KR102616453B1 - 성체줄기세포의 호밍 효과 증진방법 및 이로부터 호밍 효과가 증진된 세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저강도 초음파 처리에 의한 성체줄기세포의 호밍 효과 증진방법 및 이로부터 호밍능이 향상된 대상 세포에 관련된 것으로서, 줄기세포에 저강도 초음파 자극을 가하는 경우 SDF-1의 분비량이 증가되어 농도구배(gradient)를 형성함을 발견함에 기반한 것이다. 이러한 경우, SDF-1/CXCR4 신호전달기전을 활성화시켜 초음파에 노출된 조직부위로 CXCR4 수용체가 발현된 세포들이 이동하여 노화된 피부조직 등 몸의 여러 부분을 정상적으로 회복시킬 수 있게 된다. 본 기술은 자가세포를 이용한 줄기세포 기반 세포치료 용도로서 광범위하게 적용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 저강도 초음파 처리에 의한 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법 및 이로부터 호밍능이 향상된 성체줄기세포에 관련된 것이다.
성체줄기세포(mesenchymal stem cells)는 여러종류의 신체조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화세포로 골수, 지방조직, 탯줄, 탯줄혈액, 말초혈액, 태반융모 및 모공주변의 팽창 영역(bulge area) 등 다양한 부위에 분포되어 있다. 이들은 배아줄기세포에 비해 윤리적인 문제가 적고 사용자 본인의 성체줄기세포를 직접 이용할 수 있으며, 면역거부반응 문제가 없어 최근에 난치병치료에 널리 이용되고 있다. 줄기세포를 이용한 세포치료는 심근경색처럼 질병이 유발된 조직부위에 세포를 직접 이식함으로써 질병의 치료를 가능하게 할 수 있으나, 조직이식후 손상된 타겟조직으로 줄기세포가 정확하게 이동되어 질병부위의 세포손상 또는 염증현상을 극복하고 장기간 생착상태를 유지하며 치료효과를 나타내는 등 여러가지 극복해야할 점들이 있어 이에 대한 더 많은 연구가 진행중이다.
줄기세포의 치료효과를 높이기 위해서는 먼저 줄기세포의 이동 및 생착율을 높이기 위하여 줄기세포의 세포배양 환경을 조절하는 방법이 있는데 이는 세포를 저산소환경(hypoxic environment)에서 배양하여 세포치료에 이용하는 방식이 그 예이다. 그러나, 저산소환경에서 세포를 키우면 줄기세포가 쉽게 변성되고 세포배양 중 많은 세포가 사멸에 이르는 등 상용화를 위한 기술적용이 쉽지 않다. 또한 니코틴아마이드 등을 전처리한 줄기세포를 이용하여 생착율을 높이는 방법도 있으나 니코틴아마이드는 세포배양 처리시 비용이 많이 들고 세포의 민감도가 높아져 세포배양이 쉽지 않다는 또다른 문제점이 있다.
이로 인해, 최근에는 반복적이고 안정적인 줄기세포 치료효과를 나타낼 수 있는 물리적 또는 기계적인 자극을 이용하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 여기서 이용되는 자극 중에는 스트레치(stretch), 전기자극 또는 초음파자극 등이 있다. 특히 줄기세포에 초음파자극을 주면 줄기세포가 연골세포 또는 뼈세포로 분화가 촉진되는 효과가 있어 이 기술은 실제 임상에서 골절치료에 이용하고 있다. 그렇지만 이 기술을 시험관내 배양기술에 적용해 생산된 줄기세포를 이용하는 경우에는 질병부위 이식시 생착율이 낮다.
따라서 본 발명자는 저강도의 초음파를 조사함으로써, 조사된 부위의 세포가 향상된 호밍능을 가지게 되는 방법을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 20 내지 60 mW/cm2의 강도범위를 가지는 초음파를 대상세포 또는 대상세포를 포함하는 부분에 조사하는 단계를 포함하는, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법 또는 이에 따라 제조된 호밍능이 향상된 성체줄기세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 20 내지 60 mW/cm2의 강도범위를 가지는 초음파를 대상세포 또는 대상세포를 포함하는 부분에 조사하는 단계를 포함하는, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법이 제공된다.
