KR101817108B1 - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시가 독소(shiga toxin)의 STX 유전자를 1차 유전자 마커로 사용하여, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출하고, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 시가 독소를 이용한 혈청분석법으로는 구분할 수 없는 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli)과 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae)를 특이적으로 판별하여 설사 증세 등을 일으키는 원인균을 잘못 진단하는 문제점을 해결할 수 있다.
Description
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 시가 독소를 이용한 혈청분석법으로는 구분할 수 없는 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli)과 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae)를 특이적으로 판별하여 설사 증세 등을 일으키는 원인균을 잘못 진단하는 문제점을 해결할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 초기에도 소량의 원인균의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 시가 독소(shiga toxin)의 STX 유전자를 1차 유전자 마커로 사용하여, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출하고, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 의심 환자의 분변, 타액 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 육류, 어패류 등의 환경 시료로부터도 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리를 민감도 높게 검출하여 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 관한 것이다.
식중독이란 음식, 물 등을 매개로 하여 발병하고, 통상 설사, 구토, 복통, 혈변 등을 수반하는 위장관의 중독 증상을 말한다. 통상, 식중독을 일으키는 원인균은 식품과 함께 섭취되어 소장에서 증식한 후 중독증상을 일으키는데, 원인균이 증식하면서 독소를 생산하는 경우에는 독소에 의한 치명적인 중독증상을 일으킨다. 이러한 식중독 원인균으로 대표적인 것으로는 병원성 대장균, 살모넬라 등이 있다. 또한, 세균성 이질은 식중독과 유사한 증상을 나타내는데, 이러한 세균성 이질의 원인균으로는 시겔라 속(屬) 세균이 알려져 있다.
설사 증세를 일으키는 병원성 대장균은 다음과 같이 크게 4가지로 나눌 수 있다.
장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli; EHEC, VTEC 또는 STEC로 약칭됨)은 시가 독소(shiga toxin)를 생성하는 대장균을 말하며, 감염에 의해 출혈성 장염을 일으킨다. O157, O26, O111 등의 혈청형이 대표적이며, 치사율은 유아의 경우 약 10%, 노인의 경우 50% 전후에 이르는 것으로 알려졌다. 장출혈성 대장균은 설사, 혈변, 복통 등의 증상을 일으키며, 감염자의 약 10% 정도는 용혈성 요독증후군(Haemolytic uraemic syndrome, HUS)을 일으킬 수 있다.
장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli, EPEC)은 장 점막의 세포에 달라붙는 성질이 있으며 이질과 비슷한 증상을 보인다. 장병원성 대장균은 발열, 복통, 구토, 수양성 설사 등의 증상을 일으키며, 이중 10%에서는 혈성 설사를 일으키기도 한다.
장독소성 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC)은 콜레라와 유사한 독소를 생산하는데, 100℃ 온도 조건에서 30분간 가열해도 내성을 보이는 내열성 독소(Heat stable enterotoxin)와, 60℃ 온도에서 10분간 가열했을 때 활성을 잃는 이열성독소(Heat labile enterotoxin)를 생성한다. 장독소성 대장균은 여행자 설사의 주된 원인균으로 오염된 음식이나 물 섭취를 통하여 감염된다.
장침습성 대장균(Enteroinvasive E. coli, EIEC)은 200 kb의 병독성 연관 침습성 플라스미드(virulence-associated invasion plasmid)에 위치한 ipaH 유전자를 가지고 있으며, 동물에게는 병원균으로 작용하지 않지만 사람에게는 이질균과 동일하게 질병을 일으킨다. 장침습성 대장균은 수양성 설사나 혈변 설사를 일으킨다.
한편, 세균성 이질은 시겔라(Shigella) 감염에 의한 열성 설사를 특징으로 한다. 고열과 구역질, 구토, 경련성 복통이 주요한 증상이며, 매우 적은 양(10~100개)으로도 감염이 가능하다. 시겔라(Shigella) 속(genus)에는 4종(species)의 혈청형이 있다. 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)는 A군으로 12종의 혈청형 아속으로 나뉘어지고, 시겔라 플렉스네리(S. flexneri)는 B군으로 6종의 혈청형 아속으로 나뉘어지며, 시겔라 보이디이(S. boydii)는 C군으로 18종의 혈청형 아속으로 나뉘어지고, 시겔라 소네이(S. sonnei)는 D군으로 혈청군은 1종으로 되어 있다.
