력의 장점을 가짐으로 인해, 그 크기를 줄이지 않고도 RES를 통과하여 지날 수 있는바, 증가된 혈중 순환 시간과 인 비보 종양 표적화가 가능하다는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 PEI의 망상 구조가 가돌리늄을 타이트 킬레이션하여, 유리 가돌리늄 이온의 독성 효과를 최소화시키는 또 다른 장점을 제공한다.

일 구현예에 있어서, 본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 DTPA(diethylene triamine pentaacetic acid) 및 산화철을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 어디까지나 유연한 PEI 망상 네트워크 구조를 기본으로 하여, 그 내부에 가돌리늄 이온이 타이트 킬레이션된 것으로서, 기존에 가돌리늄 조영제에 사용되어 온 다른 고분자들(예컨대 DTPA)을 기본 구조로 하고, 여기에 PEI를 컨주게이션 내지 추가 도입한 구조와는 전혀 별개의 구조를 갖는 것이다. 물론, 본 발명의 Gd-PEI 나노겔도 그 기본 구조를 형성하는 고분자인 PEI에 다른 기능성 물질을 컨주게이션 내지 추가 도입할 수 있지만, 어디까지나 기본 구조가 유연한 무정형의 PEI 망상 구조라는 점에 그 특징이 있다.

일 구현예에서, 상기 Gd-PEI 나노겔의 전체 직경은 100 내지 500 nm이며, 바람직하게는 100 내지 200 nm이다.

다른 구현예에서, 상기 Gd-PEI 나노겔의 코어의 직경은 10 내지 100 nm이며, 바람직하게는 40 내지 80 nm이다.

또 다른 일 구현예에서, 본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 PEI에 존재하는 기능기를 이용하여 추가의 화학 또는 생체 기능성 물질을 도입할 수 있는데, 예컨대 PEI의 여분의 아민기에 폴리에틸렌 글리콜(PEGs) 또는 형광 표지자 내지 형광체를 결합시킬 수 있다.

적합한 형광체로는 예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), Cy3, Cy5(Pharmacia), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 Gd-PEI 나노겔에 사용되는 PEI는 분지형의 PEI인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 관점은 상술한 Gd-PEI 나노겔 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조영제 조성물은 비경구 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 하는 경우, 정맥내 주입, 근육내 주입, 관절내(intra-articular) 주입, 활액내(intra-synovial) 주입, 수망강내 주입, 간내(intrahepatic) 주입, 병변내(intralesional) 주입 또는 두개강내(intracranial) 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조영제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 조영제 조성물은 MRI(Magnetic resonance imaging) 용인 것을 특징으로 한다.

다른 구현예에서 본 발명의 조영제 조성물은 형광 영상화용인 것을 특징으로 한다.

바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 조영제 조성물은 MRI영상화와 형광 영상화를 동시에 수행할 수 있는 이중-방식(dual-modality) 조영제 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조영제를 이용하여 형광 이미지 및 MRI 이미지를 얻는 방법은 종래의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 이들 방법은 미국 특허 제6,151,377호, 제6,072,177호 제5,900,636호, 제5,608,221호, 제5,532,489호, 제5,272,343호 및 제5,103,098호, 미국 특허 제6,151,377호, 제6,144,202호, 제6,128,522호, 제6,127,825호, 제6,121,775호, 제6,119,032호, 제6,115,446호, 제6,111,410호 및 제602,891호에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 조영제 조성물은 형광 이미지화 및 MRI 이미지화의 조영제로 동시에 이용될 수 있기 때문에, 이미지를 얻고자 하는 조직에 도달한 조영제로부터 MRI 및 형광 이미지를 같이 얻을 수 있다. 이러한 특징은, MRI 및 형광 이미징의 장점을 모두 취할 수 있도록 하며 결국, 형광 이미징 우수한 민감도 및 높은 일시적 해상도와 MRI의 높은 공간 해상도가 반영된 이미지를 동시에 얻을 수 있다.

본 발명의 이중-방식 조영제는 인체의 내부 부위(internal region)에 대한 이미징에 매우 유용하다. 이미징 과정은 사람에게 조영제의 진단학적 유효량을 투여한 다음 인체의 내부 부위(조직)의 가시적 이미지를 얻기 위하여 형광 이미징 및 MRI 이미징을 이용하여 인체를 스캐닝함으로써 이루어진다.

특히, 본 발명의 이중-방식 조영제는 암 이미징에 유용하다.

본 발명의 또 다른 관점은 상술한 Gd-PEI 나노겔을 포함하는 암 또는 종양 세포로의 약물 전달체를 제공하는 것이다.

본 발명의 약물 전달체는 조영 이외의 다른 기능(예컨대, 암 치료)을 더 부여하기 위하여, 생체 활성을 나타내는 화학물질 또는 생물질(biomolecules)과 같은 약물을 포함할 수 있으며, 이 경우 상기 약물은 PEI(폴리에틸렌이민)의 망상 구조 내부에 추가로 함침될 수 있다.

상기 생체활성 화학물질은 다양한 기능성 단분자, 고분자 및 무기 지지체 등을 포함한다.　　

상기 단분자의 예는 항암제, 항생제, 비타민, 폴산을 포함하는 약물, 지방산, 스테로이드, 호르몬, 퓨린, 피리미딘, 단당류 및 이당류 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 생물질(biomolecules)의 예는, 단백질, 펩타이드, DNA, RNA, 항원, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 호르몬, 인터루킨, 인터페론, 성장인자, 종양괴사인자, 엔도톡신, 림포톡신, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 가수분해 효소, 산화-환원효소, 분해 효소, 이성질화 효소와 합성효소 등의 생체활성 효소, 효소 공인자 및 효소 억제제 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 관점은 가돌리늄(Gd)염 및 PEI(폴리에틸렌이민)을 수용액상에서 혼합하여 Gd-PEI 나노겔을 형성시키는 단계 및 상기 형성된 Gd-PEI 나노겔을 분리하는 단계를 포함하는, Gd-PEI 나노겔의 제조방법을 제공하는 것이다.