본 발명에서 상기 초음파는 0.5 내지 1.5 MHz의 주파수를 가지는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 10 내지 30%의 듀티 사이클(duty cycle) 하에 수행되는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 10분 내지 30분간 수행되는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 대상세포의 SDF-1 분비를 촉진시키는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 상기 대상세포의 SDF-1 분비량을 초음파를 조사하기 전 대비 1.1 내지 2.0배 증가시키는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명에서 상기 대상세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인. 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기의 제조방법에 의해 제조된 호밍능이 향상된 성체줄기세포를 제공한다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 SDF-1 분비량이 초음파를 조사하기 전 대비 1.1 내지 2.0배 증가된 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 분비량이 증가된 SDF-1의 SDF-1/CXCR4 신호전달 기전 활성화에 의해 호밍능이 향상된 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 상기 초음파가 조사된 부위로 CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4) 수용체를 발현하는 타 세포가 이동하도록 유도하는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 CXCR4 수용체를 발현하는 타세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 호밍능이 향상된 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 호밍능이 향상된 세포의 제조방법 또는 이에 따라 제조된 세포는 저강도의 초음파가 조사됨에 따라 세포의 SDF-1 분비를 촉진시켜 SDF-1/CXCR4 신호전달기전을 활성화시킬 수 있고, SDF-1/CXCR4 신호전달기전의 활성화는 초음파에 노출된 조직부위로 세포들이 효과적으로 이동할 수 있도록 하여 손상된 세포가 정상적으로 회복될 수 있도록 도움을 줄 수 있다.
또한, 질병부위 또는 노화된 피부조직 등 몸의 특정 부분을 초음파 조사로 자극함에 따라, 자가세포를 이용하여 간편하고 효율적으로 손상된 조직을 치료할 수 있음으로 유용한 치료 보조제로 이용될 수 있다
다만, 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 초음파처리에 의한 세포의 호밍기전에 대한 모식도이다.
도 2는 실시예에 따른 섬유아세포와 성체줄기세포의 세포배양 이미지이다.
도 3은 초음파처리시 섬유아세포와 성체줄기세포의 SDF-1 분비량변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 초음파처리에 의한 섬유아세포와 성체줄기세포의 세포생존율 및 증식효과 그래프이다.
도 5는 초음파 처리의 강도에 따른 성체줄기세포 배양액을 이용한 세포이동 및 의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 초음파처리에 의한 성체줄기세포 배양액을 이용한 세포이동효과(wound migration assay)의 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 SDF-1의 농도에 따른 성체줄기세포의 세포이동효과(transwell insert migration assay)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 SDF-1에 의한 성체줄기세포의 세포이동효과(transwell insert migration assay)를 나타낸 이미지이다.
도 2는 실시예에 따른 섬유아세포와 성체줄기세포의 세포배양 이미지이다.
도 3은 초음파처리시 섬유아세포와 성체줄기세포의 SDF-1 분비량변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 초음파처리에 의한 섬유아세포와 성체줄기세포의 세포생존율 및 증식효과 그래프이다.
도 5는 초음파 처리의 강도에 따른 성체줄기세포 배양액을 이용한 세포이동 및 의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 초음파처리에 의한 성체줄기세포 배양액을 이용한 세포이동효과(wound migration assay)의 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 SDF-1의 농도에 따른 성체줄기세포의 세포이동효과(transwell insert migration assay)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 SDF-1에 의한 성체줄기세포의 세포이동효과(transwell insert migration assay)를 나타낸 이미지이다.
본 발명의 일 양태로서, 20 내지 60 mW/cm2의 강도범위를 가지는 초음파를 대상세포 또는 대상세포를 포함하는 부분에 조사하는 단계를 포함하는, 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법을 제공한다.