그런데, 상기 기술한 장출혈성 대장균(EHEC)과 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)는 모두 시가(shiga) 독소를 보유하고 있어, 장출혈성 대장균(EHEC)과 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)의 구분이 쉽지 않다는 문제가 있다. 또한, 일반적으로 시겔라(Shigella)에 속한 세균을 확인하기 위한 유전자 마커로 ipaH를 사용하고 있지만, 병원성 대장균 중 장침습성 대장균(EIEC)의 경우에도 ipaH 유전자를 보유하고 있기 때문에 ipaH 유전자를 분자생물학적 검출을 위한 마커로 사용할 경우 장침습성 대장균(EIEC)과 시겔라(Shigella) 속의 세균과의 구분이 어렵다는 문제가 있다.
종래에는 설사 증세를 보이는 식중독 및 이질 등의 원인균의 규명과 발병처의 확인을 위해 의심 환자의 검체에 대해 면역학적 검사를 수행하였다. 면역학적 검사는 낮은 검사비로 경제성은 높지만, 검체로부터 원인균을 배양하고 원인균의 항원을 이용한 응집 반응법으로 검사하기 때문에 확진까지 오래 시간이 걸리며, 유전자 검사와 비교할 때 민감도가 낮은 문제점이 있다.
이러한 문제점을 감안하여 식중독 및 이질 등의 원인균이 가지는 특정 유전자 서열(즉, 유전자 마커)을 증폭하여 검사하는 유전자 검사가 주목을 받고 있으나, 종래의 식중독 및 이질 등의 원인균의 검사를 위한 분자생물학적 진단법들은 제한된 종류의 원인균의 검사만이 가능하였다. 따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 다양한 식중독 및 이질 등의 원인균의 검사가 가능하면서도 신속하고 정확하게 식중독 및 이질 등의 원인균을 판별할 수 있는 기술 개발에 대한 요구는 꾸준히 계속되고 있다.
이와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0143347호에서는 시가독소 유전자인 stx1 및 stx2에 대한 프라이머 세트를 이용한 실시간 다중 등온증폭반응을 수행하여 다양한 생물이 혼재된 시료에서 장출혈성 대장균을 특이적으로 조기에 검출할 수 있는 기술을 개시하고 있다. 그러나, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0143347호는 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자만을 유전자 마커로 이용하고 있기 때문에, 의심 환자의 검체 내에 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)가 존재하는 경우 세균성 이질로 진단하는 것이 아니라 장출혈성 대장균에 의한 식중독으로 오진할 수 있는 문제점이 있다.
즉, 상기 종래기술은 시가독소 유전자를 이용한 검출방법이 장출혈성 대장균(EHEC)과 시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)를 구별하기 어려운 문제점이 있다는 점에 전혀 주목하지 않고 있다. 이러한 관점에서, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0143347호를 포함한 종래기술은 설사 증세 등 유사한 증세를 나타내는 식중독 및 이질 등의 원인균을 정확하게 구별하여 검출함으로써 환자에 대한 적절한 치료를 수행하고 원인균 맞춤형 방역 대책을 수립하는데에는 한계가 있다고 할 수 있다.
따라서, 본 발명이 속한 기술분야에서는 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 기술의 제공이 요구되고 있다고 할 수 있다.
