KR101810632B1 - 장관감염성 원충 3종을 검출하기 위한 프라이머와 이를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 진단방법 - Google Patents

장관감염성 원충 3종을 검출하기 위한 프라이머와 이를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성되어 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출하기 위한 프라이머와 이 프라이머를 이용한 동시분석법인 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction, Multiplex PCR) 진단을 제공한다.

Description

장관감염성 원충 3종을 검출하기 위한 프라이머와 이를 이용한 다중 중합효소연쇄반응 진단방법{Primers for detection of three species of intestinal parasitic protozoa and Multiplex Polymerase Chain Reaction diagnosis method using the primers}
본 발명은 장관감염성 원충 3종인 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 동시분석을 통한 검출을 시행하기 위한 프라이머와 이 프라이머를 이용한 동시분석법인 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction, Multiplex PCR) 진단방법에 관한 것이다.
사람에서 질병을 일으키는 주요 장관감염성 원충에는 작은와포자충, 람블편모충, 이질아메바, 그리고 원포자충 4개 종이 있으며, 이들은 ‘감염병의 예방 및 관리에 관한 법률'에 지정 감염병에 속해 있다. 감염 시 주요 임상증상은 설사이며, 최근 이들 원충에 의한 집단적 발병사례가 2건 (2010년 1건, 2012년 1건)이 보고되었다. 2003년에는 인도네시아 여행자에게서 원포자충증이 보고되었으며 계속해서 국내 발생이 증가하는 추세이다(설사환자에서 장관감염성 원충감염 현황-Public Health Weekly Report vol.8 No.7).
또한 WHO 보고에 따르면 2012년 전 세계 설사환자는 6.6백만 명에 이르며, 최근 우리나라도‘급성 설사질환 원충 실험실 감시 사업’을 통해 총 설사환자 중 약 2%가 원충 충란 양성률을 보이고 있음을 확인하였다. 또한 최근 3년 동안 매년 원충 감염에 의한 집단 식중독 사례가 보고되고 있다(NIH 용역사업).
2013년 장관감염성 원충 실험실 감시사업(NIH 용역사업)을 통해 조사된 ‘2013년 설사환자에서의 장관감염성 원충 감염 현황’에 따르면 전체 양성율 3.14% 중, 원충별로는 작은와포자충(0.74%), 람블편모충(0.87%), 이질아메바(0.03%)이고, 원포자충은 1.49%로 타 원충에 비해 급격히 증가하는 현상이 두드러졌으며, 장관감염성 원충에 감염된 사람은 대표적으로 설사질환을 나타내며, 이들 원충은 여행자 설사증의 부각되는 원인으로 향후 내국인뿐만 아니라 외부에서 유입된 여행객, 또한 해외여행 후 입국한 우리나라 국민에게서 발병할 수 있다.
그리고 현재 수인성 원충에 대한 국내 감염률은 높지 않으나 지구환경의 변화, 국제교류의 증대, 식품산업의 발달 등의 영향으로 인한 식품 및 음수 매개의 질병 발생 가능성은 향후 점점더 높아질 것이다. 이에 따라 국민 건강을 지키기 위한 방안 또한 강구되어야 할 시점이며, 최근 구제역과 같은 대규모 가축질병 발생으로 인한 전국적인 가축 매몰은 침출수에 의한 지하수의 오염을 야기할 수 있고, 이들이 강물로 유입될 경우 장관원충 질환의 집단 발병을 일으킬 위험이 있다.
그러나 식수 및 환경 내에서의 검사는 현재 단일 PCR 방법으로 각 원충에 대한 검사가 순조롭게 이루어지고 있으나, 환자 발생 시에는 대개 설사를 포함한 식중독 증상에 의한 대규모 집단 발병의 가능성과 함께 신속한 조기진단 및 원인규명 등이 필요하며, 이를 위해 고감도 동시 신속진단법을 구축할 필요가 있다.
하지만 현재 대부분의 진단 kit 및 특허들이 외국에 과점되고 있어 수인성 원충에 대한 예방 및 진단법의 국내 기술이 빈약하고, 이러한 원충 질환이 대량으로 퍼졌을 때 국가적 차원의 원천기술이 없는 관계로 신속 대응이 어려우며 경제적 타격도 심할 수 있다. 또한 설사 원인 병원체로서 세균 및 바이러스는 보건환경연구원에서 진단이 이루어지고 있지만, 장관감염성 원충은 지자체 보건환경연구원으로의 진단 이전이 안 되고 있어 이들 원충의 신속진단법 개발이 시급한 실정이다.
이와 같은 실정에도 불구하고 현재 장관감염성 원충의 진단법으로 대변에서의 원충 포낭 확인이 중요하나 확진을 위한 진단법으로는 PCR이 사용되고 있다. 그러나 3종의 원충 별로 PCR을 각각 실시해야하는 복잡성과 실험시간이 장시간 소요되는 단점이 있다.
또한 현재 관련된 특허 출원으로는 출원번호 제10-2011-0057535호 "람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 검출용 키트", 출원번호 제10-2011-0048020호 "수인성 원충의 동시 검출을 위한 프라이머 및 그 프라이머를 이용한 검출방법" 및 출원번호 제10-2007-0060156호 "수인성 원생동물을 검출하기 위한 중합효소 연쇄반응의 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법"이 있으나, 국내 출원된 원충 진단 및 검출 관련 특허를 보면, 3종 원충(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충)의 동시분석법인 Multiplex PCR 및 Multiplex real-time PCR법으로 나온 특허는 전무하다. 또한 논문도 아직까지 보고된 바 없다.
○ 대한민국 출원번호 제10-2011-0057535호 "람블편모충, 작은와포자충 및 이질아메바 검출용 키트" ○ 대한민국 출원번호 제10-2011-0048020호 "수인성 원충의 동시 검출을 위한 프라이머 및 그 프라이머를 이용한 검출방법" ○ 대한민국 출원번호 제10-2007-0060156호 "수인성 원생동물을 검출하기 위한 중합효소 연쇄반응의 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 검출키트 및 방법"
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 작은와포자충, 람블편모충, 및 원포자충 3종의 장관감염성 원충의 동시진단법인 Multiplex PCR, 검출 키트 및 이와 같은 검출 내지 진단 방법을 높은 효율로 수행하기 위한 프라이머 및 를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성되어 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출하기 위한 프라이머를 제공한다.
다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머를 포함하여 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은,
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머를 PCR 프라이머로 이용하여 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종의 감염을 동시에 진단할 수 있는 다중 중합효소연쇄반응 (Multiplex- Polymerase Chain Reaction) 진단방법을 제공한다.
본 발명은 비 세균성·비 바이러스성의 감염성 설사질환에 대해 원충 감염 여부에 의한 정확한 원인 규명이 가능하기 때문에 발생빈도를 조사하는 데에 크게 기여할 수 있으며, 본 발명에서 확립된 3종의 원충에 대한 Multiplex PCR 진단법과 Multiplex real-time PCR 진단법은 우리나라의 설사환자들에서 원충성 감염 여부를 파악하는 모니터링 연구에 크게 기여할 수 있다.