상기 호밍능(Homing Effect)은 몸의 상처부위나 건강하지 못한 질병부위에서 나오는 여러가지 신호를 따라 다른 세포들이 손상된 세포나 부위를 찾아가 개선시키는 효과를 의미하는 것으로 줄기세포의 대표적인 특징이다. 또한, 호밍능이 향상될 경우 세포의 자가복제능력 또는 분화능력이 향상되어 재생 효능을 발휘함에 따라 조직을 정상적으로 회복시킬 수 있다.
상기 초음파 강도는 20 내지 60, 21 내지 59, 22 내지 58, 23 내지 57, 24 내지 56, 25 내지 55, 26 내지 54, 27 내지 53, 28 내지 52 또는 29 내지 51 mW/cm2의 강도로 조사될 수 있고, 세포의 증식률과 이동성을 효과적으로 증진시키는 측면에서 적합하게는 30 내지 50 mW/cm2의 저강도로 조사할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 초음파 강도가 20 mW/cm2 미만으로 조사될 경우 목적하는 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 60 mW/cm2 초과하여 조사될 경우 60 mW/cm2이하일 경우에 대비하여 효과의 차이가 발생하지 않거나 감소하여 실익이 없는 문제점이 발생할 수 있다.
또한, 본 발명에서 지칭되는 용어 '저강도 초음파'는 20 내지 60 mW/ cm2의 강도범위를 가지는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파는 0.5 내지 1.5, 0.6 내지 1.4, 0.7 내지 1.3, 0.8 내지 1.2 또는 0.9 내지 1.1 MHz의 주파수를 가지는 것일 수 있고, 효율적으로 세포의 호밍능을 향상시키는 측면에서 0.5 내지 1.5 MHz의 주파수를 가지는 호밍능이 향상된 세포의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 초음파의 주파수가 0.5 MHz 미만일 경우 목적하는 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 1.5 MHz를 초과할 경우 강한 자극으로 세포를 손상시키는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 10 내지 30, 12 내지 28, 14 내지 26, 16 내지 24, 17 내지 23, 18 내지 22 또는 19 내지 21%의 듀티 사이클(duty cycle) 하에 수행될 수 있고, 효율적으로 세포의 호밍능을 향상시키는 측면에서 10 내지 30%의 듀티 사이클(duty cycle)을 가지는 호밍능이 향상된 세포의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를들어, 상기 듀티 사이클(duty cycle)이 10% 미만일 경우 목적하는 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 30%를 초과할 경우 강한 자극으로 세포를 손상시키는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 10분 내지 30분, 11분 내지 29분, 12분 내지 28분, 13분 내지 27분 또는 14분 내지 26분간 수행될 수 있고, 절약된 시간으로 효율적으로 세포의 호밍능을 향상시키는 측면에서 15분 내지 25분으로 수행되는 호밍능이 향상된 세포의 제조방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를들어, 상기 초음파를 조사하는 단계에서 조사 시간이 10분 미만일 경우 목적하는 효과가 나타나지 않는 문제점이 발생할 수 있고, 30분을 초과할 경우 실익이 없는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명에서 상기 초음파를 조사하는 단계는 상기 대상세포의 SDF-1 분비량을 초음파를 조사하기 전 대비 1.1 내지 2.0배 증가시키는 호밍능이 향상된 세포의 제조방법일 수 있다.
상기 SDF-1(Stromal cell derived factor)은 염증, 저산소자극에 의해서 많은 세포에서 분비하는 사이토카인의 일종으로, 간질 세포 유래 인자라고도 불리고 G-단백질 결합 수용체 CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)에 결합하는 골수 세포 배양에 의해 구성적으로 발현되는 CXC 케모카인이다.
