KR101813358B1 - 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제(ICMT_Ph), 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ICMT_Ph는, 프로스타글란딘(prostaglandin E2: PGE2) 및 종양사멸인자-알파(Tumor Necrosis Factor-α: TNF-α)의 생성을 억제한다는 것이 확인되어, 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.

Description

이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물{Compositions preventing or treating inflammatory diseases comprising isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase inhibitor}
본 발명은 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제(Isoprenylcystein carboxyl methyltransferase, 이하 ICMT) 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국부적인 또는 전신적인 방어기작으로 주로 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 및 비만 세포(mast cell)에 의해 조절된다. 염증은 주로 면역계를 이루는 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나, 국부적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다. 주요 염증성 질환으로는 위염, 염증성 장염 등의 소화기질환, 치주염 등의 구강 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기질환, 아토피 피부염 등의 피부질환이 포함되며, 기타 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염, 위궤양; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨병, 동맥경화증 등이 있다.
또한 지속적인 염증성 질환은 암을 유발할 수 있다는 연구 결과도 있다. 이러한 염증성 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되고 있는 일반적인 조성물로는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 조성물로 구분되어지며, 이중 대부분이 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많다. 따라서 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제(Isoprenylcystein carboxyl methyltransferase, 이하 ICMT)는 단백질의 번역 후 과정 중 하나인 메칠화(methylation)를 유도하는 효소로 알려져 있다. 이러한 메칠화가 항암작용에 적용되는 사례들은 다수 밝혀진 바가 있으며, 상기 메칠화의 억제를 통해 항암 활성을 가진다는 것도 알려져 있다(PCT/US2006/009806).
그러나 특정 단백질의 메칠화가 염증반응에 영향을 미친다는 이론은 아직 밝혀지지 않았다. 또한 ICMT라는 특이적인 단백질을 억제하였을 시 나타나는 염증관련 생리활성에 대한 연구도 미비한 상태로 ICMT를 특이적으로 저해하는 저해제(Isoprenylcystein carboxyl methyltransferase inhibitor, 이하 ICMT_Ph)의 구체적인 약리작용과 면역학적 상관관계, 생리학적 연구보고는 전무한 실정이다.
본 발명자들은 단백질 메칠화를 유도하는 ICMT의 저해제인 ICMT_Ph를 이용해 염증성 및 자가면역성 질환에 대한 치료 및 개선 효과를 확인하였으며, 다양한 염증 신호전달계 단백질의 활성 평가 (Western blot, Immunoprecipitation, Kinase assay)에서 그 기전을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 화합물인 ICMT_Ph를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 ICMT_Ph를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또다른 목적은 ICMT_Ph를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(N-(2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)아닐린, N-(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)aniline; 이하 ICMT_Ph로 약칭) 또는 이의 염을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure 112016007466936-pat00001
또한 본 발명은 하기 단계를 포함하는 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제(ICMT_Ph) 또는 이의 염의 제조방법을 제공한다:
1) 케톤 화합물 A (2,2,6,6-tetramethyldihydro -2H-pyran-4(3H)-one) 및 사이아노 아세테이트 축합반응을 통해 컨쥬케이션 화합물 B(ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyldihydro-2H-pyran-4(3H)-ylidene)acetate)를 합성하는 단계;
2) 상기 컨쥬케이션 화합물 B에 페닐기를 도입하여 화합물 C(ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetate)를 제조하는 단계;
3) 상기 화합물 C에서 에틸아세테이트기를 제거하여 화합물 D(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetonitrile)를 제조하는 단계;
4) 상기 화합물 D에 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LiAlH4)를 첨가하여 생성물 E(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethanamine)를 제조하는 단계; 및
5) 상기 화합물 E에 팔라듐 촉매를 사용한 커플링 반응을 통하여 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
[화학식 1]
Figure 112016122683856-pat00030
또한 본 발명은 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제(ICMT_Ph)를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 저해제는 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 프로스타글란딘(prostaglandin: PGE) 및 종양사멸인자-알파(Tumor Necrosis Factor-α: TNF-α)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 염증성 질환은 간염, 위궤양, 위염, 패혈증, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 ICMT_Ph를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 ICMT_Ph를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하고자 한다.