PEI는 에틸렌 디아민 단위(강건한 금속-킬레이트 리간드)를 매우 높은 밀도로 가지는 유연한 수용성 고분자이기 때문에, 가돌리늄 이온과 수용액 중에서 혼합하는 경우 유연한 고분자 사슬의 불규칙한 가교로 인하여, 고분자 사이(interpolymeric)에 가돌리늄 이온을 함침하여, 빠르고 불규칙적인 겔화를 야기한다.

일 구현예에서, Gd-PEI 나노겔의 분리는 에멀젼 브레이킹, 원심분리, 세척, 수중에 재현탁시키는 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 Gd-PEI 나노겔은 무정형이고 유연한 성질을 나타내고, 최소한의 세포 독성을 나타내며, 우수한 인 비보 종양 표적화가 가능하므로, 조영제 및 약물 전달체로서의 높은 생의학적 잠재력을 갖는다.

도 1. (a) GdNGs 내 네트워크 구조의 도식. (b) 수중에서 형성된 Gd-배위된PEI 겔. (c) 역 마이크로 에멀젼 기법에 의한 콜로이드성 GdNGs 제조의 도식. GdNGs 의 (d) 극저온 TEM 이미지 및 (e) EDX 스펙트럼. Gd 의 L 및 M 껍질 이온화는 적색 화살표로 표시하였다. 청색 화살표는 구리 그리드로부터의 방출을 지시한다.
도 2. (a) 수중에 잠긴 유리 기질 상에 고정시킨 GdNGs의 AFM 지형 형태 이미지. 화살표 (i) 및 (ii)는 각각 나노겔 및 에폭시실란 코팅된 유리를 나타낸다. (b) (a)에서 화살표 (i) 및 (ii)에 의해 지시되는 위치에서 수중에서 얻은 인덴테이션 커브. 실선은 지시된 바에 따라 영률값을 계산한 이론적 피트를 나타낸다. (c) 지시된 바에 따라 다양한 기공 크기를 갖는 필터를 통한 SPION 및 GdNGs의 여과를 보여주는 컬러 및 NIR 형광(NIRF) 이미지. (d) (c)에 있어서 필터의 상대적인 흡광도(Abs) 및 형광(FL). (e) 시료 처리 6시간 후 행해진 MTT 분석에 의하여 평가된, SCC7 세포에 대한 GdNGs, Gd-DTPA 및 GdCl3(0.1 mM Gd^{3 +})의 세포 독성. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 세포이다. 에러 바는 독립적인 실험(n=10)에 대한 표준 편차를 나타낸다. (f) 37℃에서 PBS(pH 7.4, 10% FBS 포함) 중에서 배양된 GdNGs로부터 방출된 유리 Gd^{3 +}. 에러 바는 독립적인 실험(n=3)에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 3. (a) GdNGs(200 L, 3.8 mM Gd^{3 +})를 꼬리 정맥 주입하기 전과 후의 SCC7 종양 모델 마우스의 인 비보 NIRF 이미지. 주입 후 이미지화 시점을 나타낸다. 백색 점은 종양 위치를 나타낸다. (b) 주입 전(대조군) 및 후에 절제된 기관 및 종양으로부터의 NIRF 신호로부터 확인한 GdNGs의 생체 분포. 에러 바는 독립된 실험(n=3)의 표준 편차를 나타낸다.
도 4. (a) Gd^{3 +} 농도(1: 0 mM, 2: 0.0625 mM, 3: 0.125 mM, 4: 0.25 mM, 5: 0.5 mM, 6: 1 mM, 7: 1.5 mM, 8: 3 mM) 작용에 따른, R ₂ 맵 이미지 (b) GdNGs의 R ₁ 및 R ₂ 커브. 경사는 지시된 r ₁ 및 r ₂을 제공한다. (c) GdNGs (200 L, 3.8 mM Gd^{3 +})의 꼬리 정맥 주입 전 및 2시간 후의 SCC7 종양 포함 마우스의 T ₂-중량 MR 이미지. 종양 조직은 점선으로 표시되었다.
도 5. 수중에 분산된 GdNGs의 흡광 및 발광 스펙트럼.
도 6. 수중에 분산된 GdNGs의 수평균 유체역학적 크기(DLS로 측정).
도 7. (a) GdNGs 파우더의 작은 각 파우더 x-레이 회절(왼쪽), 회절도(삽입) 및 모델링(NanoFit, Bruker, Germany) 결과(오른쪽). (b) GdNGs 파우더의 넓은 각 파우더 x-레이 회절(왼쪽) 및 회절도.
도 8. (a) 수중에 분산된 SPION의 수평균 유체역학적 크기(DLS로 측정함). (b) SPION과 GdNG 및 SPION 혼합물의 TEM 이미지.
도 9. GdNGs로 처리된 SCC7 세포의 근적외선 형광(NIRF) 이미지.
도 10. SCC7 종양 포함 마우스로부터 절제된 기관의 엑스 비보 NIRF 이미지. 마우스는 GdNGs의 정맥 투여 전(대조군) 및 1일/1주 후에 희생되었다(대조군은 n=1, 1일/1주 시료는 n=3).
도 11. (a) Gd-DTPA 및 (b) 다른 Gd^{3 +} 농도(0 mM ~ 3 mM)의 GdNGs를 포함하는 팬텀의 R ₁ 맵. (c) GdNGs(3.8 mM Gd^{3 +}의 200 L)를 꼬리 정맥 주입하기 전 및 주입 2시간 후의 SCC7 종양 포함 마우스의T ₁-중량 MR 이미지.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

