KR101815525B1 - 증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포의 제조방법 및 그 줄기세포 - Google Patents

증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포의 제조방법 및 그 줄기세포 Download PDF

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Abstract

이동성 및 착생이 증가된 줄기세포가 개시된다. 줄기세포를 준비하는 단계 및 상기 줄기세포에 초음파를 조사하는 단계를 포함하는 줄기세포의 제조방법을 통하여, 줄기세포가 증가된 이동성 및 착생 효과를 갖는 것이 가능하다.

Description

증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포의 제조방법 및 그 줄기세포{METHOD FOR PRODUCING A STEM CELL THAT INDICATES AN INCREASED MOBILITY AND ENGRAFTMENT AND THAT STEM CELL}
본 발명은 초음파를 처리하여 줄기세포의 이동성과 착생을 향상시키기 위한 방법 및 그 줄기세포에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포는 크게 성체 줄기세포와 배아 줄기세포로 나뉠 수 있는데 그 중 성체 줄기세포는 골수, 제대혈 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있다. 성체 줄기세포는 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하는 것이기 때문에 면역거부반응도 적어서 이를 이용한 연구가 활발하다. 최근, 의료기술의 패러다임 변화에 따라 난치병 치료에 대한 시도로서 줄기세포 치료의 필요성이 부각되고 있다. 줄기세포를 이용한 세포치료는 세포나 조직을 이식함으로서 질병의 근원적 치료를 가능하게 할 수 있는 새로운 개념의 의료 기술로서 극복해야 할 많은 문제점이 있다. 그 문제점으로 재생된 조직과 기존 조직과의 상호 관계와 거부반응, 다른 장기의 세포로 분화 등 다양한 위험성을 내포하고 있으며, 특히 세포치료로서 세포나 조직을 이식한 후에는 세포들이 타겟 조직으로 정확하고 신속하게 이동되어야만 하는바, 이에 대한 체계적 연구가 요구된다.
성체줄기세포 중에서도 가장 활발히 응용되고 있는 것이 중간엽 줄기세포(Mensenchymal Stem Cell, MSC)라 할 수 있다. 그러나 이식 후 세포의 이동 및 유도의 기작은 명확히 알려진 바가 없다. 중간엽 줄기세포의 분화능이나 이동능이 결여 또는 손상된 경우, 세포치료의 효과는 현저히 감소한다. 또한 생착률이 감소하면 종양 및 암으로의 발전 가능성이 있어서 줄기세포의 이동성 및 착생에 관한 부분은 중요한 과제가 되어왔다.
줄기세포의 이동성 및 착생과 관련하여, 줄기세포의 세포배양환경을 조절하는 연구로 최근 저산소상태(hypoxia)에서 배양하는 방식이 있다(한국등록특허공보 제10-1224850호, 2013.01.16.). 그러나, 저산소상태 조절이 실패하게 되면 자칫 줄기세포가 폐사가 될 위험성이 존재하기 때문에 상용화된 적용이 용이하지 않은 문제가 있다. 또한 니코틴아마이드의 전처리를 통한 줄기세포의 귀소효과(Homing effect) 및 생착(한국출원공개공보 제10-20080072748호, 2008.08.06)을 높이는 연구의 경우, 니코틴아마이드의 처리에 대한 세포에 대한 민감도가 높아서 조절이 어렵고 비용이 높은 단점이 있다.
이에 반복적 실시와 안정적 효과를 위해, 최근 물리적 및 기계적 자극을 통한 세포의 변화를 관찰하는 연구가 많이 행해지고 있다. 연구에 있어 이용되는 자극 중에는 스트레치(Stretch), 전기 자극 및 초음파자극 등이 있다. 특히 줄기세포에 초음파자극을 줄 경우 연골세포 또는 골세포로의 분화를 촉진시킬 수 있으며, 실제 임상에 있어서도 골절치료에 효과적이어서 치료의 목적으로 많이 이용되고 있다. 그러나 아직까지 초음파 자극이 배양초기의 줄기세포에 미치는 영향에 관한 것으로서, 이동성 및 착생에 대한 연구는 이루어지지 않았다.
