KR101812559B1 - 세린-팔미토일 전이효소 활성화를 통한 세라마이드 생합성 촉진과 항염효과를 갖는 제주 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제주 산양산삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 세라마이드 생합성 촉진 및 세라마이드 유래의 디히드로세라마이드(dihydroceramide), 스핑고신(sphingosine), 스핑고신-1-인산염(Sphingosine-1-Phosphate, S1P) 및 글루코실 세라마이드(glucosylceramide) 등 대사체 분석을 기반으로 제주 산양산삼 추출물의 세라마이드 생합성 조절기전을 분석함으로써, 피부 보습, 가려움 개선 및 염증 완화 효과를 발휘하는 화장료 조성물을 제공한다.

Description

세린-팔미토일 전이효소 활성화를 통한 세라마이드 생합성 촉진과 항염효과를 갖는 제주 산삼 추출물을 함유하는 화장료 조성물 {Cosmetic composition containing Jeju Wild Ginseng extracts promoting ceramide biosynthesis and having anti-inflammatory effects via activation of Serine-palmitoyl transferase}

본 발명은 제주산양산삼 또는 산양삼(장뇌삼) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 제주산양산삼 또는 산양삼(장뇌삼)의 세린-팔미토일 전이효소 활성화를 통한 세라마이드 생합성 촉진과 항염효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 조직학적 구조는 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있으며, 이 중 가장 외부에 존재하는 표피는 피부 미용과 관련하여 가장 많은 연구가 되고 있는 구조이다. 이 표피에서도 최외각 층을 이루는 성분은 각질세포와 세포 간 지질로서 피부의 장벽기능을 담당한다. 이처럼 피부의 장벽 기능은 각질의 세포분열과 분화를 통해서, 그리고 세포 간 지질을 통해서 체내 물질의 유출을 방지하고 피부 수분 증발을 방지하는데 그 중 가장 대표적인 것이 세라마이드이다.

세라마이드는 세포간 지질의 핵심 구성성분으로, 각질세포 간 지질의 약 50퍼센트를 차지하며 라멜라 액정구조의 형성에 결정적인 역할을 하여 피부장벽과 수분 유지 기능에 아주 중요한 스핑고지질이다. 각질형성세포의 어느 층에서 세라마이드의 합성 과정이 시작되는지는 확실히 알려져 있지 않지만, 일반적으로는 분화가 시작되는 유극층으로 알려져 있으며, 세라마이드의 양이 감소하면 피부건조증, 아토피, 건선과 같은 피부 질환을 야기하는 것이 보고된 바 있다.

이러한 세라마이드의 부족을 해결하기 위해 많은 연구자들이 천연 세라마이드를 개발하거나 유사 게라마이드를 개발하여 피부 외용제를 개발하여 사용하고 있으나, 천연 세라마이드는 가격이 높을 뿐만 아니라 물성이 좋지 않고, 동물에서 추출해야하는 어려움이 있어 화장품에 고농도로 사용할 수 없을 뿐만 아니라 매우 소수성(疏水性)이고 결정화 경향이 커서 이것을 함유하는 처방의 개발이 어려운 단점이 있다. 유기용제를 연속상으로 하는 방법의 경우에는 피부에 대한 자극이 발생하며, 수상을 연속상으로 하고 리포좀에 도입하는 방법의 경우에는 대부분의 리포좀이 장기간 안정성이 불안하여 실질적인 효능을 기대하기 어렵다.

한편, 항염 작용은 염증을 방어하는 기전으로, 염증은 조직에 해롭거나 외부로부터 들어온 요인들로부터 생체를 보호하는 국소적인 생리적 반응이다. 이러한 염증반응이 과다하게 유발되면 일산화질소(Nitric oxide, NO) 등의 염증성 산물들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 결합조직의 손상은 피부탄력을 감소시켜 결과적으로 피부의 노화를 촉진시키므로 건강한 피부를 유지할 수 없게 된다. 따라서 피부 건강을 위한 화장료 소재로 항염 작용을 갖는 소재가 요구되는 실정이다.