아울러, 본 발명은 ICMT_Ph의 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 ICMT_Ph는 염증 및 자가면역 활성에 관여하는 사이토카인과 그에 연관된 신호전달 단백질의 발현 억제에도 효과가 탁월하다는 점을 동물 실험을 통해 확인하였으므로 이를 함유하는 조성물은 염증 질환들을 근본적으로 치료하고 예방할 뿐만 아니라 증상을 완화 및 개선시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 화합물 B의 구조를 확인한 NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 화합물 C의 구조를 확인한 NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 화합물 D의 구조를 확인한 NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 화합물 E의 구조를 확인한 NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 ICMT_Ph의 구조를 확인한 NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 ICMT_Ph의 RAW 264.7 cells에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ICMT_Ph가 RAW 264.7 cells의 LPS에 의한 Prostaglandin E2 (이하 PGE2) 생산을 저해하는 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 ICMT_Ph를 RAW 264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 COX-2 및 TNF-α의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 ICMT_Ph를 RAW 264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체(MEK 1/2, c-Raf, Ras)의 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과이다.
도 10은 급성 간염 모델에서 ICMT_Ph를 RAW 264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 COX-2, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현을 줄이는 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 급성 간염 모델에서 ICMT_Ph의 간 손상 억제효과를 확인하기 위한 AST/ALT 효소 혈청분석결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 LPS/D-galactosamine을 이용한 급성 간염 모델에서 ICMT_Ph의 간 손상 억제 효과를 확인하기 위한 Hematoxylin/Eosin 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 LPS/D-galactosamine을 이용한 급성 간염 모델에서 간 조직에서 분리한 단백질 분획에서 염증 관련 단백질인 Ras, c-Raf, MEK 1/2의 억제효과를 Western blot으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 ICMT_Ph가 간조직의 co-stimulatory molecule에 미치는 영향을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제(Isoprenylcystein carboxyl methyltransferase inhibitor, 이하 ICMT_Ph)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112016007466936-pat00002
상기 화학식 1은 N-(2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)아닐린(N-(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)aniline)인 것이다.
상기 ICMT_Ph는 하기 단계를 포함하는 제조방법을 통해서 제조되는 것이다:
1) 케톤 화합물 A (2,2,6,6-tetramethyldihydro -2H-pyran-4(3H)-one) 및 사이아노 아세테이트 축합반응을 통해 컨쥬케이션 화합물 B(ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyldihydro-2H-pyran-4(3H)-ylidene)acetate)를 합성하는 단계;
2) 상기 컨쥬케이션 화합물 B에 페닐기를 도입하여 화합물 C(ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H- pyran-4-yl)acetate)를 제조하는 단계;
3) 상기 화합물 C에서 에틸아세테이트기를 제거하여 화합물 D(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetonitrile)를 제조하는 단계;
4) 상기 화합물 D에 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LiAlH4)를 첨가하여 생성물 E(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethanamine)를 제조하는 단계; 및
5) 상기 화합물 E에 팔라듐 촉매를 사용한 커플링 반응을 통하여 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하는 단계.
상기 1) 단계는 케톤 화합물 A (2,2,6,6-tetramethyldihydro -2H-pyran-4(3H)-one)에 사이아노 아세테이트와 축합반응을 통해서 컨쥬케이션 화합물 B를 합성하는 단계이다. 에틸 사이아노아세테이트 (ethyl cyanoacetate)와 케톤 화합물 A의 혼합물에 촉매 량의 아세트산과 피페리딘(piperidine)을 사용하면 축합 반응이 진행되어 사이아노 컨쥬케이션 화합물 B인 에틸 2-사이아노-2-(2,2,6,6-테트라메틸다이하이드로-2H-피란-4(3H)-일리딘)아세테이트(ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyldihydro-2H-pyran-4(3H)-ylidene)acetate)가 52% 수율로 합성된다.
상기 2) 단계는 1) 단계에서 제조된 컨쥬케이션 화합물 B에 하나의 페닐기를 도입하는 단계이다. 10 mol %의 구리 금속 촉매(CuBr) 촉진 하에 페닐 마그네슘 브로마이드를 사용하여 하나의 페닐기를 사이아노 컨쥬케이션 화합물 B의 이중결합에 첨가하였다. 상기 결과 생성되는 화합물 C는 에틸 2-사이아노-2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세테이트 (ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H- pyran-4-yl)acetate)이다.
상기 3) 단계는 2)단계에서 제조된 페닐이 치환된 사이아노 에틸아세테이트 화합물 C에서 에틸아세테이트기를 제거하는 단계이다. 화합물 C에 수산화칼륨을 넣고 에틸렌글리콜 용매 하에 190℃ 온도에서 20분 간 환류 시키면 비누화 반응이 진행된 후 바로 이산화탄소가 제거되는 디카르복실레이션(decarboxylation)이 진행되어 에틸아세테이트가 제거된 화합물 D가 84%의 수율로 제조된다. 상기 결과 생성되는 화합물 D는 2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세토나이트릴 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetonitrile)이다.