<실험방법>

실험도구

투과전자현미경(TEM, CM200 electronmicroscope, Philips, Netherlands) 및 극저온 투과전자현미경(Cryo TEM, Tecnai G2 F20 Cryo, FEI, Netherlands)을 사용하여 나노겔의 형태를 관찰하였다. 캔틸레버(NT-MDT)를 구비한 액상 원자현미경(NTEGRA, NT-MDT, Russia)을 사용하여, 유리 기질 상에 고정한 나노겔의 표면 지형 및 힘 곡선을 얻었다. 흡광도 및 형광 스펙트럼은 각각 UV-가시광선 분광기(8453, Agilent, USA) 및 형광분광기(F-7000, Hitachi, Japan)를 사용하여 취득하였다. Gd^{3 +}의 농도는 유도 결합 플라스마-질량 분석기(ICP-MS, Elan 6100DRC Plus, Perkin Elmer, USA)를 사용하여 측정하였다. 유체역학적 크기 및 제타 포텐셜은 제타사이저 나노 ZS(Malvern, UK)를 사용하여 측정하였다. 파워 X-레이 회절 패턴은 GADDS(general area detector diffraction system, Bruker AXS, Germany) 상에 취득하였다. SCC7 세포의 NIR 형광은 누안스(Nuance) FX 멀티스펙트럼 이미지 시스템(Cambridge Research & Instrumentation, Inc.,USA)을 사용하여 이미지화하였다. 96-웰 플레이트의 NIR 형광 이미지 및 SCC7 종양 포함 마우스의 절개 기관 형태는 150-W 석영 할로겐 일루미네이터(Fiber-Lite, PL900, Dolan-Jenner, USA)를 구비한 12-비트 CCD 카메라(Image Station 4000MM, Kodak, USA) 및 Cy5.5 용 여기/발광 필터 세트(Omega optical, USA)를 사용하여 취득하였다. SCC7 종양 포함 마우스의 인 비보 NIR 형광 이미지는 37^oC로 가열한 동물 플레이트 상에서 마우스에 위치한 익스플로어 옵틱스 시스템(ART, Canada)을 사용하여 얻었다. 또한, 7T MRI 시스템(70/20 BioSpec, Bruker BioSpin GmbH, Germany)에서 자기 공명 이미지를 얻었다.

GdNGs 의 제조

트윈 80의 역 미셀 중에서, 분지형 PEI(bPEI, Mw 1.8k, Polysciences Inc., USA) 및 Gd^{3 +}사이의 인 시투 콜로이드 함침에 의하여 GdNGs를 제조하였다. 구체적으로 GdNGs의 균일한 분산을 위하여, 격렬한 교반 조건하에서 사이클로헥산 중에 있는 20 w% 트윈 1 mL에, 20 wt% aq. GdCl₃·H₂O₂ (Sigma-Aldrich) 20 L, 20 wt% aq. bPEI, 30 L, aq. Cy5.5-비닐설폰(10 mg mL^-1, BioActs Co. Ltd., Korea) 10 L 및 aq. PEG-NHS(Mw 5k, 10mg mL^-1, Sunbio Inc., Korea) 15 L를 연속적으로 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 부드럽게 흔들어 준 다음, 유화 혼합물을 과에탄올에 부었다. 원심분리(10000 rpm, 1 h), 상등액의 조심스로운 제거 및 프로브 소니케이션 하에서 에탄올에 재현탁하는 과정을 3회 반복하여, 침전된 GdNGs를 정제하였다. 마지막 원심분리 후 정제된 GdNGs 침전물을 프로브 소니케이션을 사용하여 Milli-Q 워터(1 mL)에 재현탁시키고, 추가 실험에 사용하였다.

나노 인덴테이션 실험

에폭시 실란-코팅된 유리 플레이트를 5 mm × 5 mm로 절단하고, 96-웰 플레이트의 웰 속에 두었다. GdNGs 현탁액 100 L를 웰에 첨가하고, 주변 온도에서 24시간 동안 보관하여, GdNGs를 유리의 표면 상에 고정시켰다. AFM 측정 전에, 시료-고정화된 유리를 Milli-Q 워터로 3회 세척하고, 물을 채운 액상 AFM 셀 속에 담갔다. 세미-콘택 모드에서 NSG20 캔틸레버(NT-MDT, force constant = 48 N/m)를 가지고 상온에서 NT-MDT AFM 이미지화를 수행하여, 표면 지형(topography) 정보를 취득하였다. 표면 지형으로부터 단일의 GdNG를 다룬 후에, 캔틸레버에 대하여 액상 셀을 올리고, GdNG 세포에서, 그리고 비교를 위하여 에폭시 실란-코팅된 유리 표면 근처에서 캔틸레버의 편향 거리를 기록하는 것에 의하여 힘 곡선을 측정하였다. 얻은 힘 곡선에 다음의 등식을 적용하는 것에 의하여 헤르츠 모델에 따라 영률(Young's modulus)을 계산하였다:

d = [(2/π)[E/(1-v)²](d-z)²tan(α)]/k

여기서 d는 편향 거리, E는 영률, v는 시료의 푸아송 비(Poisson ratio)(고무에 대하여 0.5를 추정하였음), z는 피에조 움직임(도 2(b)에서 시료의 높이), α는 인덴팅 콘(indenting cone) 열림 각도의 절반(NSG20 캔틸레버에 대하여 11^o), 그리고 k는 힘 상수(NSG20 캔틸레버에 대하여 48 N/m)를 나타낸다.

GdNGs 의 세포 독성

SCC7 세포를 96-웰 플레이트에서 배양하고, GdNGs, Gd-DTPA 및 GdCl₃·H₂O₂(모든 시료에 대하여 0.1 mM Gd^{3 +})와 함께 6시간 동안 배양하였다. 신선한 배지로 세척한 다음, 세포 생존도를 MTT 분석으로 평가하였다.

인 비트로 세포 내 도입 및 형광 이미지화

뮤린 SCC7(squamous carcinoma cell) 세포를 10% 우태아 세럼(FBS)을 포함하는 RPMI1640 배지 중에서 배양하였다. 시험한 세포를 35 mm 유리 커버슬립 접시 상에 통과시키고 2일 동안 방치하였다(접시 당 1×10⁶ 세포). 그 다음, 세포를 DPBS로 세척하고 10% FBS 배지 중의 GdNGs 현탁물(200 L, 1 mM Gd³⁺)과 함께 3시간 동안 배양하였다. 그 다음 DPBS로 세포를 2회 세척하고, 620-660 nm 여기 및 100 ms 노출 시간으로 설정된 누안스 FX 멀티스펙트럼 이미지 시스템(Cambridge Research & Instrumentation, Inc., USA)을 구비한 LEICA DMI3000B를 사용하여 직접 이미지화하였다.