이와 같이, 보습이나 아토피 등 건조 피부의 문제점을 근본적으로 해결하기 위해서는 감소되어 있는 세라마이드를 회복시키는 것이 일차적인 목표라고 할 수 있으며, 피부 건강을 위해 항염효과를 갖는 소재가 요구되는바, 본 발명자들은 외부에서 세라마이드를 보충하는 기존의 방식을 대폭 수정하여, 천연소재로부터 피부 내에서 세라마이드의 생합성을 촉진시키는 새로운 방식과 더불어 항염효과를 갖는 화장품 소재를 개발하였다.

한편, 인삼(Panax ginseng)은 오갈피나무과(Araliaceae)에 속하는 다년생 초본류로서, 한방에서는 그 뿌리를 인삼(Ginseng Radix)이라 하며, 기원에 따라 인위적 도움 없이 야생에서 자연 발아하여 성장한 산삼과, 천연산삼의 종자나 어린뿌리, 혹은 인삼의 종자를 산림 중에 파종하여 키운 산양산삼, 그리고 논이나 밭에 인삼의 씨를 파종하여 재배한 인삼으로 나눌 수 있다. 인삼은 강장(强壯), 강정(强精), 조혈(造血), 보온(保溫), 건위(健胃), 피로회복, 정신안정, 진정작용 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 인삼의 주요 유효성분으로는 사포닌, 사포게닌, 폴리아세틸렌, 피라진 유도체, 말톨 등이 있으며, 인삼 사포닌은 화학구조의 특성에 따라 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)계, 프로토파낙사트리올 (protopan-axatriol)계 및 올레아노난(oleanonane)계 사포닌으로 구분하는데, 현재까지 각각 19종, 10종, 1종의 화합물이 분리 정제되었으며, 디올계와 트리올계는 체내에서의 약리작용이 서로 다른 것으로 알려져 있다.

인삼 사포닌은 다른 식물의 사포닌과 달리 독성이 없고 0.001% 이하에서는 용혈작용을 나타내지 않는 것으로 알려져 있으며, 중추신경 억제작용, 단백질합성 촉진작용, 부신피질호르몬 분비촉진작용, 면역증강작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다.

대한민국 공개특허 제2003-0019884호 대한민국 공개특허 제2004-0067042호 대한민군 공개특허 제2010-0006618호 대한민국 공개특허 제2012-0069029호 대한민국 공개특허 제2014-0075225호

본 발명은 세린-팔미토일 전이효소 활성화를 통해 세라마이드 생합성 촉진에 의한 피부 보습, 가려움 개선 효과가 있으며, 동시에 항염증 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 제주도 제주시 조천읍 교래리 해발 600~800 m 한라산 중턱에 위치한 것으로, 북쪽~북동쪽 방향으로 위치하고, 경사도 19~21도를 갖으며, 토양의 pH가 5.1~5.35이고, 유기물 함량이 6.8~7.8%인 미사질양토에서 재배된 6년근의 제주 산양산삼 추출물 (이하, '제주 산양산삼 추출물'이라 함) 및 이로부터 유래한 유효성분을 포함하는 피부 보습 및 가려움 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

세라마이드는 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성과 직접적인 관련이 있으며, SPT KO mouse의 피부에서 세라마이드 함량이 감소하면 피부 가려움증과 아토피가 나타나는 것으로 알려진 바 있다(Nakajima K., et al. 2013).

그런데, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물 및 이로부터 유래한 유효성분은 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성을 촉진하여 세라마이드 생합성을 촉진하는 동시에 세라미데이즈(ceramidase) 활성을 억제하여 세라마이드 함량을 증가시킬 수 있다. 이에 본 발명은 피부 보습 및 가려움을 효과적으로 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물 및 이로부터 유래한 유효성분은 필라그린(filagrrin)과 세라마이드의 합성을 감소시켜 피부장벽 결함을 야기하고 악화시키는 인터루킨 1(IL-1)을 억제하는 동시에 염증관련인자인 일산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성을 저해하여 자극을 완화시킬 수 있다. 이에 본 발명은 항염 효능으로 인한 아토피성 피부염 개선효과, 피부자극 완화효과가 우수하다.

