KR101800951B1 - 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드, 그의 용도 및 그의 제조 방법 - Google Patents

호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드, 그의 용도 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드, 그의 용도 및 그의 제조 방법이 개시된다. 상기 펩티드는 화학적 또는 유전 공학 방법에 의해 합성될 수 있으며, 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 갖고, 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는다. 상기 펩티드는 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하고, 상기 감염을 방지/치료하고, 또한 호흡기 바이러스에 대한 새로운 예방/치료 약물을 개발하는데 유용하다. 또한, 임의의 상기 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA, 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 상기 감염을 억제할 수 있는 펩티드를 스크리닝하기 위한 키트 및 상기 스크리닝 방법이 개시된다. 본 발명은 또한 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖는 새로운 예방제/치료제를 개발하기 위한 이론적 뒷받침을 제공하는 상기 감염의 억제에서의 상기 펩티드의 메커니즘이 개시된다.

Description

호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드, 그의 용도 및 그의 제조 방법{PEPTIDES HAVING ACTIVITY OF INHIBITING INFECTIONS OF RESPIRATORY VIRUSES, USE OF THE SAME AND METHODS OF PREPARING THE SAME}
본 발명은 항-바이러스의 예방 및 치료 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드, 상기 펩티드를 이용하여 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법, 상기 펩티드를 호흡기 질환의 감염을 방지 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 사용하는 용도, 상기 펩티드의 제조 방법, 상기 펩티드를 포함하는 조성물, 상기 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA, 프로모터에 작동적으로 연결된(operatively linked) 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포뿐만 아니라 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드를 스크리닝하기 위한 키트 및 상기 스크리닝 방법에 관한 것이다.
항미생물 펩티드(AMP, antimicrobial peptide)는 아마도 모든 다세포 식물 및 동물에 의해 생산되는 고유한 숙주 방어 분자이다("Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)" 참조). 이들은 감염의 초기 단계에서 침입하는 병원체를 신속하게 제거하기 위한 선천성(innate) 면역 시스템의 첫 번째 라인을 포함하며, 또한 전신 적응성(adaptive) 면역 반응을 촉진한다("Rohrl, J., Huber, B., Koehl, G.E., Geissler, E.K. & Hehlgans, T. Mouse beta-defensin 14 (Defb14) promotes tumor growth by inducing angiogenesis in a CCR6-dependent manner. J Immunol 188, 4931-4939 (2012)" 및 "Yang, D., et al. Beta-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science 286, 525-528 (1999)" 참조). 대부분의 AMP는 양친매성 및 양이온성 분자로서, 일반적으로 음전하를 갖는 미생물의 막에 대한 결합 능력을 부여한다. 수 백가지 AMP가 그 구조적 특성 및/또는 아미노산 조성에 따라 확인 및 분류되어 있다. 척추동물에서 AMP의 2가지 패밀리인 카텔리시딘(cathelicidin) 및 디펜신(defensin)은 백혈구 및 상피 세포에 의해 주로 생산되는 작은 분자이다("Lehrer, R.I. Primate defensins. Nat Rev Microbiol 2, 727-738 (2004)" 및 "Selsted, M.E. & Ouellette, A.J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. Nat Immunol 6, 551-557 (2005)" 참조). 카텔리시딘의 전구체는 보존된 아미노-말단 "카텔린" 도메인(약 100개 잔기의 길이)을 함유한다. 가공된 카텔리시딘 펩티드는 12 내지 80개 아미노산 잔기의 길이 범위이고, α-나선, β-시트 또는 다른 유형의 3차원 구조를 갖거나 갖지 않는다("Lehrer, R.I. & Ganz, T. Cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides. Curr Opin Hematol 9, 18-22 (2002)" 및 "Zanetti, M. Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity. J Leukoc Biol 75, 39-48 (2004)" 참조). 디펜신은 작은(2-6 kD) 시스테인-풍부 AMP이며, 주로 3개(드물게는 4개)의 보존된 분자내 이황화 가교에 의해 안정화된 β-시트 구조를 형성한다. 디펜신의 3가지 서브패밀리는 척추동물에서 그 이황화 패턴에 따라 α-, β- 및 θ-디펜신으로 추가로 분류된다("Lehrer, R.I. Primate defensins. Nat Rev Microbiol 2, 727-738 (2004)" 참조). 상기 펩티드는 일반적으로 그람-양성 및 그람-음성 박테리아, 진균 및 바이러스를 포함하는 미생물의 감염에 대해 더 넓은 범위의 비-특이적 활성을 갖는다. 박테리아에 대한 AMP의 다양한 작용 모드(mode)는 막의 본성을 파괴하고("Shai, Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. Biochim Biophys Acta 1462, 55-70 (1999)" 및 "Yang, L, Weiss, T.M., Lehrer, R.I. & Huang, H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. Biophys J 79, 2002-2009 (2000)" 참조), 핵 및 단백질 합성을 손상시키며, 샤페론-지원된(assisted) 단백질 접힘(fold)을 억제하고, 세포벽 생합성 경로를 방해하며, 막의 생체합성(biogenesis)을 표적하는 것을 포함한다("Brogden, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol 3, 238-250 (2005)", "Hale, J.D. & Hancock, R.E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Rev Anti Infect Ther 5, 951-959 (2007)" 및 "Srinivas, N., et al. Peptidomimetic antibiotics target outer-membrane biogenesis in Pseudomonas aeruginosa. Science 327, 1010-1013 (2010)" 참조). 그러나, 지금까지 AMP의 항바이러스 메커니즘은 여전히 많이 알려져 있지 않다.
디펜신은 항균("Nizet, V., et al. Innate antimicrobial peptide protects the skin from invasive bacterial infection. Nature 414, 454-457 (2001)" 및 "Mygind, PH., et al. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus. Nature 437, 975-980 (2005)" 참조), 항바이러스("Gong, T, et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010)" 및 "Leikina, E., et al. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6, 995-1001 (2005)" 참조), 및 항진균("Krishnakumari, V., Rangaraj, N. & Nagaraj, R. Antifungal activities of human beta-defensins HBD-1 to HBD-3 and their C-terminal analogs Phd1 to Phd3. Antimicrob Agents Chemother 53, 256-260 (2009)" 및 "Jiang, Y, et al. Antifungal activity of recombinant mouse beta-defensin 3. Lett AppI Microbiol 50, 468-473 (2010)" 참조)을 포함하는 많은 특성을 갖는 것으로 나타나 있다.
자연형 디펜신은 바이러스 감염과 같은 감염에 대한 반응으로 선천성 및 적응성 면역 시스템에 의해 생산된다("Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)" 참조). 마우스에서, 뮤린(murine) β-디펜신-3 및 β-디펜신-4의 유전자 발현은 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 상부 호흡기에서 유도된다("Chong, K.T., Thangavel, R.R. & Tang, X. Enhanced expression of murine beta-defensins (MBD-1 , -2, -3, and -4) in upper and lower airway mucosa of influenza virus infected mice. Virology 380, 136-143 (2008)" 참조). HIV-1 Tat는 인간 B 세포에서 인간 β-디펜신-2의 발현을 유도할 수 있다("Ju, S.M., et al. Extracellular HIV-1 Tat induces human beta-defensin-2 production via NF-kappaB/AP-1 dependent pathways in human B cells. Mol Cells 33, 335-341 (2012)" 참조).
유도된 디펜신은 감염의 초기 단계에 침입하는 미생물에 대한 보호에 있어서 중요한 역할을 한다("Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)" 참조). 인간 α-디펩신-1은 인플루엔자 바이러스 복제를 억제하는 것으로 나타나 있으며, 이는 단백질 키나아제(kinase) C 활성화의 감쇠(attenuation)로 인한 것일 수 있다("Salvatore, M., et al. alpha-Defensin inhibits influenza virus replication by cell-mediated mechanism(s). J Infect Dis 196, 835-843 (2007)" 참조). 마우스 β-디펜신-2는 표적 세포 내로 바이러스가 진입하는 것을 차단함으로써 바이러스 감염을 억제하는 것으로 나타나 있다("Gong, T, et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010)" 참조). θ-디펜신인 레트로사일린 2(RC2)는 막 당단백질을 가교결합함으로써 바이러스-세포 막 융합을 억제하는 것으로 실증되었다("Leikina, E., et al. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6, 995-1001 (2005)" 참조). 항체 및 T 림프구와 같은 적응성 면역 시스템의 이펙터(effector)는 매우 병원체 특이적이다. 이와 대조적으로, 디펜신과 같은 선천성 면역 시스템의 이펙터는 일반적으로 미생물에 대한 더 넓은 스펙트럼의 활성을 갖는다. 디펜신의 특유의(unique) 특성은 이들이 약-저항성의 기회를 줄이면서 더 넓은 스펙트럼의 항바이러스 약을 개발하기 위한 매력적인 후보가 되게 한다. 항바이러스 전략의 경우, 바이러스 진입, 바이러스 RNA 방출, 바이러스 복제 및 방출의 억제가 항바이러스 약을 개발하기 위한 표적으로 선택될 수 있다.
오르토믹소비리대, 파라믹소비리대 및 코로나비리대와 같이 최근의 감염병(emerging infection)을 초래하는 보통의 호흡기 바이러스 패밀리에 대한 특이적 항바이러스제는 이용가능하지 않거나, 상기 바이러스 유전자의 빠른 돌연변이로 인해 약-저항성이 일어나기 쉽다("Cheng, V.C., S.K. Lau, P.C. Woo, and K.Y. Yuen. 2007. Severe acute respiratory syndrome coronavirus as an agent of emerging and reemerging infection. Clin Microbiol Rev 20:660-694", "Cheng, V.C., K.K. To, H. Tse, I.F. Hung, and K.Y. Yuen. 2012. Two years after pandemic influenza A/2009/H1 N1: what have we learned? Clin Microbiol Rev 25:223-263", 및 "Wong, S.S., and K.Y. Yuen. 2008. Antiviral therapy for respiratory tract infections. Respirology 13:950-971" 참조). 마우스 및 인간 유래의 많은 디펜신이 시험관내 및 생체내에서 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타났지만("Jiang, Y, Y. Wang, Y. Kuang, B. Wang, W. Li, T. Gong, Z. Jiang, D. Yang, and M. Li. 2009. Expression of mouse beta-defensin-3 in MDCK cells and its anti-influenza-virus activity. Arch Virol 154:639-647", "Quinones-Mateu, M.E., M.M. Lederman, Z. Feng, B. Chakraborty, J. Weber, H.R. Rangel, M.L. Marotta, M. Mirza, B. Jiang, P. Kiser, K. Medvik, S.F. Sieg, and A. Weinberg. 2003. Human epithelial beta-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. Aids 17:F39-48", 및 "Sun, L., CM. Finnegan, T. Kish-Catalone, R. Blumenthal, P. Garzino-Demo, GM. La Terra Maggiore, S. Berrone, C. Kleinman, Z. Wu, S. Abdelwahab, W. Lu, and A. Garzino-Demo. 2005. Human beta-defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. J Virol 79:14318-14329" 참조), 치료제로서 디펜신을 개발하는 것은 차선의(suboptimal) 효능, 부작용 및 상업적 규모 생산의 비용-효과적인 수단의 부재와 같은 몇 가지 인자에 의해 못하게 되었다.
따라서, 최근의 바이러스 호흡기 질환과 싸우기 위해서는 안전하고, 강력하며, 넓은 스펙트럼의 항바이러스제가 시급히 요구된다.
본 발명의 한 과제는 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 펩티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 과제는 상기 펩티드의 합성 방법, 상기 펩티드를 포함하는 조성물, 상기 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA, 프로모터에 작동적으로 연결된 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 과제는 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법 및 호흡기 바이러스의 감염을 방지 또는 치료하기 위한 약물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 과제는 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드를 스크리닝하기 위한 키트뿐만 아니라 상기 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 화학적 경로를 통해 또는 유전 공학 공정에 의해 합성된 펩티드를 제공하며, 상기 펩티드는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 갖고, 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 세포의 말기 엔도좀(late endosome) 내의 산성화를 방지하는 기능을 추가로 갖는다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 5개 이상의 염기성 아미노산을 갖는다; 보다 바람직하게는, 상기 펩티드는 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 2 이상의 염기성 아미노산을 갖는다; 및 추가로 바람직하게는, 상기 펩티드는 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 3개 이상의 염기성 아미노산을 갖는다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 4개 이상의 시스테인을 갖는다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 아래에 개시된 것과 같은 아미노산 서열 (a) 또는 (b)를 갖는다:
(a) 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열; 또는
(b) 상기 아미노산 서열 (a)에서 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 얻어진 아미노산 서열.
바람직하게는, 상기 아미노산 서열 (b)는 상기 아미노산 서열 (a)와 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 추가로 바람직하게는 적어도 90% 동일하다.
바람직하게는, 상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 10, 서열번호 13 또는 서열번호 17로 기재된다.