동물 영상화 실험

모든 동물 실험은 한국 과학기술원의 동물 보호 및 사용 윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 마우스에 대한 조작은 위원회 규정에 따라 행하여졌다. 5주령의 BALB/c 누드 마우스(Orient. Korea)에 RPMI1640 세포 배양 배지 중의 1×10⁷ SCC7 세포 현탁액을 피하 주입하는 방법으로 종양 이종이식 모델을 만들었다. 접종 후 2~3주 후에, 마우스 꼬리 정맥을 통하여 GdNGs(200 mL, 3.8 mM Gd^{3 +})를 주입하였다. 형광 영상화를 위하여 옵틱스 익스플로어 시스템(Advanced Research Technologies Inc., Canada)을 사용하여, 37^oC에서의 MR 영상화를 위하여 7 T MRI 시스템 70/20 BioSpec(Bruker BioSpin GmbH, Germany)을 사용하여 인 비보 영상화 실험을 수행하였다. GdNGs의 조직 분포를 평가하기 위하여, 미리 정해진 시점에 마우스로부터 주요 기관 및 종양을 절제하였다. 12-비 CCD 카메라(Image Station 4000MM, Kodak, USA)를 사용하여 절제된 기관 및 종양의 형광 영상을 얻었다. 분석 워크스테이션 소프트웨어(Advanced Research Technologies Inc., Canada)의 ROI(region of interest) 기능에 의하여, 조직 영상으로부터 형광 강도를 정량화하였다.

<실험결과>

GdNGs 구조 확인

결정형의 나노 MOFs는 인 비보 투여된 경우 RES 기관에 의하여 신속하게 배제되는 점을 고려하여, 본 발명자들은 고도의 변형성을 얻기 위하여, 비결정형/유연성의 금속-유기 하이브리드 플랫폼, 즉 금속-고분자 배위 네트워크 구조로 구성되는 임의로 가교된 나노겔을 디자인하기에 이르렀다. 유기 성분의 유연함을 차용하기 위하여, 다돌기성(multidentate)의 고분자 리간드로서 분지화된 폴리(에틸렌이민)(PEI, MW = 1.8 kD)을 채택하였는데, 이는 금속 이온과 수용액 중에서 킬레이션을 시키는 경우, 유연한 고분자 사슬의 불규칙한 가교로 인하여, 빠르고 불규칙적인 겔화를 야기할 것을 기대하였기 때문이다. 이렇게 생성된 무정형의 네트워트 구조는, 그것이 나노 관찰적 공간 내에 제한된다면, 탄성적 변형성의 장점을 가짐으로 인해 RES를 통과하여 지날 수 있는 고무와 유사한 "연성의" 나노겔을 형성하게 될 것이다.

본 발명자들은 우선, 용액 중의 벌크 착물에 의하여 Gd^{3 +} 및 PEI간 복합이 실제 일어났음을 확인하였다. 기대하였던 바와 같이, GdCl₃ 및 PEI 수용액의 혼합은 상온에서 부동상 겔의 즉각적인 형성을 야기하였는데(도 1b), 이는 Gd가 함침된 PEI의 가교결합이 매우 효율적이어서, 과량의 물을 그 내부에 붙잡아 둘 수 있을 정도로 충분히 강건한 망상 구조를 형성함을 나타낸다. 나노스케일의 GdNGs를 제조하기 위하여, 오일 중 물 마이크로에멀젼(Tween 80/cyclohexane /water) 시스템 중에서 겔화를 수행하였다(도 1c). 마이크로에멀젼 중에 형성된 나노겔은 표면 코팅과 이중-방식 이미지화를 위하여, 여분의 유리 PEI 아민기에 각각 폴리에틸렌 글리콜(PEGs) 및 NIR 염색 표지(Cy5.5)를 결합시키어 추가적으로 기능화하였다. 페길화에 의한 항오염 코팅은 PEI계 나노겔의 양이온 대전된 표면 상에 일어날 수 있는 혈장 단백질의 옵소닌화를 방지하기 위한 것이었다. 마지막으로, 에탄올 중에서의 에멀젼 브레이킹, 원심분리, 세척 및 수중에 재현탁시키는 과정으로 GdNGs를 분리하여, NIR 흡광 및 형광을 가지는 수성 현탁액을 생산하였다(도 5).

ICP-MS(inductively coupled plasma-mass spectrometry)에 의하여, Gd^{3 +} 농도가 3.84 mM로 측정되었는데, 이는 에멀젼 중의 Gd^{3 +} 이온이 37%의 수율로 PEI와 복합되었음을 나타내는 것이다. 극저온 투과전자현미경 및 DLS(dynamic light scattering) 연구는, 이렇게 얻어진 나노겔이 평균 크기가 65 ± 4 nm(도 1d)인 Gd가 함침된 구형의 하이브리드 코어를 가지고 있으며, 그 전체의 유체역학적 크기는 159 ± 62 nm(도 6)임을 나타낸다.

TEM 관찰 하에서 얻은 GdNGs의 EDX(Energy dispersive X-ray) 스펙트럼은 Gd의 L 및 M 껍질 방출 피크 특성을 나타내었고, 여기서 그 어떠한 Cl도 탐지되지 않았는데, 이는 GdCl₃의 완전한 제거를 나타내는 것이다(도 1e). PXRD(powder X-ray diffraction) 패턴에 있어서, 작은 각 영역(2θ=2.6°) 중에서 오직 하나의 넓은 회절 피크만이 관찰되었는데, 이는 구형의 나노 물체에 들어맞는 56 nm의 직경에 해당하는 것이며, TEM 결과와도 잘 일치하는 것이었다(도 7a). 특히 넓은 각 범위에 걸쳐 결정형 구조가 관찰되지 않았다는 것에 주목해야 하는데, 이는 Gd-함침된 코어가 예상한 바와 같이 랜덤하게 가교된 무정형의 겔임을 확인해주는 것이다(도 7b).

