KR101810810B1 - 물 샘플에서의 미생물을 판정하는 방법과 기기 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예를 들면, 바닷물이나 다른 물 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하기 위한 방법과 기기에 관한 것이다. 수단이 테스트될 물의 샘플을 취하고, 일련의 저장부를 통과해 이동시키고, 그리고 상기 샘플에서의 임의의 미생물의 DNA를 결합하는 염색제와 같은 지시약과 혼합하도록 제공된다. 지시약의 임의의 혼합은 예를 들면, 분광형광계나 또는 지시약을 측정하는데 적당한 여러 장치에 의해 측정된다.

Description

물 샘플에서의 미생물을 판정하는 방법과 기기{Method and Apparatus for Determining Microorganisms in a Water Sample}

본 출원은 미국특허청에 2014년 04월 09일에 출원된 미국특허 가출원번호 제61/977,330호를 우선권 주장하고 있다.

본 발명은 바이오센서 및 DNA 염색(staining) 기술을 사용하는, 바닷물을 포함한 시스템과 같은 유동하는 물 시스템에서 미생물을 연속의 자동화된 실시간 판정하는데 유용한 방법과 기기에 관한 것이다.

유동하는 물을 포함한 임의의 시스템에 있어서, 물에서의 미생물의 존재는 부정적인 방식으로 상기 시스템에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 문제점의 예는 미생물에 의해 영향을 받는 기구의 부식, 시스템이나 저장부의 폐색, 생물오손(biofouling) 등을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제8,525,130호를 참조하기 바라며, 이 특허문헌은 참조를 위해 본 명세서에 그 내용이 모두 통합되어 있으며, 바닷물 담수 설비에서의 생물 오손에 의해 야기된 문제점과, 상기 담수 설비의 기기에서 성장하는 예를 들면, 생물막을 검출해 분석하기 위한 노력에 대해 언급하고 있다.

바이오센서를 사용하여 미생물의 존재를 판정하기 위한 많은 방법론이 알려져 있지만, 천연수, 레크레이션용(recreational) 물, 바닷물 등과 같은 유체에 적용가능한 이들 방법에서 사용가능한 제한된 정보가 존재한다. 이와 관련하여 참조를 위해 본 명세서에 또한 통합되어 있는 미국특허 제8,206,946호를 살펴보기 바란다.

참조를 위해 본 명세서에 통합된 미국특허 제6,787,302호는 유체 샘플에서의 생균(viable cell)을 판정하기 위해 상업적으로 이용가능한 염료 "SYTO16"의 사용을 개시하고 있다. 또한, 미생물 판정을 위한 형광 염료의 사용을 개시하고 있는, 미국특허 제8,206,946호, 미국특허 공개번호 제20040191859호, 및 PCT 출원 WO 1995 0191859호를 살펴보기 바란다. 이들 특허문헌은 참조를 위해 본 명세서에 모두 통합되어 있다.

이들 특허문헌 어느 것도 바닷물과 같은 물 샘플에서의 미생물의 존재의 자동화되고 연속의 모니터링에 사용될 수 있는 실시간 분석 시스템에 사용가능한 방법 및/또는 기기를 개시하거나 언급하고 있지 못하고 있다.

아래에 기재된 본 발명은 위에서 언급된 문제점을 처리하기 위한 기기 및 방법에 관한 것이다.

본 발명은 바닷물과 같은 유동하는 물 시스템에서의 미생물을 연속에 기초하여 모니터링하는데 유용한 방법 및 기기에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DNA 염색 기술을 자율(autonomous) 미생물 센서에 통합하는 단계를 포함하고, 이에 따라 미생물에 있어서 아주 흔한 DNA 염색을 통한 미생물의 검출을 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 실시예를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따라 실행된 한 실험의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 도 3b는 다른 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 또 다른 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명의 일 실시예가 도 1에 나타나 있다. 도 1을 살펴보면, 파이프라인(117)과 연결된 파이프라인 밸브 "101"가 나타나 있다. 이는 아래에 기재된 바이오센서와 바닷물 주입 사이드 스트림(side stream) 사이의 연결기 인터페이스(connector interphase)로서 사용된다. 또한 압력 조정기(102)가 기재되어 있으며, 상기 압력 조정기는 바이오센서로 주입된 물의 압력을 조정하고, 그리고 샘플링 챔버로의 안정적인 유동을 보장한다. 아래에 기재된 바와 같이, 물의 압력은 10 bar 아래일 수 있다.

