JP2016520052A - 呼吸器ウイルス感染の阻害活性を有するペプチド、その使用、およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)SEQ ID NO.:10に記載されるアミノ酸配列;または
(b)アミノ酸配列(a)において、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および/または付加によって得られたアミノ酸配列。
塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−システイン−システイン−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸-遊離カルボキシル。
本発明のペプチドのいずれかひとつ;および
薬学的に許容される賦形剤。
標的細胞および呼吸器ウイルスを含む系において、本発明のペプチドのいずれかひとつを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス;
該ペプチドによって標的細胞の後期エンドソームにウイルスRNAの放出を阻害させ、その結果、標的細胞において呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス;
ここで、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスとコロナウイルスから選択され、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプH1、H3、H5、およびH7が含まれ、コロナウイルスにはSARS−CoVおよびMERS−CoVが含まれる。
本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照;および
呼吸器ウイルスに感染できる標的細胞。
a)単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ;
b)本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照を準備するステップ;
c)候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ;
d)候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ;
e)標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ;
f)陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
(a)SEQ ID NO.:10に記載されるアミノ酸配列;または
(b)アミノ酸配列(a)において、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および/または付加により得られたアミノ酸配列。
標的細胞およびウイルスを含む系において、本発明のペプチドを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス;および、
該ペプチドにより標的細胞の後期エンドソームにウイルスRNAの放出を阻害させて、その結果、標的細胞において呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス。
a)単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ;
b)本発明のペプチドのいずれかひとつである陽性対照を準備するステップ;
c)候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ;
d)候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ;
e)標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ;
f)陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
ウイルスと細胞培養
非常に悪性のマウスのインフルエンザA型ウイルスの変異株であるA/Hong Kong/415742Md/2009(H1N1)(“Zheng,B.,et al.D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1N1 (2009)virus enhances virulence in mice.Exp Biol Med (Maywood)235,981−988(2010)”参照)、A/Hong Kong/8/68(H3N2)(ATCC No.VR−544)、A/Vietnam/1194/2004(H5N1)(“Chan MC,et al.Proinflammatory cytokine responses induced