상기 4) 단계는 3)단계에서 제조된 사이아노 화합물 D에서 환원반응을 통하여 아민 화합물을 합성하는 단계이다. 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LiAlH4)와 사이아노 화합물 D를 에틸 에테르 용매 하에서 혼합하면 환원 반응을 통하여 사이아노기가 아민으로 환원되어 생성물 E를 높은 수율 (90%)로 합성 할 수 있다. 상기 결과 생성되는 화합물 E는 2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)에테인아민 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethanamine)이다.
상기 5) 단계는 4)단계에서 합성된 아민 화합물 E에 팔라듐 촉매를 사용한 커플링 반응을 통하여 아민에 페닐기를 도입하여 최종 생성물 ICMT-Ph를 합성하는 단계이다. 팔라듐 (Pd2(dba)3)촉매와 포스핀 리간드(binap)를 사용하여 염기 (NaOt-Bu), 아민화합물 E와 브로모벤젠을 혼합하여 톨루엔 용매 하에 환류 시키면 아민에 하나의 페닐기가 치환된 최종 생성물 ICMT-Ph가 합성된다. 상기 ICMT-Ph는 N-(2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)아닐린 (N-(2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)aniline)이다.
상기 제조 방법에서 수행되는 합성 반응식은 하기 도식 1과 같다.
<도식 1>
Figure 112016007466936-pat00003
또한 본 발명은 ICMT_Ph를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 단백질 메칠화를 유도하는 ICMT의 저해제인 ICMT_Ph를 이용해 염증성 및 자가면역성 질환에 대한 치료 및 개선 효과를 확인하여, 신규 화합물 및 상기 화합물을 포함하는 염증성 질환 예방, 개선 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 실시예를 통해서, ICMT_Ph이 단백질의 메칠화를 유도하는 Isoprenylcystein carboxyl methyltransferase (ICMT)의 저해제로써 염증 및 내재면역 활성에 관여하는 사이토카인(cytokine)과 그에 따른 신호전달 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였고, 이를 통해서 상기 ICMT_Ph의 탁월한 항염증 효과가 확인되었다.
또한 In vivo에서도 ICMT_Ph의 효과를 확인하였다. LPS와 D-galactosamine에 의해 간염 (hepatitis)이 유도된 ICR mouse에 ICMT_Ph를 복강으로 주입한 뒤 해부 후 혈액을 채취해 간수치 (AST/ALT)를 확인하였다. 그 결과 ICMT_Ph 12.5~50mg/kg을 처리한 군에서 AST/ALT값이 약 50% 가량 저해된 것을 확인할 수 있었다. 다음은 간 조직을 추출해 mRNA level과 단백질 발현을 측정하였다. 염증관련 전사인자인 COX-2, TNF-α, IL-1β가 12.5와 25mg/kg에서 유효하게 억제되었고 단백질 수준에서 AP-1관련 신호 (MEK 1/2, c-Raf)들의 전달과정과 이들의 최상위 신호인 Ras의 발현이 ICMT_Ph 12.5, 25mg/kg에서 저해되었다. 또한 간조직을 hematoxylin and eosin (H&E) 염색법을 통해 leukocyte의 발현 및 저해 유무를 평가한 결과 ICMT_Ph 12.5와 25mg/kg에서 leukocyte의 숫자가 현저히 감소한 것을 확인하였다. 마지막으로 간조직에서 간세포를 유리해 co-stimulatory molecule인 CD40/80의 level을 flow cytometry를 통해 측정하였다. 그 결과 CD40, 86의 MFI value가 ICMT_Ph 12.5 ~ 50mg/kg 그룹에서 저해되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 실시예를 통해 ICMT_Ph에 In vivo 간염 억제 효과가 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 간염, 위궤양, 위염, 패혈증, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환, 또는 만성 염증 질환 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러나 본 발명의 조성물은 염증성 질환 중에서도 특히 간염에서 우수한 효과를 가지는 것이며, 급성 간염에 우수한 효과를 가짐을 동물실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 조성물은 ICMT_Ph와 함께 염증성 질환 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 상기 ICMT_Ph의 일일 투여량은 약 0.0001-500 ㎎/㎏, 바람직하게는 약 0.001-300 ㎎/㎏이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 ICMT_Ph를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 ICMT_Ph를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 ICMT_Ph는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 ICMT_Ph를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 피험자는 인간 또는 비-인간을 포함하는 포유류이며, 비-인간 포유류는 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지, 토끼 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: ICMT _ Ph 합성 및 세포 준비
1.1. ICMT _ Ph의 합성
1.1-1. 2- 사이아노 -2-(2,2,6,6- 테트라메틸다이하이드로 -2H-피란-4(3H)- 일리딘 )아세테이트 (ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyldihydro-2H-pyran-4(3H)- ylidene )acetate, 화합물 B)의 합성
본 실시예에서 제조하는 화합물 B의 합성 반응식은 하기 반응식 1과 같다.