결국 본 발명은 세라마이드 함량을 증가시키는 동시에 인터루킨 1(IL-1)을 억제하고 일산화질소의 생성을 저해함에 따라, 피부장벽기능을 강화하여 피부 보습 및 가려움증 개선 효과가 뛰어나고 피부자극 완화효과가 우수하여 아토피성 피부, 건조피부 등의 피부 개선 효과가 뛰어나다.

게다가, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 다른 산양산삼 추출물에 비하여 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성 촉진 및 세라미데이즈(ceramidase) 활성 억제 효과가 뛰어나 세라마이드 함량을 증가시키며, 이에 따라 경표피 수분 손실이 낮다.

또한, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 일반 인삼에 비하여 NO 생성 억제 효과가 우수하다.

여기서, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물을 얻는 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산의 용매를 각각 단독으로 또는 이들을 2종 이상 혼합한 용매를 추출 용매로 이용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 다른 방법으로 추출된 추출물도 포함한다. 예컨대, 초고압 추출법에 의한 추출; 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리; 다양한 크로마토그래피, 예를 들어 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 제주 산양산삼 추출물에 포함되는 것이다.

또한, 제주 산양산삼을 초고압 추출법을 이용하여 초고압 추출하는 경우, 바람직하게는 압력 100~3000MPa, 온도 40~90℃에서 20 ~ 30시간 처리하며, 더욱 바람직하게는 압력 500~1000MPa, 온도 40~60℃에서 23 ~ 25시간 처리하는 것이 좋다.

또한, 초고압 추출시 pH는 특정 pH에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 초고압기 내부 물의 pH를 1~6으로 낮춰 처리하는 것이 좋다. 또한, 본 발명은 이와 같이 초고압 처리한 제주 산양산삼을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 추출용매를 이용하여 환류 추출하고 냉침한 후, 여과시킨 여과액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하는 것이 바람직하다. 본 발명은 이렇게 얻어진 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 ~ 70.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 상기 추출물을 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출물 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

한편, 본 발명에서 제주 산양산삼 추출물은 바람직하게 화장료 조성물 전체에 대해 0.001~30.0 중량% 함유되는 것이 좋은데, 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 피부개선효과가 미미하고, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하다.

한편, 본 발명에서 유효성분으로 포함된다는 의미는 본 발명의 화장료 조성물로부터 세라마이드 생합성 촉진 및 항염증 효과를 나타낼 수 있는 정도로, 화장료 조성물에 제주 산양산삼 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 상기 제주 산양산삼 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 예를 들면, 노화방지 성분, 주름개선 성분, 미백 성분, 보습 성분 및 항균 성분 등을 더욱 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총중량에 대해 0.0001 내지 30중량%이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 특정의 종류에 한정되는 것은 아니나, 일예로 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 기초 화장료 제형과 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류로 이루어진 색조 화장료 제형 중에서 선택되는 어느 하나의 외관을 가질 수 있다. 또한, 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

이와 같이 제조된 본 발명의 화장료 조성물은 세라마이드 함량을 증가시키는 동시에 인터루킨 1(IL-1)을 억제하고 일산화질소의 생성을 저해함에 따라, 피부장벽기능을 강화하여 피부 보습 및 가려움증 개선 효과가 뛰어나고 피부자극 완화효과가 우수하여 아토피성 피부, 건조피부 등의 피부 개선 효과가 뛰어나다.

본 발명은 제주 산양산삼추출물을 유효성분으로 함유함에 따라 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT) 활성화를 통하여 세라마이드 생합성을 촉진함으로써 피부 보습 및 가려움을 효과적으로 개선할 수 있으며 NO 생성 억제를 통해 항염효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 세라마이드 함량을 증가시키는 동시에 인터루킨 1β (IL-1β)을 억제하고 일산화질소의 생성을 저해함에 따라, 피부장벽기능을 강화하여 피부 보습 및 가려움증 개선 효과가 뛰어나고 피부자극 완화효과가 우수하여 아토피성 피부, 건조피부 등의 피부 개선 효과가 뛰어나다.