바람직하게는, 상기 N-말단 영역은 상기 펩티드의 N-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하의 서열을 포함한다; 및 상기 C-말단 영역은 상기 펩티드의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 C-말단 영역은 2개의 시스테인 및 염기성 아미노산을 갖는다.
바람직하게는, 상기 C-말단 영역은 다음의 아미노산 조성을 갖는 10개의 아미노산을 갖는다: 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 시스테인 - 시스테인 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 -자유 카르복실.
바람직하게는, 상기 펩티드는 인간 또는 마우스로부터 기원된다(originated); 및 보다 바람직하게는, 상기 펩티드는 마우스 β-디펜신-4로부터 기원된다.
바람직하게는, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택된다; 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 임의의 하나의 펩티드; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법을 제공하는 것으로서, 상기 방법은 본 발명의 임의의 하나의 펩티드를 표적 세포 및 호흡기 바이러스를 포함하는 시스템 내에서 상기 호흡기 바이러스와 접촉 및 결합하도록 하는 단계; 및
상기 펩티드가 상기 표적 세포의 말기 엔도좀이 바이러스 RNA를 방출하는 것을 억제하도록 함으로써 상기 표적 세포 내에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 단계를 포함한다;
상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택된다; 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한다.
바람직하게는, 상기 바이러스에 대한 상기 펩티드의 결합은 상기 바이러스의 표면 당단백질에 대한 상기 펩티드의 결합을 포함한다; 및 상기 펩티드는 상기 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 억제함으로써 상기 바이러스 RNA의 방출을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 임의의 하나의 펩티드를 호흡기 바이러스의 감염을 방지 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 화학적 경로를 통해 또는 유전 공학 공정에 의해 상기 펩티드를 합성하는 단계를 포함하는 본 발명의 임의의 하나의 펩티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 임의의 하나의 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 상기 DNA를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 임의의 하나의 펩티드인 양성 대조군; 및
상기 호흡기 바이러스에 의해 감염될 수 있는 표적 세포를 포함하는, 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 키트는 세포 배양 배지를 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 키트는 음성 대조군 또는 블랭크(blank) 대조군을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택된다; 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한다.
바람직하게는, 상기 표적 세포는 마딘-다비(Madin-Darby) 개 신장 세포(MDCK, ATCC No. CCL-34), 태아 레수스(rhesus) 원숭이 신장 세포(FRhK-4, ATCC No. CRL-1688) 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 E6 세포(Vero-E6, ATCC No. CRL-1586)로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드의 스크리닝 방법을 제공하는 것이며, 다음의 단계들을 포함한다:
a) 단리된 또는 무작위로 합성된 후보 펩티드를 제공하는 단계;
b) 본 발명의 임의의 하나의 펩티드인 양성 대조군을 제공하는 단계;
c) 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군을 각각 및 별도로 상기 호흡기 바이러스와 접촉하도록 하는 단계;
d) 상기 후보 펩티드와 접촉된 호흡기 바이러스 및 상기 양성 대조군과 접촉된 호흡기 바이러스를 각각 및 별도로 이용하여 표적 세포를 감염시키는 단계;
e) 상기 표적 세포에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하기 위한 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군의 능력을 평가하는 단계; 및
f) 상기 양성 대조군과 동일하거나 그 이상인 억제 능력을 갖는 후보 펩티드를 선택하는 단계.
본 발명은 다양한 호흡기 바이러스 감염을 저해할 수 있는 펩티드를 제공하며, 호흡기 바이러스 감염 억제에 있어서의 상기 펩티드의 메커니즘을 개시한다. 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인으로 인해, 상기 펩티드는 바이러스 표면 당단백질에 결합할 수 있고, 다시 식세포작용(endocytosis)을 통해 세포의 엔도좀 내로 운반될 수 있다. 상기 펩티드는 염기성 아미노산이 풍부하기 때문에, 말기 엔도좀에서 pH의 감소를 억제할 수 있고, 이로 인해 바이러스-엔도좀 막의 융합과, 이후의 바이러스 분리(disassembly) 및 바이러스 RNA 방출을 차단한다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 다양한 서브타입의 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스와 같은 호흡기 바이러스의 감염을 방지하는 강력한 활성을 보여주며, 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하고 호흡기 바이러스의 감염을 방지 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는데 있어서의 이러한 펩티드의 메커니즘을 개시하며, 이는 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖는 새로운 예방제 및 치료제를 개발하기 위한 이론적 뒷받침을 제공하고, 상기 예방제 및 치료제의 개발을 위한 길을 닦는다.
본 발명의 바람직한 구현예는 실시예에 의해, 그리고 부속하는 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 재조합 마우스 β-디펜신-4(rmBD4)의 구축, 발현 및 정제를 보여준다; (A)는 마우스 β-디펜신-4(mBD4) 유전자의 원래의 코돈이 OPTIMIZER에 의해 대장균(E. coli)-선호의(preferred) 코돈으로 최적화되었음을 보여준다; (B)는 상기 최적화된 서열에 기초하여, PCR에 의해 rmBD4 유전자를 합성하기 위해 6쌍의 올리고뉴클레오티드가 디자인되었음을 보여주며, 밑줄친 뉴클레오티드는 Kpnl 및 Xhol의 인식 부위를 나타낸다; (C)는 β-디펜신-4 융합 단백질인 Trx-rmBD4(Trx-β-D-4)의 발현 및 정제의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 보여주며, 상기 분석에서, 샘플 내의 단백질은 먼저 12%(w/v) SDS-PAGE에 의해 용해되었고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 용액으로 염색함으로써 시각화하였으며, 겔 상의 평행한(parallel) 용해된 단백질은 PVDF 막으로 전달되었고, 이후 1차 항체로서 토끼 항-mBD4 항체(1:2,000, Max Biotechnology Co. Ltd., China) 및 2차 항체로서 서양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다아제 접합된(HRP-) 염소 항-토끼 항체(1:3,000, Dako, Denmark)를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다; 및 (D)는 정제된 Trx-β-D-4, 소화된(digested) Trx-β-D-4 및 정제된 rmBD4(즉, 도 1의 (D)에서 나타낸 회복된(recovered) β-D-4)의 트리신(tricine) 겔(16%(w/v)) 전기영동 분석을 보여준다.
도 2는 시험관내에서 펩티드의 항바이러스 활성 및 세포독성을 평가한 것을 보여준다; A는 MDCK 세포 배양물의 플라크 분석에 의해 30 mM 포스페이트 버퍼(PB, phosphate buffer) 및 MEM 내에서 mBD4로부터 유래된(derived) 11개 짧은 펩티드의 항바이러스 활성을 스크리닝한 것을 보여준다; B는 플라크 분석에 의해 PB 내에서 상이한 농도에서 P9의 항바이러스 효능을 검출한 것을 보여준다; C는 테트라졸리움-기반의 비색(colorimetric)(MTT) 분석을 이용하여 P9, smBD4 및 rmBD4의 세포독성을 검출한 것을 보여준다.
도 3은 치사(lethal) 바이러스 챌린지(challenge) 마우스 모델에서 P9의 예방 및 치료 효과를 평가한 것을 보여준다; A는 치사 바이러스 챌린지 전에 P9 또는 rmBD4(50 ㎍/마우스)로 비강내(i.n.) 접종된 마우스의 생존율을 보여준다; B는 치사 바이러스 챌린지 4시간 후에 P9 또는 rmBD4(50 ㎍/마우스)로 비강내 처리된 마우스의 생존율을 보여준다; 및 C는 치사 바이러스 챌린지 4시간 후에 표시된 복용량(200 또는 400 ㎍/마우스)으로 P9로 복강내(i.p.) 주사된 마우스의 생존율을 보여준다. 생존율의 통계적 유의성(9 마우스/군)은 GraphPad Prism 5에 의해 분석되었고, P 값은 본 도면에 표시되었다.
도 4는 P9 또는 rmBD4로 예방 및 치료적으로 처리된 마우스의 폐 조직에서 바이러스 부하(load) 및 조직병리학적 변화를 검출한 것을 보여준다; A는 비강내 접종(비강내 치료) 또는 복강내 주사(복강내 치료)에 의해 예방적 처리(예방) 또는 치료를 받은 마우스의 폐 조직에서 실시간(real-time) RT-PCR에 의해 측정된 바이러스 RNA 카피(copy)를 보여주며, 데이터는 5마리 마우스로부터의 결과의 평균+SD로서 제공되고, 기호 "*"는 투-테일(two-tailed) 스튜던트 t-테스트에 의해 분석될 때 P<0.05 임을 나타낸다; B는 마우스의 폐 조직에서의 감염성 바이러스의 역가가 플라크 분석에 의해서도 검출되었음을 보여주며, 결과는 5마리 마우스의 평균+SD로서 제공되고, 기호 "*"는 투-테일 스튜던트 t-테스트에 의해 분석될 때 P<0.05 임을 나타낸다; C는 H&E 염색에 의해 테스트된 마우스 폐 조직에서의 조직병리학적 변화를 보여주는 이미지이다. P9(예방, 비강내 치료, 또는 복강내 치료) 또는 rmBD4(예방, 또는 비강내 치료)로 처리된 마우스, 처리되지 않은 마우스(처리되지 않음) 및 감염되지 않은 마우스(정상)로부터 취한 폐 조직의 대표적인 조직학적 절편(section)은 도 4의 C에 나타나 있다(원래 배율의 100×).
도 5는 P9가 바이러스와의 반응을 통해 MDCK 세포에서의 바이러스 감염을 억제하였음을 보여준다; A 내지 C는 감염 후의 표시된 시점에서 수집된 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 감염된 세포 내부의 바이러스 RNA 카피를 보여준다; D 내지 F는 감염 후의 표시된 시점에서 수집된 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 배양 상등액에서의 바이러스 RNA 카피를 보여준다; 및 G 내지 I는 감염 후 표시된 시점에서 수집된 플라크 분석에 의해 검출된 배양 상등액에서의 바이러스 역가를 보여준다. 처리되지 않은 바이러스 대조군(VC)이 실험 내에 포함되었다. 상기 도면에서, 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균+SD로서 표시되었고, 기호 "*"는 투-테일 스튜던트 t-테스트에 의해 분석될 때 P<0.05 임을 나타내었다.
도 6은 바이러스 입자 및 바이러스 표면 단백질 해마글루티닌(HA, haemagglutinin)에 결합된 P9를 보여준다; A는 공초점 현미경(원래 배율의 400×)으로 찍은 대표적인 형광 이미지를 보여주며, 그 결과는 P9가 바이러스에는 결합하지만 세포에는 결합하지 않았음을 나타낸다; B는 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 P9가 바이러스 표면 당단백질 HA에는 결합하지만 뉴라미니다아제(NA, neuraminidase)에는 결합하지 않았음을 보여준다; 및 C는 ELISA에 의해 검출된 HA 및 NA에 대한 P9의 결합 친화도를 보여주며, 그 결과는 P9가 HA에는 결합하지만 NA에는 결합하지 않았음을 확인한다.
도 7은 P9가 바이러스-수용체 결합 및 식세포작용을 억제하지 않았지만, 말기 엔도좀으로부터의 바이러스 RNA 방출은 차단하였음을 보여준다; A 및 B는 공초점 현미경(원래 배율의 400×)으로 찍은 대표적인 형광 이미지를 보여주며, 보다 구체적으로, A의 결과는 P9가 바이러스-수용체 결합 및 식세포작용을 방지할 수 없었음을 나타내고, B는 바이러스(컬러 이미지에서의 녹색 점, B의 왼쪽 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함) 및 P9(컬러 이미지에서의 붉은색 점, B의 가운데 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함)의 동시국소화(colocalization)(컬러 이미지에서의 오렌지색 점, B의 오른쪽 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함)가 감염 2시간 후에 나타났음을 보여준다; 및 C는 처리되지 않은 바이러스("VC"로 나타냄) 또는 P9를 이용하여 전처리된 바이러스("P9"로 타나냄)로 MDCK 세포를 감염시키고, 상기 감염된 세포를 표시된 시점에서 수확하고, 및 실시간 RT-PCR에 의해 바이러스 RNA 카피를 검출함으로써 얻은 결과를 보여주며, 그 결과는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD로서 나타나 있다.
도 8은 P9가 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 저해하여 감염된 세포로 바이러스 RNA가 방출되는 것을 차단하였음을 보여준다; A는 표시된 시점에서 수집된 세포 샘플에서 실시간 RT-PCR에 의해 검출된 바이러스 RNA 카피를 보여주며, 그 결과는 P9의 억제 효과가 말기 엔도좀 억제제(NH4Cl)의 경우와 유사하였음을 나타낸다; 및 B는 공초점 현미경으로 찍은 엔도좀 산성화의 검출을 보여주는 이미지를 제공하며, 흰색 화살표는 바이러스 위치(컬러 이미지에서의 녹색 점, B의 왼쪽 아래 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함) 및 대응하는 엔도좀 산성화(컬러 이미지에서의 붉은색 점, B의 왼쪽 위 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함)를 나타내고, P9로 전처리된 바이러스로 감염된 세포에서는, 엔도좀 산성화(B의 오른쪽 위 사진 참조)는 검출되지 않았지만, 엔도좀 내에서 바이러스(컬러 이미지에서의 녹색 점, B의 오른쪽 아래 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 대응함)는 검출되었다.
