KR20150115657A

KR20150115657A - 고강도 전자기장을 이용하여 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20150115657A
Application number: KR1020150046741A
Authority: KR
Inventors: 서영권; 박정극; 윤희훈; 조현진; 박희정; 김유미; 유보영; 조상은; 김상헌
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2015-10-14
Also published as: US10167465B2; KR101743539B1; US20170152500A1

Abstract

본 발명은 100 내지 1500mT의 고강도, 0.01 내지 100Hz의 저주파수 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 처리하여, 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법이 적용된 의료기기에 관한 것이다. 본 발명에 따른 자기장을 이용한 신경세포 분화 방법 및 조성물은 저주파수의 고강도 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도함으로써, 짧은 시간의 전자기장 처리만으로 신경세포나 신경줄기세포를 용이하게 분화시킬 수 있다.

Description

고강도 전자기장을 이용하여 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법 {Method For Differentiation Of Adult Stem Cells Into Nerve Cells Using High Intensity Of Electromagnetic Field}

본 발명은 본 발명은 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 고강도의 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포에 처리하여, 해당 세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

전자기장(electromagnetic field)을 이용하여 줄기세포의 분화를 촉진시키는 다양한 연구들이 보고되고 있다. Fregni 등 (비특허문헌 1)은 다양한 전기 및 전자기장 자극이 척추 손상으로 인한 만성신경통의 통증을 완화시킴을 보고하였고, Ahmadian S 등(비특허문헌 2)은 쥐의 피부에 25 Hz 및 2 mT 하루에 2.5시간을 조사하였을때 피부의 콜라겐이 증가됨을 보고하였다.

또한 전자기장을 이용한 골 재생 관련 연구들도 보고되고 있다. Ceccarelli 등(비특허문헌 3)은 75Hz 및 2 mT의 전자기장으로 다양한 중간엽 줄기세포의 골 분화를 촉진시켰고, Sun 등은 15 Hz, 1.8 mT의 전자기장에서 골수유래 중간엽 줄기세포를 배양하여, 알카라이니포스파테이즈(ALP)와 골형성단백질(BMP-2) 등의 발현이 촉진되어 골세포로의 분화가 촉진됨을 보고하였고, Schwartz등은 15Hz, 1.6 mT의 전자기장으로 중간엽 줄기세포의 골분화를 촉진시켰다. 이러한 전자기장을 이용한 골분화 촉진 연구는 7.5∼15 Hz, 0.1∼5mT의 전자기장을 이용하였다 (비특허문헌 4).

최근에는 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 등의 신경질환치료에 줄기세포를 이용한 치료 방법이 부각됨에 따라 신경세포분화촉진을 위한 연구에 전기자극을 이용한 벙법들이 보고되고 있다. 기존에 알려진 신경치료 기술로는 뇌조직에 약 10 Hz이하의 저주파 에너지를 적용시키기 위한 장치로 환자의 뇌안에 전극을 이식후 직접 전기자극을 부여하여 전기흐름에 의한 자기장을 야기하는 장치 (특허문헌 1)가 있으며, Zheng은 중추신경계에 자기자극을 주는 방법으로 고주파 또는 복수의 주파수 성분을 조합하여 뇌기능 개선에 사용하려는 기술 (특허문헌 2)을 개발하였으며 Riken은 배아줄기세포에 전기펄스 처리하여 신경세포를 제조하는 기술 (특허문헌 3)을 개발하였다. Gliner 등은 세포에 전기펄스를 처리하여 신경세포를 제조하는 기술을 개발하였다 (특허문헌 4). 위의 기술들은 전극을 직접 이식하는 방식으로 전극을 이식하는 수술이 추가되어 환자에게 고통이 수반되며 배아줄기세포의 경우 종양형성의 가능성이 문제가 되어 임상에 적용하는 데 한계가 있다. 따라서 화학적 방법이 아닌 비침습적인 방법으로 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포를 신경세포로 분화시키는 새로운 기술이 필요한 실정이며, 이러한 필요에 따라 본 발명자들은 다양한 신경관련 질병을 치료하기 위한 세포치료제의 일환으로 중간엽 줄기세포 및 성체줄기세포에 대한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

[비특허문헌]

1. Fregni. et al., Cranial electrotherapy stimulation and transcranial pulsed current stimulation: A computer based high-resolution modeling study, NeuroImage, Volume 65, Pages 280-287, 15 January 2013.

2. Ahmadian S et al., Effects of extremely-low-frequency pulsed electromagnetic fields on collagen synthesis in rat skin, Biotechnol. Appl. Biochem. 2006, 43, 71-75.

3. Ceccarelli et al., A Comparative Analysis of the In Vitro Effects of Pulsed Electromagnetic Field Treatment on Osteogenic Differentiation of Two Different Mesenchymal Cell Lineages, BioResearch Open Access, 2013, 2(4): 283-294.

4. Schwartz Z, Simon BJ, Duran MA, Barabino G, Chaudhri R, Boyan BD. Pulsed electromagnetic fields enhance BMP-2 dependent osteoblastic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 2008; 26(9):1250-1255.

[특허문헌]

1. 미국공개특허 US20060205993

2. 일본공개특허 JP2008543388

3. 미국공개특허 US20070065941

4. 미국공개특허 US20050075679

본 발명의 목적은 고강도 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 처리하여, 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법이 적용된 의료기기를 제공하는 것이다.