안정적이고, 규칙적인 유동의 물의 이동은 제한기 부재 "103"를 구비한 배관 수단에 의해 또한 용이하게 된다. 물은 배관 수단을 통해 샘플링 챔버 "104"로 유동한다. 이러한 챔버는 새로운(fresh) 샘플의 일정한 이용가능성을 보장하는 일정한 오버플로(overflow)를 갖는다. 또한, 정확한 샘플 볼륨(예를 들면, 5 ml)을 갖도록 교정되는 자동식 주사기 "105"가 제공되며, 상기 정확한 샘플 볼륨은 2 포트 주입 밸브 "106" 및 분배 밸브 "110"에 의해 용이하게 된다. 주입 밸브(106)는 샘플 챔버와, 또한 지시약 저장부(indicator reservoir) "107"로부터 물을 제거한다. 샘플 및 DNA 염색이 혼합되고 있을 때, 자동식 주사기 "105"는 액체를 전후방으로 빼내고, 이후 더욱 일정한 혼합을 보장하기 위해, 액체가 혼합 챔버 "108"로 이동한다. 그러나, 더욱 일반적으로, 주사기는 예를 들면, 아래에서 언급된 저장부(111 및 112), 지시약 저장부, 샘플링 챔버로부터의 액체와, 그리고 본 명세서에 나타나 있지 않은 공기 필터로부터의 공기의 샘플을 취하도록 사용된다. 액체 또는 공기가 이후 샘플링 챔버, 지시약 저장부, 아래서 언급된 혼합 챔버, 또한 아래서 언급된 흐름 셀(flow cell), 및 물 저장부 쪽으로 이동될 수 있다. 밸브(110) 및 주입 밸브(106)의 위치는 샘플의 선택 및 분배를 제어한다. 또한 큐벳(cuvette)을 통한 유동으로 보여질 수 있는 흐름 셀 "109", 예를 들면, 증류수를 수용한 제1 저장부 "111", 및 세정제를 수용한 제2 저장부 "112"가 제공되며, 이들 저장부 각각에 작업 기기로 개별 재료를 빼내기 위한 수단 "113" 및 "114"이 제공되는 것으로 또한 나타나 있다. 바람직한 실시예에 있어서, 분배 밸브(110)가 동력공급된다. 도 1의 실시예에 도시된 바와 같이, 주입 밸브는 복수의 포트(이러한 실시예에서, 8개의 포트, 각각의 포트가 유도 라인(lead line)에 의해 나타내어짐)를 구비하고, 그리고 주사기가 액체 또는 공기를 빼내는 곳으로부터, 그리고 상기 주사기가 비워질 때 주사기 내용물이 분배되는 곳까지 제어한다. 또한 본 명세서에 개시된 것은 기기를 주변 환경으로부터 보호하도록 사용되는 포위 수단(115)의 일부이다. 센서 자체는 본 도면에 나타나 있지 않다. 측정 이후에, 샘플 폐 재료가 수단(116)을 통해, 예를 들면, 본 명세서에 나타나 있지 않은 폐기물 저장부로 운송된다.

작동 중에, 기기는 "on" 모드로 자동으로 또는 수동으로 터언 온된다. 이처럼 자동으로 터언 온이 행해졌을 경우, 타이머, 컴퓨터 제어부, 인터 또는 인트라넷 연결 등이 사용될 수 있다. 자동식 타이머가 사용될 때, 이는 내부 인트라넷 연결을 통해, 원격 제어에 의해, 바이오센서의 일부인 컴퓨터를 프로그래밍함으로써, 또는 통상적인 소프트웨어나 또는 맞춤형 소프트웨어를 사용하여, 컴퓨터를 터언 온하도록 구성된다. 자동식 타이머 수단은 최소 에너지를 사용하지만, 그러나 다른 시스템이 사용될 수 있다.

위에 언급된 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기기는 유체(예를 들면, 물 샘플, 염료 용액, 청정제, 및 세척수)를 운송 및 혼합하기 위한 분배 시스템을 사용한다. 언급된 실시예에 있어서, 주사기가 사용되지만, 당업자라면 분배 및 혼합을 위한 다른 모드의 가능성에 대해 알고 있을 것이다.

작동 중에, 예를 들면, 바닷물과 같은 물의 샘플이 샘플링 챔버로부터 제거되고, 그리고 아래서 언급된 바와 같이 정확한 양이 사전판정되지만 가변 비를 갖는 DNA 바인딩 염료와 같은 지시약에 의해, 혼합된다. 이러한 비는 지시약의 특성, 테스트되는 액체의 염분, 및 다른 여러 요인을 포함한 많은 요인에 따라 결정된다. 예로서, SYBR^® Green I((N^',N^'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-yildene)methyl]-1-phenylquinolin-1-um-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine))는 1:10,000 비로 55% 염분을 갖는 바닷물과 혼합되었다. 혼합물이 사전판정된 시간 간격 동안 배양되어, 세균 세포 멤브레인을 통한 지시약의 침투와 예를 들면, DNA에 대한 지시약의 결합(binding)을 허용한다. 배양 시간의 길이의 선택은 변할 것이고, 그리고 요구되는 민감도의 정도에 따라 결정되어 증가할 것이다. 아래 기재된 실시예에 있어서, 배양 시간은 40분 이었다.