본 발명은 시가 독소를 이용한 혈청분석법으로는 구분할 수 없는 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli)과 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae)를 특이적으로 판별하여 설사 증세 등을 일으키는 원인균을 잘못 진단하는 문제점을 해결할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 초기에도 소량의 원인균의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
특히, 본 발명은 시가 독소(shiga toxin)의 STX 유전자를 1차 유전자 마커로 사용하여, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출하고, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 의심 환자의 분변, 타액 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 육류, 어패류 등의 환경 시료로부터도 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리를 민감도 높게 검출하여 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 시가 독소(shiga toxin)의 STX 유전자를 1차 유전자 마커로 사용하여, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출하고, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 신속 검사 키트 및 방법을 고안하기에 이르렀다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "검체"란 감염 의심 환자의 분변, 타액 외에도 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리의 유전자 검출이 가능한 환경시료, 예를 들어 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 육류, 어패류 등도 포함하는 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "유전자 샘플"이란 DNA, RNA, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 생성된 cDNA, pre-PCR (예비 PCR)을 통해 증폭된 DNA 또는 cDNA 등을 포함하는 광의의 개념으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법에서 사용되는 리얼타임 PCR 증폭용 프라이머 쌍으로서, 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자를 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 증폭하는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 포함하는, 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 표적 유전자 증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사용 프로브 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트로서, 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자를 증폭하는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자를 증폭하는 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 증폭하는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 포함하고, 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브와, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자에 특이적인 프로브로서 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드와 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 프로브를 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 STX1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 STX2 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 rfpB 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트는, 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같이 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 포함하는 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 존재 여부를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 STX1 유전자의 증폭량, 상기 STX2 유전자의 증폭량 및 상기 rfpB 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법은,
검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트를 이용하여, 상기 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자, 상기 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자 및 상기 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 증폭 단계를 수행한 후 리얼타임 PCR 결과를 확인하고, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 증폭량에 기초하여 상기 검체 내의 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 리얼타임 PCR 결과, 상기 검체 내에 STX1 유전자 및 STX2 유전자가 검출되고, 또한 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자가 검출되는 경우에는 상기 검체는 시겔라 디젠테리에 의해 감염된 것으로 결정하고, 상기 검체 내에 STX1 유전자 및 STX2 유전자는 검출되지만, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자가 검출되지 않는 경우에는 상기 검체는 장출혈성 대장균에 의해 감염된 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법은,
증폭 전, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자를 각각 증폭하는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 STX1 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 STX2 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단과, 상기 rfpB 유전자의 증폭산물에 특이적으로 결합하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
이와 관련하여 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 3가지 프로브를 동시에 사용하는 경우 1개의 검사 튜브에서 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 존재 여부를 한번에 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 상기 STX1 유전자의 증폭량, 상기 STX2 유전자의 증폭량 및 상기 rfpB 유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ, ZEN-IBFQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 시가 독소를 이용한 혈청분석법으로는 구분할 수 없는 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli)과 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae)를 특이적으로 판별하여 설사 증세 등을 일으키는 원인균을 잘못 진단하는 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 초기에도 소량의 원인균의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있는 장점이 있다.
특히, 본 발명은 시가 독소(shiga toxin)의 STX 유전자를 1차 유전자 마커로 사용하여, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출하고, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있다.
추가로, 본 발명은 의심 환자의 분변, 타액 뿐만아니라 의심 환자가 접촉한 화장실 변기, 수건, 휴지, 오염된 물, 오염된 식품, 육류, 어패류 등의 환경 시료로부터도 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리를 민감도 높게 검출하여 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염여부에 대한 정확한 진단과 감염 확산을 조기에 차단할 수 있다.
도 1은 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍)과, 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자에 특이적인 프로브(서열번호 3의 프로브)의 조합을 사용하여 STX1 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 합성된 STX1 유전자의 농도를 107, 105 및 103 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 2는 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍)과, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자에 특이적인 프로브(서열번호 6의 프로브)의 조합을 사용하여 STX2 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 합성된 STX2 유전자의 농도를 107, 105 및 103 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍)과, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자에 특이적인 프로브(서열번호 9의 프로브)의 조합을 사용하여 rfpB 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 합성된 rfpB 유전자의 농도를 107, 105 및 103 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 FAM-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 3의 프로브), JOE-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 6의 프로브) 및 CY5-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 9의 프로브)를 모두 사용하여 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자를 동시에 검출하는 다중 리얼타임 PCR을 수행하여 얻어진 결과 그래프이다. 각 유전자 주형의 농도는 107, 105 및 103 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시하였다.
도 2는 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍)과, 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자에 특이적인 프로브(서열번호 6의 프로브)의 조합을 사용하여 STX2 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 합성된 STX2 유전자의 농도를 107, 105 및 103 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 3은 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 증폭하는 프라이머 쌍(서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍)과, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자에 특이적인 프로브(서열번호 9의 프로브)의 조합을 사용하여 rfpB 유전자에 대해 리얼 타임 PCR을 실시한 결과로서, 합성된 rfpB 유전자의 농도를 107, 105 및 103 의 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시한 결과 그래프이다.