본 발명은 100 내지 1500mT의 고강도 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 처리하여, 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “전자기장”은 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로 전자파와 같은 의미이며, 본 발명에서 사용된 전자기장은 펄스파 형태와 연속파(사인파) 형태를 모두 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “고강도”는 강도 10mT 이상의 전자기장 강도를 갖는 것을 말하며, 본 발명에서 바람직하게는 10 내지 1500mT, 100 내지 1500mT, 200 내지 1500mT, 300 내지 1500mT, 400 내지 1500mT, 가장 바람직하게는 500 내지 1500mT로 처리될 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 줄기세포의 신경세포 전환 효율이 떨어진다.

또한 본 발명의 전자기장은 0.01 내지 1000Hz, 바람직하게는 1 내지 100Hz의 주파수를 갖는 저주파수 전자파가 될 수 있으며 40 Hz 내지 80 Hz, 50 Hz 내지 80 Hz, 가장 바람직하게는 60 Hz 내지 80 Hz, 특히, 60 Hz 내지 75 Hz 일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 줄기세포의 신경세포 전환 효율이 떨어진다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “전자파”는 주기적으로 세기가 변화하는 전자기장이 공간 속으로 전파해 나가는 현상으로, 전자기파와 같은 의미이며, 저주파수 전자파는 주파수가 낮은 파를 말하는데, 보통 10kHz 이하를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서, 고강도, 저주파수 조건의 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 배양하였을 때, 신경세포 관련 단백질의 양이 증가한 것을 확인하였으며, 특히 45 Hz 내지 85 Hz 저주파수에서, 100 내지 1500 mT의 고강도 조건의 전자기장에서 배양한 성체줄기세포에서 신경관련 단백질의 발현이 가장 높게 증가한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 적용한 경우, 성체줄기세포가 신경세포로 분화됨을 알 수 있었다 (도 7).

본 발명의 전자기장은 1 내지 60분/일간 3 내지 20일간 처리될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 30분/일간 3 내지 15일, 가장 바람직하게는 15 내지 20분/일간 5 내지 15일 동안 처리될 수 있다.

상기 “줄기세포”란 미분화 세포로서 오랜 기간 동안 분열을 하고 자기 갱신(self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 기원되는 조직에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 나뉜다. 신경줄기세포(neural stem cell)는 배아줄기세포와 성체줄기세포의 중간단계로 분류될 수 있으며, 비교적 쉽게 신경세포 등 원하는 세포로의 분화 유도가 가능한 것으로 알려져 있다. 이에 비하여, 성체줄기세포는 배아줄기세포보다 부작용이 없는 것으로 알려져 있으나, 원하는 세포로의 분화 유도가 어려운 것으로 알려진 줄기세포이다.

상기 “성체줄기세포”는 중간엽 줄기세포도 포함하며, 성체줄기세포는 치주인대세포, 치수줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포, 제대유래 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 성체줄기세포 중 치주인대세포, 치수줄기세포 또는 신경전구세포를 특정 주파수와 고강도의 전자기장을 이용하여 배양함으로써 신경세포로 분화시킬 수 있다. 상기 성체줄기세포는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 제한없이 이용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, “신경세포”는 슈반세포(Schwann), 성상세포 (Astrocytes), 희소돌기아교세포(Oligodendrocytes), 신경(Neuron)을 모두 포함하며, 본 발명의 방법으로 분화된 신경세포는 성상세포 또는 희소돌기아교세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 고강도 및 저주파수의 전자기장을 처리한 성체줄기세포의 분화유도 효과를 관찰하기 위하여, MMP 1, Neuro D1, NF-L의 발현 정도를 면역화학적염색을 통해 확인하였다. 그 결과, 신경세포 지표인자인 Neuro D1, NF-L 단백질의 발현은 저강도 전자기장 비처리군에 비하여 본 발명의 고강도, 저주파수 전자기장 처리군에서 모두 증가하여 신경 재생이 가장 잘 진행됨을 확인할 수 있었다. 즉, 배양한 성체줄기세포에서 상기 신경 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 본 발명의 45 Hz 내지 75 Hz 의 저주파수, 100 내지 1500mT 고강도, 15 내지 20분/일 조건으로 처리한 전자기장이 성체줄기세포의 신경분화를 활발하게 유도함을 알 수 있었다(도 12, 도 13 및 도 14).

또한 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 손상된 신경 조직 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 통상의 방법에 따라 체내에 적합한 세포를 투여할 수 있으며, 상기 세포는 1회 또는 수회 투여에 의해 치료 효과를 극대화 할 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 상기 세포는 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다.

상기 손상된 신경 조직은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 및 말초신경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환, 바람직하게는 신경질환으로부터 유래된 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에서 신경세포의 기능을 회복함으로써 신경질환 치료용 조성물로 기능할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법이 적용된 의료기기를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 분화된 신경세포를 포함하는 의료기기를 제공한다. 상기 의료기기는 손상된 신경 조직을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 손상된 신경 조직은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 및 말초신경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환, 바람직하게는 신경질환으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에 대해 신경세포의 기능을 회복함으로써 의료기기의 일 구성으로 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 피검체에 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 주입하는 단계; 및 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 100 내지 1500mT의 전자기장을 처리하는 단계;를 포함하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐(마우스 또는 랫트), 토끼, 기니아 피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한 상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포는 피검체의 체내, 보다 바람직하게는 피검체의 뇌, 가장 바람직하게는 피검체의 손상된 신경조직으로 주입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 인체 중간엽 줄기세포를 렛트 뇌졸중 모델에 주입한 뒤 저강도의 전자기장(EMF)과 고강도의 전자기장(h-EMF)을 조사한 뒤 조직을 회수하여 웨스턴 블롯(western blot)을 실시한 결과, 신경 관련 단백질 MAP 2, Neuro D1의 발현이 증가되었으며, 이는 p-ERK와 p-CREB의 증가로 유발된 것임을 확인할 수 있었다. 면역 염색 결과 고강도 전자기장 조사군에서 MMP의 발현이 줄어들어 염증이 감소함을 확인하였고(도12), 저강도 전자기장 조사군(60 Hz, 1 mT, 60 분/일)보다 고강도 전자기장 조사군(60 Hz, 630 mT, 20분/일)에서 Neuro D1과 NF-L의 염색이 강하게 발현되어 신경재생이 더욱 활발히 진행되고 있음을 확인할 수 있었다.