<반응식 1>
Figure 112016007466936-pat00004
10 mL 둥근 바닥 플라스크에 케톤 화합물 A (700 mg, 4.48 mmol), 아세트산 (26.0 μL, 0.452 mmol), 에틸사이아노아세테이트 (477 μL, 4.48 mmol)와 피페리딘 (piperidine, 45.0 μL, 0.452 mmol) 을 0 ℃에서 넣었다. 온도를 상온으로 바꾼 후 아세트산 (26.0 μL, 0.452 mmol)과 피페리딘 (45.0 μL, 0.452 mmol)을 한번 더 넣었다. 상온에서 1.5 시간 동안 교반 후, 생성된 현탁액에 탄산수소나트륨 수용액 (3 mL)을 넣고 에틸 아세테이트 (3 mL)로 세 번 추출했다. 유기층을 모아서 무수 황산마크네슘으로 물을 제거하였고, 여과 및 농축하여 얻은 용액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexanes/EtOAc, 5:1)로 분리하여 노란색 액체인 2-사이아노-2-(2,2,6,6-테트라메틸다이하이드로-2H-피란-4(3H)-일리딘)아세테이트 (ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyldihydro-2H-pyran-4(3H)-ylidene)acetate, 화합물 B) (586 mg, 2.33 mmol, 52%)를 제조하였다. 화합물 B의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 도 1a 및 1b에 각각 나타내었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 4.30 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.08 (s, 2H), 2.70 (s, 2H), 1.37 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.29 (s, 6H), 1.26 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 173.9, 161.7, 115.3, 105.0, 75.6, 61.8, 47.2, 42.4, 30.6, 30.4, 14.0; LRMS (EI) m/z : [M+] Calcd for C14H21NO3 251; Found 251.
1.1-2. 2- 사이아노 -2-(2,2,6,6- 테트라메틸 -4- 페닐테트라하이드로 -2H-피란-4-일)아세테이트 (ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H- pyran -4- yl )acetate, 화합물 C)의 합성
본 실시예에서 제조하는 화합물 C의 합성 반응식은 하기 반응식 2과 같다.
<반응식 2>
Figure 112016007466936-pat00005
25 mL 둥근 바닥 플라스크에 컨쥬케이션 화합물 B (385 mg, 1.53 mmol), CuBr(SMe2) (3.00 mg,0.0153 mmol)와 테트라하이드로퓨란 (THF, 10 mL)을 넣고 온도를 -78 ℃로 낮춰주었다. 질소기체 하에서 페닐마그네슘 브로마이드 (1 M in THF, 1.81 mL, 1.81 mmol)를 넣고 상온으로 온도를 올린 후 20 시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 1 N 염산 (8 mL)을 넣은 후 에틸 아세테이트 (10 mL)로 세 번 씻어내었다. 유기 층을 모아서 무수 황산마그네슘으로 물을 제거하고 여과 후 농축 하여 얻은 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexanes/EtOAc, 5:1)로 분리하여 하얀색 고체인 2-사이아노-2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세테이트 (ethyl 2-cyano-2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H- pyran-4-yl)acetate, 화합물 C) (213 mg, 0.646 mmol, 42%)을 제조하였다. 화합물 C의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 도 2a 및 2b에 각각 나타내었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.49 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.40-7.30 (m, 3H), 3.93-3.84 (m, 2H), 3.61 (s, 1H), 2.80-2.68 (m, 2H), 2.11-1.96 (m, 2H), 1.34 (s, 3H), 1.33 (s, 3H), 1.05 (s, 3H), 1.02 (s, 3H), 0.97 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 164.2, 139.6, 128.2, 127.8, 127.4, 115.4, 71.7, 62.3, 53.6, 42.9, 41.9, 41.9, 34.4, 34.3, 30.2, 30.1, 13.4; LRMS (EI) m/z : [M+] Calcd for C20H27NO3 329; Found 329.