도 1은 제주 산양산삼 추출물의 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT) 활성 효과를 나타내는 도이다.
도 2는 제주 산양산삼 추출물의 세라미데이즈(ceramidase) 활성 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 3은 제주 산양산삼 추출물이 IL-1β의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
도 4는 제주 산양산삼 추출물의 경표피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL)에 미치는 영향을 나타내는 도이다.
도 5는 제주 산양산삼 추출물의 NO 생성 억제효과를 나타내는 도이다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지 모두 포함한다.

[ 제조예 1 : 제주도, 강원도(평창군 봉평면), 경상도(대구 동구 진인동)]

제주 산양산삼의 약리학적 효과를 비교 검증하기 위하여 비교군으로서 생육환경이 다른 두 지역(강원도, 경상도)의 산양산삼을 구매하여 비교 실험하였으며, 각각 산양산삼의 생육조건은 다음과 같았다.

재배지	경사도(°)	방위	배수등급	토양의 특성	pH	유기물 함량(%)
제주 산양산삼 1	19	북쪽	매우양호	미사질양토	5.24	7.8
제주 산양산삼 2	20	북동쪽	양호	미사질양토	5.35	7.4
제주 산양산삼 3	21	북동쪽	양호	미사질양토	5.1	6.8
강원 산양산삼 1	35	북쪽	약간양호	세사양토	4.67	4.7
강원 산양산삼 2	32	북동쪽	약간양호	세사양토	4.97	4.9
강원 산양산삼 3	27	북서쪽	약간양호	양토	4.4	5.2
경상 산양산삼 1	35	북서쪽	양호	사양토	5.6	6.1
경상 산양산삼 2	38	북동쪽	약간양호	사양토	5.54	5.5
경상 산양산삼 3	39	북쪽	약간양호	사양토	5.72	4.3

또한, 상기의 제주 산양산삼은 해발 600~800 m의 한라산 중턱에서 재배된 것으로 한정하며, 6년근 삼만을 채취 선별하여 실험에 사용하였다. 제주 산양산삼이 재배되고 있는 제주도 제주시 조천읍 교래리 일대(해발 600~800 m)는 부엽토가 많아 유기물이 타지역에 비해 풍부하고 배수가 매우 양호 또는 양호한 미사질양토로 이루어져 있으며 약산성의 유기물 함량이 타지역에 비하여 높은 것으로 확인된다.

[ 실시예 1 : 제주 산양산삼 초임계 추출물의 제조]

상기 제조예 1에서 채취한 제주 산양산삼의 뿌리, 잎, 열매를 동일한 비율로 섞고, 음건하여 파쇄 후 50.0 g을 추출용기에 넣고 CO₂ : 조용매(co-solvent)의 유량(flow rate)을 47.5 g/mL : 2.5 g/min으로 하여 전체 유량(total flow rate)을 50 g/min의 속도로 흘려주었으며, 조용매는 에틸 아세테이트를 사용하였다. 추출온도는 60℃, 추출 시간은 60분, 압력은 300 bar로 추출하였다.

[ 실시예 2 : 제주 산양산삼 초고압 추출물의 제조]

상기 제조예 1에서 채취한 제주 산양산삼의 뿌리, 잎, 열매를 동일한 비율로 섞고, 음건하여 파쇄 후 50.0 g을 초고압처리기를 이용하여 압력 1000MPa 하에서 온도를 50℃로 승온시키고 24시간 처리한 후 실온으로 냉각시켰다. 초고압 처리한 제주 산양산삼을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25 μM의 여과기를 이용하여 농축조로 이송하여 60℃ 정도에서 감압농축 또는 동결 건조하였다.

[ 실시예 3 : 제주 산양산삼 환류 냉각 추출물의 제조]

상기 제조예 1에서 채취한 제주 산양산삼의 뿌리, 잎, 열매를 동일한 비율로 섞고, 음건하여 파쇄 후 50.0 g을 5배량의 70% (v/v) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하여 냉침한 후, 와트만(Whatman) #2 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 60℃ 이하에서 감압 농축 및 동결건조 하였다.