by influenza A(H5N1)viruses in primary human alveolar and bronchial epithelial cells.Respir Res.Nov.11,2005;6:135”参照)、A/Netherlands/219/2003(H7N7)(“Fouchier RA,et al.Avian influenza A virus(H7N7)associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:1356−1361.2004”参照)およびA/Anhui/1/2013(H7N9)(“Gao R, et al.Human infection with a novel avian−origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J Med.368(20):1888−97.May 2013”参照)は、メイディン・ダービー・イヌ腎臓(MDCK,ATCC No.CCL−34)細胞で培養し、これらの力価はプラークおよびTCID50アッセイによって検出した(“Zheng,B.J.,et al.Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus.Proc Natl Acad Sci USA 105,8091−8096(2008)”参照)。重篤な急性呼吸器症候群コロナウイルス(SRAS−CoV)株のHKU39849は、アカゲザル胎児腎臓細胞(FRhK−4,ATCC No.CRL−1688)で培養し(“Peiris JS,et al.Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome.Lancet.361(9366):1319−25.Apr.2003”参照)、中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS−CoV)株のhCoV−EMC/2012(Dr.Ron Fouchier,Erasmus University Medical Center Rotterdamから供与)は、アフリカミドリザル腎臓E6細胞(Vero−E6,ATCC No.CRL−1586)で培養し、それらの力価はプラークおよびTCID50アッセイによって検出した(“Zhong,N.S.,et al.Epidemiology and cause of severe acute respiratory syndrome(SARS) in Guangdong,People’s Republic of China,in February,2003.Lancet 362,1353−1358(2003)”参照)。
マウスβデフェンシン−4(mBD4)のコドンはOPTIMIZERに基づき大腸菌に適したコドンに最適化した(図1A)(“Puigbo,P.,Guzman,E.,Romeu,A. & Garcia−Vallve,S.OPTIMIZER:a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences.Nucleic Acids Res 35,W126−131(2007)”参照)。mBD4の遺伝子断片を6塩基対のオリゴヌクレオチドを用いてPCRに基づく遺伝子合成によって生産した(図1B)。コドンを最適化した遺伝子は、PCR2.1ベクター(Invitrogen,USA)にクローニングし、KpnIおよびXhoI部位でPET32a(+)(Novagen,USA)にサブクローン化した。作製したプラスミドはチオレドキシンβデフェンシン−4融合蛋白質(Trx−β−D−4)を発現するためにBL21(DE3)に形質転換した。Trx−β−D−4は簡単な浸透圧ショック法によって大腸菌細胞質から放出され(“McCoy,J.&Lavallie,E.Expression and purification of thioredoxin fusion proteins.Curr Protoc Mol Biol Chapter 16,Unit 16 18(2001)”参照)、さらに取り扱い説明書に従い、HisをトラップするFFカラムを用いてAKTA−FPLC(GE Healthcare,イギリス)によって精製された(図1C)。組み換えマウスβデフェンシン−4を放出するために80μgのTrx−β−D−4を1U enterokinase(Merck,USA)で分解した(短いrmBD4またはβ−D−4)。β−D−4は、取扱説明書に従い、Sp sepharose Fast Flow(GE Healthcare)を用いて陽イオン交換クロマトグラフィーによって回収した。精製したβ−D−4は、25mM HEPES緩衝液(pH7.4)中にPD−10カラムを用いて脱塩した(図1D)。