1.1-3. 2-(2,2,6,6- 테트라메틸 -4- 페닐테트라하이드로 -2H-피란-4-일) 아세토나이트릴 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetonitrile, 화합물 D)의 합성
본 실시예에서 제조하는 화합물 D의 합성 반응식은 하기 반응식 3과 같다.
<반응식3>
Figure 112016007466936-pat00006
10 mL 둥근 바닥 플라스크에 사이아노 에틸아세테이트 화합물 C (200 mg, 0.0700 mmol), 수산화칼륨 (68.0 mg, 0.214 mmol)과 에틸렌글리콜 (2.4 mL)을 넣고 190 ℃에서 20분 동안 교반시켰다. 반응 용액을 디에틸에테르 (Et2O, 3 mL)로 세 번 씻어낸 후 유기 층을 모아서 무수 황산마크네슘으로 탈수시킨 후 여과하여 주었다. 여과 용액을 농축하여 얻은 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexanes/EtOAc, 3:1)로 분리하여 하얀색 고체인 2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)아세토나이트릴 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)acetonitrile, 화합물 D) (131 mg, 0.600 mmol, 84%)을 제조하였다. 화합물 D의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 도 3a 및 3b에 각각 나타내었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.48 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.38 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.60 (s, 2H), 2.47 (d, J = 14.4 Hz, 2H), 1.87 (d, J = 14.4 Hz, 2H), 1.32 (s, 6H), 1.10 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 143.8, 128.5, 127.2, 126.3, 117.4, 71.6, 43.0, 38.4, 36.1, 34.0, 30.9; LRMS (EI) m/z : [M+] Calcd for C17H23NO 257; Found 257.
1.1-4. 2-(2,2,6,6- 테트라메틸 -4- 페닐테트라하이드로 -2H-피란-4-일) 에테인아민 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethanamine, 화합물 E)의 합성
본 실시예에서 제조하는 화합물 E의 합성 반응식은 하기 반응식 4과 같다.
<반응식4>
Figure 112016007466936-pat00007
10 mL 둥근 바닥 플라스크에 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LiAlH4, 44.2 mg, 1.16 mmol)와 디에틸 에테르 (1.5 mL)를 섞은 용액에 사이아노 화합물 D (150 mg, 0.583 mmol)와 디에틸 에테르(1.5 mL)의 혼합 용액을 0 ℃, 질소 기체 하에서 천천히 첨가했다. 반응 용액을 5 시간 동안 상온에서 교반 시킨 후 생성된 현탁액에 물 한 방울, 수산화나트륨 수용액 한 방울, 다시 물 세 방울을 0 ℃에서 천천히 첨가하여 남아있는 리튬 알루미늄 하이드라이드 소광시켰다. Celite 플러그를 통해 용액을 여과 후 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexanes/EtOAc, 3:1)로 분리하여 무색 액체인 2-(2,2,6,6-테트라메틸-4-페닐테트라하이드로-2H-피란-4-일)에테인아민 (2-(2,2,6,6-tetramethyl-4-phenyltetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethanamine, 화합물 E) (138 mg, 0.528 mmol, 90%)을 제조하였다. 화합물 E의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 도 4a 및 4b에 각각 나타내었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.38 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 2.41-2.32 (m, 4H), 1.77-1.72 (m, 4H), 1.35 (br s, 2H), 1.30 (s, 6H), 1.04 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 146.7, 127.8, 126.6, 125.7, 71.7, 52.4, 44.2, 38.4, 36.9, 33.9, 31.0; LRMS (EI) m/z : [M+] Calcd for C17H27NO 261; Found261.
1.1-5. ICMT - Ph인 N -(2-(2,2,6,6- 테트라메틸 -4- 페닐테트라하이드로 -2H-피란-4-일)에틸)아닐린 ( N -(2-(2,2,6,6- tetramethyl -4- phenyltetrahydro -2H- pyran -4-yl)ethyl)aniline)의 합성
본 실시예에서 제조하는 최종 생성물 ICMT-Ph의 합성 반응식은 하기 반응식 5과 같다.