본 발명자는 중간엽 줄기세포의 이동성 및 착생을 향상시켜 보다 효과적인 세포치료 위한 중간엽 줄기세포를 얻기 위하여 예의 노력한 결과, 이동성 및 착생이 증가된 줄기세포를 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허공보 제10-1224850호(2013.01.16) 한국출원공개공보 제10-20080072748호(2008.08.06)
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 창출된 것으로서, 발명의 목적은 초음파 처리를 통해 이식된 줄기세포의 치료부위로의 이동성 및 착생을 향상시켜 줄기세포 치료 효능을 높이기 위함이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따른 증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포의 제조방법은, 줄기세포의 준비 단계 및 상기 줄기세포에 초음파를 줄기세포에 조사하는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포 일 수 있다.
상기 초음파는 펄스 집속 초음파(pulsed focused ultrasound)일 수 있다.
상기 초음파는 주파수가 1khz 내지 10MHz 일 수 있다.
상기 초음파는 출력강도가 1W/cm2 내지 20W/cm2 일 수 있다.
상기 초음파 조사는 1ms 내지 1,000ms 로 지속될 수 있다.
상기 초음파 조사는 돌발 변조신호(burst modulation)를 2분 내지 30분 간격으로 복수회 조사할 수 있다.
상기 초음파 조사는 초음파 조사부와 상기 줄기세포와의 간격이 1mm 내지 10mm 일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포는 줄기세포를 준비하는 단계 및 상기 줄기세포에 초음파를 줄기세포에 조사하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것이다.
여기서, 상기 줄기세포는 MCP-1 및 MCP-2의 발현이 증가한 것으로 나타나는 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 초음파 처리의 간단한 물리적 조작만으로 줄기세포의 이동성 및 착생을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포간격 비교 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포간격 그래프이다.
도 3는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포증식 변화에 따른 그래프이다.
도 4은 본 발명의 일 실시예에 따른 MCP의 발현정도 차이에 따른 그림이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 줄기세포를 준비하는 단계 및 상기 줄기세포에 초음파를 조사하는 단계를 포함하는 증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포의 제조방법 및 그 줄기세포를 제공한다.
상기 줄기세포는 성체 줄기세포 및 배아 줄기세포를 포함하는 의미이며, 바람직하게는 성체 줄기세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 골수 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
상기 초음파는 줄기세포에 영향을 줄 수 있는 음향물리학적 조사를 의미한다. 물리적 자극들 중 초음파는 조직 내의 세포를 기계적으로 자극시킬 수 있는 수단으로 손상된 조직의 수복에 효과적인 것으로 알려져 있다. 인체치료를 위한 초음파로는 주로 고강도 집속 초음파(High intensity focused ultrasound) 및 저강도 집속 초음파(Low intensity focused ultrasound)가 있다. 따라서 상기 초음파는 줄기세포 또는 인체에 적용할 수 있는 고강도 집속 초음파(High intensity focused ultrasound) 및 저강도 집속 초음파(Low intensity focused ultrasound)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 초음파는 저강도 집속 초음파 일 수 있다. 또한 상기 초음파는 펄스 집속 초음파(pulsed focused ultrasound)일 수 있다. 상기 초음파는 주파수 1khz 내지 10MHz일 수 있고, 바람직하게 20khz 내지 50khz 일 수 있다. 1khz 이하의 초음파의 경우 에너지가 낮아 세포에 영향을 미치지 않을 수 있으며, 10MHz 이상의 초음파의 경우 에너지가 너무 높아 세포 손상으로 인한 돌연변이가 있을 수 있다. 상기 초음파는 출력강도 1W/cm2 내지 20W/cm2일 수 있다. 출력강도 1W/cm2 이하의 경우 출력이 너무 낮아서 효율적이지 못하고, 20W/cm2 이상의 경우 안전 문제가 중요하게 작용하는 바, 근위장 처음 1cm 에서 간섭이 많이 일어나 핫 스팟(Hot spot)이 초래될 수 있다.