mBD4由来の全長のmBD4(smBD4)と短鎖ペプチドを表1に示すようにデザインし、それらをMocell Biotech Limited(上海,中国)によって化学的に合成し、確認した。最初に、短鎖ペプチドであるsmBD4およびrmBD4の抗ウイルス効果を、低塩培地、すなわち24.6mM Na2HPO4および5.6mM KH2PO4を含む30mMリン酸緩衝液(pH7.4)(“Gong,T.,et al.Recombinant mouse beta−defensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry.Arch Virol 155,491−498(2010)”参照)および高塩濃度培地MEM(Invitrogen,USA)中で評価した。ペプチド(25μg/ml)を、PBまたはMEM中でH1N1ウイルス(50PFU/well)と事前に混合し、1時間室温(RT)でインキュベートした。ペプチドで事前に処理したウイルスをMDCK細胞に感染させ、プラークアッセイを用いてこのペプチドの抗ウイルス活性を測定した(“Sui,H.Y.,et al.Small interfering RNA targeting m2 gene induces effective and long term inhibition of influenza A virus replication.PLoS One 4,e5671(2009)”参照)。
ペプチドの細胞毒性をテトラゾリウムベースの比色(MTT)アッセイを用いた50%毒性濃度(TC50)の検出によって測定した(“Pauwels,R.,et al.Rapid and automated tetrazolium−based colorimetric assay for the detection of anti−HIV compounds.J Virol Methods 20,309−321(1988)”参照)。簡潔には、MDCK細胞を96穴プレートで一晩培養した。細胞をPBSで2回洗浄し(Invitrogen,USA)(以下に記載したPBSもInvitrogen,USAから購入)、様々な濃度のペプチドを含んだ、またはペプチドを含まない100μl/wellのMEMを3連で添加した。37℃で24時間インキュベートした後、10μl/wellのMTT溶液(Beyotime,中国)をプレートに添加した。プレートを4時間インキュベートした後、100μlの0.01M HCl中の10%(w/v)SDSを各ウェルに添加した。さらに、37℃で一晩インキュベートした後、そのプレートをVictor(商標)X3 Multilabel Reader(PerkinElmer,USA)を用いてOD570およびOD640の吸光度を測定した。
6〜8週齢のBALB/c雌マウス(17−21g)を生物学的安全性レベル3の研究室で飼育し、標準の固形飼料および水を与えた。すべての実験のプロトコールは許可された生物学的安全性レベル3の動物施設の標準業務手順書に従い、動物倫理委員会によって承認された(“Zheng,B.J., et al.Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus.Proc Natl Acad Sci USA 105,8091−8096(2008)”参照)。非常に悪性のマウスのインフルエンザA型ウイルスの変異株であるA/Hong Kong/415742Md/2009(H1N1)はマウスの致死感染のために使用した。予防効果を評価するために、マウスに50μg/マウスのP9またはrmBD4を鼻腔内に接種(i.n.)し、その後、5LD50のウイルスを感染させた。治療効果を評価するために、マウスに5LD50のウイルスを感染させ、致死感染後4時間から開始し、1日おきにP9またはrmBD4(50μg/マウス/日)の3用量を鼻腔内に接種するか、1日おきに6日間、200または400μg/マウス/日のP9を腹腔内投与(i.p.)した。生存および一般状態を21日間または死亡まで観察した。ウイルス学的または病理学的検査のために、感染後5日目にマウスを屠殺した。血液および肺サンプルを収集した。
感染マウスから収集した肺組織は、PBS緩衝液中の10%(v/v)ホルマリンで速やかに固定し、脱水を施し、パラフィンワックスで包埋した。4〜6μmの厚さの切片をスライド上に載せた。ヘマトキシリンとエオシン(H&E)で染色し、光学顕微鏡下で病理組織学的変化を観察した(“Zheng,B.J.,et al.Delayed antiviral plus immunomodulator treatment still reduces mortality in mice infected by high inoculum of influenza A/H5N1 virus.Proc Natl Acad Sci USA 105,8091−8096(2008)”参照)。