도 4는 FAM-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 3의 프로브), JOE-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 6의 프로브) 및 CY5-EBQ로 표지된 프로브(서열번호 9의 프로브)를 모두 사용하여 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자를 동시에 검출하는 다중 리얼타임 PCR을 수행하여 얻어진 결과 그래프이다. 각 유전자 주형의 농도는 107, 105 및 103 카피수로 하여 리얼타임 PCR을 실시하였다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자의 합성
장출혈성 대장균(EHEC)/시겔라 디젠테리(S. dysenteriae)를 검출할 수 있도록 STX1 유전자 서열, STX2 유전자 서열 및 rfpB 유전자 서열을 확인한 후, 이중 일부를 유전자 증폭실험에 사용하기 위하여 합성을 진행하였다.
각각의 유전자 합성은 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 아큐젠블록 서비스(AccuGeneBlock Service)를 이용하여 진행하였으며, 합성된 각 유전자의 상세한 서열정보는 다음과 같다.
| STX1 유전자 (107 bp), GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No.KP203839 |
| CTCAGTGGGCGTTCTTATGTAATGACTGCTGAAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAAGGTTGAGTAGTGTCCTGCCTGACTATCATGGACAAGACTCTGTTCG |
| STX2 유전자 (100 bp), GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. KT356579 |
| GACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCGCCGGGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACGAGGGCTTGATGTCTATCAGGCGCGTTTTGACCATCTT |
| rfpB 유전자 (123 bp), GenBank의 NCBI에 등록된 Accession No. CP000640.1 |
| AAGGTTAATACCACTGCGACTTAAATTATAATCAACAGGAATGGCGCCTGCTTTTTTTATTATTTCCTTGGATGAATCATTATAGTCAGTAGCAAAAGCATAGACTGAAATCCCTTTCTTGGT |
실시예 2: STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자 검출을 위한 프라이머 및 프로브의 준비
상기 실시예 1에서 기술한 표 1 내지 표 3의 합성 유전자 서열을 이용하여, 장출혈성 대장균/시겔라 디젠테리 검출을 위한 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자에 각각 특이적인 증폭용 프라이머 쌍과, 증폭반응 결과물을 특이적으로 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 아래의 표 4와 같이 디자인하였다. 프라이머와 프로브 서열의 Tm 값 분석은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)사에서 제공하는 웹 기반 프로그램인 oligoanalyzer 3.1을 이용하여 수행하였다. 한편, 하기 표 4의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
| 서열번호 | 명칭 | 염기서열 (5'→3') | 길이 | GC% | Tm(℃) | 증폭산물 |
| 1 | STX1-F | CTCAGTGGGCGTTCTTATGT | 20 | 50 | 54.7 | 107 bp |
| 2 | STX1-R | CGAACAGAGTCTTGTCCATGATA | 23 | 43.5 | 54.2 | |
| 3 | STX1-P | AAGGTTGAGTAGYGTCCTGCCTGA | 24 | 52.1 | 60.8 | |
| 4 | STX2-F | GACCACATCGGTGTCTGTTATT | 22 | 45.5 | 54.8 | 100 bp |
| 5 | STX2-R | AAGATGGTCAAAACGCGCCTG | 21 | 52.4 | 58.6 | |
| 6 | STX2-P | TGCTGTGGATATACGAGGGCTTGA | 24 | 50 | 59.8 | |
| 7 | rfpB-F | AAGGTTAATACCACTGCGACTT | 22 | 40.9 | 54.1 | 123 bp |
| 8 | rfpB-R | ACCAAGAAAGGGATTTCAGTCTAT | 24 | 37.5 | 53.9 | |
| 9 | rfpB-P | TAATCAACAGGAATGGCGCCTGCT | 24 | 50 | 61.1 |
그 결과, STX1 유전자에 특이적인 프라이머 쌍으로서 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 그리고 STX1 유전자 증폭산물에 특이적인 프로브로서 서열번호 3의 프로브를 준비하였다. 또한, STX2 유전자에 특이적인 프라이머 쌍으로서 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 그리고 STX2 유전자 증폭산물에 특이적인 프로브로서 서열번호 6의 프로브를 준비하였다. 다음으로, rfpB 유전자에 특이적인 프라이머 쌍으로서 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍, 그리고 rfpB 유전자 증폭산물에 특이적인 프로브로서 서열번호 9의 프로브를 준비하였다.