또한 본 발명은 향후 고부가가치 연구를 위한 제품 개발로의 연구 확산이 가능하며, 임상적 활용성을 통해 일반 외래 환자들에서도 수인성 원충 감염 여부 확진이 가능하여 임상적 치료 효과를 높일 수 있으며, 감염성 진단 키트 개발로 이어지는데 크게 기여할 수 있다.
도 1은 각 원충별 multiplex PCR 타깃 유전자 구간에 대한 도면이다[(도 1a: 작은와포자충 (Genbank accession number: AB089292, Sequence Position: 358-912), 도 1b: 람블편모충 (Genbank accession number: KJ499992, Sequence Position: 26-213), 도 1c: 원포자충 (Genbank accession number: AB111183, Sequence Position: 268-667)].
도 2는 Multiplex real-time PCR 유전자 구간에 대한 도면이다[도 2a: 작은와포자충 (Genbank accession number: AB089292, Sequence Position: 819-921), 도 2b:람블편모충 (Genbank accession number: KJ499992, Sequence Position: 64-162), 도 1c: 원포자충 (Genbank accession number: AF302546, Sequence Position: 385-489)]
도 3은 3종의 원충에 대한 동시검출을 위한 Fluorophore and Quencher (IDT)에 대한 도면이다.
도 4는 원충 3종에 대한 Single PCR 결과 도면이다[M: Marker, CP: 작은와포자충(C. parvum), GL: 람블편모충(G. lamblia), CC: 원포자충(C. cayetanensis), PR: Negative Control (Distilled Water+Primer)].
도 5는 원충 3종의 primer mixture를 이용한 Multiplex PCR 결과 도면이다.
도 6은 작은와포자충(Cp)에 대한 검출한계 확인 결과에 대한 도면이다(Lane 1 - Marker, 및 람블편모충의 경우 Lane 2부터 Lane 6까지 107, 106, 105, 104, 103cysts.).
도 7은 람블편모충(Gl)에 대한 검출한계 확인 결과에 대한 도면이다.
도 8은 원포자충(Cc)에 대한 검출한계 확인 결과에 대한 도면이다(Lane 1 - Marker, 및 람블편모충의 경우 Lane 2부터 Lane 6까지 107, 106, 105, 104, 103cysts.).
도 9는 작은와포자충(Cp)과 람블편모충(Gl) 두 종에 대한 동시검출한계 확인 결과에 대한 도면이다.
도 10은 작은와포자충(Cp)과 원포자충(Cc) 두 종에 대한 검출한계 확인 결과에 대한 도면이다(Lane 1 - Marker, 람블편모충의 경우 Lane 2부터 Lane 6까지 107, 106, 105, 104, 103cysts. 원포자충의 경우 Lane 2부터 Lane 6까지 103, 102, 101, 100, 10-1copies.).
도 11은 람블편모충(Gl)과 원포자충(Cc) 두 종에 대한 검출한계 확인 결과 도면이다.
도 12는 작은와포자충(Cp)과 람블편모충(Gl), 원포자충(Cc) 세 종에 대한 검출한계 확인 결과 도면이다.
도 13은 톡소포자충(Tg)과 3종의 원충(Cp, Gl, Cc) 교차반응 유무 확인 결과 도면이다(Lane 1: Marker, Lane 2: Tg DNA+Cp primer, Lane 3: Tg DNA+Gl primer, Lane 4: Tg DNA+Cc primer, Lane 5: Tg DNA+Cp,Gl primer, Lane 6: Tg DNA+Cp,Cc primer, Lane 7: Tg DNA+Gl,Cc primer, Lane 8: Cp,Gl,Cc primer, Lane 9: Tg DNA+Tg primer, Lane 10: Cp primer-only, Lane 11: Gl primer-only, Lane 12: Cc primer-only, Lane 13: Cp,Gl primer-only, Lane 14: Cp,Cc primer-only, Lane15: Gl,Cc primer-only, Lane 16: Cp,Gl,Cc primer-only).
도 14는 바베시아(Bm)와 3종의 원충(Cp, Gl, Cc) 교차반응 유무 확인 결과 도면이다(Lane 1: Marker, Lane 2: Bm DNA+Cp primer, Lane 3: Bm DNA+Gl primer, Lane 4: Bm DNA+Cc primer, Lane 5: Bm DNA+Cp,Gl primer, Lane 6: Bm DNA+Cp,Cc primer, Lane 7: Bm DNA+Gl,Cc primer, Lane 8: Cp,Gl,Cc primer, Lane 9: Bm DNA+Bm primer, Lane 10: Cp primer-only, Lane 11: Gl primer-only, Lane 12: Cc primer-only, Lane 13: Cp,Gl primer-only, Lane 14: Cp,Cc primer-only, Lane15: Gl,Cc primer-only, Lane 16: Cp,Gl,Cc primer-only)
도 15는 이질아메바(Eh)와 3종의 원충(Cp, Gl, Cc) 교차반응 유무 확인 결과 도면이다(Lane 1: Marker, Lane 2: Eh DNA+Cp primer, Lane 3: Eh DNA+Gl primer, Lane 4: Eh DNA+Cc primer, Lane 5: Eh DNA+Cp,Gl primer, Lane 6: Eh DNA+Cp,Cc primer, Lane 7: Eh DNA+Gl,Cc primer, Lane 8: Cp,Gl,Cc primer, Lane 9: Eh DNA+Eh primer, Lane 10: Cp primer-only, Lane 11: Gl primer-only, Lane 12: Cc primer-only, Lane 13: Cp,Gl primer-only, Lane 14: Cp,Cc primer-only, Lane 15: Gl,Cc primer-only, Lane 16: Cp,Gl,Cc primer-only).
도 16은 SYBRGreen qPCR 각 원충별 증폭 곡선에 관한 도면이다.
도 17은 Multiplex real-time PCR (SYBRGreen qPCR) 2종 혹은 3종 원충 혼합 DNA에서의 각 증폭곡선과 Melting Peak 곡선에 관한 도면이다.
도 18은 Multiplex real-time PCR 각 원충에 대한 특이적인 증폭곡선에 관한 도면이다.
도 19는 양성 확인용 plasmid DNA에 대한 증폭곡선과 standard curve에 관한 도면이다.
이하 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상세하게 설명하기로 한다.
Ⅰ. 연구 내용
(가) 본 연구에서 타깃 유전자 선정을 위해 기 개발된 Multiplex 및 Real-time PCR 진단법 검토 및 타깃 유전자 구간 선정
○ 본 연구의 타깃 유전자 선정을 위해 여러 논문 및 Kit 회사들의 타깃 유전자를 검토하였고, 이를 바탕으로 본 연구에서 시도한 Multiplex PCR 타깃 유전자로는 작은와포자충(Cryptosporidium parvum)의 Cryptosporidium Oocyst Wall Protein (COWP) 유전자, 람블편모충(Giardia lamblia)의 Glutamate dehydrogenase (GDH) 유전자, 그리고 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 18S rRNA를 선정하여 실험을 진행하였다.