ウイルス量はリアルタイムRT−PCRによって検出した(“Zheng,B.,et al.D225G mutation in hemagglutinin of pandemic influenza H1N1(2009)virus enhances virulence in mice.Exp Biol Med(Maywood)235,981−988(2010)”参照)。簡潔には、ウイルスRNAはメーカーのプロトコールに従って、RNeasy Mini Kit(Qiagen,USA)を用いて培養上清から抽出し、一方、細胞溶解液およびマウス肺組織中のウイルスRNAはメーカーのプロトコールに従って、QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)を用いて抽出した。逆転写は、取り扱い説明書に従って、RSII kit(Invitrogen,USA)を用いて実施した。リアルタイムPCRは、ABI SYBR Green Mastermixおよび7500 system(Invitrogen)を用いて実施した。H1N1ウイルスのHA遺伝子のクローンは、陽性コントロールおよび標準物質として使用した。リアルタイムPCR実験は3連で実施した。
H1N1ウイルスは、取り扱い説明書に従って、緑色の蛍光疎水性色素Dio(Invitrogen,USA)を用いて標識し、P9は、検出するために1:5000に希釈したRabbit−anti−smBD4 antibody(Max Biotechnology)および1:400に希釈したGoat anti−rabbit Alexa594 antibody(Invitrogen,USA)を用いて赤色に標識した。細胞膜は、取り扱い説明書に従って、色素Alexa594(Invitrogen)を用いて染色した。標識したウイルスおよびP9は事前に1時間混合し、4℃または37℃でMDCK細胞とインキュベートした。感染細胞は、感染後の異なった時点でPBS緩衝液中10%(v/v)ホルマリン溶液にて固定し、画像を共焦点顕微鏡(Carl Zeiss LSM 700,Zeiss,ドイツ)で撮影した。
ウイルス感染後のエンドソームの酸性化は、pH感受性色素、すなわちpHrodo Red dextran(Invitrogen, USA)の取り扱い説明書に従って、検出した。簡潔には、H1N1ウイルスは事前にDioで標識し、50μg/mlのP9(以下「P9処理」という)またはPB(以下「非処理」という)と共に室温で45分間インキュベートし、次いで4℃で15分間インキュベートした。MDCK細胞に、5MOIのP9処理ウイルスまたは非処理ウイルスを接種し、4℃で1時間インキュベートした。100μg/mlのpH感受性色素(すなわち、pHrodo Red dextran)を細胞に添加し、4℃で10分間インキュベーションを続け、その後、さらに37℃で10分間培養した。細胞をPBSで2回洗浄した後、新しい培地をそれに添加し、直ぐに、共焦点顕微鏡(Carl Zeiss LSM 700,Zeiss,ドイツ)で画像を撮影した。
ペプチドが結合したウイルスタンパクをウエスタンブロットアッセイによって同定した(“Guan,Y.,et al.Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China.Science 302,276−278(2003)”参照)。簡潔には、ウイルスタンパクサンプルはSDS−PAGEで分離し、ポリビニリデンフロリド(PVDF)膜(Hi−bond Amersham Biosciences,USA)に転写した。一次抗体および二次抗体を希釈するためにSignal Boost Immunoreaction Enhancer Kit(EMD MILLPORE,ドイツ)を使用した。ウイルスタンパクと示された抗体またはペプチドの結合後、免疫反応したバンドを増幅化学発光によって可視化した。
ウイルスタンパクへのペプチドの結合親和性は、ELISAで検出した(“Du,L.,et al.Intranasal vaccination of recombinant adeno−associated virus encoding receptor−binding domain of severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS−CoV)spike protein induces strong mucosal immune responses and provides long−term protection against SARS−CoV infection.J Immunol 180,948−956(2008)”参照)。簡潔には、異なった濃度のペプチドをELISAプレートにコーティングし、ブロッキング緩衝液(5%(w/v)PBS中のウシ血清アルブミン)と4℃で一晩インキュベートした。H1N1ウイルスのHAまたはNA(Invitrogen,USA)を添加し、37℃で2時間インキュベートした後、ウイルスタンパクへのペプチドの結合親和性をウサギ抗His抗体(1:2,000,Santa Crvi Biotechnology,USA)またはウサギ抗HA抗体もしくはウサギ抗NA抗体(1:2,000,Immune Technology,USA)によって測定し、二次抗体としてのヤギ抗ウサギIgG−HRP(1:2,000,Invitrogen,USA)によって認識し、ELISAリーダー(Victor 1420 Multilabel Counter;PerkinElmer,USA)で読んだ。