배양 이후에, 샘플은 예를 들면, 490 nm의 여기 파장을 갖는 LED 광원과 같은 형광을 통해 지시약의 검출 동안에 적용되고 있는 흐름 셀에 펌프된다. 이러한 매개변수는, 예열 시간이 짧고 에너지 요구가 적기 때문에, 사용된다. 광의 진입과 방사는 예를 들면, 간섭을 최소화하기 위한 광학 필터를 통해 제어될 수 있고, 그리고 방사된 광은 분광분석법을 통해 520 nm에서 측정된다. 당업자가 사용된 지시약의 특성에 따라 결정되는 LED 특성 및 필터를 변경시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 시스템을 통해 안전한(secure) 임의의 데이터가 센서 컴퓨터에 저장될 수 있고, 그리고 직접적으로 또는 원격으로 접근가능하다. 당업자는, 필터 및 LED 파장이 사용된 염료에 따라 결정되어 변할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.

주어진 시간 간격에서 취해질 수 있는 측정 수와 작동 길이는 시약 용기의 크기와 같은 요인에 독립적이다.

실시예 1

아래 기재된 실시예는 앞서 기재된 실시예를 이용해 기재된다. 시약의 검사 및 교체가 요구되기 전에 하루 3회 측정으로써, 26일 동안 셋업 작동이 가능하게 된다.

바이오센서는 평탄한 표면에 놓여, 파워 서플라이(230V AC, 파워 서플라이에 대한 접지, 어쓰 및 라이브를 구비)에 연결되었다. 시스템이 태양 전지판, 컨트롤, 및 배터리의 사용에 적용될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

또한, 센서가 10 bar 보다 낮은 압력을 갖는, 사이드 스트림에 연결되었다. 운송 수단의 연결 및 교체를 용이하게 하는, 컨넥터의 푸쉬에 의해 연결이 용이하게 되었으며, 상기 운송 수단은 물을 시스템으로 이동시킨다.

작동 중에, 현 시스템은 40℃ 보다 낮은 온도에서 작동하도록 설계된다. 온도가 40℃ 이상 상승된다면, 통합된 구성요소가 시스템을 셧 다운시킨다. 온도에 민감하지 않은 구성요소가 사용된다면, 또는 냉각 수단이 시스템에 통합된다면, 이러한 구성은 불필요할 수 있다.

아래 기재된 사항은 시스템이 작동하는 일반적인 방식을 상세하게 나타내고 있지만, 그러나, 당업자라면 이에 대한 변경이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다.

바이오센서는 먼저 온도 및 습도를 측정하여, 임계 매개변수(예를 들면, 40℃를 넘는 온도, 또는 90%를 넘는 습도)가 존재하는지의 여부를 판정한다. 위에서 언급한 바와 같이, 설비는 이러한 경우에 셧 다운한다.

센서는 또한 임의의 시약이 보충을 필요로 하는지에 대한 정보를 제공한다.

환경적 조건이 만족스럽고 필요한 양의 시약이 존재한다면, 분광계는 예열되고 그리고 시스템은 샘플에 의해 세척된다(rinse). 이에 이어서, 물 샘플 및 사전 설정된 비를 사용하는 다량의 염료 용액 모두가 주사기로 빼내진다. 이들은 액체를 혼합 챔버 전후로, 예를 들면, 3회 펌핑함으로써 혼합된다. 혼합 이후에, 샘플이 배양되고, 흐름 셀에 투약되었고, 형광이 검출되었다.

이에 이어서, 시스템은 세정제, 증류수, 공기, 및 이후 증류수로 다시 가득찬다(flush). 시스템은 이후, 처리가 반복될 수 있을 때와 관련하여 자동화된 지령이 인풋된 상태에서 셧 다운된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 발명은 수 주에서 수 시간까지 물 샘플을 분석하는데 필요한 시간을 감소시킨다.

실시예 2

물 공급이 위에서 설명된 방법론을 사용해 분석되었다. 균수(microbial content)가 처음부터 많았으나; 그러나, 화살표로 지시된 지점에서(측정이 개시된 이후에 10일), 살생물제가 첨가되었고, 그리고 값이 검출 한계치보다 낮았다는 것을 도 2로부터 알 수 있을 것이다. (도 2의 데이터가 형광 시그널 사이의 상관관계, 및 메뉴얼 카운팅을 나타내고 있음을 알기 바람).