도 9는 P9에서의 염기성 아미노산이 바이러스 감염의 억제에 있어서 중요한 역할을 함을 보여준다; A는 음성 대조군(NC)으로 포함되어 있는 소 혈청 알부민을 이용한 ELISA에 의해 표시된 농도(ng)에서 테스트된 바이러스 단백질 HA에 대한, P9의 C-말단에 1 내지 3개 염기성 아미노산(들)을 중성 또는 산성 아미노산(들)으로 치환하거나(P9-S1, P9-S2 및 P9-S3), P9의 N-말단에 3개의 산성 아미노산을 부가하거나(P9-aci-1), P9의 N-말단에 3개의 염기성 아미노산을 부가함으로써 얻어진 P9-유사체(analogous) 펩티드(아래의 표 3 참조)를 포함하는 표시된 펩티드의 결합 친화도를 보여준다; B는 헤마글루틴화(hemagglutination)-억제(HAI) 분석에 의해 측정된 바이러스 HA 단백질의 헤마글루틴화에 대한 펩티드의 억제 활성을 보여준다; 및 C는 실시간 RT-PCR을 이용하여 MDCK 세포에서 P9-유사체 펩티드의 항바이러스 효과를 검출한 결과를 보여준다.
도 10은 생체내에서 넓은 호흡기 바이러스의 감염에 대한 P9의 항바이러스 효과를 검출한 것을 보여주며, 50% 억제 농도(IC50)는 각각 점선으로 나타내었고, 그 결과는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD로서 나타내었다. 도 10에서, 그래프 (a)는 플라크 분석에 의해 상이한 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스의 감염에 대한 P9의 항바이러스 효과를 검출한 것을 보여준다; 및 그래프 (b)는 플라크 분석에 의해 SARS-CoV 및 MERS-CoV의 감염에 대한 P9의 항바이러스 효과를 검출한 것을 보여준다.
본 발명은 화학적 경로를 통해, 또는 유전 공학 공정에 의해 합성된 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 갖고, 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는다.
예를 들면, 상기 호흡기 바이러스가 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 또는 H7과 같은 인플루엔자 바이러스인 경우, 본 발명의 펩티드는 상기 바이러스의 표면 당단백질인 HA에 결합할 수 있다. 상기 호흡기 바이러스가 SARS-CoV 또는 MERS-CoV와 같은 코로나바이러스인 경우, 본 발명의 펩티드는 상기 바이러스의 표면 당단백질인 스파이크(spike) 단백질(S 단백질)에 결합할 수 있다.
호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 가짐으로써, 상기 펩티드는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있고, 추가로 식세포작용을 통해 세포의 엔도좀 내로 운반되어 상기 호흡기 바이러스의 감염을 방지함에 있어서의 활성을 발휘할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 세포의 말기 엔도좀에서의 산성화를 방지하는 기능을 추가로 갖는다. 특히, 상기 펩티드는 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 저해하여 바이러스-엔도좀 막 융합과, 이후의 바이러스 분리 및 바이러스 RNA 방출을 차단할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 5개 또는 그 이상(예를 들면, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6개 이하)의 염기성 아미노산을 갖는다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 2개 또는 그 이상(예를 들면, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하)의 염기성 아미노산을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 펩티드는 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에 3개 또는 그 이상(예를 들면, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개 이하)의 염기성 아미노산을 갖는다.
또한, 본 발명의 펩티드는 4개 또는 그 이상(예를 들면, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 이하), 바람직하게는 4 내지 6개의 시스테인을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 펩티드의 N-말단 영역은 상기 펩티드의 N-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하 아미노산의 서열을 포함하고, 상기 펩티드의 C-말단 영역은 상기 펩티드의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하 아미노산의 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 C-말단 영역은 2개의 시스테인을 갖고, 염기성 아미노산이 풍부하다. 본 명세서에서 사용된 "염기성 아미노산이 풍부한"이란 표현은 상기 펩티드의 C-말단이 2개 또는 그 이상(예를 들면, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3개 이하), 바람직하게는 3 내지 6개의 염기성 아미노산을 갖는 것을 의미한다.
보다 바람직하게는, 상기 C-말단 영역은 다음의 아미노산 조성으로 10개의 아미노산을 갖는다: 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 시스테인 - 시스테인 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 자유 카르복실. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, C-말단에서의 "자유 카르복실"은 상기 C-말단 염기성 아미노산의 카르복실을 나타낸다.
본 발명의 펩티드는 아래에 개시된 것과 같은 아미노산 서열 (a) 또는 (b)를 갖는 것이 바람직하다:
(a) 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열; 또는
(b) 상기 아미노산 서열 (a)에서 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 얻어진 아미노산 서열.
서열번호 10으로 나타낸 아미노산 서열은 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 포함하며, 2개의 시스테인을 갖고, 그의 C-말단 영역에서 염기성 아미노산이 풍부하다. 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드(즉, 아미노산 서열 (a))는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있고, 세포의 말기 엔도좀에서의 산성화를 방지하는 기능을 가져서 호흡기 바이러스의 감염을 방지한다.
전술한 아미노산 서열 (b)를 갖는 펩티드는, 치환, 결실 및/또는 부가가 호흡기 바이러스의 감염을 방지하는데 있어서 상기 펩티드의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 상기 아미노산 서열 (a)에서 하나 또는 수 개의 아미노산을 치환, 결실 및/또는 부가함으로써 얻어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 염기성 아미노산의 수는 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 얻어진 아미노산 서열에서 변하지 않거나 증가한다. 상기 아미노산 서열 (b)는 상기 아미노산 서열 (a)와 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 97% 동일한 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 10, 서열번호 13 또는 서열번호 17로 기재되는 것이 바람직하다. 전술한 것과 같이, 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있고, 세포의 말기 엔도좀에서의 산성화를 방지하는 기능을 가져서 호흡기 바이러스의 감염을 방지한다. 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 서열번호 10으로 나타낸 아미노산 서열의 C-말단에서 하나의 염기성 아미노산 K를 N으로 치환시킴으로써 얻어졌다. 이러한 치환은 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 대한 상기 펩티드의 결합 친화도에 영향을 미치지 않고, 호흡기 바이러스의 감염에 대한 상기 펩티드의 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 서열번호 17로 기재되는 펩티드는 서열번호 10으로 나타낸 아미노산 서열의 N-말단에서 3개의 염기성 아미노산 K, H 및 R을 부가함으로써 얻어졌다. 이러한 부가는 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 대한 상기 펩티드의 결합 친화도에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라, 호흡기 바이러스의 감염에 대한 상기 펩티드의 효과에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 유전 공학에 의해 얻어지거나(예를 들면, 재조합 펩티드로서 얻어짐), 화학적 합성 방법에 의해 얻어진다. 또한, 본 발명의 펩티드는 마우스 또는 인간으로부터 기원되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 상기 펩티드는 마우스 β-디펜신-4(mBD4)로부터 기원된다.
상기 개시의 다른 측면은 본 발명에 따른 하나 이상의 펩티드 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물 내에서 사용되는 펩티드의 양은 특정 적용분야에 따라 결정될 수 있고, 5-500 ㎍/㎖, 바람직하게는 20-300 ㎍/㎖ 및 보다 바람직하게는 50-200 ㎍/㎖의 범위일 수 있다.
본 발명에서 유용한 약학적으로 허용가능한 부형제는 본 기술분야에서 종래 사용되는 것들이다. 상기 부형제는 실제 적용분야 또는 특정 복용량의 필요에 따라 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들면, 문헌(Chapter 4, "Research of Peptide Drug Formulations", pages 82-100 of "Peptide Drugs Research and Development" edited by Baoqiu LI, People's Medical Publishing House, July 2011)에 개시된 것들일 수 있다. 본 발명의 조성물에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제는 보통 범위 내의 양으로 사용될 수 있으며, 이의 적합한 양은 실제 적용분야에 따라 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 펩티드가 표적 세포 및 바이러스를 포함하는 시스템에서 호흡기 바이러스와 접촉 및 결합하도록 하는 단계; 및
상기 펩티드가 표적 세포의 말기 엔도좀이 바이러스 RNA를 방출하는 것을 억제하도록 하여 상기 표적 세포 내에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 단계를 포함하는, 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한다.
바람직하게는, 바이러스에 대한 펩티드의 결합은 상기 바이러스의 표면 당단백질에 대한 상기 펩티드의 결합을 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 억제함으로써 바이러스 RNA 방출을 억제할 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 펩티드는 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 효과를 발휘한다.
본 발명의 한 특정한 구현예에서, 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법은 생체내 또는 시험관내에서 수행된다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 펩티드를 호흡기 바이러스의 감염을 방지 또는 치료하기 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다. 상기 약물은 스프레이 형태, 주사 형태(예컨대, 주사 용액 또는 동결건조 분말 주사), 경구용 제형 등으로 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 호흡기 바이러스에 감염되거나 감염이 발생할 위험이 있는 개체를 치료적으로 또는 예방적으로 처리하는 방법을 제공하며, 본 발명에 따른 임의의 하나 이상의 펩티드를 상기 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
상기 펩티드가 호흡기 바이러스에 의해 감염된 개체를 치료하기 위해 사용되는 경우, 투여 용량은 치료를 위한 유효량이다. 예를 들면, 상기 치료에 사용되는 본 발명의 펩티드의 총 용량은 1-40 ㎎/㎏ 체중/일, 바람직하게는 2-20 ㎎/㎏ 체중/일, 및 보다 바람직하게는 2.5-10 ㎎/㎏ 체중/일의 범위일 수 있다.
상기 펩티드가 호흡기 바이러스의 감염이 발생할 위험이 있는 개체의 예방적 처리를 위해 사용되는 경우, 상기 투여 용량은 예방을 위한 유효량이다. 예를 들면, 상기 예방적 처리에서 사용되는 본 발명의 펩티드의 총 용량은 0.1-40 ㎎/㎏ 체중/일, 바람직하게는 0.5-20 ㎎/㎏ 체중/일, 및 보다 바람직하게는 1-10 ㎎/㎏ 체중/일의 범위일 수 있다.
본 발명의 펩티드는 비강내 접종(예를 들면, 스프레이) 또는 정맥내 주사(예를 들면, 복강내 주사)에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 개시된 호흡기 바이러스는 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스를 포함한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 H1N1, H3N2, H5N1, H7N7 및 H7N9와 같은 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 다른 측면은 화학적 경로를 통해 또는 생물학적 방법(즉, 유전 공학)에 의해 펩티드를 합성하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 펩티드의 제조 방법을 제공한다.
원하는 펩티드는 본 기술분야에서의 일반적인 공정을 통해 화학적 방법 또는 생물학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 화학적 반응을 통해 구성하는 아미노산들을 하나씩 결합시킴으로써, 원하는 펩티드는 화학적으로 합성될 수 있다. 생물학적 방법에 의한 원하는 펩티드의 합성은, 예를 들면, 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 원하는 펩티드를 암호화하는 DNA를 증폭하는 단계; 상기 DNA를 발현 벡터 내로 서브클로닝(subcloning)하는 단계; 및 상기 DNA를 함유하는 발현 벡터를 진핵세포 또는 원핵세포 숙주 세포 내로 형질감염 또는 형질전환함으로써 상기 원하는 펩티드를 발현하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 임의의 하나의 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명에 따른 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "발현 벡터"란 용어는 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터를 나타낸다. 본 발명에 따른 해당 펩티드의 발현은 발현되는 본 발명의 DNA와 프로모터 서열을 작동적으로 연결시킴으로써 상기 프로모터 서열에 의해 유도될 수 있다. 일반적으로, 유전 공학 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 그러나, 본 발명은 다른 공지된 형태의 발현 벡터도 포함하도록 의도된다.
프로모터 및 본 발명의 펩티드를 암호화하는 DNA는, 상기 프로모터가 상기 DNA가 RNA로 발현하도록 유도할 수 있을 때, "작동적으로 연결된다". 상기 프로모터는 유전 공학 분야에서 종래 사용되는 임의의 프로모터일 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 메시지 레벨을 향상시키고 구조체가 다른 서열들을 초과판독(readthrough)하는 것을 최소화하도록 기능할 수 있는 종결 서열과 같은 추가적인 서열 또는 서열들을 함유할 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는, 예를 들면, 상기 벡터를 운반하는 세포를 스크리닝해 내도록 허용하는 항생제 저항성 유전자의 형태인 선택가능한 마커를 추가로 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"란 용어는 본 발명에 따른 발현 벡터가 도입된 세포를 나타낸다. 이러한 세포는, 예를 들면, 본 발명의 발현 벡터를 대량으로 신속하게 생산하기 위해 사용될 수 있는 원핵세포일 수 있다.