아울러, 본 발명은 미분화된 중간엽 줄기세포 또는 분화된 신경세포를 체내에 주입한 뒤 환부에 고강도 전자기장을 하루 20분씩 조사함으로써 손상된 신경조직의 치료 효율을 극대화 할 수 있다.

또한 본 발명의 상기 방법에 적용되는 전자기장은 0.01 내지 1000Hz, 바람직하게는 1 내지 100Hz의 주파수를 갖는 저주파수 전자파가 될 수 있으며 가장 바람직하게는 45 Hz 내지 75 Hz 일 수 있다. 상기 범위를 벗어나는 경우, 줄기세포의 신경세포 전환 효율이 떨어진다. 본 발명의 전자기장은 1 내지 60분/일간 3 내지 20일간 처리될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 30분/일간 3 내지 15일, 가장 바람직하게는 15 내지 20분/일간 5 내지 15일 동안 처리될 수 있다. 상기 신경세포는 성상세포 또는 희소돌기아교세포일 수 있으며, “성체줄기세포”는 중간엽 줄기세포도 포함하며, 성체줄기세포는 치주인대세포, 치수줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포, 제대유래 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 성체줄기세포 중 치주인대세포, 치수줄기세포 또는 신경전구세포를 특정 주파수와 고강도의 전자기장을 이용하여 배양함으로써 신경세포로 분화시킬 수 있다. 상기 성체줄기세포는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 제한없이 이용할 수 있다. 또한 상기 신경세포는 슈반세포(Schwann), 성상세포 (Astrocytes), 희소돌기아교세포(Oligodendrocytes), 신경(Neuron)을 모두 포함하며, 본 발명의 방법으로 분화된 신경세포는 성상세포 또는 희소돌기아교세포를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법이 적용된 의료기기를 제공한다. 상기 의료기기는 손상된 신경 조직을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 손상된 신경 조직은 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상 및 말초신경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환, 바람직하게는 신경질환으로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 분화된 신경세포 또는 신경줄기세포는 신경질환에 대해 신경세포의 기능을 회복함으로써 의료기기의 일 구성으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 자기장을 이용한 줄기세포 분화 방법 및 조성물은 저주파수의 고강도 전자기장을 이용하여 성체줄기세포를 신경세포로 분화 유도함으로써, 짧은 시간의 전자기장 처리만으로 신경세포나 신경줄기세포를 용이하게 분화시킬 수 있다. 또한 상기 방법으로 분화된 줄기세포를 알츠하이머병, 우울증, 파킨슨병, 뇌경색, 뇌출혈, 척수손상, 그리고 말초신경 손상 등의 신경질환치료에 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 신경전구세포를 이용하여 고강도 전자기장 조사한 후 세포형태 결과를 나타낸 것이다 (contol: 비조사군, 60 Hz, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 신경전구세포의 생존도를 확인한 결과이다 (contol: 비조사군, 60 Hz, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 신경분화 관련 mRNA의 발현 견과를 나타낸 것이다 (CTL: 비조사군, 60 Hz, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 전기생리학적 신호에 관련하는 클로라이드 채널(chloride channel) 관련 인자 CLC2, CLC7의 mRNA 발현 결과를 나타낸 것이다 (CTL: 비조사군, 60 Hz, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 성체줄기세포의 신경분화유도에 대한 조건의 실험으로서, 생체 외에서 고강도 전자기장 처리 후 신경분화 유도 후 세포의 형태학적 변화 관찰을 확인한 결과이다. Cont-는 증식배지 사용, Cont+, 30 Hz, 45 Hz, 50 Hz, 60 Hz, 70 Hz는 신경분화 유도배지를 사용하였다. 고강도 전자기장 강도는 30 Hz(1120 mT), 45 HZ(890 mT), 50 Hz(680 mT), 60 Hz(630 mT), 70 Hz(570 mT)로 하였다 (Cont-: 비조사군 증식배지, Cont+: 비조사군 분화배지, 30, 45, 50, 60, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장 처리 후 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 락테이트 디하이드로제네이즈(lactate dehydrogenase)가 분비되는 것을 LDH assay로 확인한 결과이다 (C-:비조사군 증식배지, C+: 비조사군 분화배지, 30, 45, 50, 60 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장 처리 후 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 신경관련 단백질 발현 비교결과를 나타낸 것이다 (C-: 비조사군 증식배지, C+: 비조사군 분화배지, 30, 45, 50, 60, 75 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물 효능 평가를 위해 고강도 전자기장 처리 후 세포의 생존도 결과를 나타낸 결과이다 (Control: 비조사군, 60 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 소동물 랫트를 이용하여 뇌졸중 동물모델을 만드는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리 후 헤마톡실린&이오신(Hematoxylin & Eosin) 염색 결과를 나타낸 것이다 (Control: 대조군, Cell: 성체줄기세포 투여군, Cell+EMF: 성체줄기세포 투여 및 저강도 전자기장 조사군, Cell+h-EMF: 성체줄기세포 투여 및 고강도 전자기장 조사군).
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리 후 신경관련 단백질 발현 비교결과를 나타낸 것이다 (Control: 대조군, Cell: 성체줄기세포 투여군, Cell+EMF: 성체줄기세포 투여 및 저강도 전자기장 조사군, Cell+h-EMF: 성체줄기세포 투여 및 고강도 전자기장 조사군).
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리 후 신경세포 관련 인자 MMP 1의 발현 결과를 나타낸 것이다 (Control: 대조군, Cell: 성체줄기세포 투여군, Cell+EMF: 성체줄기세포 투여 및 저강도 전자기장 조사군, Cell+h-EMF: 성체줄기세포 투여 및 고강도 전자기장 조사군).
