JP6216472B2 - 試水中の微生物を決定する方法および装置 - Google Patents

Description

本願は、２０１４年４月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９７７，３３０について優先権を主張するものである。

本発明は、バイオセンサーおよびＤＮＡ染色技術を用いた、流水系、例えば海水を含む系等における微生物のリアルタイムな連続的自動化決定に有用な方法および装置に関する。

流水を含む任意の系では、水中の微生物の存在は、系に悪影響を及ぼす場合がある。そのような問題の例としては、機器の微生物腐食、系または貯蔵部の目詰り、生物付着などが挙げられる。例えば米国特許第８，５２５，１３０号（参照により組み込まれる）を参照されたい。これは、海水淡水化プラントにおいて生物付着により生じた問題について議論し、例えばプラントの装置上で成長する生物膜を検知し分析する努力がなされている。

バイオセンサーを用いて微生物の存在を決定するための多くの方法論が知られているが、これらの方法の流体、例えば天然水、レクリエーション水域、海水などへの適用性における利用可能な情報は限られている。これに関し、米国特許第８，２０６，９４６号（これも参照により組み込まれる）を参照されたい。

米国特許第６，７８７，３０２号（その開示は参照により組み込まれる）は、流体試料中の生存細胞を決定するための市販色素「ＳＹＴＯ１６」の使用を教示する。微生物を決定するための蛍光染料の使用を開示している米国特許第８，２０６，９４６号、公開米国特許出願第２００４０１９１８５９号、およびＰＣＴ出願ＷＯ １９９５ ０１９１８５９もまた参照されたい。すべて参照により組み込まれる。

これらの参考文献にはいずれも、海水などの水試料中の微生物の存在を自動かつ連続的に監視するために使用することができるリアルタイム分析システムに有用な方法および／または装置について教示されておらず、開示もされていない。

米国特許第８，５２５，１３０号明細書 米国特許第８，２０６，９４６号明細書 米国特許第６，７８７，３０２号明細書 米国出願第２００４／０１９１８５９号明細書 国際公開１９９５／０１９１８５９パンフレット

以下に開示される本発明は、上記の問題に対処する装置および方法を対象とする。

本発明は、海水等の流水系の微生物を連続的に自動監視するのに有用な方法及び装置に関する。さらに、本発明は、ＤＮＡ染色技術を自律的微生物センサーに組み込むことを含み、したがって、微生物中に偏在するＤＮＡを染色することによって微生物を検出することを可能にする。

図１は、本発明の実施態様を示す。 図２は、本発明に従って行われた一実験からの結果を示す。 図３ａおよび３ｂは、さらなる結果を示す。 図４は、さらなる結果を示す。

本発明の一態様は図１に示される。図１によれば、パイプライン弁「１０１」が示され、パイプライン１１７に接続される。これは、後述するバイオセンサーと海水注入側流との間のコネクタ中間相として働く。また、バイオセンサーに注入される水の圧力を調整し、サンプリングチャンバーへの安定した流れを確保する圧力レギュレーター１０２が示されている。後述するように、水の圧力は１０バール未満となる。

安定した規則的な流れでの水の供給はまた、絞り弁要素「１０３」を有する配管手段により促進される。水は、配管手段を通ってサンプリングチャンバー「１０４」に流れる。このチャンバーには一定のオーバーフローがあり、新しい試料の一定な利用が確保される。また、２ポート注入弁「１０６」および分配弁「１１０」によって促進される通り、正確な試料容量（例えば５ｍＬ）を採取するように較正された自動化シリンジ「１０５」も示されている。注入弁１０６は、試料チャンバーから、および指示薬リザーバー「１０７」から水を除去する。試料およびＤＮＡ染色剤が混合されるとき、自動化シリンジ「１０５」は、液体を前後に引き込み、その後、混合チャンバー「１０８」に移動し、均一な混合をさらに確実にする。しかしながら、より一般的には、シリンジは、例えばサンプリングチャンバー、指示薬リザーバー、以下に説明するリザーバー１１１および１１２からの液体およびエアフィルターからの空気（図示せず）などの試料を採取するために使用される。次いで、液体または空気を、サンプリングチャンバー、指示薬リザーバー、後述する混合チャンバー、後述するフローセル、および水リザーバーに向けて移動させることができる。弁１１０および噴射弁１０６の位置は、試料の採取および分配を制御する。また、フローセル「１０９」が示され、蒸留水を含む第１リザーバー「１１１」と、洗浄剤を含む第２リザーバー「１１２」とがキュベットを通る流れとして示され、それらは、各材料を作業装置へ引き込むための手段「１１３」および「１１４」が設けられている。好ましい実施形態では、分配弁１１０は電動化されている。図１の実施形態に示されている通り、これは複数のポート（この実施形態では８つがそれぞれリード線で表される）を有し、シリンジが液体または空気をどこから吸い込むか、およびシリンジ内容物が、シリンジが空になるときにどこへ分配されるかを制御する。本明細書では、装置を環境から保護するために使用される封入手段１１５の一部が示されている。センサー自体はこの図には示されていない。試料の測定後、廃棄物は、手段１１６により、例えば図示されていない廃棄リザーバーに移される。