GdNGs 의 형태 변형력

GdNGs의 탄성적 변형력은 NSG-20 캔틸레버(spring constant: 48 N/m)를 사용하여 원자력 현미경에 의해 수중에서 평가하였다. AFM 인덴테이션 측정을 위하여, 표면 아민 결합을 통하여 에폭시-코팅된 유리 표면 상에 GdNGs를 미리 고정시키고, 물속에 넣었다. 도 2a-b는 반-접촉 모드에서 스캔한 표면 지형과 헤르쯔 모델²⁶에 따라 분석한 나노 인덴테이션 결과를 보여준다. 초기 힘 인덴테이션 범위 중의 커브 피트로부터, GdNGs의 명백한 영률은 3.0 MPa으로 측정되었는데, 이는 GdNGs가 없는 에폭시실란-코팅된 기질의 그것(9.2 MPa)보다 훨씬 작은 값이다. 이 값은 부풀려진 젤라틴의 박막²⁶과 유시한 모듈 범위에 있는데, 이는 GdNGs가 기계적으로 연성이고 유연함을 확인시켜 준다. 참으로, 평균 크기가 158 nm인 GdNGs는 0.2 m 만큼이나 작은 멤브레인의 기공 크기에도 관계없이 멤브레인 필터를 쉽게 통과하여 지나갔다(도 2c-d). 급격한 대조에서, 단단한/비변형성의 산화철 나노입자(SPION)는, 그들이 훨씬 작은 코어 및 전체 크기(각각 9 및 54 nm; 도 8)를 가지고 있음에도 불구하고, 기공 크기의 감소에 따라 막을 가로지르는 통과가 현저하게 감소하였다. 이렇게 유연성에 의존하는 뚜렷한 동태는 유연한 GdNGs가 RES²⁷와 같은 여과 시스템을 통과하여 지날 수 있도록 하는 형태 변형력을 가짐을 강하게 뒷받침한다.

GdNGs 의 세포 독성 여부

RES 봉쇄 이외에도, 금속 이온으로부터 야기되는 잠재적인 독성은 생의학적 용도에 적용하기 위한 나노하이브리드에 있어 고려해야 할 또 다른 이슈이다. Gd^{3 +} 이온은 세포 내 중요한 Ca^{2 +} 신호를 교란시키므로 높은 독성을 가지며, 따라서 유리 Gd³⁺ 방출을 피하기 위하여 DTPA(diethylenetriamine pentaacetate)와 같은 리간드에 의한 강한 킬레이션을 필요로 하는 것으로 알려져 있다.²⁸ 이와 관련하여, PEI는 '에틸렌 디아민'이 풍부한 다돌기성(polydentate) 성질을 가지기 때문에, 리간드로서 PEI를 사용하는 것은 타이트 킬레이션에 유익하다. 게다가, 양이온을 띤 분지된 PEI는 생적합성일뿐만 아니라, 세포 투과성까지 제공하는 것으로 알려져 있다.²⁹ 참으로, 양성적 제타 전위(38 mV)를 가진 PEI계 GdNGs는 NIR 형광 현미경 하에 시험하였을 때, Cy5.5 표지로부터의 강한 신호가 세포질 내에서 관찰되어, SCC7(squamous cell carcinoma) 세포 속으로의 매우 효과적으로 도입되었음을 나타내었다(도 9). PEI 킬레이션의 유익함을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 GdNGs, Gd-DTPA 및 GdCl₃(모두 0.1 mM Gd^{3 +} 포함)으로 6시간 동안 처리된 SCC7 세포를 가지고 MTT 분석을 수행하여, 세포 생존에 관한 비교 실험을 수행하였다(도 2e). 유리된 Gd^{3 +}(GdCl₃)의 독성이 심각한 주어진 조건 하에서, 리간드 킬레이트된 Gd-DTPA(상업적으로 판매하는 MRI 조영제)의 경우 세포 생존에 대한 영향이 감소되긴 했지만 여전히 주목할 만한 영향을 나타내었다. 하지만, PEI 킬레이션을 구비한 GdNGs는 눈에 띠는 독성 없이 세포 생존에 있어 훨씬 향상된 결과를 나타내었는데, 이는 독성의 Gd^{3 +} 이온이 PEI 의 망상 구조에 강하게 붙잡히었음을 제시한다. 이를 입증하기 위하여, 본 발명자들은 10% 우태아 혈청(FBS)을 포함하는 37^oC PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4) 중에서 배양된 GdNGs로부터 유리된 임시의 Gd^{3 +}를 관찰하였다. 각 시점에 시료를 원심분리하여 나노겔을 가라앉히고, ICP-MS로 분석하여 전체 Gd^{3 +} 함량에 대한 상등액 유리 이온 분율을 계산하였다. 도 2f는 상등액 중에서 얻어진 Gd^{3 +} 프로파일을 나타내는데, 여기서 초기 Gd^{3 +}의 존재(ca. 1.2%)는 불완전한 원심분리 또는 약하게 결합된 이온의 초기의 빠른 방출에서 기인한 것이다. 여기서, 실험 기간(2 주) 동안에 그 어떠한 추가의 상등액 분율의 증가도 관찰되지 않았다는 점에 주목해야 하는데, 이는 PEI에 의한 다돌기성 킬레이션이 생리학적 조건하에서 독성 Gd^{3 +} 이온의 유리를 최소화 할 수 있을 만큼 강건하다는 사실을 확인시켜 주는 것이다.