또한, SDF-1은 내피 세포, 혈관주위세포 또는 수지상 세포 등에서 발현될 수 있고, CXCR4 양성 림프구 침윤물과 밀접하게 접촉하는 다수의 단핵 세포 또는 섬유아세포에서도 발현될 수 있으며 혈관투과성과 신생혈관생성을 증가시킬 수 있다. 또한 SDF-1이 증가됨에 따라 SDF-1/CXCR4의 신호전달기전을 자극시킬 수 있으며 이에 따라 CXCR4가 발현된 세포들이 모일 수 있음으로 손상된 세포 또는 조직이 정상적으로 회복할 수 있도록 도움을 줄 수 있다.
본 발명에서 상기 대상세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있으나, 초음파 자극에 의해 SDF-1을 분비하는 세포라면 이에 제한은 없다.
본 발명의 다른 실시예는 상기의 제조방법에 의해 제조되는 것인 호밍능이 향상된 성체줄기세포에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 SDF-1 분비량이 초음파를 조사하기 전 대비 1.1 내지 2.0배 증가되는 것일 수 있고, 분비량이 증가된 SDF-1은 SDF-1/CXCR4 신호전달 기전을 활성화할 수 있고, 활성화된 SDF-1/CXCR4 신호전달 기전은 CXCR4 수용체를 발현하는 타 세포가 이동하도록 유도할 수 있어 호밍능이 향상된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 성체줄기세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 호밍능이 향상된 성체줄기세포의 제조방법일 수 있으나, 초음파 자극에 의해 SDF-1을 분비하는 세포라면 이에 제한은 없다.
본 발명에서 상기 CXCR4 수용체를 발현하는 타세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있고, CXCR4 수용체를 발현하는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 호밍능이 향상된 성체줄기세포 또는 성체줄기세포의 제조방법은 살아있는 포유동물에 적용될 수 있고, 예를 들어 생쥐, 래트, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함할 수 있으며 가장 적합하게는 인간에게 적용될 수 있다.
또한, 상기 호밍능이 향상된 성체줄기세포 또는 성체줄기세포의 제조방법은 뼈, 연골, 지방, 간, 신경 또는 피부에서 손상된 조직을 치료할 수 있으며, 성체줄기세포가 분화가능한 조직이라면 치료부위에 제한은 없다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포의 준비
성체줄기세포(Mesenchymal stem cells)는 골수유래 줄기세포를 사용하였고, alpha-MEM 배양액(Gibco)에 2mM의 L-글루타민(Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신 및 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 첨가한 배양액을 사용하여 계대배양하였다. 배양액은 2~3일에 한 번 또는 일주일에 두 번 교환하였으며, 80~90%의 컨플루언시(confluency)를 나타낼 때까지 배양한 후, 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 계대배양 하였다.
사람의 섬유아세포(human dermal fibroblasts)은 Dulbecco's modified Eagle's culture medium (DMEM, Gibco)에 4.5g/L의 글루코오스, 2mM의 L-글루타민(Sigma), 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신 및 10%의 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS)을 첨가한 배양액을 사용하여 배양하였다. 또한, 이를 T-75 flask를 이용하여, 37℃, 5% CO2가 공급되고, 90% 이상의 습도가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2~3일에 한 번 또는 일주일에 두 번 교환하였으며, 80~90%의 컨플루언시(confluency)를 나타낼 때까지 배양한 후, 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 계대배양 하였다.
도 2는 상기의 과정에 의해 배양된 성체줄기세포와 섬유아세포를 촬영한 현미경 사진이다.