[ 실시예 4 : 제주 산양산삼 초음파 추출물의 제조]

상기 제조예 1에서 채취한 제주 산양산삼의 뿌리, 잎, 열매를 동일한 비율로 섞고, 음건하여 파쇄 후 50 g을 슈퍼노닉 초음파기기를 이용하여 25 KHz의 강도로 30℃에서 약 2시간 동안 추출하여 초음파 추출물을 얻었다. 초음파 추출물은 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25 μM의 여과기를 이용하여 농축조로 이송하여 60℃ 정도에서 감압농축 또는 동결 건조하였다.

[ 실시예 5 : 제주 산양산삼 추출물의 제조]

상기 제조예 1에서 채취한 제주 산양산삼의 뿌리, 잎, 열매를 동일한 비율로 섞고, 음건하여 파쇄 후 50 g을 10배 가량의 40% (v/v) 1,3-부틸렌글라이콜 수용액에 상온에서 3일간 추출하였다. 추출로 얻은 추출물은 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25 μM 필터로 필터하였다.

한편, 본 실시예에서는, 제주 산양산삼 1 내지 3으로부터 추출한 추출물을 각각 실시예 5-1, 실시예 5-2, 실시예 5-3으로 나타내어 하기 실험에서 샘플로 사용하였다.

[ 비교예 1 내지 5 : 강원 산양산삼 추출물의 제조]

실시예 1 내지 5와 동일한 방법으로 강원 산양산삼 추출물을 제조하였다.

[ 비교예 6 내지 10 : 경상 산양산삼 추출물의 제조]

실시예 1 내지 5와 동일한 방법으로 경상 산양산삼 추출물을 제조하였다.

[ 실험예 1 : 제주 산양산삼의 세린- 팔리토일 전이효소 활성 촉진효과 및 세라미데 이즈 활성 억제효과 확인]

본 실험에서는 제주 산양산삼이 세라마이드의 생합성에 관여하는 핵심효소인 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성에 영향을 미치는 정도와 세라마이드를 분해하는 세라미데이즈(Ceramidase)의 활성억제에 영향을 미치는 정도를 측정하였다.

인간 각질 세포주 (HaCaT, keratinocyte)를 6 well 배양접시에 분주하고 80%정도 세포가 찼을 때 배지를 1% FBS로 교체하고 각 시료를 농도별로 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수거하여 용해시키고 세포용해물을 'BCA protein assay kit'로 단백질을 정량하였다. 100 ㎍의 세포용해물에 클로로포름(CHCl₃):메탄올(MeOH)을 1:2(v/v)로 혼합한 용액 1 ml을 넣고 1시간 혼합(vortexing)하였다. 혼합물을 14,000~15,000 rpm, 3~5 분간 원심분리한 후 하층을 새로운 용기에 옮겨 Spee Vac (진공)을 이용하여 건조하였다. 클로로포름(CHCl₃):메탄올(MeOH)을 1:2 (v/v)로 혼합합 용액을 30 ㎕ 넣고 재용해하였다. 획득한 세라마이드는 박층크로마토그래피 (TLC)를 이용하여 확인하였다. 전개용매는 Diisopropylether/MeOH/29% NH₄OH = 40:10:1(v/v/v)로 제조하여 사용하였고 N-Lauryl-D-erythro-sphingosine C12 ceramide 2 mM을 점적하여 표준 시료(Standard)로 사용하였고 전개 후 10% 황산용액을 이용하여 발색하여 결과를 확인하였다.

세포에서 회수되어 정량한 단백질은 10% SDS-PAGE gel에서 전기영동 시킨 후 PVDF 멤브레인에 전이(transfer) 시킨 후, 1차 항체 (SPT, ceramidase: Santa cuz., USA)를 4 ℃에서 오버나이트 처리한 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후 TBST로 세척하고 ECL 반응 kit을 이용하여 반응시켜 밴드를 확인 하였다. 각 밴드의 강도(intensity)는 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 '% control' 하여 정량하여 활성도 (%)와 저해율(%)을 계산하였다.