<반응식 5>
Figure 112016007466936-pat00008
Glove box 안에서 4 mL 바이알에 아민 화합물 E (13.9 mg, 0.0532 mmol), Pd2(dba)3 (0.400 mg, 0.426 μmol), binap (2.70 mg, 0.00426 mmol)과 NaOt-Bu (14.0 mg, 0.149 mmol)를 넣은 후 glove box에서 반응 용기를 꺼냈다. 질소 기체 하에 브로모벤젠 (11.0 μL, 0.106 mmol)과 톨루엔 (0.3 mL)을 넣고 반응 바이알을 뚜껑으로 밀봉한 후 80 ℃ 에서 14시간 동안 교반시켰다. 제조된 현탁액을 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (hexanes/Et2O, 4:1)로 분리하여 흰색 고체인 ICMT-Ph (12.8 mg, 0.380 mmol, 71%)를 제조하였다. ICMT-Ph의 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 도 5a 및 5b에 각각 나타내었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.43 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.24 (tt, J = 7.2, 1.4 Hz, 1H), 7.08 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 6.63 (tt, J = 7.3, 1.0 Hz, 1H), 6.31 (dd, J = 8.6, 1.1 Hz, 2H), 3.19 (s, 1H), 2.83-2.78 (m, 2H), 2.45 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 1.91-1.87 (m, 2H), 1.79 (d, J = 14.1 Hz, 2H), 1.31 (s, 6H), 1.07 (s, 6H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 148.2, 129.2, 128.1, 126.8, 126.1, 117.2, 112.7, 71.8, 47.9, 44.2, 39.0, 38.6, 34.0, 31.0; LRMS (EI) m/z : [M+] Calcd for C23H31NO 337; Found 337.
1.2. 세포 배양
Murine 대식세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 100 mm cell culture dish에 70-80%의 밀도로 배양하였다.
실시예 2: ICMT _ Ph의 세포 독성 측정
ICMT_Ph의 세포 독성을 측정하기 위해 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphinyltetrazolium bromide) assay법을 이용하여 분석하였다. 96-well plate에 1 × 106 cell/ml의 세포를 plating하고 37℃에서 각 면역실험 조건에 상응하는 배양시간 동안 CO2 incubator에서 배양했다. 이후 10 ㎕ MTT 용액 (stock concentration : 5 mg/ml)을 첨가하고 3시간 동안 추가반응을 유도하였다. 반응 종료 및 formazan crystal 용해를 위해 각 well에 100 ㎕ MTT stopping solution (10% Sodium dodecyl sulfate in 0.01M HCl)을 추가적으로 첨가하였다. 세포 생존율은 MTT가 formazan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있는 것과 같이, 50μM 농도까지 높은 세포 생존율을 보인다는 것을 알 수 있다.
실시예 3: ICMT _ Ph의 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2, PGE 2 ) 생성 저해 활성 확인
염증발생의 주요 원인인 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 저해 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.
마우스 대식세포주인 RAW264.7를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 1×106 cell/ml의 농도로 조절한 후, 96 well plate에 접종하고, 5% CO2 및 37℃에서 18시간 동안 전배양하였다. 이후 배지를 제거하고 4배 농도로 조제된 ICMT_Ph 50 μl와 50 μl의 LPS (최종농도 1 μg/ml) 함유 배지를 동시에 처리하여 배양하였다. 24시간 후 상층액을 100μl씩 또 다른 96 well plate에 옮기고 ELISA KIT를 통해 PGE2 생성량을 확인 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 실시하였다.
그 결과는 도 7에서 확인할 수 있는 것과 같이 ICMT_Ph의 농도가 높아질수록, RAW264.7 cell에서의 PGE2 생성 농도가 낮아진다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4: ICMT _ Ph의 COX-2 및 TNF -α 유전자 발현 억제 효능 확인
ICMT_Ph가 염증 반응을 유도하는 COX-2, 및 TNF-α유전자의 발현을 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 실시하였다
즉, 사이토카인의 발현 정도를 전사수준에서 조사하기 위해 각 시료를 일정시간 동안 처리하고 Trizol reagent를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA를 First strand cDNA synthesis kit (Thermo scientific)를 사용하여 cDNA를 제조한 다음, 동량의 cDNA를 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 표적단백질의 sense 및 antisense primer 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다. 대조군 유전자로는 GAPDH를 사용하였다. PCR은 95 ℃에서 45초 간 denaturing, 55 ℃에서 45초 간 annealing 그리고 72 ℃에서 1분간 extension 하는 조건으로 시행하며, 총 20 cycles을 수행하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, ICMT_Ph를 RAW 264.7 cells에 처리하였을 때 LPS에 의한 COX-2 및 TNF-α 의 mRNA 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