실시예 2. 저강도 초음파(LIPUS) 처리
배양중인 세포에 대한 초음파자극은 1 MHz 주파수, 20% 듀티 사이클(duty cycle)을 갖는 초음파장비를 이용하여 1mW/cm2 내지 100mW/cm2의 강도범위로 수행하였다. 6대의 초음파장비에 각각 연결된 초음파 트랜스듀서(ultrasound transducer)를 플라스틱 프레임의 바닥에 붙이고, 세포배양용 6-웰 접시의 2mm 아래쪽에서 방사되는 초음파가 위로 전달되도록 하였다. 각 세포들은 배양액을 이용하여 1.25 X 104/ml로 세포밀도를 조절하여 세포부유액을 만든 다음, 6-웰 접시의 각 웰에 2ml의 세포부유액을 넣고 24시간 배양하여 세포들이 바닥에 부착되도록 한 뒤, 다음날 새로운 배양액으로 갈아주고 5일 동안 0, 20, 40, 60, 80 및 100mW/cm2 초음파로 각각 자극하였다. 초음파로 자극하는 동안 실험장치는 5% CO2가 공급되고 37℃에서 90% 이상의 습도가 유지되는 CO2 인큐베이터에 유지시켰으며, 10분 또는 30분간 초음파를 방사하였고, 같은 강도의 초음파자극을 24, 48, 72, 96 및 120시간에 각각 하루 한번씩 5회 노출시킨 후, CO2 인큐베이터에서 24시간 추가배양한 다음 세포 및 배양액을 수거하여 세포의 수를 계수하고 배양액 내 SDF-1의 농도를 측정하였다.
실험예 1. 초음파 처리한 섬유아세포와 성체줄기세포의 세포배양액 내 SDF-1 농도분석
사이토카인은 다양한 세포가 자극을 받을 때 분비되는 단백질로서, 백혈구를 혈액으로부터 손상부위로 이동시키는 효과를 나타낸다. 세포배양시 초음파 자극을 받은 세포들은 자극의 정도에 따라 다양한 케모카인을 분비하는데, 이 중 SDF-1은 성체줄기세포를 증식, 이동 및 생착시키는 효과가 있어 호밍(homing) 효과를 나타낸다(도 1). 케모카인은 백혈구의 이동과 활성화를 유도하여 염증, 면역, 재생 및 혈관형성 등 중요한 역할을 수행한다. 특히, SDF-1은 호밍 케모카인의 전형적인 모델로서, 성체줄기세포의 이동과 생착(adhesion)에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
세포배양 및 초음파처리 실험은 실시예 1 및 2에 따라 진행되었으며 세포배양액 내 SDF-1의 농도측정을 위해서, R&D system사의 ELISA 키트를 사용하였다.
도 3을 참조하면, 초음파를 처리하지 않은 대조군과 초음파를 처리한 실험군 그룹을 비교하였을 때, 실험군에서 대조군에 비해 SDF-1의 배양액내 농도가 약 1.1배에서 1.4배까지 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 성체줄기세포(human BD-MSC; 이하 hBD-MSC로 기재)와 섬유아세포(Human Fibroblast) 실험군 모두 40mW/cm2 강도의 저강도 초음파를 처리한 경우 SDF-1의 배양액 내 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
이에 따라 성체줄기세포(human BD-MSC)와 섬유아세포(Human Fibroblast)에 20 내지 60mW/cm2 강도의 저강도 초음파를 처리할 경우 SDF-1농도가 증가하는 것을 알 수 있으며 40mW/cm2 강도의 저강도 초음파를 처리할 경우 가장 효율적인 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 섬유아세포와 성체줄기세포의 생존율 및 증식율 분석
성체줄기세포(human BD-MSC)와 섬유아세포(Human Fibroblast)의 생존 및 증식율을 분석하기 위한 방법으로 MTT 분석방법을 이용하였다. 이는 미토콘드리아의 전자전달계 과정 중 생존에 필요한 에너지를 생산하는 과정에서, 전자전달계에 존재하는 탈수소효소가 테트라졸리움염(tetrazolium salt)을 분해하여 포르마잔(formazan)이라는 발색물질을 생성하는 원리를 이용한 것이다.
실험은 실시예 1 및 2에 따라 진행하였고, 저강도 초음파를 처리하지 않은 대조군과, 20mW/cm2 내지 100mW/cm2 강도의 저강도 초음파를 처리한 실험군에서 각각 세포의 증식율을 분석하였다.