상기와 같이 준비된 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍, 그리고 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자를 증폭하고 증폭산물 내 특이적인 형광 프로브로서 서열번호 3의 프로브, 서열번호 6의 프로브 및 서열번호 9의 프로브를 이용하여 특이적으로 상기 표적 유전자의 존재여부와 정량분석을 진행할 수 있다. 이와 같은 프라이머 쌍과 프로브의 조합으로 동시에 리얼타임 PCR을 실시할 경우 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 동시에 검출할 수 있으며, 2종을 정확하게 구분할 수 있다.
상기 표 4의 프라이머 쌍과 프로브는 (주)바이오니아의 올리고 합성 서비스를 이용하여 합성하였고, 최종 농도가 100 μM이 되도록 멸균증류수를 첨가하여 준비하였으며, 증폭 실험 전까지 냉장 보관하였다.
실시예 3: STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자 각각에 대한 리얼타임 PCR의 수행
실시예 1에서 준비된 각각의 합성유전자(STX1, STX2 및 rfpB 합성유전자)와 실시예 2에서 준비된 각 유전자에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 조합을 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하였다. 증폭실험은 (주)바이오니아의 Exicycler 96 리얼 타임 PCR 장비를 이용하여 수행하되, 하기 표 5에 기술한 바와 같은 리얼타임 PCR 반응 조성액을 조제하여 사용하였다. 증폭을 위한 주형 DNA로는 실시예 1에서 기술한 합성유전자를 사용하였으며, 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스(Real-time PCR Master Mix)는 제이에스 바이오테크(대한민국 경기도 소재)의 제품을 사용하였다.
| 구 성 물 | 첨 가 량 |
| 2X 리얼타임 PCR 마스터 믹스 | 10 μl |
| 정방향 프라이머 (100 μM) | 각 0.1 μl |
| 역방향 프라이머 (100 μM) | 각 0.1 μl |
| 프로브 (100 μM) | 각 0.05 μl |
| 주형 DNA | 2 μl |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 7.25 μl |
| 전체 부피 | 20 μl |
또한, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 각 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, STX1 유전자에 대한 프로브(서열번호 3)는 5'말단에 FAM(최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm)으로 표지하였고, STX2 유전자에 대한 프로브(서열번호 6)는 JOE(최대 흡수 파장: 520nm, 최대 방출 파장: 548nm)로 표지하였으며, rfpB 유전자에 대한 프로브는 5'말단에 CY5(최대 흡수 파장: 650nm, 최대 방출 파장: 670nm)로 표지하였다. 그리고, 이들 프로브의 3'말단에는 소광물질인 EBQ(Excellent Bioneer Quencher)를 표지하였다. 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
리얼타임(real-time) PCR 방법은 이러한 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 표적 유전자의 초기 주형량(본 발명의 경우 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자의 카피수)을 정확하게 반영한다. 따라서, STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자를 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자가 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 이들 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 실시예에서는 STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자의 각각의 합성 유전자에 대해 상기 표 5에 나타낸 바와 같은 리얼타임 PCR 증폭 반응액의 조성 하에서, 하기 표 6의 리얼타임 PCR 반응조건으로 40회 반복하여 실험을 진행하였으며, Ct 값을 기준으로 음/양성(STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자 존재 여부)을 판정하였다.
| 변성(Denaturation) | 95℃, 5분 |
| 40 사이클 | |
| 변성(Denaturation) | 95℃, 10초 |
| 어닐링 및 연장 (데이터 수집) | 55℃, 45초 |
STX1 유전자의 경우, 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 FAM 파장에서 형광값을 측정하여 각 반응 사이클에 대한 형광세기를 분석하였다. 그 결과는 도 1에 도시하였다.
또한, STX2 유전자의 경우, 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 JOE 파장에서 형광값을 측정하여 각 반응 사이클에 대한 형광세기를 분석하였다. 그 결과는 도 2에 도시하였다.
다음으로, rfpB 유전자의 경우, 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 CY5 파장에서 형광값을 측정하여 각 반응 사이클에 대한 형광세기를 분석하였다. 그 결과는 도 3에 도시하였다.