그 결과는 도 1, 2에 나타내었는데, 이에 의하면 제주 산양산삼 추출물(실시예 5-1 내지 5-3)는 비교예 5, 10에 비하여 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성을 증가시키고, 세라미데이즈(Ceramidase)의 활성을 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 제조 산양산삼은 세라마이드 생합성을 촉진하고, 그 분해를 억제함으로써 피부 보습 및 가려움을 효과적으로 개선할 수 있는 것으로 결론 내릴 수 있었다.

[ 실험예 2 : 제주 산양산삼의 IL- 1β 억제 효과 확인]

염증으로 인하여 도움T세포2(helper T cell 2)가 분비하는 IL-1β는 아토피성 피부염이 있는 피부에서 주로 발견되는 사이토카인으로서, 필라그린(filaggrin)과 세라마이드의 합성을 감소시켜 피부장벽 결함을 야기하고 악화시킨다. 따라서, 본 실험에서는 제주 산양산삼 (실시예 5-1 샘플)이 IL-1β의 mRNA 발현을 억제하는 정도를 알아보았다.

RAW 264.7 세포를 PBS로 세척한 후, 트립신을 이용해 배양접시에서 떼어낸 후, 6 well 플레이트에 3×10⁵ cells 로 접종하고 24시간 안정화시켰다. 10 ㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccaride)와 각 추출물을 동시에 처리하였다. 24시간 후에 트리졸(Trizol)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA는 UV 스펙트로미터로 정량한 후, 2 ㎍의 RNA를 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 이용해 cDNA로 합성하고, Taq 중합효소를 이용하여 증폭시켰다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 아가로스 겔에 전기영동을 실시한 후 밴드를 확인하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었는데, 이에 의하면 제주 산양산삼 추출물 (실시예 5-1)은 농도 의존적으로 IL-1β의 mRNA 발현을 억제함을 알 수 있었다.

[ 실험예 3 : 제주 산양산삼의 세라미데이즈 ( ceramidase ) 억제 효과 확인]

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 세라미데이즈(ceramidase)를 생산하여 피부에 존재하는 세라마이드를 분해시키므로, 제주 산양산삼 추출물로부터 황색포도상구균의 억제능을 페이퍼 디스크 방법 (paper disc method)를 이용하여 측정함에 따라 세라미데이즈 활성을 억제하는 효과를 탐색하였다.

실시예 5-1 내지 5-3, 비교예 5, 10의 추출물을 각각 100㎕씩 페이퍼-디스크에 흡수시키고, TSA와 PDA 배지를 굳힌 페트리 디쉬 중앙에 각 페이퍼-디스크를 올려 놓았다. 세균 중 황색포도상구균(S. aureus)는 균 농도를 1×10⁵ cfu/ml의 농도로 균주를 희석하고 Tap 아가(0.05%) 10 ml에 희석한 후, 페트리 디쉬 위에 1 ml 분주 후 32 ℃에서 24시간 배양을 하여 확인하였다.

그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	실시예 5-1	실시예 5-2	실시예 5-3	비교예 5	비교예 10
	Concentration (0.1%)
S. aureus	22.0	21.7	22.2	12.1	11.8

(단위 : mm)

상기 표 1에 의하면, 실시예 5-1 내지 5-3은 비교예 5, 10에 비하여 저해환의 크기가 매우 큼을 알 수 있었다. 이에 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 세라미데이즈의 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다.

[ 실험예 4 : 세라마이드 함량 및 경표피 수분 손실 측정]

본 실험예에서는 실시예 5-1 내지 5-3, 비교예 5, 10의 추출물에 대하여 테이프 스트라이핑 법(tape striping method)을 이용하여 인체 적용시험에서 세라마이드의 함량을 측정하였다.

세라마이드 함량은 테이프 스트라이핑 (tape stripping) 또는 패치(patch)를 이용하여 테이프에서 지질을 추출하고 HPTLC (High performance thin layer chromatography: silica gel 60A, 200 um thickness, Whatman, USA)에 점적하여 다음의 전개 용매를 사용하여 세라마이드를 분획하여 (1차 전개액, Chloroform:Methanol:acetone, 76:20:4 (v/v/v)와 2차 전개액 Chloroform:acetone:methanol, 80:10:10, v/v/v, 3차 전개액 chloroform:ethylacetate:et-her:methanol, 76:20:6.2) 그 함량을 분석하였다.