도 13 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리 후 신경세포 관련 인자 Neuro D1의 발현 결과를 나타낸 것이다 (Control: 대조군, Cell: 성체줄기세포 투여군, Cell+EMF: 성체줄기세포 투여 및 저강도 전자기장 조사군, Cell+h-EMF: 성체줄기세포 투여 및 고강도 전자기장 조사군).
도 14은 본 발명의 일 실시예에 따라 소동물 뇌졸중 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리 후 신경세포 관련 인자 NF-L의 발현 결과를 나타낸 것이다 (Control: 대조군, Cell: 성체줄기세포 투여군, Cell+EMF: 성체줄기세포 투여 및 저강도 전자기장 조사군, Cell+h-EMF: 성체줄기세포 투여 및 고강도 전자기장 조사군).
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 FACS (Fluorescence activated cell sorter) 결과를 나타낸 것이다 (C-: 비조사군 증식배지, C+: 비조사군 분화배지, 50, 60, 75, 85 Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 신경관련 mRNA 발현 비교결과를 나타낸 것이다. (C-: 비조사군 증식배지, C+: 비조사군 분화배지, 50, 60, 75, 85 Hz: 고강도 전자기장 주파수)
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 고강도 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경분화 유도 후 신경관련 단백질 발현 비교결과를 나타낸 것이다. (C-: 비조사군 증식배지, C+: 비조사군 분화배지, 50, 60, 75, 85 Hz: 고강도 전자기장 주파수)
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 고강도 전자기장을 조사한 뒤 골수유래 중간엽 줄기세포의 형태학적 변화를 관찰한 사진이다 (100배, Cont- : 비조사군 증식배지, Cont+: 비조사군 분화배지 50 Hz, 60 Hz, 75 Hz, 85Hz: 고강도 전자기장 주파수).
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 신경분화 관련 인자인 Neurofilament를 형광염색하여 관찰한 결과이다.(CTL: 비조사군, 50 Hz, 60 Hz, 75 Hz, 85Hz: 고강도 전자기장 주파수)
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 신경분화 관련 인자인 NeuroD1(도 20a) 과 MAP2(도 20b)의 발현을 면역염색을 통해 비교한 결과이다.(Cont (-) : 비조사군 증식배지, Cont (+): 비조사군 분화배지, 50 Hz, 60 Hz, 75 Hz, 85Hz: 고강도 전자기장 주파수)
도 21a, 21b는 본 발명의 실시예에 따른 고강도 전자기장 조사 후 신경분화 관련 인자인 NeuroD1, MAP2, DCX, Nestin, NFL의 mRNA발현과 이온채널 관련 인자인 Ion channel 1I, 1E, 1G의 mRNA발현을 비교한 결과이다.(Cont- : 비조사군 증식배지, Cont+: 비조사군 분화배지, 30 Hz, 45 Hz, 50 Hz, 60Hz, 75Hz: 고강도 전자기장 주파수)
도 22는 본 발명의 실시예에 따라 뇌졸중 마우스 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장을 처리한 실험군의 운동회복력(로타로드)을 평가한 것이다.(도 22c: control, 비처치군; 도 22b: cell, 세포이식군; 도 22a: cell+TMS, 세포이식 후 고강도 전자기장 조사군)
도 23a, 23b는 본 발명의 실시예에 따라 뇌졸중 마우스 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장을 처리한 후 신경관련 단백질의 발현 비교결과를 나타낸 것이다.(Cont: 비처치군, cell: 세포이식군, cell+TMS: 세포이식 후 고강도 전자기장 조사군)
도 24는 본 발명의 실시예에 따라 뇌졸중 마우스 모델을 제작한 뒤 성체줄기세포를 주입하여 고강도 전자기장 처리한 후 생검하여 헤마톡실린&이오신(Hematoxylin & Eosin), 프러시안 블루(prussian blue), NF200, NeuroD1 염색 결과를 나타낸 것이다.(sham: 비처치군, cell: 세포이식군, cell+TMS: 세포이식 후 고강도 전자기장 조사군)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 손상된 신경재생을 위한 시스템으로서, 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포의 신경관련 세포로의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로 체외에서 물리적 자극을 통하여 신경유사 세포로의 분화를 촉진시키거나, 체내에서 주입된 줄기세포와 함께 손상된 신경의 재생을 촉진시키는 시스템이다. 보다 구체적으로는, 특정 저주파수의 고강도 전자기장에 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 노출시켜 신경유사 세포로의 분화를 촉진시키거나, 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포를 체내에 주입한 뒤 저주파수의 고강도 전자기장에 노출시킴으로써 손상된 신경조직의 회복을 촉진하는 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 짧은 시간에 고강도 전자기장을 적용함으로서 기존 전자기장의 분화 효율을 향상 시킬 수 있는 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 상기 전자기장은 특정 주파수로 중간엽 줄기세포 또는 성체줄기세포에 처리하였을 때만 신경세포로 분화될 수 있으며, 본 발명자들은 본 발명을 통해 체외에서 고강도 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 신경분화유도기술을 확보하였다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 도 1에 나타난 바와 같이 고강도 전자기장에 하루 20분씩, 5일간 조사한 경우 SH-SY5Y 신경전구세포는 60과 75Hz에서 수상돌기(dendrite)의 길이가 증가 되어 분화가 향상됨을 확인하였고, 이때 세포의 생존도를 분석한 결과 세포의 생존도에 크게 여향을 주지 않았다(도2). 도 3은 신경관련 뉴로 필라멘트(Neuro filament, NF)와 타우(Tau) mRNA발현을 분석한 결과이며, 전자기장 비조사군에 비해 발현이 증가됨을 확인하였고(도3), 도 4는 이러한 고강도 전자기장이 클로라이드 채널(chloride channel, CLC)을 활성화시킴으로서 분화가 촉진된 것을 보여주는 결과이다.