도 1 내지 도 3에서 확인되는 바와 같이, STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자를 각각 리얼 타임 PCR로 증폭하는데 사용하기 위해 디자인된 표 4의 프라이머 쌍과 프로브의 각 조합은 대응하는 각각의 표적 유전자를 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 표적 유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 실시예 2에서 디자인된 표 4의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 리얼타임 PCR을 수행하면, STX1 유전자 및 STX2 유전자의 검체 내 존재에 의해, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출할 수 있고, 시겔라 rfpB 유전자의 검체 내 존재 여부에 의해 시겔라 디젠테리와 장출혈성 대장균을 특이적으로 구분할 수 있다. 즉, 본 발명의 검사 키트 및 방법을 이용하면, 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있다.
실시예 4: STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자에 대한 다중 리얼 타임 PCR의 수행
본 실시예에서는 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 3개의 유전자(STX1 유전자, STX2 유전자 및 rfpB 유전자) 존재 유무를 동시에 검출할 수 있는지를 확인하였고, 형광세기에 기초한 해당 유전자의 정량적 분석이 가능한지 여부도 확인하였다. 본 실시예의 리얼 타임 PCR 조성과 증폭 조건은 실시예 3과 동일하므로 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 실시예에서는 상기 3개의 유전자 증폭산물로부터 검출되는 형광신호의 파장들은 서로 다르게 되어 한 번의 리얼타임 PCR 반응으로 1개의 반응 튜브 내에서 상기 3개의 유전자의 존재 유무의 검출 및 정량적 분석이 가능하게 된다.
그 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, 상기 3개의 유전자 각각에 대응하는 프로브의 5'말단에 각각 형광물질인 FAM, JOE 및 CY5를 표지하고 3'말단에 소광물질인 EBQ를 표지한 경우 실시예 3의 결과와 유사하게 상기 3개의 유전자 각각을 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 1개의 반응 튜브에서 3가지 발광파장을 갖는 3개의 반응물의 구분을 명확히 할 수 있었으며, 3개의 반응물의 위양성 혹은 위음성 결과가 나오지 않는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 실시예 2에서 디자인된 표 4의 프라이머 쌍과 프로브의 조합들을 이용하여 1개의 반응 튜브에서 다중 리얼타임 PCR을 수행하면, STX1 유전자 및 STX2 유전자의 검체 내 존재에 의해, 병원성 대장균 중 장출혈성 대장균과, 시겔라(Shigella) 속의 세균 중 시겔라 디젠테리를 검출할 수 있고, 시겔라 rfpB 유전자의 검체 내 존재 여부에 의해 시겔라 디젠테리와 장출혈성 대장균을 특이적으로 구분할 수 있다.
예를 들어, 다중 리얼타임 PCR 결과, 검체 내에 STX1 유전자 및 STX2 유전자가 검출되고, 또한 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자가 검출되는 경우에는 상기 검체는 시겔라 디젠테리에 의해 감염된 것으로 결정할 수 있고, 상기 검체 내에 STX1 유전자 및 STX2 유전자는 검출되지만, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자가 검출되지 않는 경우에는 상기 검체는 장출혈성 대장균에 의해 감염된 것으로 결정할 수 있다.
즉, 본 발명의 검사 키트 및 방법을 이용하면, 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있는 장점이 있다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명의 검사 키트 및 방법은 시가 독소를 이용한 혈청분석법으로는 구분할 수 없는 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli)과 시겔라 디젠테리(Shigella dysenteriae)를 특이적으로 판별하여 설사 증세 등을 일으키는 원인균을 잘못 진단하는 종래기술의 문제점을 해결할 수 있다.