상기 숙주 세포는 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 일시적으로 또는 안정하게 형질전환될 수 있다. 발현 벡터의 세포 내로의 이러한 형질전환은 표준 박테리아 형질전환, 칼슘 포스페이트 공-침전 또는 전기천공을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 본 기술분야에 공지된 임의의 기술을 통해 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 양성 대조군, 본 발명에 따른 임의의 하나의 펩티드인 대조군, 및 상기 호흡기 바이러스에 의해 감염될 수 있는 표적 세포를 포함하는, 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드를 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 키트는 세포 배양 배지를 추가로 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 키트는 음성 대조군 또는 블랭크 대조군을 추가로 포함할 수 있다. 상기 음성 대조군 또는 블랭크 대조군은 표적 세포 내에서 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 없는 펩티드이다.
상기 표적 세포는 호흡기 바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포이며, 마딘-다비 개 신장 세포(MDCK, ATCC No. CCL-34), 태아 레수스 원숭이 신장 세포(FRhK-4, ATCC No. CRL-1688) 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 E6 세포(Vero-E6, ATCC No. CRL-1586)로부터 선택될 수 있다. 상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드의 스크리닝 방법을 제공하는 것이며, 다음의 단계들을 포함한다:
a) 단리된 또는 무작위로 합성된 후보 펩티드를 제공하는 단계;
b) 본 발명의 임의의 하나의 펩티드인 양성 대조군을 제공하는 단계;
c) 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군을 각각 및 별도로 상기 호흡기 바이러스와 접촉하도록 하는 단계;
d) 상기 후보 펩티드와 접촉된 호흡기 바이러스 및 상기 양성 대조군과 접촉된 호흡기 바이러스를 각각 및 별도로 이용하여 표적 세포를 감염시키는 단계;
e) 상기 표적 세포에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하기 위한 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군의 능력을 평가하는 단계; 및
f) 상기 양성 대조군과 동일하거나 그 이상인 억제 능력을 갖는 후보 펩티드를 선택하는 단계.
본 발명의 특정 구현예에서, 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드의 스크리닝 방법은 생체내 또는 시험관내에서 수행된다.
이하, 본 발명은 도면을 참조하여 실시예에 의해 보다 상세히 개시될 것이다. 본 발명의 과제, 특징 및 측면들은 다음의 설명에 개시되거나 이로부터 명확하다. 상기 설명은 예시적인 구현예를 실증하기 위한 목적으로서만 제공되며, 본 발명의 더 넓은 측면들을 제한하기 위한 의도가 아님이 본 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되어야 하며, 상기 더 넓은 측면들은 예시적인 구성 내에 구현된다.
재료 및 방법
바이러스 및 세포 배양
고독성(highly virulent) 마우스 적응된(adpated) 돌연변이체 균주인 인플루엔자 A 바이러스 A/Hong Kong/415742MD/2009(H1N1)("Zheng, B., et al. D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1 N1 (2009) virus enhances virulence in mice. Exp Biol Med (Maywood) 235, 981-988 (2010)" 참조), A/Hong Kong/8/68(H3N2)(ATCC No. VR-544), A/Vietnam/1194/2004(H5N1) ("Chan MC, et al. Proinflammatory cytokine responses induced by influenza A (H5N1) viruses in primary human alveolar and bronchial epithelial cells. Respir Res. Nov. 11, 2005;6:135" 참조), A/Netherlands/219/2003(H7N7)("Fouchier RA, et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:1356-7367. 2004" 참조) 및 A/Anhui/1/2013(H7N9)("Gao R, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus. N Engl J Med. 368(20):1888-97. May 2013" 참조)를 마딘-다비 개 신장(MDCK, ATCC No. CCL-34) 세포에서 배앙하였고, 플라크 및 TCID50 분석에 의해 그의 역가를 결정하였다("Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)" 참조). 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 균주 HKU39849를 태아 레수스 원숭이 신장(FRhK-4, ATCC No. CRL-1688) 세포에서 배양하였고("Peiris JS, et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet. 361(9366):1319-25. Apr. 2003" 참조), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 균주 hCoV-EMC/2012(Dr. Ron Fouchier(Erasmus University Medical Center Rotterdam)에 의해 제공됨)를 아프리카 녹색 원숭이 신장 E6(Vero-E6, ATCC No. CRL-1586) 세포에서 배양하였으며, 플라크 및 TCID50 분석에 의해 그의 역가를 결정하였다("Zhong, N.S., et al. Epidemiology and cause of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Guangdong, People's Republic of China, in February, 2003. Lancet 362, 1353-1358 (2003)" 참조).
재조합 마우스 디펜신-4의 클로닝, 발현 및 정제
마우스 β-디펜신-4(mBD4)의 코돈을 OPTIMIZER에 기초하여 대장균-선호의 코돈으로 최적화하였다(도 1의 (A))("Puigbo, P., Guzman, E., Romeu, A. & Garcia-Vallve, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Res 35, W126-131 (2007)" 참조). 6쌍의 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR-기반의 유전자 합성에 의해 mBD4의 유전자 단편(fragment)을 생성하였다(도 1의 (B)). 상기 코돈-최적화된 유전자를 PCR2.1 벡터(Invitrogen, USA) 내로 클로닝한 후, Kpnl 및 Xhol 부위에서 PET32a(+)(Novagen, USA) 내로 서브-클로닝하였다. 결과물인 플라스미드를 BL21(DE3) 내로 형질전환시켜 티오레독신-β-디펜신-4 융합 단백질(Trx-β-D-4)을 발현하였다. 상기 Trx-β-D-4를 단순한 삼투압 충격 절차("McCoy, J. & Lavallie, E. Expression and purification of thioredoxin fusion proteins. Curr Protoc Mol Biol Chapter 16, Unit 16 18 (2001)" 참조)에 의해 대장균 세포질로부터 방출하였고, 제조사의 설명서에 따라 His Trap FF 컬럼을 이용하여 AKTA-FPLC(GE Healthcare, United Kingdom)에 의해 추가로 정제하였다(도 1의 (C)). 80 ㎍의 Trx-β-D-4를 1 U 엔테로키나아제(Merck, USA)로 소화시켜 재조합 마우스 β-디펜신-4(rmBD4, 또는 줄여서 β-D-4)를 방출하였다. β-D-4를 제조사의 설명서에 따라 SP 세파로오즈 Fast Flow(GE Healthcare)를 이용하여 양이온-교한 크로마토그래피에 의해 회복하였다. 정제된 β-D-4를 PD-10 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 25 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 내로 탈염시켰다(도 1의 (D)).
펩티드 디자인 및 항바이러스 효과의 평가
전체 길이의 mBD4(smBD4) 및 mBD4로부터 유래된 짧은 펩티드를 표 1에 나타낸 것과 같이 디자인하였고, 이들을 화학적으로 합성하였으며, Mocell Biotech Limited(Shanghai, China)에 의해 확인하였다. 상기 짧은 펩티드, smBD4 및 rmBD4의 항바이러스 효과를 먼저 저염 배지, 즉 24.6 mM의 Na2HPO4 및 5.6 mM의 KH2PO4, pH 7.4를 함유하는 30 mM 포스페이트 버퍼(PB)에서("Gong, T., et al. Recombinant mouse beta-defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry. Arch Virol 155, 491-498 (2010)" 참조), 그리고 고염 배지 MEM(Invitrogen, USA)에서 평가하였다. 상기 펩티드(25 ㎍/㎖)를 PB 또는 MEM 내에서 H1N1 바이러스(50 PFU/웰)와 미리혼합하였고, 실온(RT)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. MDCK 세포를 펩티드-전처리된 바이러스로 감염시켰고, 상기 펩티드의 항바이러스 활성을 플라크 분석을 이용하여 측정하였다("Sui, H.Y., et al. Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One 4, e5671 (2009)" 참조).
Figure 112015118408192-pct00001
세포독성 및 IC 50 분석
상기 펩티드의 세포독성을 테트라졸리움-기반의 비색(MTT) 분석을 이용한 50% 독성 농도(TC50)에 의해 결정하였다("Pauwels, R., et al. Rapid and automated tetrazolium-based colorimetric assay for the detection of anti-HIV compounds. J Virol Methods 20, 309-321 (1988)" 참조). 간략하게, MDCK 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 밤새 배양하였다. 상기 세포를 PBS(Invitrogen, USA)로 2회 세척한 후(이후 개시된 PBS 또한 Invitrogen(USA)의 제품임), 다양한 농도의 펩티드를 함유하거나 펩티드가 없는 100 ㎕/웰의 MEM을 3중으로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 10 ㎕/웰의 MTT 용액(Beyotime, China)을 상기 플레이트에 첨가하였다. 상기 플레이트를 4시간 동안 인큐베이션한 후, 0.01 M HCl 내의 100 ㎕의 10%(w/v) SDS를 각각의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 추가로 밤새 인큐베이션한 후, 상기 플레이트를 Victor™ X3 Multilabel Reader(PerkinElmer, USA)를 이용하여 OD570 및 OD640에서 판독하였다.
상이한 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스, 즉 H1N1, H3N2, H5N1, H7N7 및 H7N9, 코로나바이러스 SARS-CoV 및 hCoV-EMC에 대한 상기 펩티드의 50% 억제 농도(IC50)를 플라크 분석에 의해 직접 결정하고, 및/또는 감염 18시간 후에 수집된 배양 상등액 내의 바이러스 역가를 플라크 분석 및 실시간 RT-PCR을 이용해 간접적으로 검출한 것을 제외하고는, 하기 참고문헌에 개시된 방법에 따라 실험을 수행하였다("Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)" 참조).
생체내 항바이러스 효과의 평가
6-8 주령의 BALB/c 암컷 마우스(17-21 g)를 생물안전성 레벨 3 실험실에서 유지하였고, 표준 펠렛 사료 및 물을 제공하였다. 모든 실험 프로토콜은 승인된 생물안전성 레벨 3 동물 시설의 표준 운영 절차를 따랐고, 동물 윤리 위원회에 의해 승인되었다("Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)" 참조). 고독성 마우스 적응된 돌연변이체 균주인 A/Hong Kong/415742Md/2009(H1N1)를 마우스의 치사 챌린지용으로 사용하였다. 예방 효과를 평가하기 위하여, P9 또는 rmBD4를 50 ㎍/마우스로 마우스의 비강내에 접종한 후, 5 LD50의 바이러스로 챌린지하였다. 치료 효과를 평가하기 위하여, 상기 마우스를 5 LD50의 바이러스로 챌린지하였고, 치사 챌린지 4시간 후에 시작하여 1일 간격으로 상기 P9 또는 rmBD4(50 ㎍/마우스/일)의 3 용량으로 비강내 접종하거나, 1일 간격으로 6일 동안 200 또는 400 ㎍/마우스/일의 P9로 복강내(i.p.) 주사하였다. 생존 및 일반적인 증상을 21일 동안 또는 죽을 때까지 모니터링하였다. 바이러스학적 및 병리학적 테스트를 위하여, 챌린지 5일 후에 마우스를 희생시켰다. 혈액 및 폐 샘플을 수집하였다.
조직병리학적 염색
상기 챌린지된 마우스로부터 수집된 폐 조직을 PBS 버퍼 내의 10%(v/v) 포르말린으로 즉시 고정하였고, 탈수한 후, 파라핀 왁스에 포매하였다. 4-6 ㎛ 두께의 절편을 슬라이드 위에 마운팅하였다. 광학 현미경 하에서 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색에 의해 조직병리학적 변화를 조사하였다("Zheng, B.J., et al. Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus. Proc Natl Acad Sci USA 105, 8091-8096 (2008)" 참조).
바이러스 RNA 추출 및 실시간 RT- PCR
실시간 RT-PCR에 의해 바이러스 부하를 검출하였다("Zheng, B., et al. D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1 N1 (2009) virus enhances virulence in mice. Exp Biol Med (Maywood) 235, 981-988 (2010)" 참조). 간략하게, 바이러스 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 배양 상등액으로부터 추출하였고, QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 세포 용해물 및 마우스 폐 조직 내의 바이러스 RNA를 추출하였다. RSII 키트(Invitrogen, USA)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 역전사를 수행하였다. ABI SYBR Green Mastermix 및 7500 시스템(Invitrogen)을 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. H1N1 바이러스의 HA 유전자의 클론을 양성 대조군 및 표준으로 사용하였다. 실시간 PCR 실험을 3중으로 수행하였다.