○ Real-time PCR 타깃 유전자로 작은와포자충과 람블편모충은 동일한 COWP 유전자와 GDH 유전자를 선정하였고, 원포자충의 타깃 유전자로는 Internal transcribed spacer 1 (ITS1) 유전자를 선정하여 실험을 진행하였다.
(나) Single PCR 및 Multiplex PCR 프라이머 제작 및 PCR 조건 확립
○ Multiplex PCR 프라이머의 제작 및 조건 확립을 위하여 GUI (Graphic User Interface) 기반의‘Geneious Pro’라는 서열 분석프로그램을 이용하였다. 또한 이와 함께 프라이머 디자인을 위한 프로그램으로 Whitehead Institute for Biomedical Research社의 'Primer3' 프로그램을 사용하였다. 시퀀싱 및 올리고 합성은 ‘(주)마크로젠’에서 진행하였다.
(다) Real-time PCR 프라이머 제작 및 PCR 조건 확립
○ Real-time PCR 프라이머의 제작 및 조건 확립을 위하여 GUI (Graphic User Interface) 기반의‘Geneious’라는 서열 분석프로그램을 이용하였다. 또한 이와 함께 프라이머 디자인을 위한 프로그램으로 Whitehead Institute for Biomedical Research社의 'Primer3' 프로그램을 사용하였다. 시퀀싱 및 올리고 합성은 ‘(주)마크로젠’에서 진행하였다.
(라) Real-time PCR법 probe 선정 및 PCR 조건 확립
○ Real-time PCR 프로브의 제작 및 조건 확립을 위하여 GUI (Graphic User Interface) 기반의‘Geneious Pro’라는 서열 분석프로그램을 이용하였다. 또한 이와 함께 프라이머 디자인을 위한 프로그램으로 Whitehead Institute for Biomedical Research社의 'Primer3' 프로그램을 사용하였다. 시퀀싱 및 올리고 합성은 ‘(주)마크로젠’에서 진행하였다.
(마) 각각의 유전자구간을 cloning 하여 vector에 삽입(positive control용 vector DNA)
○ 진단 프로토콜 제공 시 positive control 용의 DNA 제공을 위해 DNA cloning vector(유전자운반체)를 제작하였다. 이를 위해, pBHA vector를 사용하였고, 작은와포자충과 원포자충의 타깃 유전자 구간의 양 끝엔 BamHI, 그리고 람블편모충은 HindIII 제한효소 인식부위를 추가하였다. Cloning vector의 제작 및 대장균에의 삽입은‘(주)바이오니아’에서 진행하였다.
(바) 3종 혹은 2종의 원충유전자를 대상으로 Real time PCR 검출 확인
○ 3종의 원충유전자를 대상으로 프라이머 및 프로브를 제작했으며, 작은와포자충은 5' FAM™ / 3' BHQ-1,, 람블편모충은 5' HEX™ / 3' BHQ-1, 그리고 원포자충은 5' Cy5™ / 3'BHQ-2를각각 Reporter dye / Quencher dye로 사용하여 실험을 실시하였다.
(사) Real-time PCR 기계 간 차이 비교 (Bio- Rad & ABI )
○ Real-time PCR의 기계간 차이 비교는 Bio-Rad社의 ‘CFX96’와 Life Technologies(ABI)社의 ‘ABI 7500’에 대해 비교하였다. 이 밖에 Bio Molecular Systems(BMS)社의 ‘MIC’을 사용하여 다른 기계의 사용으로 인한 PCR 효율 및 결과의 차이가 있는지를 점검하였다.
(아) 원충 유전자의 검출한계 검토
○ 본 연구에서 다루고 있는 3종의 원충에 감염되지 않은 신선한 분변에 107, 106, 105, 104,103 개로 순차 희석한 원충 포낭을 섞어 Qiagen社의 QIAamp DNA Stool Mini Kit를 이용해 추출한 DNA로 각각에 대해 PCR을 진행하여 검출한계를 비교하였다(단, 원포자충은 cyst가 없는 관계로 Synthetic DNA (ATCC社)를 이용하여 검출한계를 검토하였다).
(자) 민감도 및 특이도 비교
○ 민감도와 특이도를 비교하기 위해선 실제로 원충에 감염된 환자(진양성)의 분변샘플, 원충에 감염되지 않은 환자(진음성)의 분변샘플이 상당부분 확보되어야 하는데 실제 설사변에서의 원충 감염 진양성의 수가 현저히 부족(1.0 % 미만)하여 민감도 측정 대신에 검출한계로 연구를 진행하였고 특이도 확인도 장내 감염 기생충들과의 교차반응으로 연구를 진행하였다.
○ 즉, 확립한 PCR 동시진단 검사방법이 3종의 원충에만 특이적으로 반응하는지를 알아보기 위해 계통분류학적으로 본 연구의 원충과 가까운 인체감염 원충인 바베시아(Babesia microti), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 이질아메바(Entamoeba histolytica) 3종과 함께 PCR 교차반응의 유무를 확인하였다.
(차) 대변 샘플 확보
○ 설사환자의 대변 샘플 확보를 위해서 인하대병원의 IRB 승인을 받아 진행하였다.
(카) 대변 샘플로부터 DNA 추출
○ 대변 샘플로부터 DNA를 추출하기 위해 분변 DNA 추출 전용 Kit인 Qiagen社의 QIAamp DNA Stool Mini Kit를 사용하였다.
(타) 유효성 평가(타 진단 Kit와의 차이 검토)
○ 확립한 PCR 진단법의 유효성 평가를 위해 현재 시판되는 kit중 오랜 기간 시중에서 판매되고 있고 병원체 진단 kit 개발에서 세계적으로 유명한 G사의 kit와 비교하였다. 또한 kit 회사 선정 시 RT-PCR kit 혹은 multiplex PCR kit가 아닌 real time PCR kit를 제공하고 3종의 원충에 대해 모두 kit를 시판하고 있는 회사의 것을 선정하였다. G사의 kit에서 원충 3종에 대한 real time PCR kit를 구입하여 환자 샘플에 대해 비교하였다.
Ⅱ. 연구 방법
(가) 기 개발된 Multiplex 및 Real-time PCR 진단법 검토 및 타깃 유전자 구간 선정
○ 본 연구에서 다루고 있는 3종의 원충과 관련하여 기존에 개발된 PCR 진단법, 유전자 검출법 그리고 현재 시중에 시판되고 있는 진단kit에서 사용한 유전자들을 검토하여 실험에 이용할 타깃 유전자를 선정하였다.