실시예 3

본 명세서에 기재된 본 발명의 긴 기간의 필드-테스트(field-testing)가 사우디 아라비아에서 실행되었다. 도 3a 및 도 3b는 형광 염색의 상관관계 및 메뉴얼 카운팅에 의한, 데이터를 다시 나타내고 있다. 선형 상관관계는 균수(cell number)(바닷물의 균/ml)로의 전환을 가능하게 한다. 전환 계수는 이 중에서도 미생물 크기, 염료 및 샘플의 화학 조성에 기초하여 모든 시스템에 상이할 것이다.

실시예 4

긴 기간의 필드 테스트에 있어서, 바닷물의 균수가 4-달 기간 내내 하루 3회 측정되었다. 도 4에 도시된 결과는 미생물 존재 뿐만 아니라 성장률의 증감 기간에 대한 기중한 정보를 제공하였다. 예를 들면, 살생물제 처리에 이어, 검출가능한 미생물이 없었으며, 이후 성장률이 증가된다.

당업자라면 다른 실시예가 가능하다는 것을 알 수 있을 것이며 이에 대한 반복은 본 발명에서 필요하지 않는다.

본 명세서에서 사용되고 있는 용어와 표현은 예시적으로 사용된 것으로서 기재된 용어만으로 한정되는 것은 아니며, 이러한 용어와 표현은 또한 본 명세서에 기재되고 나타내어진 특징부나 이러한 특징부의 일부를 배제하도록 의도되지 않았음을 알 수 있을 것이며, 본 발명의 범주 내에서 다양한 변경이 가능하다는 것을 알 수 있을 것이다.

Claims (8)

1. 바이오센서를 포함한, 물 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는데 사용가능한 기기로서,
   상기 바이오센서는 제1 밸브 수단을 통해 상기 바이오센서에 물 샘플을 제공하기 위한 수단과 연결되고, 상기 바이오센서는 샘플 챔버로의 물의 유동을 조정하는 제한기 수단 및 압력 조정기 수단을 더 포함하고, 상기 샘플 챔버는 혼합 챔버로 한 볼륨의 샘플을 운송하기 위한 제1 운송 수단을 구비하고, 상기 혼합 챔버로 DNA 염색 염료의 운송을 위한 제2 수단이 DNA 염색 염료 저장부에 제공되고, 상기 제1 운송 수단 및 제2 수단은 샘플 및 DNA 염색 염료의 볼륨을 제어하기 위한 주입 밸브 수단을 연결시키고; 상기 혼합 챔버는 상기 혼합 챔버와 연결된 주사기 수단을 구비하고, 상기 주사기 수단은 상기 샘플과 DNA 염색 염료를 혼합하도록 작동가능하고, 상기 혼합 챔버와 분석 샘플의 유체 연통을 유지시키기 위한 수단과, 증류수를 수용하고 증류수를 상기 기기로 이송하기 위한 수단을 통해 상기 바이오센서와 연결된 제1 저장부 수단, 상기 바이오센서로 청정제를 이송하기 위한 수단을 통해 상기 기기와 연결된 상기 기기로부터 소정의 샘플 및 DNA를 가득차게 하기 위한 청정제를 수용하는 제2 저장부 수단, 상기 혼합 챔버로부터 폐기물을 제거하기 위한 수단을 통해 상기 혼합 챔버와 연결된 폐기 처분 수단, 및 상기 분석 샘플을 수용한 상기 수단에서 상기 DNA 염색 염료를 판정하기 위한 수단이 제공되는, 바이오센서를 포함한 물 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는데 사용가능한 기기.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 DNA 염색 염료를 판정하기 위한 수단은 분광형광계인, 바이오센서를 포함한 물 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는데 사용가능한 기기.
3. 액체 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는 방법으로서,
   혼합물을 형성하도록 DNA 염색 염료 샘플과 함께 청구항 1에 따른 기기의 혼합 챔버로 액체 샘플을 운송하는 단계, 상기 혼합물을 배양하는 단계, 및 미생물의 존재의 DNA 염색 염료로서 발생하게 되는 상기 DNA 염색 염료의 흡수(uptake)를 판정하는 단계를 포함하는, 액체 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는 방법.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 액체 샘플은 바닷물인, 액체 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는 방법.
5. 청구항 3에 있어서,
   상기 DNA 염색 염료는 SYBR^® green I인, 액체 샘플에서의 미생물의 존재를 판정하는 방법.
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