형광 이미지 분석
상기 H1N1 바이러스는 녹색 형광 친유성 염료인 DIO(Invitrogen, USA)로 제조사의 설명서에 따라 표지하였고, 상기 P9를 검출하기 위하여 1:5,000 희석된 토끼-항-smBD4 항체(Max Biotechnology) 및 1:400 희석된 염소 항-토끼 Alexa594 항체(Invitrogen, USA)로 P9를 붉게 표지하였다. 세포막을 염료 Alexa594(Invitrogen)로 제조사의 설명서에 따라 염색하였다. 상기 표지된 바이러스 및 P9를 1시간 동안 미리혼합한 후, 4℃ 또는 37℃에서 MDCK 세포와 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 감염 후 상이한 시점에서 PBS 버퍼 내의 10%(v/v) 포르말린으로 고정하였고, 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 700, Zeiss, Germany)으로 사진을 찍었다.
엔도좀 산성화의 검출
바이러스 감염 후 엔도좀 산성화를 pH-민감성 염료, 즉 pHrodo Red 덱스트란(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 검출하였다. 간략하게, H1N1 바이러스를 Dio로 미리-표지한 후, 50 ㎍/㎖의 P9(이하, "P9 처리됨"으로 나타냄) 또는 PB(이하, "처리되지 않음"으로 나타냄)로 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였고, 이어서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. MDCK 세포를 5 MOI의 P9-처리되거나 처리되지 않은 바이러스로 접종하였고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎍/㎖의 pH-민감성 염료, 즉 pHrodo Red 덱스트란을 상기 세포에 첨가하였고, 4℃에서 10분 동안 인큐베이션을 계속한 후, 37℃에서 10분 동안 세포를 추가로 배양하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 여기에 신선한 배지를 첨가하였고, 공초점 현미경(Carl Zeiss LSM 700, Zeiss, Germany)으로 즉시 이미지를 찍었다.
웨스턴 블롯 분석
상기 펩티드에 의해 결합된 바이러스 단백질을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다("Guan, Y, et al. Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China. Science 302, 276-278 (2003)" 참조). 간략하게, 바이러스 단백질 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분획화하였고, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Hi-bond Amersham Biosciences, USA)으로 전달하였다. Signal Boost Immunoreaction Enhancer Kit(EMD MILLPORE, Germany)를 이용하여 1차 항체 및 2차 항체를 희석하였다. 바이러스 단백질이 표시된 항체 또는 펩티드와 결합한 후, 향상된 화학발광에 의해 면역반응성 밴드를 시각화하였다.
ELISA
바이러스 단백질에 대한 펩티드의 결합 친화도를 ELISA에 의해 검출하였다("Du, L., et al. Intranasal vaccination of recombinant adeno-associated virus encoding receptor-binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) spike protein induces strong mucosal immune responses and provides long-term protection against SARS-CoV infection. J Immunol 180, 948-956 (2008)" 참조). 간략하게, 상이한 농도의 펩티드를 ELISA 플레이트에 코팅하였고, 차단 버퍼(PBS 내의 5%(w/v) 소 혈청 알부민)로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. H1N1 바이러스 HA 또는 NA(Invitrogen, USA)를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 바이러스 단백질에 대한 펩티드의 결합 친화도를 토끼 항-His(1:2,000, Santa Crvi Biotechnology, USA) 또는 토끼 항-HA 또는 토끼 항-NA 항체(1:2,000, Immune Technology, USA)에 의해 결정하였고, 2차 항체로서 염소 항-토끼 IgG-HRP(1:2,000, Invitrogen, USA)에 의해 인식하였으며, ELISA 판독기(Victor 1420 Multilabel Counter; PerkinElmer, USA)에서 판독하였다.
통계적 분석
마우스의 생존 및 통계적 유의성은 GraphPad Prism 5 (http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/)에 의해 분석하였다. 다른 결과들의 통계적 유의성은 Stata 통계 소프트웨어를 이용하여 투-테일 스튜던트 t-테스트에 의해 계산하였다. 결과는 P<0.05에서 유의한 것으로 간주하였다.
실시예
실험예 1: 항바이러스 펩티드 P9는 배양된 세포에서 가장 높은 항바이러스 활성을 나타내었다.
11개의 mBD4-유래 펩티드를 디자인 및 합성하였다(표 1). 세포 배양에서 인플루엔자 A 바이러스(H1N1)의 감염에 대한 smBD4, rmBD4 및 mBD4로부터 유래된 11개의 펩티드(표 1)의 항바이러스 효과를 검출하였다. 전체 길이의 합성 mBD4(smBD4) 및 재조합 mBD4(rmBD4)와 비교하여, 짧은 펩티드 P9(30개 아미노산)는 강력하고 용량-의존적인 항바이러스 활성을 나타내었지만, 다른 짧은 펩티드는 평균 항바이러스 효과를 보이거나 항바이러스 효과가 없었다(도 2). 도 2의 A에서, H1N1 바이러스를 각각 짧은 펩티드 및 양성 대조군(즉, smBD4 및 rmBD4)으로 실온(RT)에서 1시간 동안 미리 인큐베이션한 후, MDCK 세포에 접종하였다. 바이러스 감염에 대한 억제 효과를 플라크 분석에 의해 검출하였다. 펩티드로 전처리된 바이러스의 플라크 수를 PB로 전처리된 바이러스의 플라크 수로 나눔으로써 감염 비를 계산하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균+SD로 나타내었다. 도 2의 A에 나타낸 것과 같이, P9는 가장 높은 항바이러스 효과를 보여주었고, 더 짧은 형태인 P7 및 P8은 평균의 항바이러스 효과를 보여주었다. 또한, P9, smBD4 및 rmBD4는 고염 최소 필수 배지(MEM)보다 저염 포스페이트 버퍼(PB)에서 보다 효과적이었다. 도 2의 B에서, H1N1 바이러스(50 PFU/웰)을 상이한 농도의 P9, smBD4 또는 rmBD4로 전처리한 후, MDCK 세포에 접종하였다. 항바이러스 활성을 플라크 분석에 의해 직접 결정하였다. IC50은 점선으로 나타내었으며, 그 결과는 smBD4, rmBD4 및 P9의 평균 IC50이 각각 3.2 ㎍/㎖(0.7 μM), 1.5 ㎍/㎖(0.33 μM) 및 1.2 ㎍/㎖(0.36 μM)이었음을 보여주었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD로 나타내었다. P9의 IC50은 약 1.2 ㎍/㎖ 였는데, 이는 smBD4 또는 rmBD4(각각 약 3.2 및 1.5 ㎍/㎖)보다 낮았다(도 2의 B). 또한, 도 2의 C에서, P9, smBD4 및 rmBD4의 50% 독성 농도(TC50)를 테트라졸리움-기반의 비색(MTT) 분석을 이용하여 결정하였다. 그 결과는 처리된 세포의 광학 밀도(OD)/처리되지 않은 정상 세포의 OD(즉, OD 비)로서 나타내었고, TC50은 점선으로 표시하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD로서 나타내었다. 그 결과는 P9, smBD4 및 rmBD4의 TC50이 각각 860, 94 및 580 ㎍/㎖임을 보여주었다(표 2 및 도 2의 C). P9의 세포독성은 가장 낮았으며, 이는 smBD4의 경우보다 9배 낮은 것이었다. smBD4의 높은 세포독성을 고려하여, 본 발명자들은 이를 동물 실험에 포함시키지 않았다. P9의 선택성 지수(TC50/IC50)는 717이었으며, 이는 smBD4(선택성 지수: 29) 및 rmBD4(선택성 지수: 387)의 경우보다 각각 약 25 및 2배 더 높은 것이었다. 상기 결과는 P9가 시험관내에서 가장 높은 항바이러스 활성 및 선택성 지수를 나타내었음을 보여주었다.
Figure 112015118408192-pct00002
실험예 2: P9는 H1N1 인플루엔자 바이러스의 치사 챌린지에 대해 훨씬 강력한 보호 효과를 보였다.
P9의 예방 및 치료 효과를 H1N1 인플루엔자 바이러스의 치사 감염 동물 모델에서 평가하였다(도 3). 마우스를 치사 용량의 바이러스로 비강내 접종하기 전에 P9 또는 rmBD4로 비강내 접종하였을 때, 상기 P9-처리된 마우스의 생존율은 100%(9/9)였고, 이는 rmBD4-처리된 마우스의 생존율(22% (2/9))(P<0.008) 및 처리되지 않은 마우스의 생존율(0%)(P<0.0001)보다 현저하게 더 높았다(도 3의 A). P9의 치료 효과를 평가하기 위하여, 상기 마우스를 치사 챌린지 4시간 후에 하루 간격으로 P9 또는 rmBD4의 3 용량(50 ㎍/용량/일)으로 비강내 접종하였다(도 3의 B). 그 결과는 P9 및 rmBD4로 비강내 처리된 마우스의 생존율은 각각 67%(6/9) 및 33%(3/9)였음을 보여주었다. 비강내로 P9-처리된 마우스의 생존율은 처리되지 않은 대조군의 경우보다 현저하게 더 높았고(P<0.015), rmBD4-처리된 마우스의 경우보다 수치적으로 더 높았다(도 3의 B). 또한, 투여 용량의 효과를 평가하기 위하여, 챌린지 4시간 후 시작하여 하루 간격으로 P9의 6 용량(200 또는 400 ㎍/용량/일)으로 마우스를 복강내 투여하였다. 그 결과는 마우스를 400 ㎍/용량/일의 P9로 복강내 주사하였을 때 생존율이 56%(5/9)였고, 이는 처리되지 않은 마우스의 경우보다 현저하게 더 높았으며(P<0.026), 마우스를 200 ㎍/용량/일의 P9로 복강내 처리하였을 때 생존율은 22%(2/9)로 줄어들었음을 보여주었다(도 3의 C). 상기 결과는 용량-의존적 효과를 나타내었다. 본 연구에서, 비강내로 rmBD4-전처리되거나 처리된 마우스는 P9와 비교하여 더 낮은 효능을 보여주었고, rmBD4-전처리되거나 처리된 마우스는 통계적으로 유의미하게 증가된 생존율을 보이지 않았다(P>0.05).
예방적 처리를 비강내 치료 또는 복강내 치료로 받은 마우스의 폐 조직에서의 바이러스 RNA 카피 및 바이러스 역가를 각각 실시간 RT-PCR(도 4의 A) 및 플라크 분석(도 4의 B)에 의해 검출하였다. 그 결과는 P9-전처리되고 비강내 또는 복강내 P9-처리된 마우스의 폐 조직에서의 바이러스 부하가 처리되지 않은 마우스의 경우보다 유의미하게 낮았음을 보여주었다(P<0.05). 폐 조직에서의 조직병리학적 변화를 H&E 염색에 의해 조사하였으며, 400 ㎍/용량/일의 P9로 처리된 마우스에서의 폐포 손상 및 간질성 염증 침투가 200 ㎍/용량/일의 P9로 처리된 마우스의 경우보다도 덜 심각하였음을 보여주었다(도 4의 C). 상기 조직병리학적 결과는 생존 및 폐 조직의 바이러스 부하의 경우와 일치하였다. 상기 결과는 P9가 rmBD4보다 생체내에서 H1N1 바이러스의 치사 감염에 대해 훨씬 더 강력한 예방 및 치료 효과를 가짐을 나타내었다.
실험예 3: P9는 바이러스 표면 당단백질 HA에 대한 결합을 통해 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하였다.
P9가 바이러스 감염을 어떻게 억제하는지 조사하기 위하여, P9를 사용하여 바이러스 감염 전에 MDCK 세포 또는 H1N1 바이러스를 전처리하거나, 바이러스 감염 후에 세포 배양 배지에 단지 보충하였다. 도 5의 A, D 및 G에서, 0.3의 MOI로 상기 바이러스를 MDCK 세포에 감염시킨 후, P9(25 ㎍/㎖)의 존재 하에 배양하였다("P9-maint"로 나타냄). 도 5의 B, E 및 H에서, 상기 세포를 P9(25 ㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리한 후, 0.3 MOI의 바이러스로 감염시켰다("P9-cell-pre"로 나타냄). 도 5의 C, F 및 I에서, 상기 바이러스(0.3 MOI)를 P9(25 ㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리한 후, 상기 세포에 접종하였다("P9-virus-pre"로 나타냄). 감염후 상이한 시점에서, 감염된 세포 내부의 바이러스 부하(도 5의 A, B 및 C) 및 세포 배양 상등액(도 5의 D, E 및 F)을 실시간 RT-PCR에 의해 결정하였고, 상등액 내의 감염된 바이러스의 역가를 플라크 분석에 의해 검출하였다(도 5의 G, H 및 I). 그 결과는 P9가 배양 배지에서 유지될 때에는 바이러스 복제 및 방출에 대해 유의미한 억제 효과를 갖지 않음을 보여주었다(도 5의 A, D 및 G). 상기 바이러스 감염은 또한 상기 세포가 P9로 전처리되었을 때에는 억제되지 않았다(도 5의 B, E 및 H). 그러나, 세포 내부 및 배양 상등액 모두에서의 바이러스 부하는 바이러스가 P9로 전처리되었을 때 유의미하게 줄어들었다(P<0.05, 도 5의 C, F 및 I). 상기 결과는 (1) 배양 기간 동안 P9의 존재 하에 감염된 세포 내부 또는 배양 상등액에서의 바이러스 부하가 처리되지 않은 바이러스 대조군("VC"로 나타냄)의 경우와 유사하였기 때문에 P9가 세포 내에서의 바이러스 복제와 새포로부터의 방출을 억제할 수 없었음과, (2) 바이러스 감염을 억제하기 위하여 P9는 표적 세포의 표면이 아니라 상기 바이러스에 대한 결합에 의해 바이러스 감염을 억제할 수 있었음을 나타내었다.