○ 증폭할 유전자 구간의 선택은 NCBI에 올라와 있는 유전자 정보를 기반으로 Genenious 프로그램과 primer3 프로그램을 사용하여 선정하였다. 프라이머 디자인에 사용된 3종의 원충 염기서열 Genbank accession number는 작은와포자충-AB089292 (COWP gene), 람블편모충-KJ499992 (GDH gene), 그리고 원포자충-AB111183 (18S rRNA), AF302546 (ITS1), AF302575 (ITS1), AF302603 (ITS1)이다. ITS gene은 variation이 보고되고 있어서 3종류의 유전자 서열을 참고하였다.
○ 각 원충별 multiplex PCR 타깃 유전자 구간과 Multiplex real-time PCR 유전자 구간은 도 1 및 도 2에 나타냈다.
(나) Multiplex PCR 프라이머 제작 및 PCR 조건 확립
○ PCR반응에 이용할 프라이머의 제작은 (주)마크로젠에서 진행하였으며, Agilent Technologies社의 Surecycler 8800를 사용하여 PCR을 실시하였다. 3종 원충을 검출하기 위한 Multiplex PCR 프라이머 정보는 아래와 표 1과 같다.
Protozoa / Gene Primer Direction Sequence (5'-3')
작은와포자충/COWP
C. parvum		 Cp-M334-F Forward TCG TAG ATA ATG GAA GAG ATT GTG TT
Cp-M334-R Reverse GGA CTG AAA TAC AGG CAT TAT CTT G
람블편모충/GDH
G. lamblia		 Gl-M334-F Forward CTC CGC TTC CAC CCC TCT
Gl-M334-R Reverse TGC CTC TGG AGC TCG GTC
원포자충/18S rRNA
C. cayetanensis		 Cc-M334-F Forward CAT TTG GCT TTA GCC GGC GAT A
Cc-M334-R Reverse CTA CGG GCA AGG CCG GAT G
○ 원충 포낭 DNA는 Qiagen社의 DNeasy Blood & Tissue Kit(Cat. No. 69506)를 이용하여 제품 Manual에 제시된 Protocol에 따라 DNA를 추출하였다. 또한 정확한 프라이머 디자인을 위해 각각의 원충에 대하여 Single PCR을 진행하고, Sequencing 및 BLAST를 통해 얻은 염기서열 정보를 이용하여 프라이머 조건을 확립하였다.
○ Multiplex PCR 반응의 검출한계 연구의 시료 확보를 위해서는 2종의 원충 포낭(작은와포자충, 람블편모충)을 107, 106, 105, 104, 103개의 갯수로 spiking한 분변으로부터 DNA를 추출하였다(Qiagen社의 QIAamp DNA Stool Mini Kit., Cat. No. 51604 사용). 원포자충은 cyst가 없는 관계로 ATCC社(Cat. No. ATCCPRA-3000SD™)를 통해 C. cayetanensis 18S rRNA, ITS1, ITS2 유전자 구간이 포함된 합성 DNA를 구입 하였다.
○ 3종의 원충을 검출하기 위한 Multiplex PCR 조건으로 Touchdown PCR 방법을 이용하였다. 표 1에 나온 서열번호 1 내지 6으로 제공되는 3종의 원충 프라이머셋(Cry-M334-F, Cry-M334-R, Gia334-F, Gia-M334-R, Cyc-M334-F, Cyc-M334-R)을 2pmol/㎕ 농도로 5㎕(10pmol), DNA template 1㎕~5㎕, 2X PCR premix(SolgentTM 2X Taq PCR Pre-Mix., Cat. No.STD02-P096) 15㎕, 그리고 증류수를 넣어 총량이 30㎕가 되게 하였다.
○ PCR 반응조건으로는 먼저 95 ℃에서 5분간 pre-denaturation 시킨 다음 denaturation(변성반응)은 95℃에서 30초, annealing(결합반응)은 65℃(Maximum)부터 61.2℃(Minimum)까지 0.2℃/cycle의 온도하강으로 40초씩, extension(연장반응)은 72℃에서 1분씩으로 1차 총 반응 횟수 20회를 시행하였다. 이어서 2차로 denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 61.2℃에서 40초, extension은 72℃에서 1분씩으로 2차 총 반응 횟수 25회를 시행하였다. 이후 final extension(최종연장반응)으로 72℃에서 5분간 반응하였다(표 2 및 표 3 참조).
3종의 원충 혼합 Primer mixture* 5 ㎕
DNA template 1 ㎕ - 5 ㎕
2X PCR Premix 15 ㎕
Distilled Water up to 30 ㎕
*3종의 원충 혼합 primer mixture ((2 pmol of each primer) x F&R x 3종 / ㎕ of primer mixture)
Pre-denaturation 95℃ 5 min
Denaturation 95℃ 30 sec
20 cycle
Annealing 65-61.2℃ (-0.2℃/cycle) 40 sec
Extension 72℃ 1 min
Denaturation 95℃ 30 sec
25 cycle
Annealing 61.2℃ 40 sec
Extension 72℃ 1 min
Final Extension 72℃ 5 min
(다) Real-time PCR 프라이머 제작 및 PCR 조건 확립
○ Multiplex real-time PCR반응에 이용할 프라이머의 제작은 (주)마크로젠에서 진행하였으며, Bio-Rad社의 iQ5와 Corbett Life Science社의 Rotor-Gene 6000을 사용하여 SYBRGreen qPCR을, Bio-Rad社의 CFX96와 ABI社의 ABI7500, 그리고 Bio Molecular Systems (BMS)社의 MIC (Magnetic Induction Cycler)을 사용하여 TaqManprobe based real-time PCR을 실시하였다.
○ 원포자충의 타깃유전자로는 Multiplex PCR에서 선정했던 18S rRNA가 아닌 ITS1 유전자를 선택하였다. 그 이유는 종간의 variation이 ITS1에서 더 다양하기 때문에 원포자충 특이적 프로브를 제작하기 위해서는 상동성이 높은 18S rRNA유전자보다 ITS1 유전자가 더 적합하기 때문이다.
○ 3종 원충을 검출하기 위한 Multiplex real-time PCR 프라이머 정보는 다음 표 4와 같다.
Protozoa / Gene Primer Name Direction Sequence (5'-3')
작은와포자충/COWP
C. parvum		 Cp-R334-F Forward CAA GGC CTC CAA TGT ATA CAA AC
Cp-R334-R Reverse CGA TTG CTT GGA CTG AAA TAC AG
람블편모충/GDH
G. lamblia		 Gl-R334-F Forward CTG AAG AAC TCC CTC ACC AC
Gl-R334-R Reverse CAG AAG CGC ATG ACC TCG TTG
원포자충/ITS1
C. cayetanensis		 Cc-R334-F Forward GGT TTA TTG CTG CTG GCA GTT C
Cc-R334-R Reverse CAA CAC CAC CAC AGA CAC GTG
○ 정확한 Real-time PCR 프라이머 디자인을 위해 각각의 원충에 대하여 Single PCR을 진행하고, Sequencing 및 BLAST를 통해 얻은 염기서열 정보를 이용하여 프라이머 조건을 확립하였다.