マウスの生存と統計的有差を、GraphPad Prism 5(http://www.graphpad.com/scientific−software/prism/)によって解析した。他の結果の統計的有意差は、Stata統計ソフトを用いて2標本のスチューデントt検定によって算出した。結果は、P<0.05で有意な差とみなした。
実施例1:抗ウィルスペプチドP9は培養細胞中で最も高い抗ウイルス活性を示した。
11のmBD4由来ペプチドをデザインし、合成した(表1)。smBD4,rmBD4および11のmBD4由来ペプチド(表1)の抗ウイルス効果をインフルエンザA型ウイルス(H1N1)の感染に対して検出した。全長の合成mBD4(smBD4)および組み換えmBD4(rmBD4)と比べて、短鎖ペプチドP9(30アミノ酸)は強力で、用量依存的な抗ウイルス活性を示し、一方、他の短鎖ペプチドは中間の抗ウイルス活性を示すか、または抗ウイルス活性はなかった(図2)。図2Aでは、H1N1ウイルスを短鎖ペプチドおよび陽性コントロール(すなわち、smBD4およびrmBD4)のそれぞれと室温(R.T)で1時間、事前にインキュベートし、MDCK細胞に接種した。ウイルス感染に対する阻害効果はプラークアッセイにて検出した。感染率は、ペプチドで事前に処理したときのウイルスのプラーク数をPBで事前に処理したときのウイルスのプラーク数で割ることによって算出した。データは3つの独立した実験の平均±SDとして示した。図2Aで示すように、P9は高い抗ウイルス活性を示し、それよりも短いP7およびP8は中間の抗ウイルス活性を示した。さらに、P9,smBD4およびrmBD4は、高塩濃度MEM培地中に比べ、低塩濃度リン酸緩衝液(PB)中でより有効であった。図2Bにおいて、H1N1ウイルス(50PFU/well)を異なった濃度のP9、smBD4またはrmBD4で事前に処理した後、MDCK細胞に接種した。抗ウイルス活性はプラークアッセイにて検出した。IC50は点線で示し、その結果は、smBD4,rmBD4およびP9の平均IC50が、それぞれ3.2μg/ml(0.7μM),1.5μg/ml(0.33μM)および1.2μg/ml(0.36μM)であった。データは3つの独立した実験の平均±SDとして示した。P9のIC50は約1.2μg/mlであり、smBD4またはrmBD4(それぞれ約3.2および1.5μg/ml)よりも低かった(図2B)。さらに、図2Cでは、P9,smBD4およびrmBD4の50%毒性濃度(TC50)をテトラゾリウムベースの比色(MTT)アッセイを用いて検出した。その結果は、処理細胞の吸光度(OD)/未処理細胞の吸光度(OD)(すなわちOD比)として示し、TC50は点線で示した。データは3つの独立した実験の平均±SDとして示した。その結果、P9,smBD4およびrmBD4のTC50はそれぞれ860,94および580μg/mlであった(表2および図2C)。P9の細胞毒性が最も低く、smBD4の9倍低かった。smBD4の高い細胞毒性を考慮して、発明者らはそれを動物実験に含めなかった。P9の選択性指数(TC50/IC50)は717であり、mBD4(選択指数:29)およびrmBD4(選択指数:387)に比べてそれぞれ約25および2倍高かった。これらの結果は、P9がin vitroで最も高い抗ウイルス活性および選択指数を示すことを実証した。
P9の予防および治療効果をH1N1インフルエンザウイルスの致死感染動物モデルで評価した(図3)。マウスの鼻腔内に致死用量のウイルスを接種する前に、P9またはrmBD4を鼻腔内に接種したとき、P9投与したマウスの生存率は100%(9/9)であり、rmBD4投与マウス(22%(2/9))(P<0.008)および非投与マウス(0%)(P<0.0001)の生存率に比べて有意に高かった(図3A)。P9の治療効果を評価するために、1日おきに致死感染4時間後に3用量(50μg/1回/1日)のP9またはrmBD4をマウスの鼻腔内に接種した(図3B)。その結果、P9およびrmBD4を鼻腔内に投与したマウスの生存率はそれぞれ67%(6/9)および33%(3/9)であった。P9を鼻腔内投与したマウスの生存率は非投与マウスよりも有意に高く(P<0.015)、rmBD4を投与したマウスに比べ、数値的に高かった(図3B)。さらに、投与量の影響を調べるために、感染4時間後に開始し、1日おきに6用量(200または400μg/1回/1日)のP9を腹腔内投与(i.p.)した。その結果、マウスに400μg/1回/1日のP9を腹腔内投与したときの生存率は56%(5/9)であり、非投与マウスの生存率に比べて高かった(P<0.026)が200μg/1回/1日のP9を腹腔内投与したときの生存率は22%(2/9)に低下した(図3C)。これらの結果から、用量依存効果が示された。本試験においてrmBD4を鼻腔内に事前投与または事後投与したマウスではP9に比べて低い効果を示し、rmBD4を事前投与または事後投与したマウスでは生存率の統計的に有意な増加は示さなかった(P>0.05)。