GdNGs 의 인 비보 혈액 순환, 종양 표적화 및 신장을 통한 배출

상기 기술된 탄성 변형력 및 최소한도의 세포 독성의 장점을 가지고, 본 발명자들은 인 비보 종양 표적화 및 이중-방식 이미지화를 위한 RES-통과 나노플랫폼으로서의 GdNGs의 가능한 유용성을 시험하였다. 이를 위하여, 꼬리 정맥 주입을 통하여 GdNGs를 SCC7 종양 포함 마우스 속으로 전신 투여하고, NIR 형광 이미지화에 의하여, 그들의 약동학적 동태를 관찰하였다. 우리의 관심에 대하여, GdNGs는 그것의 큰 코어 및 유체역학적 크기(각각 65 및 158 nm)에도 불구하고 도 3a에서 보여지는 바와 같이, 우수한 혈액 순환 및 종양 축적을 나타내었다. 주입 직후에, 전체 몸 신호 중에서 주목할 만한 이미지 대비가 종양에서 강하게 증가하는 것으로 나타났다. 종양 신호는 주입 후 12시간까지 더 증가하였는데, 이는 EPR 효과에 의한 종양 표적화를 나타내는 것이다. 도 3b는 다양한 시점에서 절제된 종양 및 기관의 엑스 비보 이미지(도 10)로부터 얻어진 평균 형광 강도의 분포를 나타낸다. 초기 신호가, 견고한 나노물질을 신속하게 붙잡는 것으로 기대되는 간 및 비장과 같은 RES 기관에서 보다 종양 중에서 훨씬 높았다는 점에 주목하여야 한다. 게다가, 다른 기관들의 경우 점진적으로 어두워진 반면에, 신장 신호는 전 시간 동안 높게 유지되었는데, 이는 GdNGs의 신장 배출을 의미한다. 이러한 결과는 GdNGs가 혈중에서 변형가능하고, 그 결과 큰 크기에도 불구하고 RES 필터를 통과하는 능력이 있다는 것을 명백하게 입증하는 것이다. GdNGs 추가 실험(연장된 혈액 순환, EPR 효과에 의한 종양 표적화 및 신장을 통한 신체 정화) 수행은 금속-유기 나노 하이브리드의 구조적인 변형력을 목적으로 하는 본 발명의 디자인 전략을 입증한다.

GdNGs 의 조영제로서의 용도

GdNGs의 Gd^{3 +}가 풍부한 구조로부터 본 발명자들은 자기 공명 이미지(MRI)를 위한 조영제로서의 용도를 구상하여 이를 시험하게 되었다. MRI는 의학적 이미지 진단을 위한 뛰어난 비침습적인 도구로서, 정상 조직과 질환이 있는 조직간의 물 수소원자의 밀도 및 이완도(relaxivity)의 차이를 측정한다. 물 프로톤의 세로축 이완을 가속화하여 T ₁-중량 MRI 대비를 촉진하기 위하여 상자성 Gd^{3 +} 복합체가 일반적으로 사용된다. 나노-가돌리듐의 경우, 세로축(T ₁) 및 가로축(T ₂) 이완 시간은 Gd³⁺ 이온의 수 또는 크기에 의존하는 것으로 알려져 있다.^30,31 나노크기의 멀티-Gd^{3 +} 복합체로서, 37^oC 7 T MR 필드에서 세로축(r ₁) 및 가로축(r ₂) 이완능력을 측정하는 것에 의하여 GdNGs의 자성을 측정하였다. R ₁ (=1/T ₁) 및 R ₂ (=1/T ₂) 맵 이미지는 Gd^{3 +} 농도가 증가됨에 따라 물 프로톤 이완이 명백하게 증가함을 보여주었다(도 4a 및 도 11). R ₁ 및 R ₂ 플롯의 양 의존성으로부터 GdNGs의 r ₁ 및 r ₂ 은 각각 2.1 및 82.6 mM^-1s^-1로 평가되었다(도 4b). Gd-DTPA(모노-Gd^{3 +}의 킬레이트)의 r ₁ 및r ₂ 값은 동일한 실험 조건하에서 3.6 및 5.5 mM^-1s^{- 1}으로 측정되었다. Gd-DTPA와 비교하여 GdNGs의 감소된 r ₁은 작은 표면 대 부피 비율을 가지는 큰 나노겔 코어 크기에서 기인하는데, 세로축 이완에 영향을 주기 위한 전제 조건인 직접적인 Gd^{3 +}-물 접촉을 방해한다. 반면에, 가로축 이온은 ~40의 높은 r ₂/ r ₁ 비율로 현저하게 증가하였는데, 이는 큰 사이즈 코어 중의 Gd^{3 +} 이온의 높은 밀도에서 기인한 것이다. 얻어진 가로축 이완도(r ₂ = 82.6 mM^-1s^-1)는 초상자성 산화철 나노입자의 범위에 속하는데,³² 이는 T ₂ MRI 조영제로서 가능한 GdNGs의 용도를 제시한다.

7 T MR 필드에서 종양 이미지화에 의하여, GdNGs의 인 비보 MRI 성능을 평가하였다. NIR 형광 이미지화를 위하여 동일한 양의 GdNGs를 SCC7 종양 포함 마우스에게 정맥 투여하였는데, 이는 Gd-DTPA(100 몰 Gd/kg)의 표준 투여량보다 약간 낮은 수준인 77 몰 Gd/kg에 해당하였다.³³ 이러한 실험 조건 하 스핀-에코 T ₁-중량 이미지에서 그 어떠한 주목할 만한 콘트라스트 증진도 관찰되지 않았다(도 11). 그러나, 재초점 에코(RARE) 펄스 시퀀스(echo time: 40 ms, RARE factor: 4)를 가지고 신속한 획득을 사용하는 T ₂-중량 이미지에서, 주입 2시간 후 종양의 특정 영역 중에서, 높은 공간 해상도에서 종양 내부 조직을 시각화하면서 현저한 신호 어두워짐이 명백하게 관찰되었다(도 4c). 강한 NIR 형광을 가진 뚜렷한 종양 시각화(도 3a)와 함께, 음성적 콘트라스트 증진은 GdNGs가 전신 종양 표적화를 가능하게 하는 이중-방식(T ₂ MRI 및 optical) 조영제로서의 잠재력을 가짐을 제시한다.