표적단백질 염기서열 (5' → 3')
COX-2 F : 5-CACTACATCCTGACCCACTT-3 (서열번호 1)
R : 5-αTGCTCCTGCTTGAGTATGT-3 (서열번호 2)
TNF-α F : 5-TGCCTATGTCTCAGCCTCTT-3 (서열번호 3)
R : 5-GAGGCCATTTGGGAACTTCT-3 (서열번호 4)
GAPDH F : 5-CAATGAATACGGCTACAGCAAC-3 (서열번호 5)
R : 5-αGGGAGATGCTCAGTGTTGG-3 (서열번호 6)
실시예 5: ICMT _ Ph에 의한 표적 단백질 발현 및 신호 전달 과정의 변화 확인
Murine 대식 세포주인 RAW264.7 세포를 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 μg/ml)과 10%의 FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용해서 배양한 세포를 7X106 cell/ml 농도로 60mm의 dish에서 전 배양시켰다. 이후 각 분획들을 처리하고 일정시간 후 stimuli (Lipopolysaccharide)로 자극하고 약물에 따른 일정시간 후 cell 들을 모아서 lysis buffer와 sonicator를 사용해 세포를 깨어 western 표본을 얻어냈다. 그리고 각 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정했다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE를 실행했고, wet blotting 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting시킨 후 membrane을 5 % non-fat dried milk (Bio-rad)를 사용해 blocking시켰으며, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (MEK 1/2, p-MEK 1/2, c-Raf, p-c-Raf, Ras, β-αctin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 washing 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 washing하였다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광해주었다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9의 결과를 통해서 ICMT_Ph를 RAW 264.7 cells에 처리할 때, LPS에 의한 신호전달 단백질 Ras, c-Raf, 및 MEK 1/2의 생성이 억제된다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: ICMT _ Ph의 급성간염(acute hepatitis) 억제 확인
ICMT_Ph를 통한 급성간염의 억제 효과를 동물 실험을 통해서 확인하였다. 본 실시예에서는 리포폴리사카라이드(LPS)와 D-갈락토사민을 사용하여 급성간염을 유발시켰다. 먼저 ICR mouse를 다섯 군으로 분류한 뒤 두 군은 ICMT_Ph의 vehicle인 PEG 400 solution (Polyethylene glycol 400 : 5% dextose : Ethanol = 6 : 3 : 1) 을 다른 세 군은 각각 ICMT_Ph를 12.5, 25, 50mg/kg 로 5일간 복강 투여하였다. 이후 vehicle을 투여한 두 군 중 한 군은 PBS를 복강주사하였고 나머지 네 군은 LPS (10 μg/kg), D-갈락토사민(1 g/kg)을 복강주사하여 간염을 유발한 뒤 희생(sacrifice)시켰다.
이후, 혈액을 채취한 뒤 혈액으로부터 LPS에 의한 COX-2, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현의 정도를 실시예 4의 방법을 통해서 확인하여 도 10에 나타내었다. 사용한 COX-2 및 TNF-α의 염기서열은 표 1과 같으며, IL-1β의 sense 및 antisense primer 염기서열은 하기와 같다.
F: 5-CAA CCA ACA AGT GAT ATT CTC CAT G-3(서열번호 7)
R: 5-GAT CCA CAC TCT CCA GCT GCA-3(서열번호 8)
도 10의 결과에서 확인할 수 있는 것과 같이, ICMT_Ph의 처리에 의해 COX-2, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현이 감소한다는 것을 알 수 있다.
상기 혈액으로부터 혈청만을 골라 급성 간염의 지표인 AST/ALT(aspartate aminotransferase/alanine aminotransferase)의 농도를 Roche Modular spectrophotometric autoanalyzer를 이용하여 측정하였다. AST/ALT 효소 혈청 분석결과는 도 11에 나타내었다. LPS/D-galactosamine을 이용한 급성간염 모델에서 AST/ALT의 농도는 모두 ICMT_Ph의 농도값에 따라 현저히 감소한다는 것을 알 수 있다.
또한 간 조직의 일부는 western blotting을 위해 -70℃ 초저온 냉장고에 보관하였고 일부는 3% 포르말린 용액에 4일간 고정시킨다. 이후 4 μm 두께로 절편으로 자른 후 Hematoxylin 과 Eosin으로 세포핵과 세포질을 염색하여 조직의 형태를 현미경으로 관찰한 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12의 Hematoxylin/Eosin 염색 결과에서와 같이 ICMT_Ph의 간 손상 억제 효과를 확인할 수 있다.