P9가 바이러스에 대한 결합에 의해 바이러스의 감염을 억제하는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스를 녹색 형광으로 표지하고 P9를 붉은색 형광으로 표지하여 이들의 상호작용을 보았다. Dio 염료로 표지된 바이러스(5 MOI)를 50 ㎍/㎖의 P9(도 6의 A에서 "P9-Virus-Pre"로 나타냄) 또는 PB(도 6의 A에서 "VC"로 나타냄)로 실온에서 1시간 동안 전처리하거나, MDCK 세포를 50 ㎍/㎖의 P9(도 6의 A에서 "P9-Cells-Pre"로 나타냄)로 실온에서 1시간 동안 전처리하였다. 상기 MDCK 세포를 상기 바이러스(5 MOI)로 감염시켰고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 세포를 PBS 버퍼 내의 10%(v/v) 포르말린으로 고정시켰고, 토끼-항-smBD4 항체 및 Alex594 표지된 염소-항-토끼 항체로 염색하였다. 마지막으로, 상기 세포의 핵을 DAPI(INvitrogen, USA)와 Prolong Gold Antifade Reagent로 염색하였다. 대표적인 이미지를 공초점 현미경으로 찍었다(원래 배율의 400×). 도 6의 A에 나타낸 것과 같이, 바이러스가 P9로 전처리되었을 때 붉은색-표지된 P9(첫번째 열의 가운데 사진의 흑백 이미지에서의 회색 점에 해당함)는 녹색-표지된 바이러스 입자(첫번째 열의 왼쪽 사진의 흑백 이미지에서의 회색 점에 해당함)에 결합하였고, 세포 내로 운반되었지만(컬러 이미지에서의 오랜지색 점, 첫번째 열의 오른쪽 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서의 회색 점에 해당함), 표지된 P9로 세포가 전처리되었을 때에는 세포막 또는 세포 내부에서 P9가 검출되지 않았다.
본 발명자들은 어떤 바이러스 표면 단백질이 P9에 결합하는지를 추가로 확인하였다(도 6의 B 및 C). 도 6의 B에서, H1N1 바이러스의 바이러스 단백질을 10%(v/v) SDS-PAGE에 의해 분리하였고, PVDF 막으로 전달하였다. 레인(lane) 1은 쿠마시 브릴리언트 블루 용액에 의해 염색된 바이러스 단백질을 나타낸다. 레인 2의 경우, P9의 결합을 검출하기 위해, 전달된 막을 P9(50 ㎍/㎖)로 1시간 동안 인큐베이션한 후, 토끼-항-smBD4 항체(1:2,000, Max Biotechnology)로 다시 1시간 동안 인큐베이션하였다. 레인 3의 경우, HA 및 HA1을 검출하기 위해, 상기 막을 토끼-항-HA1 항체(1:2,000, Immune Technology, USA)로 인큐베이션하였다. 레인 4의 경우, NA를 검출하기 위해, 상기 막을 토끼-항-NA 항체(1:2,000, Immune Technology, USA)로 인큐베이션하였다. HRP 표지된 염소 항-토끼 IgG 항체(1:2,000, Invitrogen, USA)를 2차 항체로 사용하여 레인 2 내지 레인 4에서의 결합을 검출하였다. 그 결과는 바이러스 단백질 HA 및 HA1은 P9(레인 2) 및 토끼-항-HA1 항체(레인 3) 모두에 의해 인식되었지만, P9는 토끼-항-NA 항체(레인 4)에 의해 인식되는 NA(레인 2)에는 결합할 수 없었음을 보여주었다. 웨스턴 블롯 분석(도 6의 B) 및 ELISA(도 6의 C)의 결과는 모두 P9가 바이러스 표면 당단백질 HA에는 결합하지만 NA에는 결합하지 않음을 보여주었다. 따라서, P9는 바이러스 감염을 억제하기 위하여 바이러스 표면 단백질 HA에 결합할 수 있음을 결론내었다.
실험예 4: P9는 말기 엔도좀으로부터 RNA를 방출하기 위한 바이러스 분리를 차단하였다.
바이러스-수용체 결합, 식세포작용 및 바이러스 RNA를 방출하기 위한 바이러스-엔도좀 막 융합을 포함하는 바이러스 감염의 어느 단계 또는 단계들이 상기 R9-매개성 억제에 관여되는지를 추가로 조사하였다. Dio 염료 표지된 H1N1 바이러스를 25 ㎍/㎖의 P9(도 7의 A에서 "P9"로 나타냄) 또는 PB(도 7의 A에서 "VC"로 나타냄)로 1시간 동안 전처리하였다. 상기 바이러스(20 MOI)를 MDCK 세포에 접종하고 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션하거나, 5 MOI의 바이러스를 MDCK 세포에 접종하고 37℃에서 1시간 또는 2시간 동안 인큐베이션하였다. 감염된 세포를 고정하였고, 세포막을 Alex-594 염료로 염색하였다. 그 결과는 형광-표지된 바이러스가 P9로 전처리된 후 4℃에서 세포와 인큐베이션되었을 때, P9는 세포막에 대한 바이러스의 결합을 차단할 수 없음을 보여주었다(도 7의 A). 도 7의 A는 또한 표지된 바이러스를 P9로 전처리하면 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후 엔도좀의 성숙에 영향을 미치지 않음을 보여주었고, 말기 엔도좀은 근처의 핵으로 이동하였다. 도 7의 B에서, Dio 염료로 표지된 H1N1 바이러스를 50 ㎍/㎖의 P9로 1시간 동안 전처리한 후, MDCK 세포를 상기 바이러스로 감염시켰고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상기 세포를 PBS 버퍼 내의 10%(v/v) 포르말린으로 고정하였고, 토끼-항-smBD4 항체 및 Alexa594 표지된 염소-항-토끼 항체로 염색하였다. 도 7의 B는 P9가 바이러스 감염 2시간 후에 바이러스에 대한 결합에 의해 말기 엔도좀으로 운반되고, 상기 바이러스와 함께 핵주위 영역으로 이동할 수 있음을 보여주었다. 또한, 도 7의 C에 나타낸 것과 같이, P9-전처리된 바이러스에 의해 감염된 세포에서의 바이러스 RNA 레벨은 감염 후에 감소되었고, 감염 후 3.5시간에 처리되지 않은 바이러스 대조군의 경우보다 2배 이상 낮아졌다. 이와 대조적으로, 처리되지 않은 바이러스 배양에서의 바이러스 RNA는 감염 후 처음 2.5시간 동안 유사한 레벨을 유지하였고, 감염 후 3.5시간에 증가하기 시작했는데, 이는 바이러스 RNA가 핵공을 통해 핵으로 운반되어 새로운 바이러스 복제를 시작함을 제시한다. 상기 결과는 P9가 바이러스-수용체 결합 및 식세포작용에 의해 세포 내로 바이러스가 진입하는 것을 차단할 수 없음을 나타내었다. 대신, 상기 결과는 P9가 말기 엔도좀으로부터 바이러스 RNA가 방출되는 것을 억제함을 제시하였다.
실험예 5: P9는 엔도좀에서의 pH 감소(산성화)를 저해하여 바이러스- 엔도좀 막 융합 및 RNA 방출을 위한 바이러스의 분리를 차단할 수 있다.
P9에서의 풍부한 염기성 아미노산을 고려하여, P9가 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 저해함으로써 바이러스-엔도좀 막 융합을 억제할 수 있는지 여부를 추가로 조사하였다. H1N1 바이러스를 PB(도 8의 A에서 "VC"로 나타냄) 또는 P9(50 ㎍/㎖)(도 8의 A에서 "P9"로 나타냄)로 전처리하였고, 5 MOI의 바이러스를 MDCK 세포에 접종하였으며, 37℃에서 인큐베이션하였다. 접종 후 표시된 시점에서 수집된 세포 샘플 내의 바이러스 RNA 카피를 실시간 RT-PCR에 의해 검출하였고, 10 mM 및 0.1 mM의 잘-정의된 엔도좀 억제제인 NH4Cl의 존재 하에 감염된 세포에서의 경우와 비교하였다. 도 8의 A에서 나타낸 것과 같이, P9는 잘-정의된 말기 엔도좀 억제제인 염화암모늄(NH4Cl)을 최적 억제 농도(10 mM)로 처리한 경우와 비교하여 바이러스 감염에 대해 유사한 억제 효과를 보여주었다("Lakadamyali, M., M.J. Rust, H.P Babcock, and X. Zhuang. 2003. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100:9280-9285" 및 "Matlin, K.S., Reggio, H., Helenius, A. & Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol 91, 601-613 (1981)" 참조). 바이러스 RNA에 대한 P9의 억제 효과는 감염 후 3.5시간에 가장 높은 레벨에 도달하였으며, 이때 P9-전처리된 바이러스로부터 얻은 바이러스 RNA 카피는 심지어 10 mM NH4Cl로 처리된 경우보다도 약간 낮았다. 바이러스 RNA에 대한 P9의 억제 효과는 감염 후 6.5시간에 10 mM NH4Cl로 처리된 경우와 유사한 레벨에 도달하였다.
엔도좀 산성화에서의 P9의 억제 활성을 추가로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 pH-민감성 염료를 이용하여 엔도좀에서의 pH 감소를 검출하였다(도 8의 B). 세포를 처리되지 않은 바이러스("VC"로 나타냄)로 감염시켰을 때, 상기 pH-민감성 염료는 pH 값이 7로부터 5로 떨어질 때 붉은색 형광을 보여주는 pH 표시자(indicator)이기 때문에, 감염된 세포에서의 붉은색 점(컬러 이미지에서의 점, 왼쪽 위 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서 회색 점에 해당함)은 말기 엔도좀에서의 산성화 공정을 나타내었다. 사진에서의 흰색 화살표는 바이러스의 위치(컬러 이미지에서 녹색 점, 도 8의 B의 왼쪽 아래 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서 회색 점에 해당함) 및 대응하는 엔도좀 산성화(컬러 이미지에서 붉은색 점, 도 8의 B의 왼쪽 위 사진에서 보여지는 것과 같은 흑백 이미지에서 회색 점에 해당함)를 나타낸다. 이와 대조적으로, 세포를 P9-전처리된 바이러스("P9"로 나타냄)로 감염시켰을 때, 컬러 이미지에서 붉은색 형광은 관찰되지 않았는데(도 8의 B의 오른쪽 위 사진 참조), 이는 엔도좀에서 산성화 공정이 일어나지 않았음을 나타낸다. 상기 결과는 P9가 바이러스와 함께 엔도좀 내로 운반되었을 때 엔도좀에서의 산성화를 방지할 수 있음을 명확하게 나타내었다.
실험예 6: P9 내의 염기성 아미노산이 항바이러스 활성에 중요한 역할을 한다.