GdNGs의 약물전달체로서의 용도

GdNGs를 SCC7 종양 함유 마우스에 전신 투여한 후NIR 형광 현미경하에 시험한 결과, Cy5.5 표지로부터의 강한 신호가 세포질 내에서 관찰되어, SCC7(squamous cell carcinoma) 세포 속으로의 매우 효과적으로 도입되었음을 확인하였다(도 9). 또한, MTT 분석을 통한 세포 생존도 비교 실험을 수행한 결과 PEI 킬레이션을 구비한 GdNGs의 경우 유리 Gd^{3 +} 이온에 의한 독성 없이 우수한 세포 생존을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, GdNGs는 RES와 같은 여과 시스템을 통과하여 지날 수 있도록 하는 탄성적 변형력을 가질 뿐만 아니라(도 2 c-d), 과량의 물을 그 내부에 붙잡아 둘 수 있을 정도로 충분히 강건한 망상 구조를 형성하는데(도 1a), 이러한 결과들은 그 가교 결합된 나노겔 코어 내부에 약물 기타 생분자를 함침시킴에 의하여, 효율적으로 종양 조직에 약물 등을 전달할 수 있는 GdNGs의 약물 탑재 및 전달체로서의 용도를 뒷받침한다.

<참조문헌>

1. Taylor-Pashow, K. M. L.; Rocca, J. D.; Huxford, R. C.; Lin, W. Hybrid Nanomaterials for Biomedical Applications. Chem . Commun . 2010, 46, 5832-5849.

2. Stock, N.; Biswas, S. Synthesis of Metal-Organic Frameworks (MOFs): Routes to Various MOF Topologies, Morphologies, and Composites. Chem . Rev. 2012, 112, 933-969.

3. Zacher, D.; Schmid, R.; C. Woll, Fischer, R. A. Surface Chemistry of Metal-Organic Frameworks at the Liquid-Solid Interface. Angew . Chem . Int . Ed. 2011, 50, 176-199.

4. Rocca, J. D.; Liu, D.; Lin, W. Nanoscale Metal-Organic Frameworks for Biomedical Imaging and Drug Delivery. Acc . Chem . Res . 2011, 44, 957-968.

5. Keskin, S.; Kizilel, S. Biomedical Applications of Metal Organic Frameworks. Ind . Eng . Chem . Res . 2011, 50, 1799-1812.

6. McKinlay, A. C.; Morris, R. E.; Horcajada, P.; Ferey, G.; Gref, R.; Couvreur, P.; Serre, C. BioMOFs: Metal-Organic Frameworks for Biological and Medical Applications. Angew . Chem . Int . Ed . 2010, 49, 6260-6266.

7. Horcajada, P.; Serre, C.; Maurin, G.; Ramsahye, N. A.; Balas, F.; Vallet-Regi M.; Sebban, M.; Taulelle, F.; Ferey, G. Flexible Porous Metal-Organic Frameworks for a Controlled Drug Delivery. J. Am . Chem . Soc . 2008, 130, 6774-6780.

8. Horcajada, P.; Chalati, T.; Serre, C.; Gillet, B.; Sebrie, C.; Baati, T.; Eubank, J. F.; Heurtaux, D.; Clayette, P.; Kreuz, C. et al . Porous Metal-Organic-Framework Nanoscale Carriers as a Potential Platform for Drug Delivery and Imaging. Nat . Mater . 2010, 9, 172-178.

9. Matsumura, Y.; Maeda, H. A New Concept for Macromolecular Therapeutics in Cancer Chemotherapy: Mechanism of Tumoritropic Accumulation of Proteins and the Antitumor Agent Smancs. Cancer Res . 1986, 6, 6397-6392.

10. Brigger, I.; Dubernet, C.; Couvreur, P. Nanoparticles in Cancer Therapy and Diagnosis. Adv . Drug Deliver . Rev . 2002, 54, 631-651.

11. Ferrari, M. Cancer Nanotechnology: Opportunities and Challenges. Nat. Rev . Cancer 2005, 5, 161-171.

12. Berry, C. C.; Curtis, A. S. G. Functionalisation of Magnetic Nanoparticles for Applications in Biomedicine. J. Phys . D: Appl . Phys . 2003, 36, R198-R206.

13. Neuberger, T.; Schopf, B.; Hofmann, H.; Hofmann, M.; von Rechenberg, B. Superparamagnetic Nanoparticles for Biomedical Applications: Possibilities and Limitations of a New Drug Delivery System. J. Magn . Magn . Mater. 2005, 293, 483-496.

14. Åtkerman, M. E.; Chan, W. C. W.; Laakkonen, P.; Bhatia, S. N.; Ruslahti, E. Nanocrystal Targeting In Vivo. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2002, 99, 12617-12621.

15. Choi, H. S.; Liu, W.; Misra, P.; Tanaka, E.; Zimmer, J. P; Ipe, B. I.; Bawendi, M. G.; Frangioni, J. V. Renal Clearance of Quantum Dots. Nat . Biotechnol. 2007, 25, 1165-1170.

16. Xie, J.; Liu, G.; Eden, H. S.; Ai, H.; Chen, X. Surface-Engineered Magnetic Nanoparticle Platforms for Cancer Imaging and Therapy. Acc. Chem . Res . 2011, 44, 883-892.

17. Jun, Y.; Lee, J.-H.; Cheon, J. Chemical Design of Nanoparticle Probes for High-Performance Magnetic Resonance Imaging. Angew . Chem . Int . Ed . 2008, 47, 5122-5135.

18. Jun, Y. W.; Seo, J. W.; Cheon, J. Nanoscaling Laws of Magnetic Nanoparticles and Their Applicabilities in Biomedical Sciences. Acc . Chem . Res. 2008, 41, 179-189.

19. Wang, M.; Thanou, M. Targeting Nanoparticles to Cancer. Pharmacol. Res . 2010, 62, 90-99.

20. Serre, C.; Mellot-Draznieks, C.; Surble S.; Audebrand, N.; Filinchuk, Y.; Ferey, G. Role of Solvent-Host Interactions That Lead to Very Large Swelling of Hybrid Frameworks. Science 2007, 315, 1828-1831.