操作中、装置は自動的にまたは手動で「オン」モードにされる。これが自動的に行われるとき、タイマー、コンピュータ制御、イントラまたはイントラネット接続などが使用され得る。自動化タイマーが使用される場合、これは、標準またはカスタマイズされたソフトウェアを使用してコンピュータをオンにするように、またはバイオセンサーの一部であるコンピュータをプログラミングすることによって、またはイントラネット接続を介して遠隔制御によって構成される。自動化タイマー手段は最小のエネルギーを利用するが、他のシステムを使用することもできる。

上記の説明から分かるように、本発明の装置は、流体（例えば、水試料、染料溶液、洗浄剤、およびすすぎ水）を輸送および混合する分配システムを使用する。図示の実施形態では、シリンジが使用されるが、当業者は、分配および混合のための他の様式の可能性を理解するであろう。

操作中、水の試料、例えば海水がサンプリングチャンバーから取り出され、以下に述べるように、正確な量が所定であるが可変比率でＤＮＡ結合染料などの指示薬と混合される。比率は、指示薬の性質、試験される液体の塩分、および他の要素を含む多くの要素に依存する。実施例中、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩ（（Ｎ’，Ｎ’−ジメチル−Ｎ−［４−［（Ｅ）−（３−メチル−１，３−ベンゾチアゾール−２−イルデン）メチル］−１−フェニルキノリン−１−ウム−２−イル］−Ｎ−プロピルプロパン−１，３−ジアミン））を、５５％塩分を有する海水と１：１０，０００比で混合した。混合物を所定時間インキュベートして、指示薬の細菌細胞膜への浸透、および指示薬の例えばＤＮＡへの結合を可能にする。インキュベーション時間の長さの選択は様々であり、所望の感度の程度に応じて増加する。以下の実施例では、インキュベーション時間は４０分であった。

インキュベーション後、試料は、例えば４９０ｎｍの励起波長を有するＬＥＤ光源などを用いて、例えば蛍光により指示薬を検出するように適合されたフローセルにポンプ輸送される。ウォームアップ時間が短く、エネルギー需要が少ないため、このパラメータが使用される。光の入射および放出は、干渉を最小にするために、例えば、光学フィルターを介して制御することができ、放出光は、５２０ｎｍでの分光測定により測定される。使用される指示薬の性質に応じて、ＬＥＤ特性およびフィルターを変えることができることはよく知られている。本明細書に記載されたシステムにより保護された任意のデータは、センサーコンピューターに格納され、直接的または遠隔的にアクセス可能である。当業者は、使用される色素に応じて、フィルターおよびＬＥＤ波長を変えることができることを認識するであろう。

所与の時間内に採取され得る操作の長さおよび測定の数は、試薬容器のサイズなどの要素に依存する。

実施例１
以下の例は、上記の実施形態の使用を説明する。検査と試薬の交換が必要となる前に１日３回の測定で２６日間のセットアップが可能であった。

バイオセンサーを平らな面に置き、電源（２３０ Ｖ ＡＣ、電源用のライブ、ニュートラルおよびアース付き）に接続した。このシステムは、ソーラーパネル、制御装置およびバッテリーの使用に適合させることができることに留意すべきである。

さらに、センサーを１０バール未満の圧力を有する側流に接続した。接続は、システムに水をもたらす輸送手段の接続および交換を容易にするプッシュインコネクタによって容易になる。

操作中、現行システムは４０℃未満の温度で機能するように設計される。温度が４０℃を超えると、組み込まれた部品がシステムをシャットダウンする。温度に敏感でない部品が使用されている場合、または冷却手段がシステムに組み込まれている場合、この特徴は不要である。

以下は、システムが動作する一般的な方法を説明する。しかしながら、当業者によって認識されるように変形が可能である。

バイオセンサーは、まず、温度および湿度を測定して、制限パラメータ（例えば、４０℃を超える温度、または９０％を超える湿度）が存在するかどうかを決定する。上述の通り、この場合、装置は停止する。

センサーは、試薬が補充を必要とするかどうかについての情報も提供する。

環境条件が満足できるものであり、必要な量の試薬が存在する場合、分光計を温め、システムを試料でリンスする。この後、予め設定された比を使用して、水試料およびある量の色素溶液がシリンジに引き込まれる。これらは、液体を混合チャンバーに前後に、例えば３回、ポンプ送液することにより混合される。混合後、試料をインキュベートし、フローセルに投与し、蛍光を検出する。

その後、洗浄剤、蒸留水、空気、次いで再び蒸留水でシステムを洗い流す。その後、システムはシャットダウンされ、プロセスが繰り返されるべき場合について自動化された指示が入力される。

本明細書に記載される発明は、水試料を数週間から数時間分析するのに必要な時間を短縮する。

実施例２
水の供給は、上記の方法を用いて分析した。図２から、微生物含有量が高いことが分かる。しかしながら、矢印で示された時点（測定開始から１０日後）に殺生物剤が添加され、値は検出限界以下であった。（図２のデータは、蛍光シグナルと手動計数との間の相関を表すことに留意されたい。）