본 발명의 일 실시예에 따라 8일간의 고강도 저주파 전자기파에 의한 중간엽 줄기세포의 신견분화유도 후 현미경 관찰결과 (도 5), 다양한 주파수에 대하여도 세포사등은 관찰되지 않았으며, 도 6과 같이 LDH분석 결과 세포막 손상도 유발되지 않았다. 한편 중간엽 줄기세포를 30, 45, 50, 60, 70Hz의 고강도 전자기장에 노출시킨 경우60 Hz에서 중간엽 줄기세포의 신경분화 유도가 향상되는 것을, 신경 관련 단백질 MAP2, Tau, NF-L의 발현 증가를 통해 확인 할 수 있었다(도 7).

또한 본 발명의 일 실시예에서는 인체 중간엽 줄기세포를 렛트 뇌졸중 모델에 주입한 뒤 저강도의 전자기장(EMF)과 고강도의 전자기장(h-EMF)을 조사한 뒤 조직을 회수하여 웨스턴 블롯(western blot)을 실시한 결과, 신경 관련 단백질 MAP 2, Neuro D1의 발현이 증가되었으며, 이는 p-ERK와 p-CREB의 증가로 유발된 것임을 확인할 수 있었다. 면역 염색 결과 고강도 전자기장 조사군에서 MMP의 발현이 줄어들어 염증이 감소함을 확인하였고(도 12), 도 13과 도14에서 저강도 전자기장 조사군(60 Hz, 1 mT, 60 분/일)보다 고강도 전자기장 조사군(60 Hz, 630 mT, 20분/일)에서 Neuro D1과 NF-L의 염색이 강하게 발현되어 신경재생이 더욱 활발히 진행되고 있음을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신경세포주를 이용한 고강도 전자기장의 신경세포 분화 효과

실시예 1.1 신경세포주의 배양

SH-SY5Y 신경전구세포주(세포번호 CRL-2266)를 ATCC 사에서 구입하여 DMEM 배지에 5%(v/v) FBS와 5 uM Retinoic acid를 넣은 배지로 배양하였다. 배양접시에 접종한 후 3일마다 배지를 교환해 주면서 37°C로 유지되는 CO₂배양기에서 배양 하였다.

실시예 1.2 고강도 전자기장을 이용한 신경전구세포주의 분화 확인

상기 배양한 신경전구세포를 12-well plate에 2×104 세포/well 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37°C 의 CO₂배양기에서 5일간 배양하였다.

고강도 전자기장 처리는 배양기간 동안 하루에 15분씩 2회 조사하였고 조사 방법은 고강도 전자기장 위에 배양접시를 위에 놓고 조사하였다. 각각 0 Hz(비조사군), 60 Hz(630 mT), 75 Hz(570 mT) 주파수의 전자기장에서 신경전구세포를 5일간 배양하였고, DMEM 배지에 5%(v/v) FBS와 5 uM Retinoic acid를 넣은 배지로 배양하였다. 배양 후 신경전구세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 신경전구세포주는 조사군에 비조사군에 비해 수상돌기(dendrite)들이 길어지는 경향을 나타내었다.

또한, 도 2는 고강도 전자기장 조사 후 신경세포의 생존도 평가를 위해 세포 수 관찰 결과이다. 비조사군과 비교하였을 때 60 Hz(630 mT), 75 Hz(570 mT) 조사군 모두 세포 생존도에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

또한, 도 3은 고강도 전자기장 조사 후 신경분화 관련 mRNA의 발현을 관찰한 결과이다. NF-L과 Tau의 발현이 비조사군에 비하여 60 Hz, 75 Hz에서 증가한 것이 관찰되었다.

또한, 도 4는 고강도 전자기장 조사 후 전기생리학적 신호에 관여하는 chloride channel 관련 인자 CLC2, CLC7의 mRNA 발현을 비교한 결과이다. 그 결과, 60 Hz, 75 Hz에서 CLC2, CLC7의 발현이 강하게 나타났다.

실시예 2. 고강도 전자기장을 이용한 성체줄기세포의 배양

실시예 2.1 성체줄기세포의 일차 배양

Lonza(Wailersville, MD)에서 계대수 2의 인간 성체 줄기세포를 구입하여 NH 배지에 넣고 800rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 원심분리로 얻어진 상등액은 버리고, 남은 세포를 다시 NH 배지 10ml가 들어있는 100mm배양접시에 접종한 후 3일마다 배지를 교환해 주면서 37°C로 유지되는 CO₂배양기에서 배양 하였다.

실시예 2.2 고강도 전자기장을 이용하여 배양된 상체줄기세포의 신경세포로의 분화 확인

일차 배양 후, 배지를 제거하고 PBS (Phosphate Buffered Saline) 10ml을 사용하여 1회 이상 세척하였다. 세척된 세포에 0.05%(w/v) 트립신 및 0.01%(w/v) EDTA함유 용액 1ml을 첨가하고 37°C에서 5분간 처리하여, 세포를 배양접시 바닥에 떨어뜨려 용액 중에 부유시켰다. 세포 용액을 10%(v/v) FBS 함유 NH 배지 15ml에 혼합한 후, 800rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 CO₂배양기에서 계대수 5까지 배양하였다.