21. Jones, J. T. A.; Holden, D.; Mitra, T.; Hasell, T.; Adams, D. J.; Jelfs, K. E.; Trewin, A.; Willock, D. J.; Day, G. M.; Bacsa, J. et al . On-Off Porosity Switching in a Molecular Organic Solid. Angew . Chem . Int . Ed . 2011, 50, 749-753.

22. Coudert, F.-X.; Jeffroy, M.; Fuchs, A. H.; Boutin, A.; Mellot-Draznieks, C. Thermodynamics of Guest-Induced Structural Transitions in Hybrid Organic-Inorganic Frameworks. J. Am . Chem . Soc . 2008, 130, 14294-14302.

23. Ma, S.; Sun, D.; Wang, X.-S.; Zhou, H.-C. A Mesh-Adjustable Molecular Sieve for General Use in Gas Separation. Angew . Chem . Int . Ed . 2007, 46, 2458-2462.

24. Moggach, S. A.; Bennett, T. D.; Cheetham, A. K. A. The Effect of Pressure on ZIF-8: Increasing Pore Size with Pressure and the Formation of a High-Pressure Phase at 1.47 GPa. Angew . Chem . Int . Ed . 2009, 48, 7087-7089.

25. Yang, C.; Wang, X.; Omary, M. Crystallographic Observation of Dynamic Gas Adsorption Sites and Thermal Expansion in a Breathable Fluorous Metal-Organic Framework. Angew . Chem . Int . Ed . 2009, 48, 2500-2505.

26. Domke, J.; Radmacher, M. Measuring the Elastic Properties of Thin Polymer Films with the Automic Force Microscope. Langmuir 1998, 14, 3320-3325.

27. Kim, K.; Kim, J. H.; Park, H.; Kim, Y.-S.; Park, K.; Nam, H.; Lee, S.; Park, J. H.; Park, R.-W.; Kim, I.-S. et al . Tumor-Homing Multifunctional Nanoparticles for Cancer Theragnosis: Simultaneous Diagnosis, Drug Delivery, and Therapeutic Monitoring. J. Control . Release . 2010, 146, 219-227.

28. Caravan, P.; Ellison, J. J.; McMurry, T. J.; Lauffer, R. B. Gadolinium(III) Chelates as MRI Contrast Agents: Structure, Dynamics, and Applications. Chem . Rev . 1999, 99, 2293-2352.

29. Boussif, O.; Lezoualc'h, F.; Zanta, M. A.; Mergny, M. D.; Scherman, D.; Demeneix, B.; Behr, J.-P. A Versatile Vector for Gene and Oligonucleotide Transfer into Cells in Culture and In Vivo: polyethylenimine. Proc. Natl . Acad . Sci . USA 1995, 92, 7297-7301.

30. Taylor, K. M. L.; Jin, A.; Lin, W. Surfactant-Assisted Synthesis of Nanoscale Gadolinium Metal-Organic Frameworks for Potential Multimodal Imaging. Angew . Chem . Int . Ed . 2008, 47, 7722-7725.

31. Park, J. Y.; Baek, M. J.; Choi, E. S.; Woo, S.; Kim, J. H.; Kim, T. J.; Jung, J. C.; Chae, K. S.; Chang, Y.; Lee, G. H. Paramagnetic Ultrasmall Gadolinium Oxide Nanoparticles as Advanced T ₁ MRI Contrast Agent: Account for Large Longitudinal Relaxivity, Optimal Particle Diameter, and In Vivo T ₁ MR Images. ACS Nano 2009, 3, 3663-3669.

32. Weinstein, J. S.; Varallyay, C. G.; Dosa, E.; Gahramanov, S.; Hamilton, B.; Rooney, W. D.; Muldoon, L. L.; Neuwelt, E. A. Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles: Diagnostic Magnetic Resonance Imaging and Potential Therapeutic Applications in Neurooncology and Central Nervous System Inflammatory Pathologies, a Review. J. Cereb . Blood Flow Metab . 2010, 30, 15-35.

33. Weinmann, H.-J.; Brasch, R. C.; Press, W.-R.; Wesbey, G. E. Characteristics of Gadolinium-DTPA Complex: a Potential NMR Contrast Agent. Am. J. Roentgenol . 1984, 142, 619-624.

Claims (13)

1. PEI(폴리에틸렌이민)의 망상 구조 내부에 가돌리늄(Gd)이 함침되어 있는 구형의 코어를 포함하는 Gd-PEI 나노겔.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 Gd-PEI 나노겔은 DTPA(diethylene triamine pentaacetic acid) 및 산화철을 포함하지 않는 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 Gd-PEI 나노겔은 유연하고 무정형인 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 Gd-PEI 나노겔의 직경은 100 내지 500 nm인 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 코어의 직경은 10 내지 100 nm인 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 PEI의 아민기에 형광체가 결합되어 있는 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 PEI는 분지형의 PEI인 것인 Gd-PEI 나노겔.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 Gd-PEI 나노겔; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조영제 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 조영제 조성물은 MRI(Magnetic resonance imaging) 용인 것인 조영제 조성물.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 조영제 조성물은 형광 영상화(Fluorescence Imaging) 용인 것인 조영제 조성물.
    
11. 제8항에 있어서, MRI영상화와 형광 영상화가 동시에 가능한 이중-방식(dual-modality) 조영제임을 특징으로 하는 조영제 조성물.
    
12. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항의 Gd-PEI 나노겔을 포함하는 암 또는 종양 세포로의 약물전달체.
    
13. 가돌리늄(Gd)염 및 PEI(폴리에틸렌이민)을 수용액상에서 혼합하여 Gd-PEI 나노겔을 형성시키는 단계; 및
    상기 형성된 Gd-PEI 나노겔을 분리하는 단계
    를 포함하는, 제1항의 Gd-PEI 나노겔의 제조방법.

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