도 4를 참조하면, 저강도 초음파를 처리할 경우 성체줄기세포(human BD-MSC)와 섬유아세포(Human Fibroblast) 전체에서 세포증식이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 성체줄기세포는 40mW/cm2 강도에서, 섬유아세포는 60mW/cm2 강도에서 각각 가장 높은 세포증식율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 성체줄기세포와 섬유아세포 모두에 대하여, 초음파를 10분 동안 처리한 경우보다 30분 동안 처리한 경우에 세포증식율 상승효과가 높게 나타났다(섬유아세포의 경우, 20mW/cm2 강도범위에서는 예외로 나타남).
이에 따라 성체줄기세포(human BD-MSC)와 섬유아세포(Human Fibroblast)에 20 내지 100mW/cm2 강도의 저강도 초음파를 처리할 경우 20내지 60 mW/cm2 강도에서 세포생존율에 영향없이 세포증식이 증가하는 것을 알 수 있었다.
실험예 3: 성체줄기세포의 세포이동성 분석
스크래치 분석(wound migration assay)은 시험관(in vitro) 실험에서 세포이동을 측정하는 방법으로, 세포배양용기 바닥에 완벽하게 배양된 세포단층을 만들고, 중앙부분에 마이크로 피펫 팁(micro pipet tip)으로 스크래치를 내어 세포를 탈락시킨 후, 초음파 (0, 20, 40, 60, 80, 100mW/cm2)처리를 통해 얻어진 실험배양액을 사용하여 스크래치 면적이 줄어드는 정도를 평가하였다. 세포는 hBD-MSC을 사용하였고, 1 MHz 주파수, 20% 듀티 사이클(duty cycle)을 갖는 초음파장비를 사용하였다.
구체적으로, 세포이동분석을 위한 실험배양액을 얻기 위해서, 6-웰 접시를 이용하여 hBD-MSC 2.5 X 104/well을 alpha-0 배양액(FBS를 포함시키지 않은 줄기세포배양액)에서 하루동안 배양한 후, alpha-1 배양액(FBS를 1% 포함시킨 줄기세포배양액)으로 교체하고, 0, 20, 40 또는 60mW/cm2 강도의 초음파를 매일 10분씩, 5일간 조사한 다음 회수한 배양액을 실험배양액으로 사용하였다. 다음으로 스크래치분석을 위해서 hBD-MSC 2.0 X 105/well을 4-well dish의 alpha-10(10% FBS를 포함시킨 줄기세포배양액)에서 하루 동안 배양한 것을 사용하였다. 100% 단층으로 세포배양된 4-웰 접시에서 중앙을 마이크로 피펫 팁으로 스크래치 내어 세포를 탈락시키고 PBS로 2회 washing하였다. 다음으로 실험배양액 300uL/well을 실험군별로 4-웰 접시에 각각 분주하고 18시간 뒤에 스크래치 면적을 측정하여 그 결과를 하기 표 1 및 도 5에 나타내었다.
또한, 24시간 뒤 스크래치의 면적변화를 NIH image 소프트웨어를 사용하여 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.
실험은 각각의 초음파강도별로 4개의 실험군으로 진행하였고, 초음파 조사 전과 조사 후의 스크래치 면적이 줄어드는 차이를 백분율로 계산하여 초음파 강도에 따른 평균값 및 표준편차로 나타내었으며, 4개의 실험군은 각각 3회씩 반복측정 하여 측정값의 평균값으로 계산하였다.
| 구분 | 초음파 강도별 스크래치 면적 감소율 | |||
| 0(mW/cm2) | 20(mW/cm2) | 40(mW/cm2) | 60(mW/cm2) | |
| 평균값 | 34.0% | 40.5% | 48.4% | 42.5% |
| 표준편차 | 7.0% | 5.2% | 6.3% | 3.9% |
상기 표 1 및 도 5을 참조하면 실험배양액의 제조시에 조사된 초음파 강도가 증가할수록 세포의 스크래치 면적이 더욱 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 초음파 강도가 0 mW/cm2으로 조사된 경우인 대조군에 대비하여 20 mW/cm2로 조사된 경우 스크래치 면적이 5% 이상 줄어 든 것을 확인할 수 있었고, 초음파 강도가 40 mW/cm2로 조사된 경우는 14% 이상 줄었으며, 초음파 강도가 60 mW/cm2로 조사된 경우 8% 이상 줄어 든 것을 확인할 수 있었다.