배양한 세포를 DMEM 배지 60mm 배양 접시에 0.25×105세포/배양접시 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37°C 의 CO₂배양기에서 8일간 배양하였다. 이때 실험군은 고강도 전자기장을 조사하였다.

고강도 전자기장 처리는 배양기간 동안 하루에 20분씩 1회 조사하였고 조사할 경우 고강도 전자기장 위에 상기 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 0 Hz(비조사군), 30 Hz(1120 mT), 45 HZ(890 mT), 50 Hz(680 mT), 60 Hz(630 mT), 70 Hz(570 mT) 주파수의 전자기장에서 세포를 7일간 배양하였다. 배양은 5% FBS, 10 ng/ml EGF, 10uM Forskolin을 넣은 DMEM 배지에서 수행하였다. 배양 후 0 Hz(비조사군), 30 Hz(1120 mT), 45 HZ(890 mT), 50 Hz(680 mT), 60 Hz(630 mT), 70 Hz(570 mT)에서 성체줄기세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 전자기장을 이용하여 배양한 성제줄기세포는 액포형성 또는 세포막 붕괴와 같은 세포사 관련 형태가 관찰되지 않아 본 연구의 주파수 및 강도가 세포에 독성을 유발하지 않음을 확인할 수 있었다.

또한, 고강도 전자기장 세포의 독성을 평가하기 위해 LDH assay를 시행하였고 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타내 바와 같이, LDH assay는 세포가 stress를 받거나 세포막에 손상이 있을 때 lactate dehydrogenase가 분비되는 것을 분석함으로서, 세포의 stress 상태를 평가하는 분석 방법이다. 모든 조건에서 흡강도 값이 고강도 전자기장 비조사군과 큰 차이 없이 비슷하므로 고강도 전자기장이 세포의 stress 유발 또는 세포막 손상은 유발하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 배양 후 세포를 각각 회수하여 Tau, MAP 2, Neuro D1의 신경세포 관련 단백질 발현 양을 분석하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 고강도 전자기장을 이용하여 배양한 성체줄기세포에서 신경세포 관련 단백질의 양이 증가하였으며, 특히 60Hz(630 mT)주파수의 전자기장에서 배양한 성체줄기세포에서 신경관련 단백질의 발현이 가장 높게 증가하였다. 따라서, 성체줄기세포가 신경세포로 분화됨을 알 수 있었다.

또한, 동물 효능평가를 위해 체외에서 60 Hz에서의 성체줄기세포 생존도를 분석한 결과 (도 8) 세포 생존도에는 영행을 주지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 소동물 뇌졸중 모델을 이용한 고강도 전자기장 효능 평가

실시예3 .1 소동물 뇌졸중 모델 제작

뇌졸중 동물모델 제작을 위해 3주령(45~50 g) SD 랫트(rat)를 사용하였고, 마취제는 졸레틸(ZoletilTM, 250 mg/5 cc, Virbac) 0.1cc/100g(50mg/kg)과 럼푼(Rompun 2%, Bayer) 0.025~0.04/100g(5~10mg/kg)을 섞어 복강투여로 마취하였다. 뇌졸중 모델 제작 방법은 광화학적 방법을 이용하였으며 다음과 같다. 전신적 광활성 염색물질 Rose Bengal(10 mg/ml) 300 ㎕를 투여하고 두개골을 통해 광선줄기(Light beam)로 빛을 투사하여(irradiation) 뇌졸중을 유발하였다. 도 9는 광화학적 방법으로 뇌졸중 모델을 제작하는 사진이다.

실시예 3.2 소동물 모델을 이용한 고강도 전자기장의 뇌졸중 치료 효과

고강도 전자기장 효과를 평가하기 위해 실험군을 네가지로 분류하였다. 첫째, 뇌졸중 모델에 생리식염수(100 ㎕) 투여군(대조군), 둘째, 뇌졸중 모델에 성체줄기세포 투여군(세포 수: 1 × 106개), 셋째, 뇌졸중 모델에 성체줄기세포 투여 후 저강도 전자기장 처리군(60 Hz, 1 mT, 60 분/일), 넷째, 뇌졸중 모델에 성체줄기세포 투여 후 고강도 전자기장 처리군(60 Hz, 630 mT, 20분/일)으로 분류하였다.

성체줄기세포 주입 방법은 다음과 같이 실시하였다:

뇌졸중 모델 제작 후 24시간 후에 뇌졸 중 모델의 Tail vein(꼬리정맥)으로 세포를 투여하였다. 세포 농도는 1 x 106 cells을 생리식염수 500 ul 에 넣어서 2분 동안 천천히 주입하였다. 전자기장은 뇌졸중 모델의 뇌(Brain)가 위치한 두개골 위쪽에서 처리하였으며, 전자기장 처리기간은 세포투여 24시간 후부터 14일 동안 매일 20분간 처리하였다.

14일 후 랫트를 안락사 시키고 뇌경색 부위의 조직을 채취하여 웨스턴 블롯(Western Blot), 헤마톡실린&이오신(Hematoxylin & Eosin) 염색 및 면역화학적 검사를 시행하였다.