세라마이드 함량 측정 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

	실시예 5-1	실시예 5-2	실시예 5-3	비교예 5	비교예 10
세라마이드 함량 (% of control)	147.5	146.2	149.4	115.2	123.3

이에 의하면, 실시예 5-1 내지 5-3은 비교예 5, 10에 비하여 세라마이드 함량이 높음을 알 수 있었다.

한편, 실시예 5-1, 비교예 5, 10의 샘플에 대해 경표피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL) 효과를 측정하였다. 경표피 수분 손실량은 'Evaporimeter'를 이용하여 측정하였으며, 측정단위는 g/h/m²으로 측정하였다. 모발이 없는 피부를 수평을 이룬 상황에서 상기 실시예 5-1, 비교예 5, 비교예 10의 시료 각각에 대해, 바른 부분과 바르지 않은 부분의 차이를 측정하여 비교하였다.

경표피 수분 손실 측정 결과는 도 4에 나타내었는데, 이에 의하면 실시예 5-1은 비교예 5, 10에 비하여 경표피 수분 손실이 매우 낮음을 알 수 있었다.

이에 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 세라마이드 함량을 증가시킴에 따라 경표피 수분 손실이 낮아 피부 보습에 매우 효과적임을 알 수 있었다.

[ 실험예 5 : 제주 산양산삼 추출물의 NO 생성 억제 활성 탐색]

본 실험에서는 제주 산양산삼 추출물을 RAW264.7 대식세포(macrophage)에 처리함으로써 항염증과 관련된 지표인자인 Nitric Oxide (NO)의 생성을 억제하는 정도를 '일반 인삼 추출물 (실시예 5의 방법에 의해 추출된 것)'과 비교하여 알아보았다.

RAW 264.7 세포를 24 well 플레이트 (6×10⁵/well)에 DMEM 배지로 분주하고 2시간 동안 플레이팅(plating)하였다. 여기에 실시예 5-1의 추출물을 농도별로 처리하고 1시간 후에 LPS (1 g/ml)를 24시간 처리하였다. 24시간 처리한 세포의 상등액을 EP (Ependorf) 튜브에 옮겨 부유물이 남지 않도록 원심분리하고 그 상등액 70 ㎕와 Griess reagent (1% sulfanilamide + 2% phosphoric acid, 0.1% -naphthylethylene diamide dihydrochloride) 70 ㎕를 혼합하여 15분 동안 상온에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 5에 나타내었는데, 이에 의하면 본 발명의 제주 산양산삼 추출물은 일반 인삼 추출물에 비하여 NO (Nitric Oxide)의 생성을 탁월하게 억제함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 제주 산양산삼은 염증으로 인한 자극완화 효능이 탁월한 것으로 결론내릴 수 있었다.

Claims (4)

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2. 해발 600~800 m 한라산 중턱에 위치한 것으로, 북쪽~북동쪽 방향으로 위치하고, 경사도 19~21도를 갖으며, 토양의 pH가 5.1~5.35이고, 유기물 함량이 6.8~7.8%인 미사질양토에서 재배된 6년근의 제주 산양산삼의 뿌리, 잎 및 열매를 동량비로 혼합한 후, 40%(v/v) 1,3-부틸렌글라이콜 수용액으로 상온에서 추출하여 제주 산양산삼 추출물을 제조하는 단계를 포함하며,
   상기 제주 산양산삼 추출물은 세린-팔미토일 전이효소(Serine-palmitoyl transferase, SPT)의 활성을 촉진하고, 세라미데이즈(ceramidase)의 활성, 인터루킨 1β(IL-1β)의 mRNA 발현 및 일산화질소(Nitric oxide, NO)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 보습, 가려움증 개선 및 피부 자극 완화용 화장료 조성물의 제조방법.
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