○ 3종의 원충을 검출하기 위한 Multiplex real-time PCR 조건으로 SYBRGreen real time PCR과 TaqManprobe based real-time PCR에서 각기 다른 PCR (Melting Curve Analysis의 유무) 조건을 사용하였다.
○ 먼저 SYBRGreen qPCR 조건으로는 Table 10에 나온 3종의 원충 프라이머셋(Cry-R334-F, Cry-R334-R, Gia-R334-F, Gia-R334-R, Cyc-R334-F, Cyc-R334-R)을 증류수와 께 2.5pmol/㎕ 농도로 혼합하여 2㎕(5pmol/each primer), DNA template 1㎕~5㎕, 2X PCR premix(Enzynomics社 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX_SYBR Green with low ROX., Cat. No. RT500M) 10㎕, 그리고 Distilled Water를 넣어 총량이 20㎕가 되게 하였다 (표 5 Real-time PCR (SYBRGreen qPCR) mixture 조성 참조).
3종의 원충 혼합 Primer mixture* 2 ㎕
DNA template 1 ㎕ - 5 ㎕
2X PCR Premix (TOPreal™ qPCR 2X PreMIX) 10 ㎕
Distilled Water up to 20 ㎕
*3종의 원충 혼합 primer mixture ((2.5 pmol of each primer) x F&R x 3종 / ㎕ of primer mixture)
○ PCR 반응조건으로는 먼저 95℃에서 15분간 pre-denaturation시킨 다음 denaturation(변성반응)은 95℃에서 20초, annealing(결합반응)은 60℃에서 30초, extension(연장반응)은 72℃에서 30초씩으로 총 반응 횟수 50회를 시행하였다. 이어서 Melting Curve Analysis를 위해 95℃에서 75초간 pre-denaturation시킨 다음 65℃에서부터 95℃까지 0.2℃ increments로 10초간의 dwell time(체류시간)을 둔다. 이후 data acquisition을 통해Melting Peak를 분석한다[표 6 Multiplex real-time PCR 조건 (SYBRGreen qPCR) 참조].
Pre-denaturation 95℃ 15 min Pre-denaturation time은 사용하는 Premix에 따라 다를 수 있다. (Enzynomics社 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX_SYBR Green with low ROX 기준)
Denaturation 95℃ 20 sec
50 cycle
Annealing 60℃ 30 sec
Extension 72℃ 30 sec
Denaturation 95℃ 75 sec
Melting
Curve
Analysis
Annealing 65℃-95℃
0.2℃
increments		 10 sec
Dwell
time
Data Acquisition
(라) Real-time PCR 법 probe 선정 및 PCR 조건 확립
○ Multiplex real-time PCR반응에 이용할 프로브의 제작은 (주)마크로젠에서 진행하였으며, 3종의 원충에 대한 동시검출을 위해 각 원충별로 다른 파장대의 Reporter dye(FAM™, HEX™, Cy5™)를 합성하여 제작하였다(도 3 참조).
○ TaqManprobe based real-time PCR 조건으로는 표 4에 나온 3종의 원충 프라이머셋(Cp-R334-F, Cp-R334-R, Gl-R334-F, Gl-R334-R, Cc-R334-F, Cc-R334-R)을 Distilled Water(증류수)와 함께 2.5pmol/㎕ 농도로 혼합하여 2㎕ (5pmol/each primer), 하기 표 7에 나온 3종의 원충 프로브셋(Cp-Pro334, Gl-Pro334, Cc-Pro334)를 2pmol/㎕ 농도로 혼합하여 2㎕(4pmol/each probe), 그리고 DNA template 1㎕~5㎕, 2X PCR premix 10㎕ (Enzynomics社 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX., Cat. No.RT600M)와 Distilled Water를 넣어 총량이 20㎕가 되게 하였으며, PCR 반응조건으로는 먼저 95℃에서 15분간 pre-denaturation 시킨 다음 denaturation (변성반응) 은 95℃에서 10초, annealing (결합반응) 및 extension (연장반응)은 60℃에서 60초씩으로 총 반응 횟수 50회를 시행하였다[표 7. Multiplex real-time PCR 프로브 조건 (TaqManprobe based real-time PCR), 표 8 Multiplex real-time PCR (TaqManprobe based real-time PCR) mixture 조성, 표 9. Multiplex real-time PCR 조건 (TaqManprobe based real-time PCR) 참조].
Protozoa / Gene Probe name Reporter/
Quencher		 Sequence (5'-3')
작은와포자충/COWP
C. parvum		 Cp-Pro334 FAM™
BHQ-1® 		CCT GTC TGC CCT CCA
GGT ACA GTA TTA C
람블편모충/GDH
G. lamblia		 Gl-Pro334 HEX™
BHQ-1® 		CAA GGG CGG CTC
CGA CTT TGA CCC AA
원포자충/ITS1
C. cayetanensis		 Cc-Pro334 Cy5™
BHQ-2® 		GTG GTG GTG TTG
CAG CAG TGG TGT TC
3종의 원충 혼합 Primer mixture* 2 ㎕
3종의 원충 혼합 Probes** 2 ㎕
Template DNA 1 ㎕ - 5 ㎕
2X PCR Premix
(TOPreal™ qPCR 2X PreMIX)		 10 ㎕ ABI社 기계의 경우 ROX reference
dye가 첨가된 Premix를 사용 혹은 따로
ROX를 넣을 것
Distilled Water up to 20 ㎕
*3종의 원충 혼합 primer mixture ((2.5 pmol of each primer) x F&R x 3종 / ㎕ of primer mixture)
**3종의 원충 혼합 probe mixture ((2 pmol of each probe) x 3종 / ㎕ of probe mixture)
Pre-denaturation 95℃ 15 min Pre-denaturation time은 사용하는 Premix에 따라 다를 수 있다. (Enzynomics社 TOPreal™qPCR 2X PreMIX 기준)
Denaturation 95℃ 10 sec
50 cycle
Annealing& Extension 60℃ 60 sec
(마) 각각의 유전자구간을 cloning 하여 vector에 삽입(positive control)
○ DNA cloning vector(유전자운반체)로는 pBHA vector를 사용하였고, 작은와포자충과 원포자충의 타깃 유전자 구간의 양 끝엔 BamHI, 그리고 람블편모충은 HindIII 제한효소인식 부위를 추가하였다. Cloning vector의 제작 및 대장균에의 삽입은‘(주)바이오니아에서 진행하였다.
(바) 3종 혹은 2종의 원충유전자를 대상으로 Real-time PCR 검출 확인
○ 이미 확인된 3종의 원충(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충) genomic DNA 및 stool에 cyst를 섞어 추출한 stool-derived DNA(cyst 혼입: 작은와포자충 & 람블편모충, DNA 혼입: 원포자충)를 reference로 각각의 DNA에 대한 특이적인 형광 발현을 확인하였다. (작은와포자충-FAM™, 람블편모충-HEX™, 원포자충-Cy5™)
(사) Real-time PCR 기계 간 차이 비교 (Bio- Rad & ABI )
○ Bio- Rad社 CFX96 TouchTM과 ABI社 ABI 7500 두 기계에서의 Multiplex real-time PCR은 같은 조건(표 7, 표 8 및 표 9 참조) 하에서 동일 Premix를 사용하여 진행하였다.