도 10은 Hematoxylin & Eosin 염색 결과이다. 비조사군은 손상된 부위가(눈금) 비어 있으며, H/E 염색 결과 손상된 뇌 조직 부위가 관찰되었으며, 전자기장 조사군에서 뇌졸중 처리 부분의 조직이 재생된 것을 확인하였다. 실험군간에는 형태학적인 큰 차이를 보이지 않았다.

또한, 도 11은 전자기장 주파수에 따른 성체줄기세포의 신경분화 관련 단백질 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이다. 고강도 전자기장 처리군에서 신경 관련 p-ERK, p-CREB, MAP 2, Neuro D1의 발현이 강하게 발현되었다.

또한, 고강도, 저주파수 전자기장 처리에 따른 성체줄기세포의 분화유도 효과를 비교하기 위하여, MMP 1, Neuro D1, NF-L의 발현 정도를 면역화학적염색을 통해 확인한 결과를 도 12, 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 12, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, Neuro D1, NF-L 단백질의 발현은 저강도 전자기장 비처리군에 비하여 고강도 전자기장 처리군에서 모두 증가하였다. MMP-1은 h-EMF 조사군에서 현저히 감소되었으며, Neuro D1, NF-L은 h-EMF 조사군에서 강하게 염색되어 신경 재생이 가장 잘 진행됨을 관찰할 수 있었다. 즉, 배양한 성체줄기세포에서 상기 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 60 Hz 주파수, 630 mT 고강도, 20분/일 동안 처리한 전자기장이 성체줄기세포의 신경분화를 활발하게 유도함을 알 수 있었다.

실시예 4. 고강도 전자기장의 다양한 주파수에 따른 세포 분화 효율 평가

실시예 4.1 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 배양

Lonza(Wailersville, MD)에서 계대수 2의 인간 골수 유래 중간엽줄기세포를 구입하여 NH 배지에 넣고 800rpm으로 5분간 원심분리 하였다. 원심분리로 얻어진 상등액은 버리고, 남은 세포를 다시 NH 배지 10ml가 들어있는 100mm배양접시에 접종한 후 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃로 유지되는 CO₂배양기에서 배양 하였다.

실시예 4.2 다양한 주파수에 따른 고강도 전자기장의 중간엽 줄기세포 분화능 평가

일차 배양 후, 배지를 제거하고 PBS (Phosphate Buffered Saline) 10ml을 사용하여 1회 이상 세척하였다. 세척된 세포에 0.05%(w/v) 트립신 및 0.01%(w/v) EDTA함유 용액 1ml을 첨가하고 37℃에서 5분간 처리하여, 세포를 배양접시 바닥에 떨어뜨려 용액 중에 부유시켰다. 세포 용액을 10%(v/v) FBS 함유 NH 배지 15ml에 혼합한 후, 800rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액은 버리고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 CO₂배양기에서 계대수 5까지 배양하였다.

배양한 세포를 DMEM 배지 60mm 배양 접시에 0.2510⁵세포/배양접시 농도로 접종하고 3일마다 배지를 교환해 주면서 37℃ 의 CO₂배양기에서 8일간 배양하였다. 이때 실험군은 전자기장을 조사하였다.

고강도 전자기장 처리는 배양기간 동안 하루에 20분씩 1회 조사하였고 조사할 경우 고강도 전자기장 위에 상기 60mm 배양접시를 위치시킨 후, 각각 0 Hz(비조사군), 50Hz, 60Hz, 75Hz, 85Hz 주파수의 전자기장에서 세포를 7일간 배양하였다. 배양은 5% FBS, 10 ng/ml EGF, 10uM Forskolin을 넣은 DMEM 배지에서 수행하였다. 배양 후 0 Hz(비조사군), 50Hz, 60Hz, 75Hz, 85Hz에서 신경분화 효율을 확인하기 위한 FACS분석 결과를 도 15에 나타내었다.

각 실험군에서 배양한 세포를 회수하여 FACS분석 한 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 60Hz와 75Hz에서 CD105와 CD73의 발현이 줄어든 것으로 보아 중간엽 줄기세포가 분화 되었음을 확인하였다.

배양 후 세포를 각각 회수하여 Neuro D1, Map2, Tau, MBP, DCX, NF-L 의 신경세포 관련 mRNA 발현 양을 분석하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 고강도 전자기장을 이용하여 배양한 인간 중간엽 줄기세포에서 신경세포 관련 단백질의 양이 증가하였으며, 특히 60Hz, 75Hz, 80Hz 주파수의 전자기장에서 배양한 중간엽 줄기세포에서 신경관련 mRNA 발현이 가장 높게 증가하였다.

신경 관련 단백질의 발현양을 비교하기 위해 배양 후 세포를 회수하여 Western blotting 한 결과를 도 17에 나타내었다. 60 Hz와 75Hz의 전자기장에서 배양한 중간엽 줄기세포의 신경 관련 단백질인 Neuro D1, Tau, Map2의 발현이 가장 높게 증가하였다.

고강도 전자기장에서 중간엽 줄기세포를 각각 50, 60, 75, 85 Hz에서 배양 후 골수유래 세포의 형태학적 변화를 확인하기 위해 광학현미경을 이용하여 관찰한 결과를 도 18 에 나타내었다.

실시예 5. 뇌졸중 마우스 모델을 이용한 고강도 전자기장 효능 평가

실시예 5.1 뇌졸중 마우스 모델에 대한 고강도 전자기장 영향평가

뇌졸중 동물모델 제작을 위해 6주령(20-22g) C57BL/6N 마우스(mouse)를 사용하였고, 마취제는 졸레틸(Zoletil, 250 mg/5 cc, Virbac) 0.1cc/100g(50mg/kg)과 럼푼(Rompun 2%, Bayer) 0.025~0.04/100g(5~10mg/kg)을 섞어 복강투여로 마취하였다. 뇌졸중 모델 제작 방법은 광화학적 방법을 이용하였으며 다음과 같다. 전신적 광활성 염색물질 Rose Bengal(10 mg/ml) 100 를 투여하고 두개골을 통해 광선줄기(Light beam, KL 1500 LCD(SCHOTT), 532nm 파장)로 빛을 15분간 투사하여(irradiation) 뇌졸중을 유발하였다.