実施例３
本明細書に記載される本発明の長期実地試験は、サウジアラビアで行われた。図３ａおよび３ｂは、蛍光染色および手動計数の相関の観点からのデータを示す。線形相関は、細胞数（細胞／海水のｍＬ）への変換を可能にする。とりわけ、試料の化学組成、染料および微生物のサイズに基づいて、システム毎に変換係数が異なる。

実施例４
長期実地試験では、１日３回、４ヶ月間にわたって海水の微生物含有量を測定した。図４に示す結果は、微生物の存在についてだけでなく、成長率が増加または減少する期間についての貴重な情報を提供した。例えば、殺生物剤処理後、検出可能な微生物はなく、その後、成長率が増加した。

他の実施形態は、当業者には明らかであり、ここで繰り返す必要はない。

用いた用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用には、示され、および説明された特徴またはその一部の均等物を排除する意図はなく、本発明の範囲内で種々の変更が可能である。
本発明の好ましい態様は、以下を包含する。
［１］水試料中の微生物の存在を決定するのに有用な装置であって、該装置はバイオセンサーを含み、該バイオセンサーは、第１弁手段を介して該バイオセンサーに水試料を与える手段へ接続され、前記バイオセンサーは、圧力調整手段および試料チャンバーへの水の流れを調整する絞り弁手段を有し、前記試料チャンバーは、試料容積を混合チャンバーへ輸送するための第１輸送手段を有し、指示薬リザーバーは前記混合チャンバーへ指示薬を輸送するための第２手段を有し、前記第１および第２輸送手段は、それらに接続された試料および指示薬容積を制御するための射出弁手段を有し、前記混合チャンバーは、該混合チャンバーに接続されたシリンジ手段、前記混合チャンバーとの流体接続において分析試料を含むための手段、および前記分析試料を含むための前記手段において前記指示薬を決定するための手段を有し、前記シリンジ手段は、操作により前記試料および指示薬を混合する、装置。
［２］前記指示薬を決定するための前記手段は、分光蛍光光度計である、［１］に記載の装置。
［３］洗浄剤量を供給するための、前記バイオセンサーに接続された第１リザーバー手段をさらに含む、［１］に記載の装置。
［４］前記バイオセンサーに洗浄水を供給するための第２リザーバー手段をさらに含む、［３］に記載の装置。
［５］前記混合チャンバーに接続された廃棄物処理手段をさらに含む、［１］に記載の装置。
［６］液体試料中の微生物の存在を決定するための方法であって、指示薬試料と共に［１］に記載の装置の混合チャンバーへ液体試料を輸送する工程、混合物を形成する工程、前記混合物をインキュベートする工程、微生物の存在の指示薬として行われた前記指示薬の取り込みを決定する工程を含む、方法。
［７］前記液体試料は海水である、［６］に記載の方法。
［８］前記指示薬はＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩである、［６］に記載の方法。

Claims (8)

1. 水試料中の微生物の存在のリアルタイムな連続的自動化決定に有用な装置であって、該装置はバイオセンサーを含み、該バイオセンサーは、第１弁手段を介して該バイオセンサーに水試料を与える手段へ接続され、前記バイオセンサーは、圧力調整手段および試料チャンバーへの水の流れを調整する絞り弁手段を有し、前記試料チャンバーは、試料を混合チャンバーへ輸送するための第１輸送手段を有し、指示薬リザーバーは前記混合チャンバーへＤＮＡ染色剤である指示薬を輸送するための第２輸送手段を有し、前記第１および第２輸送手段は、それらに接続された試料および指示薬容積を制御するための射出弁手段を有し、前記混合チャンバーは、該混合チャンバーに接続されたシリンジ手段、前記混合チャンバーとの流体接続において分析試料を含むための手段、および前記分析試料を含むための前記手段において前記水試料と指示薬の比率を決定するための手段を有し、前記シリンジ手段は、操作により前記試料および指示薬を混合する、装置。
2. 前記指示薬を決定するための前記手段は、分光蛍光光度計である、請求項１に記載の装置。
3. 洗浄剤を供給するための、前記バイオセンサーに接続された第１リザーバー手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
4. 前記バイオセンサーに洗浄水を供給するための第２リザーバー手段をさらに含む、請求項３に記載の装置。
5. 前記混合チャンバーに接続された廃棄物処理手段をさらに含む、請求項１に記載の装置。
6. 液体試料中の微生物の存在のリアルタイムな連続的自動化決定のための方法であって、ＤＮＡ染色指示薬試料と共に請求項１に記載の装置の混合チャンバーへ液体試料を輸送する工程、混合物を形成する工程、前記混合物をインキュベートする工程、微生物の存在の指示薬として行われた前記ＤＮＡ染色指示薬の取り込みを決定する工程を含む、方法。
7. 前記液体試料は海水である、請求項６に記載の方法。
8. 前記指示薬はＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩである、請求項６に記載の方法。

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