(아) 원충 유전자의 검출한계 검토
○ Multiplex PCR의 경우 본 연구에서 다루고 있는 3종의 원충에 감염되지 않은 신선한 분변에 107, 106, 105, 104, 103 개로 순차 희석한 원충 포낭을 섞어 Qiagen社의 QIAamp DNA Stool Mini Kit를 이용해 추출한 DNA로 각각에 대해 PCR을 진행하여 검출한계를 검토하였다(단, 원포자충은 cyst가 없는 관계로 Synthetic DNA(ATCC社)를 이용하여 검토).
○ Multiplex real-time PCR의 경우에는 정확한 정량을 위해 positive control로 제작한plasmid vector를 이용하여 1010copies부터 순차 희석하여 증폭곡선 및 검출한계를 확인하였다(Plasmid DNA의 Copy수 계산은 QIAGEN社의 Critical Factors for Successful Real-Time PCR 참조)
(자) 타 원충과의 교차반응 확인
○ 민감도와 특이도를 비교하기 위해선 실제로 원충에 감염된 환자(진양성)의 분변샘플, 원충에 감염되지 않은 환자(진음성)의 분변샘플이 상당부분 확보되어야 하나, 실제로 양성 샘플은 1% 미만에 불과해서 타 장내감염 기생충과의 교차반응 분석으로 한정하였다.
○ 확립한 PCR 동시진단 검사방법이 3종의 원충(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충)에만특이적으로 반응하는지를 알아보기 위해 계통분류학적으로 본 연구의 원충과 가까운 인체감염 원충인 바베시아(Babesia microti), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 이질아메바(Entamoeba histolytica) 3종과 함께 PCR 교차반응의 유무를 확인하였다.
○ 바베시아와 톡소포자충, 이질아메바의 positive control은 질병관리본부로부터 제공받았으며 genomic DNA를 추출하기 위한 방법으로는 위의 두 가지 원충 포낭(작은와포자충, 람블편모충) DNA추출 방법과 동일한 방법을 이용하였다.
○ 또한 각각의 원충(바베시아, 톡소포자충, 이질아메바)에 대하여 프라이머를 제작하여 single PCR을 진행하였고 시퀀싱 및 BLAST를 통해 positive control을 검증하였다.
○ 프라이머 디자인에 사용된 3종의 타 원충 염기서열 Genbank accession number는 톡소포자충-AF179871 (B1 gene, sequence position: 222-433), 바베시아-AY693840 (18S ribosomal RNA, sequence position: 106-298), 그리고 이질아메바-AB197936 (Small Subunit ribosomal RNA, sequence position: 1285-1798) 이다.
(차) 대변 샘플 확보
○ 설사환자의 대변 샘플은 공동연구를 진행하는 인하대학교 의과대학에서 샘플 확보를 진행하였다.
(카) 대변 샘플로부터 DNA 추출
○ 제품 Manual에 제시된 Protocol을 본 실험실에 맞게 최적화시켜 추출하였으며, 추출한 DNA의 농도 및 순도(260/280)는 Thermo Scientific社의 NanoDrop™ 2000을 이용하여 측정하였다.
(타) 유효성 평가
○ 본 연구에서 확립한 Multiplex real-time PCR 진단법의 유효성 평가를 위해 시중에서 판매되고 있는 G사의 원충 3종에 대한 Single real-time PCR kit를 구입하여 함께 비교하였으며, Genomic DNA, Plasmid DNA, 그리고 분변샘플에서 추출한 DNA를 이용하여 본 연구에서 확립된 PCR 조건을 이용한 PCR 반응과 Kit를 사용한 PCR 반응 차이를 비교하였다.
Ⅲ. 연구 결과
1. 장관감염성 3종 원충( 작은와포자충 , 람블편모충 , 원포자충 )에 대한 동시 신속진단 유전자검사법 구축
가. 3종 원충 DNA를 이용한 Single PCR 확인
○ 작은와포자충(C. parvum)은 Crytosporidium Oocyst Wall Protein (COWP) 유전자, 람블편모충(G. lamblia)은 Glutamate Dehydrogenase (GDH) 유전자, 그리고 원포자충(C.cayetanensis)은 18S ribosomal RNA (18s rRNA) 유전자를 각각 타깃 유전자로 선정하여 프라이머를 디자인하였다.
○ 원충 포낭으로부터 추출한 genomic DNA(작은와포자충, 람블편모충)와 합성 DNA (ATCC:원포자충)를 이용하여 PCR을 진행하였다.
○ 정확한 프라이머 디자인을 위해 각각의 원충에 대하여 single PCR을 진행하고, sequencing 및 BLAST를 통해 얻은 염기서열 정보를 이용하여 프라이머 조건을 확립 하였다. 그 결과 각각의 증폭산물이 555bp, 188bp, 그리고 400bp로 in silico로 디자인한 증폭구간과 실험결과가 일치함을 확인하였다(도 4. 원충 3종에 대한 Single PCR 결과 참조).
나. 3종 원충의 specific primer mixture를 이용한 Multiplex PCR 확인
○ 원충 포낭으로 부터 추출한 genomic DNA(작은와포자충, 람블편모충)와 합성 DNA(원포자충)를 이용하여 Table 8과 Table 9의 PCR 조건으로 Multiplex PCR을 진행하였다. 그 결과 작은와포자충(C. parvum)의 증폭산물은 555bp, 람블편모충(G. lamblia)의 증폭산물은 188bp, 그리고 원포자충(C, cayetanensis)의 증폭산물은 400bp로 각각 길이가 다른 증폭산물이 특이적으로 증폭되었음을 확인하였다(도 5 원충 3종의 primer mixture를 이용한 Multiplex PCR 결과 참조).
다. 개발한 Multiplex PCR 검사법을 이용한 각 원충 포낭 함유 분변에서의 검출한계 확인
○ Multiplex PCR 검사법의 검출한계를 확인하기 위해서 3종의 원충이 감염되지 않은 신선한 분변에 107, 106, 105, 104, 103개로 순차 희석한 원충 포낭 (작은와포자충, 람블편모충)을 섞은 후 추출한 DNA를 이용하였으며, 원포자충의 경우 합성 DNA를 이용하여 그 결과를 도 6부터 도 12까지 나타냈다.
라. 개발한 Multiplex PCR 검사법의 타 원충과의 교차반응 확인
○ 타 원충(톡소포자충, 바베시아, 이질아메바)과 교차반응의 유무를 확인한 결과, 본 연구에서 확립한 3종(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충)의 프라이머가 다른 원충 DNA와의 교차반응 없이 특이적으로 반응한다는 것을 결과로 확인하였다(도 13, 도 14 및 도 15 참조).