P9에서의 풍부한 염기성 아미노산이 말기 엔도좀에서 pH 감소를 억제하는데 중요한 역할을 하는지 여부를 규명하기 위하여, P9의 C-말단에서 1 내지 3개의 염기성 아미노산을 중성 또는 산성 아미노산으로 친환하거나, N-말단에서 3개의 산성 아미노산 또는 3개의 염기성 아미노산을 부가함으로써 P9-유사체 펩티드를 디자인 및 합성하였다(표 3). 바이러스 단백질 HA에 대한 상기 유사체 펩티드의 결합 친화도를 ELISA에 의해 검출하였다(도 9의 A). 그 결과는 1 및 2개 염기성 아미노산의 감소(P9-S1 및 P9-S2) 및 3개 산성 아미노산의 부가(P9-aci-1) 또는 3개 염기성 아미노산의 부가(P9-KHR)는 상기 P9-유사체 펩티드의 결합 친화도에 영향을 미치지 않음을 보여주었다. 3개 염기성 아미노산의 감소(P9-S3)는 바이러스 단백질 HA에 대한 결합 친화도를 현저하게 감소시키게 되었다. 또한, 바이러스 HA 단백질의 헤마글루틴화에 대한 상기 펩티드의 억제 활성을 HAI 분석에 의해 측정하였다(도 9의 B). 표시된 펩티드(50 ㎍/㎖)를 2배씩 순차적으로 희석하였다. 희석된 펩티드 및 PBS(Invitrogen, USA)(음성 대조군)를 H1N1 바이러스와 실온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션한 후, 50 ㎕의 5%(v/v) 칠면조 적혈구(TRBC)를 각각의 웰에 첨가하였다. 상기 PBS 대조군이 전형적인 헤마글루틴화를 나타내고 가장 높은 희석(HAI 활성)의 펩티드가 여전히 상기 헤마글루틴화를 억제하는 것으로 기록되었을 때 결과를 관찰하였다. 그 결과는 P9-S1 및 P9-aci-1 모두 P9의 경우와 유사한 HAI 활성을 나타냄을 보여주었다(도 9의 B)(희석 배수는 세로축에 나타나 있음). 또한, MDCK 세포에서의 P9-유도체 펩티드의 항바이러스 효과를 실시간 RT-PCR을 이용하여 검출하였다. 상기 바이러스(50 PFU/웰)를 표시된 펩티드(50 ㎍/㎖) 또는 PB(도 9의 C에서 "VC"로 나타냄)로 실온에서 1시간 동안 미리 인큐베이션한 후, MDCK 세포에 접종하였다. 감염된 세포를 접종 후 표시된 시점에서 수확하였고, 바이러스 RNA 카피를 실시간 RT-PCR에 의해 검출하였다. 데이터는 3번의 독립된 실험의 평균+SD로 나타내었다. 그 결과는 1 또는 2개 염기성 아미노산의 감소(P9-S1 및 P9-S2) 및 3개 산성 아미노산의 부가(P9-aci-1)는 상기 P9-유사체 펩티드의 항바이러스 효과를 감소시키게 됨을 보여주었다(도 9의 C). 그러나, P9의 N-말단에 3개 염기성 아미노산을 부가(P9-KHR)하면 항바이러스 효과가 감소되지 않게 되었다. 상기 결과는 P9에서의 풍부한 염기성 아미노산이 실제로 바이러스 감염의 억제에 있어서 핵심적인 역할을 수행함을 설명하였다.
Figure 112015118408192-pct00003
주: 변화된 아미노산은 붉게 나타내었다. P9-S1: 1개의 염기성 아미노산인 K가 N으로 교체되었다. P9-S2: 2개의 염기성 아미노산인 K 및 R이 N 및 D로 교체되었다. P9-S3: 3개의 염기성 아미노산인 R, K 및 R이 T, N 및 D로 교체되었다. P9-aci-1: 3개의 산성 아미노산인 D, E 및 D가 P9의 N-말단에 부가되었다. P9-KHR: 3개의 염기성 아미노산인 K, H 및 R이 P9의 N-말단에 부가되었다.
실험예 7: P9- 매개성 항바이러스 효과는 또한 바이러스 당단백질 HA에 대한 높은 결합 친화도와 연관되었다.
다른 펩티드 P8은 P9의 더 짧은 형태이며, P9의 C-말단 영역의 20개 아미노산을 함유하지만 모든 6개 염기성 아미노산은 상기 P9와 동일하다(표 1). 그러나, P8은 P9와 비교하여 훨씬 낮은 항바이러스 효과를 보여주었다(도 2의 A 및 도 9의 C). 바이러스 단백질 HA에 대한 P8의 결합 친화도를 ELISA를 이용해 검출하였고(도 9의 A), HAI를 검출하였다(도 9의 B). 그 결과는 P8이 P9의 경우보다 HA에 대해 현저하게 낮은 결합 친화도를 나타냄을 보여주었다. 따라서, 이러한 종류의 항바이러스 펩티드의 항바이러스 효능은 펩티드 내의 염기성 아미노산의 수뿐만 아니라 바이러스에 대한 결합 친화도에 의해서도 결정될 수 있다.
실험예 8: P9는 호흡기 바이러스에 대해 넓은 스펙트럼의 항바이러스 효능을 보여주었다.
본 발명자들은 P9가 세포 배양에서 엔도좀 경로를 통해 표적 세포로 들어가는 다른 외피형(enveloped) 호흡기 바이러스, 예컨대 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 감염도 억제할 수 있는지 여부를 추가로 검출하였다. 인플루엔자 바이러스 서브타입 H3N2, H5N1, H7N7 및 H7N9를 연속적으로 희석된 P9로 실온에서 1시간 동안 전처리한 후, MDCK 세포에 접종하였다. 상기 바이러스들의 감염에 대한 P9의 억제 효과를 플라크 분석에 의해 결정하였다. 도 10의 (a)에 나타낸 것과 같이, P9는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 H3N2, H5N1, H7H7 및 H7N9의 감염에 대해 강한 항바이러스 효능을 나타내었다. 상기 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스의 감염에 대한 P9의 IC50은 약 1.5 내지 4.8 ㎍/㎖의 범위였는데, 이는 H1N1 인플루엔자 바이러스의 경우보다 약간 더 높은 것이었다(도 2의 B).
또한, SARS-CoV 및 MERS-CoV의 감염에 대한 P9의 억제 효능을 FRhK4 및 Vero E6 세포에서 프라크 분석에 의해 검출하였다. 주목하게는, 인플루엔자 A 바이러스에 대한 항바이러스 효능과 비교할 때, SARS-CoV 및 MERS-CoV에 대한 P9의 항바이러스 효능은 그 농도가 25 ㎍/㎖ 이상일 때 더 높았지만, 그 농도가 25 ㎍/㎖ 이하일 때 더 낮았다(도 10의 (b)). SARS-CoV 및 MERS-CoV에 대한 P9의 IC50은 약 10 ㎍/㎖ 였는데, 이는 인플루엔자 A 바이러스에 대한 경우보다 약 2-7배 더 높은 것이었다. 상기 결과는 P9가 엔도좀 경로를 통해 표적 세포를 감염시키는 복수의 호흡기 바이러스에 대한 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖고 있음을 나타내었다.
결론
뮤린 또는 인간 유래의 많은 디펜신이 시험관내 및 생체내에서 항바이러스 활성을 갖는 것으로 나타났지만("Sun, L, et al. Human beta-defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. J Virol 79, 14318-14329 (2005)", "Quinones-Mateu, M.E., et al. Human epithelial beta-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. Aids 17, F39-48 (2003)" 및 "Jiang, Y, et al. Expression of mouse beta-defensin-3 in MDCK cells and its anti-influenza-virus activity. Arch Virol 154, 639-647 (2009)" 참조), 본 발명은 본 발명에 따라 구축된 재조합 마우스 β-디펜신-4(도 1)가 넓은 호흡기 바이러스의 감염에 대해 강한 항바이러스 효과를 갖는다는 것을 처음으로 보고하였다. 그러나, 전신 치료제로서 디펜신을 개발하는 것은 차선의 효능, 부작용 및 상업적 규모 생산의 비용-효과적인 수단의 부재와 같은 몇 가지 인자에 의해 못하게 되었다("Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415, 389-395 (2002)" 참조).
본 발명에서는, 전술한 문제들을 해결하기 위하여, mBD4로부터 유래된 11개의 짧은 펩티드가 디자인 및 합성되었다. 상기 짧은 펩티드의 항바이러스 효능을 스크리닝한 후, mBD4의 C-말단에서의 30개 아미노산을 함유하는 mBD4의 짧은 형태의 한 펩티드인 P9(표 1)가 시험관내에서 인플루엔자 A 바이러스 H1N1에 대해 smBD4 및 rmBD4의 경우보다 더 낮은 약 1.2 ㎍/㎖의 IC50에 도달하는 가장 높은 항바이러스 활성을 나타내는 것이 발견되었다(도 2의 B). 또한, P9는 놀랍게도 마우스 모델(생체내)에서 rmBD4보다 상기 H1N1 바이러스의 치사 감염에 대해 훨씬 더 강력한 예방 및 치료 효과를 보여주는 것이 발견되었다(도 3 및 도 4). smBD4 및 rmBD4와 비교하여, P9는 또한 가장 낮은 세포독성을 보여주었고(도 2의 C 및 표 2), smBD4 및 rmBD4의 경우보다 각각 약 25 및 2배 더 높은 보다 뛰어난 선택성 지수를 가졌다. 인간 β-디펜신-3으로부터 유래된 일부 짧은 펩티드가 β-디펜신-3 자체보다 숙주 세포에 대해 보다 강력한 항균 효과 및 낮은 독성을 나타내는 것이 보고되어 있지만("Bai, Y., et al. Structure-dependent charge density as a determinant of antimicrobial activity of peptide analogues of defensin. Biochemistry 48, 7229-7239 (2009)" 참조), 본 발명은 β-디펜신으로부터 유래된 짧은 펩티드가 생체내에서 훨씬 더 뛰어난 선택성 지수 및 강력한 항바이러스 효과를 제공할 수 있음을 처음으로 개시한다. 상기 smBD4는 높은 세포독성으로 인해 항바이러스 약의 후보가 될 수 없다. 또한, 재조합 β-디펜신의 생산(발현, 효소-처리 및 정제를 포함함)은 시간-소비적이고 고가여서, β-디펜신을 항바이러스 제제로 개발하는 것을 제한한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 펩티드는 가장 높은 항바이러스 활성 및 가장 낮은 세포독성을 나타낼 뿐만 아니라, 화학적 방법을 이용하여 직접 합성될 수 있고, 물에 매우 가용성이다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 신규한 항바이러스 약의 개발을 위한 이상적인 후보이다.
본 발명의 펩티드의 항바이러스 메커니즘을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 P9가 바이러스 감염은 억제하지만 바이러스 복제 또는 방출은 억제하지 않음을 보여주었다(도 5의 A, D 및 G). β-디펜신의 항바이러스 활성은 바이러스에 의해 감염된 표적 세포와의 간접적인 상호작용 또는 바이러스 당단백질 및/또는 외피와의 직접적인 상호작용을 통해 매개될 수 있음이 보고되었기 때문에("Klotman, M.E. & Chang, T.L. Defensins in innate antiviral immunity. Nat Rev Immunol 6, 447-456 (2006)" 및 "Ding, J., Chou, Y.Y. & Chang, T.L. Defensins in viral infections. J Innate Immun 1, 413-420 (2009)" 참조), 본 발명자들은 P9가 바이러스 또는 표적 세포에 결합하는지 여부를 결정하였다. 그 결과는 바이러스 감염을 억제하기 위하여 P9는 바이러스에는 결합하지만(도 5의 C, F, I 및 A) 세포막에는 결합하지 않음을 보여주었다(도 5의 B, E, H 및 A). 본 발명은 P9가 상기 바이러스 표면의 당단백질인 HA에는 결합하지만 다른 바이러스 단백질인 NA에는 결합하지 않음을 추가로 규명하였다(도 6의 B 및 C). 인플루엔자 바이러스의 감염은 복수의 단계들, 즉 바이러스-수용체 결합, 식세포작용, 초기 엔도좀으로부터 말기 엔도좀으로의 이동을 통해 일어나고, 말기 엔도좀에서의 엔도좀 산성화는 바이러스 복제를 촉발하기 위해 바이러스 RNA를 방출하기 위한 바이러스-엔도좀 막 융합 및 이후의 바이러스 분리(언코팅)를 일어나게 한다는 것이 잘 알려져 있다("Lakadamyali, M., M.J. Rust, H.P. Babcock, and X. Zhuang. 2003. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100:9280-9285" 및 "Leikina, E., H. Delanoe-Ayari, K. Melikov, M.S. Cho, A. Chen, A.J. Waring, W. Wang, Y. Xie, J.A. Loo, R.I. Lehrer, and L.V Chernomordik. 2005. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nat Immunol 6:995-1001" 참조). 따라서, 본 발명자들은 어느 단계가 상기 P9-매개성 억제 효과에 의해 관여되는지를 추가로 조사하였다. 그 결과, P9는 바이러스-수용체 결합 및 식세포작용은 억제할 수 없지만, 바이러스 분리 및 말기 엔도좀으로부터의 바이러스 RNA 방출은 억제할 수 있는 것을 나타내었다(도 7).