상기 초음파 조사는 최초로 세포를 시드한 후(cell seeding) 18시간 내지 36시간 내에 돌발 변조신호(burst modulation)를 2분 내지 30분 내에서 1회 이상을 조사할 수 있다. 바람직하게 초음파 조사 전체 시간은 2분 내지 10분 일 수 있다. 돌발 변조 신호를 2분 이하로 조사할 경우 충분한 시간 동안 초음파가 조사되지 않아 세포에 영향을 미치지 않을 수 있으며, 30분 이상으로 조사할 경우 초음파 과다 노출로 인하여 세포 손상이 있을 수 있다. 또한 돌발 변조신호를 1회만 조사할 경우, 충분하지 못한 효과를 나타낼 수 있다. 상기 초음파 순돌발(순음) 조사시간(tone burst duration)은 1ms(millisecond) 내지 1,000ms 일 수 있다. 초음파 지속시간이 1ms 이하인 경우 초음파 조사 효력이 없을 수 있으며, 1,000ms 이상인 경우 지속시간이 너무 길어져 세포 변형으로 인한 세포 사멸 또는 괴사나 종양 발생 확률이 나타날 수 있다. 상기 초음파 조사는 초음파 조사부와 상기 줄기세포와의 간격이 1mm 내지 10mm 일 수 있다. 바람직하게 간격이 1mm 내지 3mm 이하 일 수 있다. 1mm 이하인 경우 조사부와 세포와의 간격이 지나치게 가까워 오염 및 손상을 초래할 수 있으며, 10mm 이상의 경우 원거리로 인하여 조사범위가 넓고 집중적이지 못해 효과가 떨어질 수 있다.
줄기세포의 이동성이란, 이식한 줄기세포가 타겟 조직으로의 이동을 하는 능력을 나타내는 것으로서 세포 간격이 적절하게 조밀할수록 이동능력이 증가할 수 있다. 줄기세포의 착생이란, 타겟 조직으로 이동한 줄기세포가 해당 조직에 보다 잘 분화되어 생착되는 것을 의미하는 것으로서 케모카인의 일종인 MCP가 높게 나타날수록 착생률이 좋고 면역 거부 반응이 덜 일어날 수 있다.
MCP 단백질(Major capsid protein)은 귀소 케모카인(Homing chemokine)의 전형적인 모델로 귀소(Homing)과 생착(adhesion)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 단핵구 주화성 단백질1(MCP-1)은 CCL2, 소형 유도성 사이토킨 A2, 단핵구 주화성과 활성화 인자(MCAF), 단핵구 분비 단백질 Je, 단핵구 주화성 인자, HC11과 같은 다양한 이름으로 알려져 있는 CC케모카인 집단의 구성원이다. 이 케모카인은 다양한 염증 질환, 상이한 유형의 암, 심장 동종이식, AIDS에서 손상과 감염신호에 반응하여 단핵구와 호염기구의 유인을 촉진할 수 있다. 단핵구 주화성 단백질2(MCP-2)는 MCP계(1-4)의 멤버로서 CCR5와도 상호작용 할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따른 증가된 이동성 및 착생을 나타내는 줄기세포는 줄기세포를 준비하는 단계 및 상기 줄기세포에 초음파를 줄기세포에 조사하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 것이다. 줄기세포의 제조방법에 대한 설명은 전술한 바와 같으므로 생략한다.
상기 줄기세포는 MCP-1 및 MCP-2의 발현이 증가한 것일 수 있다. 전술한 바와 같은 제조방법에 따른 줄기세포는 MCP-1 및 MCP-2의 발현이 증가될 수 있다. 상기 줄기세포는 MCP-1 및 MCP-2의 발현량은 초음파를 조사하지 않은 줄기세포에 비해 바람직하게는 1.1배 내지 1.8배 증가 될 수 있다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1 : 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 준비
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포는 LONZA에서 나온 제품을 사용하여 회사의 프로토콜을 따랐다.
실시예 2 : 백서 골수 유래 중간엽 줄기세포의 준비
백서의 경우, 대퇴골과 경골의 골수로부터 획득하여 단핵세포의 밀도차 분리에 의해 얻었다.