마. 3종 원충 DNA에서 SYBRGreen qPCR 을 이용한 각 원충별 증폭 곡선 확인
○ 표 5와 표 6의 조건을 참고하여SYBRGreen qPCR을 통해 3종의 원충 DNA의 증폭 곡선을 각각 확인하였다. 각 원충별 증폭 곡선(amplification curve)뿐만 아니라 PCR 산물이 단일증폭산물로 증폭되었는지 확인하는 Melting Curve Analysis 과정을 통해 각 원충별 증폭산물의 Melting Peak와 Melting Temperature를 확인하였으며, PCR 반응 후 생성된 산물들은 시퀀싱 및 BLAST를 통해 확인 및 검증하였다. SYBRGreen qPCR을 통해 3종의 원충 DNA의 증폭 곡선과 Melting Peak를 각각 확인한 결과, 본 발명에 따라 각 원충별 real-time PCR 프라이머가 서로의 간섭 없이 특이적으로 증폭된다는 것을 결과로 확인하였다(도 16 및 도 17 참조).
바. TaqManprobe based real-time PCR 이용하여 각 원충별 증폭 곡선 확인 (Bio- Rad 社 CFX96 )
○ 표 7 및 표 8의 조건을 참고하여 TaqManprobe based real-time PCR의 각 원충별 증폭 곡선을 확인하기 위해 positive control로 stool 샘플에 원충 포낭을 섞어 추출한 stool-derived DNA(작은와포자충, 람블편모충)을 이용하였다. 원포자충의 경우 cyst가 없는 관계로 합성 DNA를 사용하였으며, 또한 3종의 원충에 대한 동시검출을 위해 각 원충별로 다른 파장대의 Reporter dye (FAM™, HEX™, Cy5™)를 합성하여 제작하였다. 실험결과, 본 연구에서 확립한 3종(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충)의 TaqManprobe based real-time PCR 프라이머 및 프로브가 각 원충 DNA와 특이적으로 반응하여 형광을 내는 것을 확인하였다(도 18 참조).
사. TaqManprobe based real-time PCR 이용하여 타깃 서열이 삽입된 양성 확인용 plasmid DNA확인
○ 타깃서열이 삽입된 plasmid DNA를 이용하여 각각의 DNA에 대한 특이적인 증폭곡선과 형광발현이 나타나는지 확인하였는데, 1010copies부터 순차 희석하여 증폭곡선 및 검출한계를 확인하여 그 결과를 도 19에 나타냈다. Plasmid DNA의 Copy수 계산은 QIAGEN社의 Critical Factors for Successful Real-Time PCR을 참조하였다.
아. 2종의 기기 ( ABI & Bio- Rad 社 Real-time PCR machine) 이외에도 또 다른 기기 (BioMolecular Systems( BMS )社 MIC (Magnetic Induction Cycler)) 간의 데이터 차이분석
○ 3종류의 기계간의 결과차이를 확실히 비교하기 위해 같은 PCR premix (Enzynomics社 TOPreal™ qPCR 2X PreMIX)와 동일 조건을 이용하여 각 프라이머 및 프로브의 발현을 확인했으며,발현을 확인하기 위한 DNA로는 분변 샘플에서 추출한 DNA와 plasmid DNA, 그리고 원포자충의 경우 합성 DNA를 이용하였다. 각 프라이머 및 프로브의 증폭양상을 비교해보았을 때, 기계에 따른 형광의 간섭 혹은 저하는 없는 것으로 확인되었다.
2. 설사환자 샘플에서의 유효성 평가
○ 설사 환자의 대변 샘플을 확보한 후 대변 샘플로부터의 DNA 추출은 Qiagen社의 QIAamp DNA Stool Mini Kit (Cat. No.51604)를 사용하여 제품 Manual에 제시된 Protocol을 본 실험실에 맞게 최적화시켜 추출하였다. 추출한 DNA의 농도 및 순도(260/280)는 Thermo Scientific社의 NanoDrop™ 2000을 이용하여 측정하였다.
○ 표 10을 보면 확보된 209건의 분변 샘플들에 대하여 동일한 실험조건 하에 DNA 추출을 진행한 결과 확보된 분변 샘플들 중 103번과 104번 샘플에서 Single PCR 결과 각각 작은와포자충 검출이 확인되었으며, 이와 동일하게 Multiplex PCR에서도 Single PCR에서와 마찬가지로 이 검출되었다.
PCR positive stool No. Single PCR
 Multiple PCR
Cp Gl Cc Cp Gl Cc
103 + - - + - -
104 + - - + - -
Cp: C. parvum (작은와포자충), Gl: G. lamblia (람블편모충),
Cc: C. cayetanensis (원포자충)
○ 또한 시중에 유통되고 있는 kit (G社)를 이용한 Single real-time PCR 결과 103번(Ct: 33.94)과 104번(Ct: 31.19) 샘플이 양성으로 판정되었으며, 이 결과는 시중에서 판매되는 single real-time PCR Kit와 동일한 결과이며, 이는 표 11을 통하여 확인할 수 있다.
Real-Time PCR positive stool No. Single PCR
 Multiple PCR
CP GL CC CP GL CC
103 + - - + - -
104 + - - + - -
CP: C. parvum (작은와포자충), GL: G. lamblia (람블편모충),
CC: C. cayetanensis (원포자충)
○ 그리고, 람블편모충 포낭을 spiking한 설사변(환자변)에서 추출한 stool-derived DNA 대해 본 발명의 실험 방법과 G社 kit 사용 결과 비교, 원포자충 합성 DNA와 non-infected 환자의 설사변 (negative stool sample)에서 추출한 DNA를 혼합한 시료에 대해 본 발명의 실험 방법과 G社 kit 사용 결과 비교, 본 연구에서 개발된 PCR법과 시중에 판매되고 있는 kit의 결과가 일치하여 본 연구결과로 개발된 진단법을 환자에 적용할 수 있음을 확인하였다.
Ⅳ. 연구 결과 고찰 및 결론
1. 장관감염성 3종 원충( 작은와포자충 , 람블편모충 , 원포자충 )에 대한 동시 신속진단 유전자검사법 구축
가. 3종 원충 DNA를 이용한 Multiplex PCR 확립
○ 작은와포자충(C. parvum)과 람블편모충(G. lamblia), 그리고 원포자충(C. cayetanensis)과 관련된 유전자 검출 및 진단법(Table 5, Table 6)을 검토하였다. 이전에 개발된 검출법들에서 정한 타깃 유전자를 살펴보았고 3종의 원충을 동시에 검출하기 위해 프라이머가 특이적으로 반응할 수 있는 각 원충의 유전자 서열을 비교하여 프라이머를 제작하였다. 이 때, 최대한 상동성이 높은 구간을 피하여 다른 (장관 유래의) 세균 혹은 바이러스와의 교차반응을 줄이고자 하였고, 검출한계 테스트와 타 원충과의 교차반응 유무 검증을 통해서, 본 연구에서 확립된 Multiplex PCR 방법이 2종의 원충(Cp+Gl 혹은 Cp+Cc 혹은 Gl+Cc) 뿐만 아니라 3종의 원충(Cp+Gl+Cc)에 대해서도 동시 검출이 가능한 것으로 확인되었다.