또한, 초음파 강도가 40 mW/cm2로 조사된 경우가 60 mW/cm2로 조사된 경우에 대비하여 스크래치 면적이 5% 이상 줄어드는 것으로 보아 가장 효과가 좋은 것을 알 수 있었다.
또한, 도 6를 참조하면, 초음파 강도를 0 mW/cm2로 조사한 대조군에 대비하여 40 mW/cm2으로 조사한 경우, 24시간 후의 스크래치 면적이 현저하게 좁아진 것을 확인할 수 있어 세포의 이동 및 결합이 증가되었음을 알 수 있었다.
따라서 실험예 3을 통하여 20 내지 60 mW/cm2강도의 저강도 초음파를 조사한 실험배양액을 사용할 경우 세포의 상호작용능력이 향상되어 세포의 이동성이 촉진되는 효과가 있어, 상처가 발생할 경우 우수한 치유능력이 있는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: SDF-1에 의한 성체줄기세포의 호밍 효과 분석
신체 내 조직손상이 발생하거나 초음파에 의해 세포가 자극을 받으면, 섬유아세포와 성체줄기세포는 초음파자극정도에 따라 SDF-1을 분비한다. 이때, 분비된 SDF-1은 SDF-1/CXCR4 신호전달기전을 자극하여 CXCR4가 발현된 섬유아세포와 성체줄기세포로 하여금 SDF-1농도가 높은 쪽으로 이동하게(chemotaxis) 한다.
이를 확인하기 위하여, 농도구배에 따른 이동능력분석법(transwell insert migration assay)을 이용하여 SDF-1의 농도에 따른 hBD-MSC의 이동능력을 평가하였다
구체적으로, 8μm의 기공 사이즈를 갖고 있는 트랜스웰 인서트(transwell insert)를 이용하여 24- 웰 접시에서 확인하였는데, 먼저 트랜스웰 인서트의 아랫면을 10ug ml-1 콜라겐(collagen)으로 코팅하여 4℃의 조건에서 overnight반응을 시켰다. 다음으로 트랜스웰 인서트의 내부(upper chamber)에 hBD-MSC 2.0 X 105/well 및 배양액 alpha-0 media 200uL/well을 투입하고, 24- 웰 접시에는 SDF-1(0,25,50,100 ng/ml)이 포함된 배양액 alpha-10 media 200uL/well을 투입한 후, 각 웰에 세포가 들어있는 트랜스웰 인서트를 삽입하였다. 다음으로, 트랜스웰 인서트 내부에 있는 hBD-MSC가 SDF-1이 존재하는 곳(lower chamber, 24- 웰 접시)으로 이동하도록 37℃ 및 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 반응시켰다,
다음으로, 트랜스웰 인서트의 아랫면으로 이동한 hBD-MSC를 확인하기 위하여, 24- 웰 접시에서 꺼낸 트랜스웰 인서트(upper chamber)의 내부를 PBS-A를 이용하여 2번 세척하고, 0.05% trypsin-EDTA를 100uL를 투입하여 5분간 반응시 킨 후 트랜스웰 인서트 내부의 세포를 제거하였다. 다음으로 트랜스웰 인서트의 바닥에 부착한 세포를 methanol 200uL를 이용하여 10분간 고정한 후, 2.3%의 crystal violet 200uL를 이용하여 20분간 염색한 다음, 증류수로 워싱하였다. 마지막으로 crystal violet에 염색된 hBD-MSC의 수를 200배 현미경으로 관찰 및 계수하여 하기 표 2와 도 7 및 8에 나타내었다. 실험은 SDF-1의 각 농도별로 6개의 sample로 진행하였으며 평균값 및 표준편차값을 계산하여 나타내었다.