이러한 본 발명의 효과는 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 단순히 시가 독소의 유무의 확인만으로는 정확한 설사 원인균의 판단이 어렵고 설사와 관련한 질환의 조기 확진이 어려운 점을 감안한다면 매우 의미가 있는 것이라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 설사 증세 등을 나타내는 의심 환자의 검체로부터 원인 병원균이 장출혈성 대장균인지 또는 시겔라 디젠테리인지를 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 검출할 수 있고, 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 초기에도 소량의 원인균의 존재를 조기에 검출함으로써 감염 초기에 적절한 치료를 가능케 하여 환자의 치료시기를 놓치거나 감염을 확산시키는 위험을 사전에 차단할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> Republic of Korea(National Forensic Service Director Ministry of Public Administration and Security)
<120> Method and kit for detecting Enterohaemorrhagic E. coli and
Shigella dysenteriae using real-time PCR
<130> P16-0019KR
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX1 forward primer
<400> 1
ctcagtgggc gttcttatgt 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX1 reverse primer
<400> 2
cgaacagagt cttgtccatg ata 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX1 probe
<400> 3
aaggttgagt agygtcctgc ctga 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX2 forward primer
<400> 4
gaccacatcg gtgtctgtta tt 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX2 reverse primer
<400> 5
aagatggtca aaacgcgcct g 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> STX2 probe
<400> 6
tgctgtggat atacgagggc ttga 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rfpB forward primer
<400> 7
aaggttaata ccactgcgac tt 22
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rfpB reverse primer
<400> 8
accaagaaag ggatttcagt ctat 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rfpB probe
<400> 9
taatcaacag gaatggcgcc tgct 24
<210> 10
<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic STX1 gene
<400> 10
ctcagtgggc gttcttatgt aatgactgct gaagatgttg atcttacatt gaactgggga 60
aggttgagta gtgtcctgcc tgactatcat ggacaagact ctgttcg 107
<210> 11
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic STX2 gene
<400> 11
gaccacatcg gtgtctgtta ttaaccacac cccgccgggc agttattttg ctgtggatat 60
acgagggctt gatgtctatc aggcgcgttt tgaccatctt 100
<210> 12
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Shigella rfpB gene
<400> 12
aaggttaata ccactgcgac ttaaattata atcaacagga atggcgcctg ctttttttat 60
tatttccttg gatgaatcat tatagtcagt agcaaaagca tagactgaaa tccctttctt 120
ggt 123
Claims (13)
- 다중 리얼타임 PCR(multiplex realtime PCR)을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트로서,
시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍과, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제1 조합과,
시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 4 및 5의 프라이머 쌍과, 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제2 조합과,
시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍과, 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제3 조합을 포함하고,
상기 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되며,
1개의 반응 용기에 상기 프라이머 및 프로브의 조합들 모두가 포함된 다중 리얼타임 PCR을 수행하기 위해 제공되고,
다중 리얼타임 PCR 결과, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소의 rfpB 유전자가 모두 검출되는 경우에는 시겔라 디젠테리에 의해 감염된 것으로 결정하고, 상기 STX1 유전자 및 상기 STX2 유전자는 검출되지만 상기 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소의 rfpB 유전자가 검출되지 않는 경우에는 장출혈성 대장균에 의해 감염된 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트. - 제1항에 있어서,
DNA 중합효소, dNTPs 및 PCR 완충용액을 더 포함하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트. - 제1항에 있어서,
상기 표지물질은 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트. - 삭제
- 삭제
- 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법에 있어서,
검체로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 청구항 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트를 이용하여, 상기 시가 독소(shiga toxin)의 STX1 유전자, 상기 시가 독소(shiga toxin)의 STX2 유전자 및 상기 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 다중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 증폭 단계를 수행한 후 다중 리얼타임 PCR 결과를 확인하고, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 증폭량에 기초하여 상기 검체 내의 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 여부를 결정하는 단계를 포함하고,
다중 리얼타임 PCR 결과, 상기 검체 내에 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소의 rfpB 유전자가 모두 검출되는 경우에는 상기 검체는 시겔라 디젠테리에 의해 감염된 것으로 결정하고, 상기 검체 내에 STX1 유전자 및 STX2 유전자는 검출되지만 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소의 rfpB 유전자가 검출되지 않는 경우에는 상기 검체는 장출혈성 대장균에 의해 감염된 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법. - 삭제
- 제6항에 있어서,
증폭 전, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자의 카피수를 알고 있는 유전자 샘플인 양성 표준자를, 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자를 각각 증폭하는 프라이머 쌍과, 증폭되는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자와 관련하여 유전자 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 다중 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자 각각의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 검체의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 STX1 유전자, 상기 STX2 유전자 및 상기 rfpB 유전자 각각을 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 검체 내의 장출혈성 대장균 또는 시겔라 디젠테리 감염 여부를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함하는, 다중 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 방법. - 삭제
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| International Journal of Food Microbiology, Vol. 168-169, Pages 57-62(공개일: 2013. 10. 29.)* |
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