○ 추후 많은 개수의 환자변을 확보하는 과정에서 양성으로 판정된 환자(진양성)의 분변 샘플, 그리고 음성으로 판정된 환자(진음성)의 분변 샘플에 대한 양성 판정 및 음성 판정을 통해 민감도와 특이도에 대한 보완 연구가 향후 필요하다.
○ 3종의 원충(작은와포자충, 람블편모충, 원포자충) 동시 진단법으로 본 연구에서 확립한 Multiplex PCR 방법이 가져오게 될 업무의 단순화는 많은 분변 샘플들을 단 시간에 모니터링 해야 하는 상황에서 그리고, 원인불명의 설사증상이 광범위한 지역에 걸쳐 나타났을 때,그리고 전국적인 원충감염률의 대규모 조사에 있어서 일의 효율을 높여줄 것으로 예상된다.
나. 3종 원충 DNA를 이용한 Multiplex real-time PCR 확립
○ 3종의 프라이머와 더불어 프로브도 함께 제작해야한다는 점을 감안했을 때 일반적인 Multiplex PCR의 디자인보다 더 많은 변수와 조건을 함께 고려할 필요가 있다.
○SYBRGreen을 이용한 Multiplex real-time PCR에서, Melting Curve Analysis 과정을 통해 프라이머의 비 특이적인 결합 또는 dimer, hairpin loop 형성과 같은 PCR 효율 저해요소들을 배제시킬 수 있었다. 이 과정에서 각 원충별로 단일 산물을 증폭하기 위해 확립한 프라이머 조건 확보를 통해 TaqManprobe-based multiplex real-time PCR의 성공률을 높여줄 수 있었다.
○ 결과 도출 면에서 기계 간 차이(ABI社, Bio-Rad社)를 극복하기 위해 3종 원충의 프로브 형광으로 FAMTM, HEXTM, Cy5TM를 선정함으로써 두 기계 모두에서 호환이 가능하고 검출이 용이하도록 디자인하여 기계간 차이를 검증한 결과, 두 기계 모두에서 검출됨을 확인하였다. 또한 두 기계 이외에 BMS社의 real-time PCR machine에도 함께 검출이 가능하였기에 본 연구에서 개발된 TaqManprobe-based multiplex real-time PCR 방법은 기계간 결과 오차를 극복할 수 있는 검사법으로 기대된다.
2. 설사환자 샘플에서의 유효성 평가
○ 현재 시중에 판매되고 있는 kit (작은와포자충, 람블편모충, 원포자충)를 구매하기 위하여 조사한 결과, 본 연구에서 개발한 원충류 3종에 대한 동시 신속진단법 kit는 시판되고 있지 않았다. 따라서 타 진단키트와의 유효성 검증을 위해서는 부득이 각 원충에 대한 진단키트 와의 비교가 불가피하였고, 이를 위해 전 세계적으로 가장 많은 임상 진단 kit를 제공하고 있는 G社 kit를 구입하여 본 연구에서 확립된 Multiplex real-time PCR 조건과 비교하였다.
○ 그 결과, 2종 원충(작은와포자충, 람블편모충)에 대해서는 비슷한 정도의 검출한계를 가지고 공통적인 결과를 도출하였고, 다른 1종인 원포자충에 대해서는 본 연구에서 개발된 진단법의 검출 민감도가 더 높아 실효성과 유효성을 검증할 수 있었다.
○ 다만, 확립된 조건이 활용되도록 kit로 만들어지기 위해서는 internal control, endogenous control과 같은 PCR 반응의 효율 자체를 체크할 수 있는 control들의 개발과, 본 조건에 최적화 된 premix의 개발 같은 파생 연구가 필요하며, 향후 이러한 연구를 통해 좀 더 임상적으로 활용도가 높은 진단법이 개발될 것으로 기대된다.
○ Single PCR과 Multiplex PCR로 판정된 2개의 작은와포자충 양성 stool sample에 대해서 시중에 판매되고 있는 kit와 본 연구에서 확립된 조건을 함께 비교한 결과, 본 연구에서 개발된 PCR법과 시중에 판매되고 있는 kit의 결과가 일치하여 본 연구결과로 개발된 진단법을 환자에 적용 할 수 있음을 확인 하였다. 그러나 작은와포자충 외의 다른 원충에 대해서는 현재까지 확보한 환자 샘플에서 양성을 찾을 수 없어서, 포낭을 spiking한 감염 설사변(람블편모충)과 positive control DNA(원포자충)를 음성 설사변 DNA와 혼합한 시료에 대해 본 연구에서 개발된 PCR 방법과 G社 kit를 적용하여 시판되고 있는 진단 kit와의 비교를 시도하였다. 그 결과 람블편모충 검출결과에선 두 조건 모두 양성으로 나왔으나, 원포자충 검출결과에선 본 연구에서 개발된 진단법의 검출한계가 시중 kit보다 더 뛰어난 것으로 나타났다.
3. 연구 결론
○ 본 연구의 최종 목표인 '장관 감염성 원충의 real-time PCR, multiplex PCR 검사법 구축및 유효성 평가' 는 모두 성공적으로 목표 달성 되었다.
○ 즉, 각 원충에 대한 single PCR 검사법을 구축한 후, 이를 바탕으로 3종 원충의 동시 신속 PCR 진단법(multiplex PCR)을 2종(작은와포자충+람블편모충, 작은와포자충+원포자충, 람블편모충+원포자충) 그리고 3종(작은와포자충+람블편모충+원포자충)을 동시 검출할 수 있는 성공적인 진단법을 개발하였다.
○ 이에 더하여, 2종 혹은 3종에 대해 동시 검출이 가능하도록 각 원충별로 SYBR Green법과 single TaqMan probe법으로 real time PCR 진단법을 성공시켰으며, 최종적으로 원충의 2종 혹은 3종 모두의 동시 신속 real time PCR 진단법을 원충 특이 프로브 개발을 통해 성공하였다.
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Claims (3)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
    서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성되어 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트.
  2. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
    서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 포함하여 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출하기 위한 키트.
  3. 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍;
    서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍; 및
    서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍으로 구성된 프라이머 세트를 PCR 프라이머로 이용하여 분변에서 추출된 DNA에서 작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 람블편모충(Giardia lamblia) 및 원포자충(Cyclospora cayetanensis)의 장관감염성 원충 3종을 동시에 검출할 수 있는 다중 중합효소연쇄반응 (Multiplex- Polymerase Chain Reaction) 검출방법.
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CN109234420A (zh) * 2018-10-09 2019-01-18 河南省奶牛生产性能测定中心 检测微小隐孢子虫的荧光定量pcr引物、探针、试剂盒及方法

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