상기 -70℃ 초저온냉장고에 보관한 간 조직 일부를 lysis buffer를 넣고 sonicator를 사용해 세포를 깨어 western 표본을 얻어내었다. 상기 표본의 단백질 농도를 BSA를 표준으로 잡고 측정하였다. 이렇게 얻어진 값을 기준으로 단백질 농도가 되는 각 표본량을 가지고 SDS-PAGE를 실행하고, wet blotting 방법을 사용해 PVDF membrane으로 단백질을 blotting시킨 후 membrane을 5 % non-fat dried milk (Bio-rad)를 사용해 blocking시키고, 표적 단백질 항체 및 신호전달 단백질 항체 (Ras, p-c-Raf, c-Raf, p-MEK 1/2, MEK 1/2, β-αctin) 용액을 사용해 1차 처리하고, 다시 washing 단계 후 2차 항체 용액을 처리하고 washing하였다. 그리고 암실에서 membrane에 ECL 용액 (Amersham, England)을 골고루 분주하여 X-ray film으로 감광하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
상기 도 13에서 확인할 수 있는 것과 같이 간염 조직에서 분리한 단백질 분획에서, ICMT_Ph의 처리에 따른 염증 관련 단백질 Ras, c-Raf, MEK 1/2의 억제 효과를 확인하였다.
아울러, 염증관련 Co-stimulatory molecule의 발현을 확인하기 위해 각 군의 간조직을 분리한 후 5% FCS로 blocking 후 CD40/86-FITC 1차 안티바디로 염색을 시켰다. Flow cytometry를 통해 FITC값을 측정함으로써 ICMT_Ph가 간조직의 co-stimulatory molecule에 미치는 영향을 확인하여 도 14에 나타내었다.
도 14에서 확인할 수 있는 것과 같이 ICMT_Ph가 간조직의 co-stimulatory molecule의 발현량을 감소시킨다는 것을 알 수 있다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1 : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
ICMT_Ph 200㎎
유당 100㎎
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
ICMT_Ph 200㎎
옥수수전분 100㎎
유당 100㎎
스테아르산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
ICMT_Ph 200㎎
옥수수전분 100㎎
유당 100㎎
스테아르산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사제의 제조
ICMT_Ph 200㎎
만니톨 100㎎
Na2HPO412H2O 2㎎
주사용 멸균 증류수 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분을 혼합하여 주사제를 제조하였다.
제제예 2 : 식품의 제조
본 발명의 ICMT_Ph를 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
ICMT_Ph 20-95 중량%로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
ICMT_Ph 0.2-1.0 중량%를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
ICMT_Ph 0.5-5.0 중량%를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
ICMT_Ph 0.1-5.0 중량%를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
ICMT_Ph 10 중량%를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품(dairy products)의 제조
ICMT_Ph 5-10 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 3 : 음료의 제조
1. 탄산음료의 제조
ICMT_Ph 10-15%, 설탕 5-10%, 구연산 0.05-0.3%, 카라멜 0.005-0.02%, 비타민 C 0.1-1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 75-80%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들었다. 상기 시럽을 85-98℃에서 20-180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5-0.82%를 주입하여 ICMT_Ph를 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
2. 건강음료의 제조
ICMT_Ph(고형분 2.5%, 97.16%), 대추 엑기스(65 brix, 2.67%), 과체복합 추출물(고형분 70%, 0.12%), 비타민 C(0.02%), 판톤텐산칼슘 (0.02%), 감초 추출물(고형분 65%, 0.01%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
3. 야채쥬스의 제조
ICMT_Ph 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
4. 과일쥬스의 제조
ICMT_Ph 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Compositions preventing or treating inflammatory diseases comprising isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase inhibitor <130> MP15-185 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 forward primer <400> 1 cactacatcc tgacccactt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COX-2 reverse primer <400> 2 atgctcctgc ttgagtatgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 3 tgcctatgtc tcagcctctt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 4 gaggccattt gggaacttct 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 caatgaatac ggctacagca ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 agggagatgc tcagtgttgg 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 7 caaccaacaa gtgatattct ccatg 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 8 gatccacact ctccagctgc a 21

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112017074208935-pat00032
    .
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 프로스타글란딘(prostaglandin: PGE) 및 종양사멸인자-알파(Tumor Necrosis Factor-α: TNF-α)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 염증성 질환은 간염, 위궤양, 위염, 패혈증, 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 간직성 척추염, 류마티스열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 염증 질환 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환 개선용 건강식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112017074208935-pat00033
    .
KR1020160008099A 2016-01-22 2016-01-22 이소프레닐시스테인카복실메틸트랜스퍼라제 저해제를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 KR101813358B1 (ko)

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