다루어야 하는 다음 질문은 본 발명의 펩티드가 왜 그리고 어떻게 바이러스 분리 및 말기 엔도좀으로부터의 바이러스 RNA 방출을 억제할 수 있는지이다. 말기 엔도좀에서의 낮은 pH(5.0)는 인플루엔자 바이러스-엔도좀 막 융합을 위해 매우 중요하다. 종래의 연구는 말기 엔도좀 억제제인 NH4Cl이 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 억제함으로써 바이러스-엔도좀 막 융합을 억제할 수 있음을 나타내었다("Matlin, K.S., Reggio, H., Helenius, A. & Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol 91, 601 -613 (1981)" 및 "Lakadamyali, M., Rust, M.J., Babcock, H.P. & Zhuang, X. Visualizing infection of individual influenza viruses. Proc Natl Acad Sci USA 100, 9280-9285 (2003)" 참조). P9가 염기성 아미노산이 풍부한 것을 고려하여, 본 발명자들은 P9가 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 억제하고, 다시 바이러스-엔도좀 막 융합 및 바이러스 복제를 촉발하기 위한 이후의 핵 내로의 바이러스 RNA 방출을 차단함으로써 항바이러스 기능을 나타낼 수 있는지 여부를 테스트하였다. 그 결과, P9는 바이러스 RNA 방출을 억제하기 위하여 NH4Cl과 유사한 억제 효과를 나타내었고, 상기 억제 효과는 감염 3.5시간 후에 가장 높은 레벨에 도달하였음을 나타내었다(도 8의 A). 또한, P9는 실제로 말기 엔도좀에서의 pH의 감소를 억제할 수 있는 것으로 나타났다(도 8의 B). 또한, P9 내의 염기성 아미노산은 말기 엔도좀에서의 산성화의 진행을 저해하기 위해 필수적이었다. P9에 3개의 추가적인 산성 아미노산이 부가(P9-aci-1)되거나 1 또는 2개의 염기성 아미노산이 치환(P9-S1 및 P9-S2)되었을 때, 그 결합 친화도는 P9의 경우보다 유사하거나 심지어 더 높았음에도 불구하고(도 9의 A), 상기 P9-유사체 펩티드의 항바이러스 효과는 떨어졌다(도 9의 C). 따라서, 상기 결과는 이러한 종류의 항바이러스 펩티드 내에 함유된 염기성 아미노산이 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 저해하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타내었다.
주목할 것은, 이러한 펩티드의 항바이러스 효과에 영향을 미칠 수 있는 다른 중요한 인자는 바이러스에 대한 펩티드의 결합 친화도이다. 이것은 P8이 P9와 동일한 수의 염기성 아미노산을 함유하고 있음에도 불구하고(표 1), P9의 경우보다 더 낮은 결합 친화도(도 9의 A 및 B) 및 항바이러스 효과(도 2의 A 및 도 9의 C)를 보여준다는 사실에 의해 설명되었다. 대부분의 AMP의 공통적인 특성은 AMP 및 음전하를 갖는 미생물 막 단백질 또는 인지질 사이의 초기 상호작용을 촉발하는 순(net)-양전하에 있다("Jung, S., et al. Human beta-defensin 2 and beta-defensin 3 chimeric peptides reveal the structural basis of the pathogen specificity of their parent molecules. Antimicrob Agents Chemother 55, 954-960 (2011)" 및 "Jenssen, H., Hamill, P. & Hancock, R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 19, 491-511 (2006)" 참조). 또한, 양이온성 펩티드의 항미생물 활성은 그의 소수성("Kustanovich, I., Shalev, D.E., Mikhlin, M., Gaidukov, L. & Mor, A. Structural requirements for potent versus selective cytotoxicity for antimicrobial dermaseptin S4 derivatives. J Biol Chem 277, 16941-16951 (2002)" 및 "Zelezetsky, I., Pag, U., Sahl, H.G. & Tossi, A. Tuning the biological properties of amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides: rational use of minimal amino acid substitutions. Peptides 26, 2368-2376 (2005)" 참조) 및 2차 구조("Jenssen, H., Hamill, P. & Hancock, R.E. Peptide antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev 19, 491-511 (2006)" 참조)와도 연관된다. P8의 낮은 결합 친화도는 P8의 소수성 또는 2차 구조에 영향을 주어 P8의 결합 친화도를 감소시키게 될 수 있는 N-말단의 10개 아미노산의 결실과 연관될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스를 포함하는 무수한 병원체 바이러스의 경우, 생산적 바이러스 복제를 시작하기 위한 바이러스 분리 및 숙주 세포 내로의 바이러스 RNA 방출은 바이러스 및 엔도좀 막의 융합을 필요로 한다("Smith, A.E. & Helenius, A. How viruses enter animal cells. Science 304, 237-242 (2004)" 및 "Du, L, et al. The spike protein of SARS-CoV-a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol 7, 226-236 (2009)" 참조). 막 융합은 바이러스 외피 당단백질(예를 들면, 인플루엔자 바이러스의 HA 또는 SARS-CoV의 S 단백질)에 의해 매개되고, 말기 엔도좀에서의 산성 환경을 필요로 한다("Du, L, et al. The spike protein of SARS-CoV~a target for vaccine and therapeutic development. Nat Rev Microbiol 7, 226-236 (2009)" 및 "Das, K., Aramini, J.M., Ma, L.C., Krug, R.M. & Arnold, E. Structures of influenza A proteins and insights into antiviral drug targets. Nat Struct Mol Biol 17, 530-538 (2010)" 참조). 본 발명에서, 본 발명자들은 본 발명의 펩티드에 의해 매개되는 항바이러스 효과의 메커니즘이 2가지 중요한 인자와 연관되어 있음을 실증하였다. 첫 번째는 상기 펩티드가 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있다는 것이고, 두 번째는 상기 펩티드가 바이러스-엔도좀 막 융합 및 이후의 바이러스 RNA 방출을 차단하기 위해 말기 엔도좀에서의 pH 감소(산성화)를 억제할 수 있다는 것이다. 상기 메커니즘에 기초하여, 본 발명의 펩티드는 또한 다른 무수한 병원체 바이러스의 감염을 억제할 수 있을 것이다. 그 결과는 P9가 실제로 H3N2, H5N1, H7N7 및 H7N9을 포함하는 다른 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스(도 10의 (a)) 및 2가지 코로나바이러스인 SARS-CoV 및 MERS-CoV(도 10의 (b))의 감염을 억제할 수 있음을 보여주었다. 본 발명의 펩티드가 다른 무수한 병원체 바이러스의 표면 당단백질에 효율적으로 결합할 수 있다면, 본 발명의 펩티드가 이들의 감염을 억제할 수 있을 것으로 예측하는 것은 합리적이다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 무수한 병원체 바이러스, 특히 호흡기 바이러스의 감염에 대한 넓은 스펙트럼의 항바이러스 약으로 개발하기 위한 이상적인 후보이다.
요약하면, mBD4로부터 유래된 짧은 펩티드는 H1N1, H3N2, H5N1, N7N7 및 H7N9를 포함하는 상이한 서브타입의 인플루엔자 A 바이러스뿐만 아니라 2가지 코로나바이러스인 SARS-CoV 및 MERS-CoV의 감염에 대해 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 본 발명의 펩티드의 넓은 스펙트럼의 항바이러스 효과의 메커니즘은 (1) 상기 펩티드가 바이러스 입자의 표면의 바이러스 당단백질에 효율적으로 결합할 수 있고; 및 (2) 상기 펩티드가 바이러스-엔도좀 막 융합 및 이후의 바이러스 분리 및 바이러스 RNA 방출을 차단하기 위해 말기 엔도좀에서의 pH 감소(산성화)를 억제할 수 있는 풍부한 염기성 아미노산을 함유하고 있기 때문인 것으로 설명되었다. 인플루엔자 A 바이러스 및 코로나바이러스는 최근의 세기에서 몇 번의 치명적인 범유행(pandemic) 및 대발생(outbreak)을 초래하였다. 몇 가지 항-인플루엔자 약이 개발되었지만, 상기 항바이러스 약이 임상적 치료를 위해 적용된 후 약-저항성 바이러스주가 재빨리 생겨났다. 특히, 지금까지는 어떠한 효과적인 항바이러스 약도 SARS-CoV 및 MERS-CoV의 감염에 대한 예방 및 치료를 위해 사용될 수 없다. 이와 관련하여, P9와 같은 항바이러스 펩티드는 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖고 약 저항성이 일어날 가능성이 낮은 새로운 희망적인 예방제 및 치료제일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 실증된 메커니즘에 기초하여, 넓은 스펙트럼의 항바이러스 활성을 갖는 보다 새로운 항바이러스 펩티드가 무수한 병원체 바이러스를 예방 및 치료하기 위한 새로운 상업적 항바이러스 제제가 디자인 및 개발될 수 있다.
본 발명의 사상 및 본질을 벗어나지 않으면서 상기 개시된 예시적인 구현예에 대해 다양한 변화 및 변형이 만들어질 수 있음이 본 기술분야의 기술자에 의해 인식될 것이다. 상기 변화 및 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
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Claims (26)

  1. 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 도메인을 포함하고 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 화학적 경로를 통해 또는 유전 공학 공정에 의해 합성된 펩티드로서, 상기 펩티드는 5개 이상의 염기성 아미노산을 갖고, 이들 중 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에서 2개 이상의 염기성 아미노산을 가지며, 상기 N-말단 영역은 상기 펩티드의 N-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 C-말단 영역은 상기 펩티드의 C-말단 아미노산으로부터 세어서 10개 이하의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 펩티드는 서열번호 10과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 세포의 말기 엔도좀에서의 산성화를 방지하는 기능을 추가로 갖는 펩티드.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 그의 N-말단 영역 또는 C-말단 영역에서 3 이상의 염기성 아미노산을 포함하는 펩티드.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 펩티드는 4개 이상의 시스테인을 포함하는 펩티드.
  5. 청구항 3에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 10, 서열번호 13 또는 서열번호 17로 기재되는 펩티드.
  6. 청구항 3에 있어서,
    상기 C-말단 영역은 2개의 시스테인 및 염기성 아미노산을 포함하는 펩티드.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 C-말단 영역은 다음의 아미노산 조성을 갖는 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드:
    염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 - 시스테인 - 시스테인 - 염기성 아미노산 - 중성 아미노산 - 염기성 아미노산 -자유 카르복실.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 펩티드는 마우스 β-디펜신-4로부터 기원되는 펩티드.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택되며, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함하는 펩티드.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드; 및
    약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 호흡기 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 표적 세포 및 호흡기 바이러스를 포함하는 시스템 내에서 상기 호흡기 바이러스와 접촉 및 결합하도록 하는 단계; 및
    상기 펩티드가 상기 표적 세포의 말기 엔도좀이 바이러스 RNA를 방출하는 것을 억제하도록 함으로써 상기 표적 세포 내에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 단계를 포함하고,
    상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택되며, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함하는, 시험관내에서 표적 세포에서 호흡기 바이러스의 감염을 차단하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 바이러스에 대한 상기 펩티드의 결합은 상기 바이러스의 표면 당단백질에 대한 상기 펩티드의 결합을 포함하고, 및 상기 펩티드는 상기 말기 엔도좀에서의 pH 감소를 억제함으로써 상기 바이러스 RNA의 방출을 억제할 수 있는 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 이용한 호흡기 바이러스의 감염을 방지 또는 치료하기 위한 약물의 제조 방법.
  14. 화학적 경로를 통해 또는 유전 공학 공정에 의해 펩티드를 합성하는 단계를 포함하는, 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 제조 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 암호화하는 단리된 DNA.
  16. 프로모터에 작동적으로 연결된 청구항 15에 따른 DNA를 포함하는 발현 벡터.
  17. 청구항 16에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드인 양성 대조군; 및
    호흡기 바이러스에 의해 감염될 수 있는 표적 세포를 포함하는, 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드의 스크리닝용 키트.
  19. 청구항 18에 있어서,
    상기 키트는 세포 배양 배지를 추가로 포함하는 키트.
  20. 청구항 18에 있어서,
    음성 대조군 또는 블랭크 대조군을 추가로 포함하는 키트.
  21. 청구항 18에 있어서,
    상기 호흡기 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및 코로나바이러스로부터 선택되며, 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 서브타입 H1, H3, H5 및 H7을 포함하고, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV 및 MERS-CoV를 포함하는 키트.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 표적 세포는 마딘-다비 개 신장 세포(MDCK, ATCC No. CCL-34), 태아 레수스 원숭이 신장 세포(FRhK-4, ATCC No. CRL-1688) 및 아프리카 녹색 원숭이 신장 E6 세포(Vero-E6, ATCC No. CRL-1586)로부터 선택되는 키트.
  23. a) 단리된 또는 무작위로 합성된 후보 펩티드를 제공하는 단계;
    b) 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 펩티드인 양성 대조군을 제공하는 단계;
    c) 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군을 각각 및 별도로 호흡기 바이러스와 접촉하도록 하는 단계;
    d) 상기 후보 펩티드와 접촉된 호흡기 바이러스 및 상기 양성 대조군과 접촉된 호흡기 바이러스를 각각 및 별도로 이용하여 표적 세포를 감염시키는 단계;
    e) 상기 표적 세포에서 상기 호흡기 바이러스의 감염을 억제하기 위한 상기 후보 펩티드 및 양성 대조군의 능력을 평가하는 단계; 및
    f) 상기 양성 대조군과 동일하거나 그 이상인 억제 능력을 갖는 후보 펩티드를 선택하는 단계를 포함하는, 호흡기 바이러스의 감염을 억제할 수 있는 펩티드의 스크리닝 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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