| 구분 | SDF-1 농도별 세포수 | ||||
| 0(ng/ml) | 25(ng/ml) | 50(ng/ml) | 100(ng/ml) | ||
| hBD-MSC 측정값 | sample#1 | 25 | 55 | 80 | 117 |
| sample#2 | 36 | 59 | 79 | 103 | |
| sample#3 | 40 | 68 | 51 | 119 | |
| sample#4 | 49 | 77 | 72 | 129 | |
| sample#5 | 29 | 59 | 88 | 83 | |
| sample#6 | 39 | 61 | 93 | 100 | |
| 평균값 | 36.3 | 63.2 | 77.2 | 108.5 | |
| 표준편차 | 8.5 | 8.0 | 14.8 | 16.5 | |
상기 표 2 및 도 7을 참조하면 세포배양한 hBD-MSC가 SDF-1의 농도에 비례하여 이동성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, SDF-1의 농도가 두 배씩 증가할 때 마다 hBD-MSC 측정값이 약 14 내지 32만큼 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8은 SDF-1의 농도가 0ng/ml인 대조군(control)과 SDF-1의 농도가 100ng/ml인 실험군에서 관찰한 hBD-MSC의 현미경 이미지로, 대조군(control)에 대비하여 실험군(SDF-1)에서 세포가 현저하게 많이 이동한 것을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 실험예 3 및 실험예 4를 통하여 SDF-1농도가 높아질수록 성체줄기세포의 이동성이 증가하여 초음파조사 후 호밍능이 향상되는 것을 알 수 있었다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
1 MHz의 주파수, 40 mW/cm2의 강도 및 20%의 듀티 사이클의 초음파를 30분/일(day), 5일 동안 인간 중간엽 줄기세포 및 인간 섬유아세포를 포함하는 부분에 조사하는 단계를 포함하는, 시험관 내(in vitro) 인간 성체줄기세포의 세포증식 향상 및 호밍능 향상방법.
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제1항에 있어서, 상기 초음파를 조사하는 단계는 인간 중간엽 줄기세포 및 인간 섬유아세포의 SDF-1 분비를 촉진시키는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 상기 초음파를 조사하는 단계는 상기 인간 중간엽 줄기세포 및 인간 섬유아세포의 SDF-1 분비량을 초음파를 조사하기 전 대비 1.1 내지 2.0배 증가시키는 것인, 방법.
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제6항에 있어서, 상기 방법은 분비량이 증가된 SDF-1의 SDF-1/CXCR4 신호전달 기전 활성화에 의해 호밍능이 향상된 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 방법은 상기 초음파가 조사된 부위로 CXCR4 수용체를 발현하는 타 세포가 이동하도록 유도하는 것인, 방법.
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제11항에 있어서, 상기 CXCR4 수용체를 발현하는 타세포는 섬유아세포, 각질세포, 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 신경줄기세포, 장줄기세포, 근육줄기세포, 모낭줄기세포 및 혈관내피줄기세포로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220103712 | 2022-08-19 | ||
| KR20220103712 | 2022-08-19 |
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|---|---|
| KR102616453B1 true KR102616453B1 (ko) | 2023-12-21 |
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ID=89320703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230002541A KR102616453B1 (ko) | 2022-08-19 | 2023-01-06 | 성체줄기세포의 호밍 효과 증진방법 및 이로부터 호밍 효과가 증진된 세포 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102616453B1 (ko) |
-
2023
- 2023-01-06 KR KR1020230002541A patent/KR102616453B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PLOS ONE, vol.9(9), e106722, pp.1~13(2014)* * |
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