실험을 위한 마우스 선정을 위해 뇌졸중 모델 제작 전 1주일간 전체 마우스에 대하여 로타로드(20 rpm)를 실시하여, 운동력이 80초 이상의 마우스를 사용하였다. 뇌졸중 형성 3일 후 다시 로타로드를 실시하여 40초 이하에서 로타로드에서 떨어지는 마우스만을 선별하여 실험에 이용하였다.

마우스 뇌졸중 모델을 이용한 고강도 전자기장의 신경재생 효능을 평가하기 위해 실험군을 세 가지로 분류하였다. 첫째, 뇌졸중 모델에 생리식염수 투여군(음성대조군), 둘째, 뇌졸중 모델에 성체줄기세포 투여군 (세포 수: 110⁵, 대조군), 셋째, 뇌졸중 모델에 성체줄기세포를 투여 후 고강도 전자기장 조사군 (60Hz, 500mT, 15 분/일)으로 분류하였다.

고강도 전자기장 조사 방법은 다음과 같았다. 마우스를 50cc 시린지 안에 넣어 고정시킨 뒤 고강도 전자기장 코일 위에 두부가 안쪽으로 가도록 위치시켜 조사하였다. 고강도 전자기장 조사는 2주간 실시하였다.

실시예 5.2 뇌졸중 마우스의 운동회복력 평가

상기 실시예 5.1의 뇌졸중 마우스의 운동회복력을 평가하기 위해 로타로드를 실시하였다.

도 22a~c는 뇌졸중 마우스에 비처치군(음성대조군, control), 세포이식군(대조군, cell), 세포이식 후 고강도 전자기장 조사군(cell + TMS)의 2주간 운동회복력을 평가한 결과이다. 비처치군에 비해 대조군과 고강도 전자기장 조사군에서 운동회복능력이 증가하였고, 특히 고강도 전자기장 조사 10일 이후부터 빠른 회복 능력을 관찰할 수 있었다.

실시예 5.3 뇌졸중 마우스 모델에 고강도 전자기장 조사 후 조직검사 및 단백질 분석

2주 후 실시예 5.1의 마우스를 안락사시키고 뇌졸중 부위의 조직을 채취하여, 헤마톡실린&이오신(Hematoxylin & Eosin) 염색 및 면역화학적검사를 시행하였다.

도 24는 뇌졸중 마우스에 비처치군(음성대조군), 세포이식군(대조군), 세포이식 후 고강도전자기장 조사군을 생검하여 HE염색, prussian blue, NF200, NeuroD1 염색 결과를 나타낸 것이다. 비처치군은 뇌졸중 부위의 괴사된 부위가 탈락하여 홀이 형성되었다(HE염색). prussian blue로 주입된 세포의 이동을 확인한 결과 뇌졸중 병변 부위에 푸르게 염색된 나노자성입자가 관찰되어, 세포가 이동해 왔음을 관찰할 수 있었다(prussian blue). 뇌졸중 병변 부위의 조직재생을 관찰하기 위해 NF200단백질을 분석한 결과 세포이식 후 고강도전자기장을 조사한 실험군에서 가장 진한 갈색 염색이 관찰되어 조직 재생이 활발히 진행되고 있음을 관찰할 수 있었다(NF200). NeuroD1 발현은 음성대조군에서 가장 약하게 발현되고 있으며 세포이식군(대조군), 세포이식 후 고강도전자기장 조사군에서 발현이 증가하였다.

도 23a,23b는 뇌졸중 마우스에 비처치군(음성대조군), 세포이식군(대조군), 세포이식 후 고강도전자기장 조사군을 생검하여 조직으로부터 단백질을 분리한 뒤 웨스턴(western) 분석한 결과이다. 뇌졸중 형성 후 세포를 주입한 뒤 고강도 전자기장을 조사한 결과 NFL와 NeuroD1, Nestin의 발현이 증가하였다. 즉, 뇌졸중 동물모델에서 상기 신경 단백질이 가장 강하게 발현됨에 따라, 1일 1회 15분씩 고강도의 전자기장(60Hz, 500mT)을 처리하였을 때 손상된 신경재생을 활발하게 촉진함을 알 수 있었다.

Claims

100 내지 1500mT의 전자기장을 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 처리하여, 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 1항에 있어서,
상기 전자기장은 0.01 내지 100Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서,
상기 전자기장은 5 내지 30분/일간 3 내지 15일 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서,
상기 신경세포는 성상세포 또는 희소돌기아교세포인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래 또는 제대유래인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서,
상기 성체 줄기세포는 치수줄기세포 또는 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법이 적용된 의료기기.

피검체에 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 주입하는 단계; 및
상기 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 100 내지 1500mT의 전자기장을 처리하는 단계;
를 포함하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항에 있어서,
상기 전자기장은 0.01 내지 100Hz의 주파수로 처리되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항에 있어서,
상기 전자기장은 5 내지 30분/일간 3 내지 15일 동안 처리되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항에 있어서,
상기 신경세포는 성상세포 또는 희소돌기아교세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 골수유래, 지방유래 또는 제대유래인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항에 있어서,
상기 성체 줄기세포는 치수줄기세포 또는 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법.

제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 방법이 적용된 의료기기.