상기 백서 줄기세포는, 60 mg/kg 케타민(Ketamine)과 10 mg/kg 롬펀(Rompun)의 혼합물로 마취된 4 주령 백서의 대퇴골과 경골을 획득하였다. 이후 헤파린(heparin)이 처리된 18-Gauge 주사바늘과 DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium, Gibco BRL)을 이용하여 말초와 기부에 있는 골수를 흡입하였다. 흡입한 골수를 1600 rpm, 5분간 원심분리 실시 후, 하층부만 남기고 DMEM 으로 현탁 시켰다. 현탁시킨 골수를 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences)를 이용한 밀도구배 원심분리 (1,600 rpm, 30분)방법으로 골수세포와 적혈구를 분리하였다. 분리한 세포를 PBS (Gibco BRL)로 Ficoll-Paque PLUS, 배지에 있는 단핵구 세포를 2번 세척한 후, 새로운 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco BRL) DMEM을 첨가하여 배양하였다. 줄기세포를 3일 배양한 후, 부착하지 않은 적혈구와 단핵구세포를 버리고 새로운 10% FBS DMEM를 첨가하여 7일 간 더 배양하였다.
실시예 3 : 줄기세포에 펄스 집속 초음파(pulsed focused ultrasound)의 조사
분리한 골수 유래 중간엽 줄기세포를 2 x 104 셀(cells)/24 웰(well)에 도포하였다. 초음파는 저강도 초음파(low intensity)를 사용하였는바, 30khz의 펄스화 된 집속 초음파를 조사하였다. 저강도 집속 초음파는 출력강도 1.5W/cm2 의 시간 평균 최고 첨두 음향강도를 가지는 초음파로써 세포에 손상을 입히지 않는 범위에 있는 초음파를 사용하였다.
최초의 세포 시딩 후 18시간 내지 36시간 사이에 돌발 변조신호를 2분 간격으로 1회 이상 조사하였다. 이후 소니케이터 10% 내지 50%의 듀티싸이클로 분쇄하였다. 분리한 골수 유래 중간엽 줄기세포와 초음파 조사부의 간격은 2mm 간격으로 스페이싱(spacing)하였다.
펄스 집속 초음파를 조사한 줄기세포를 24시간 동안 인큐베이션 한 후 세포 이동성, 증식도 및 착생을 확인하였다.
시험예 1: MSC의 스크래치 분석에 의한 이동성 조사
스크래치 분석(scratch assay)은 인 비트로(in vitro)실험에서 세포이동을 측정하기에 잘 발달된 방법이다. 세포 단층에 니들(needle) 또는 팁(tip)으로 스크래치를 내어 정기적으로 화상을 촬영하고 세포의 이동속도를 정량화하는 것을 비교 포함한다. 스크래치 분석은 생체 내 상처 치유 동안 세포 이동, 모방세포 이동 및 기질(matrix)과 세포-세포 상호작용의 효과에 대한 연구에 특히 적합하다.
초음파를 조사하지 않은 대조군(before)과 일 실시예에 따라 초음파 조사한 실험군(after)을 비교 실험하였다.(도1 및 도2) 니들이나 팁으로 세포에 흠집을 낸 후 분석한 결과, 초음파 조사한 실험군 중 듀티사이클 10% 내지 50%로 분쇄한 그룹(after)의 세포사이의 간격이 대조군(before)에 비해 200픽셀 내지 250픽셀 정도 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 NIH에서 제공하는 Image J 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.
시험예 2: MSC의 증식 분석(proliferation assay)
증식도 분석(proliferation assay)은 세포의 생존율을 분석하기 위한 방법으로 티민 방법(thymine method) 및 테트라졸륨 염 방법(tetrazolium salt method)이 있다. 티민 방법은 세포 분열 S기에서 방사능을 띤 티민을 넣어주게 되어 포함량에 따라 세포의 증식여부를 판단한다. 티민 방법은 세포의 생존 및 증식을 높은 감도로 측정이 가능하고 다소 위험한 방사능 동위원소를 사용하지 않게 되는 이점이 있어 동물 실험 등 면역조직화학방법 등에 유용하게 쓰일 수 있다. 테트라졸륨 염 방법은 미토콘드리아의 전자전달계 과정 중 생존에 필요한 에너지를 생산하는 과정에서 전자전달계에 존재하는 탈수소 효소가 염을 분해하며 포르마잔(Formazan)이라는 발색물질을 생성하는 원리를 이용한다.
초음파 조사하지 않은 대조군(normal)과 처리한 그룹(10% 내지 50%)에서 증식분석을 한 결과(도 3), 평균적으로 3.2500 O. D 에 근접하여 수치상의 차이가 거의 없는 것으로 보아 펄스 집속 초음파(pulsed focused ultrasound)처리가 세포 죽음에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3: MSC의 착생 결과
케모카인은 친 염증성 분비 단백질인데, 이는 백혈구를 혈액으로부터 손상부위로 주도적으로 이동시킨다. 일반적으로, 케모카인은 손상부위에서 생성되고 백혈구 이동과 활성화를 유도하여 염증, 면역, 재생, 혈관생성과정에 중요한 역할을 수행한다. MCP는 귀소 케모카인(Homing chemokine)의 전형적인 모델로 귀소(Homing)과 생착(adhesion)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. MCP 단백질을 검출하기 위해서 RayBiotech 사에서 생산한 사이토카인 어레이(cytokine array)를 사용하였다. 줄기세포를 용해 시켜 세포 내단백질 및 외단백질을 얻은 후, 사이토카인 어레이에 도포하여 MCP단백질을 검출하였다. 도 4와 같이, 펄스 집속 초음파를 처리하지 않은 대조군(normal)과 처리한 그룹 중 50%그룹(50%)을 비교하였을 때, MCP-1 및 MCP-2가 50% 그룹에서 1.1배 내지 1.8배 높아지는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 줄기세포를 준비하는 단계; 및
    상기 줄기세포에 초음파를 줄기세포에 조사하는 단계를 포함하고,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)이며,
    상기 초음파는,
    저강도 펄스 집속 초음파(low intensity pulsed focused ultrasound)이고, 주파수가 20kHz 내지 50kHz이며, 출력 강도가 1W/cm2 내지 20W/cm2인 것을 특징으로 하고,
    상기 초음파 조사는,
    최초로 세포를 시드한 후(cell seeding) 18시간 내지 36시간 내에 이루어지고, 순돌발 조사시간(tone burst duration)이 1ms 내지 1000ms로 지속되며, 듀티사이클 10% 내지 50%이고, 돌발 변조신호(burst modulation)를 조사 전체시간이 2분 내지 10분 내로 되도록 하여 1회 이상 조사하여 이루어지며, 초음파 조사부와 상기 줄기세포와의 간격이 1mm내지 3mm인 것을 특징으로 하는,
    증가된 이동성 및 착생을 나타내고, MCP-1 및 MCP-2의 발현이 1.1배 내지 1.8배 증가된 줄기세포의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 줄기세포를 준비하는 단계; 및
    상기 줄기세포에 초음파를 줄기세포에 조사하는 단계를 포함하고,
    상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)이며,
    상기 초음파는,
    저강도 펄스 집속 초음파(low intensity pulsed focused ultrasound)이고, 주파수가 20kHz 내지 50kHz이며, 출력 강도가 1W/cm2 내지 20W/cm2인 것을 특징으로 하고,
    상기 초음파 조사는,
    최초로 세포를 시드한 후(cell seeding) 18시간 내지 36시간 내에 이루어지고, 순돌발 조사시간(tone burst duration)이 1ms 내지 1000ms로 지속되며, 듀티사이클 10% 내지 50%이고, 돌발 변조신호(burst modulation)를 조사 전체시간이 2분 내지 10분 내로 되도록 하여 1회 이상 조사하여 이루어지며, 초음파 조사부와 상기 줄기세포와의 간격이 1mm내지 3mm인 것을 특징으로 하는 제조방법으로 제조된,
    증가된 이동성 및 착생을 나타내고, MCP-1 및 MCP-2의 발현이 1.1배 내지 1.8배 증가된 줄기세포.
  10. 삭제
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