P9がウイルス感染をどのように阻害するかを調べるために、ウイルス感染前にP9をMDCK細胞もしくはH1N1ウイルスの事前処理に使用するか、またはウイルス感染後にP9を細胞培養液中に添加した。図5A、5Dおよび5Gでは、MDCK細胞に0.3MOIのウイルスを感染させ、P9(25μg/ml)の存在下で培養した(P9−maintで示す)。図5B、5Eおよび5Hでは、P9(25μg/ml)で細胞を1時間事前処理し、0.3MOIのウイルスを感染させた(P9−cell−preで示す)。図5C、5Fおよび5Iでは、P9(25μg/ml)で0.3MOIのウイルスを1時間事前処理し、細胞に接種した(P9−virus−preで示す)。感染細胞の内部(図5A、5Bおよび5C)および細胞培養上清中(図5D、5Eおよび5F)のウイルス量は、リアルタイムRT−PCRで測定し、一方、上清中の感染ウイルスの力価は感染後の異なった時点でプラークアッセイにて検出した(図5G、5Hおよび5I)。その結果、培養液中で維持したときに、P9はウイルス複製および放出に対する有意な阻害効果は示さなかった(図5A、5Dおよび5G)。また、細胞をP9で事前処理したときにウイルス感染は阻害されなかった(図5B、5Eおよび5H)。しかしながら、ウイルスをP9で事前処理したときに、細胞内および培養上清の両方のウイルス量は有意に減少した(P<0.05、図5C,5Fおよび5I)。これらの結果から(1)培養期間中、P9の存在下において感染細胞および培養上清中のウイルス量は、ウイルスを処理しなかったコントロールと同程度であったことから、P9は細胞内のウイルス複製および細胞からの放出を阻害できない(VCで示す)、および(2)P9はウイルス感染を阻害するために標的細胞の表面ではなく、ウイルスに結合することよってウイルス感染を阻害できることが示された。
さらに、ウイルスと受容体の結合、エンドサイトーシスおよびウイルスRNAを放出するためのウイルス−エンドソーム膜融合を含むウイルス感染のステップまたは複数のステップがP9を介する阻害に関係することを調べた。Dio色素で標識したH1N1ウイルスを25μg/mlのP9(図7AにおいてP9で示す)またはPB(図7AにおいてVCで示す)で1時間事前処理した。ウイルス(20MOI)をMDCK細胞に接種し、4℃で3時間インキュベートするか、5MOIのウイルスをMDCK細胞に接種し、37℃で1時間もしくは2時間インキュベートした。感染細胞を固定し、細胞膜をAlex−594色素で染色した。その結果、蛍光標識したウイルスをP9で事前処理し、4℃で細胞とインキュベートしたときに、P9はウイルスの細胞膜への結合を妨げなかった(図7A)。また、図7Aは、標識されたウイルスのP9との事前処理は、37℃で1時間インキュベートした後のエンドサイトーシスによる細胞へのウイルスの侵入に影響を与えず、また、標識されたウイルスのP9との事前処理は、後期エンドソームが核の近くに移動する37℃で2時間インキュベートした後のエンドソームの成熟に影響を与えなかったことを示した。図7Bでは、Dio色素で標識したH1N1ウイルスを50μg/mlのP9で1時間事前処理し、MDCK細胞をそのウイルスで感染させ、37℃で2時間インキュベートした。その後、細胞をPBS緩衝液中の10%(v/v)ホルマリンで固定し、ウサギ抗smBD4抗体およびAlexa594で標識したヤギ抗ウサギ抗体で染色した。図7Bは、P9がウイルスへの結合によって後期エンドソームに運ばれ、ウイルス感染の2時間後にウイルスと共に核周辺部に異動する可能性があることを示した。さらに、図7Cに示されるように、P9を事前処理したウイルスによって感染した細胞中のウイルスRNAレベルは感染後に低下し、感染後3.5時間では未処理のウイルスコントロールに比べて、2倍以上低くなった。反対に、未処理のウイルス培養におけるウイルスRNAは、感染後最初の2.5時間の間、同じレベルで維持され、感染3.5時間後に増殖を開始した。このことは、ウイルスRNAが核膜孔を通して核に輸送され、新しいウイルス複製が始まることを示唆する。これらの結果は、P9がウイルス受容体結合およびエンドサイトーシスによるウイルスの細胞への侵入を防御できることを示した。もしくは、この結果から、P9が後期エンドソームからのRNA放出を阻害することが示唆された。
P9中の豊富な塩基性アミノ酸を考慮し、さらにP9が後期エンドソーム内のpHの低下を抑制することによってウイルス−エンドソーム膜融合を阻害する可能性があるかを調べた。H1N1ウイルスをPB(図8AでVCと示す)またはP9(50μg/ml)(図8AでP9と示す)で事前処理し、5MOIのウイルスをMDCK細胞に接種し、37℃でインキュベートした。接種後の表示された時点で集められた細胞サンプル中のウイルスRNAコピー数は、リアルタイムRT−PCRによって検出し、10mMおよび0.1mMの明確に定義されたエンドソーム阻害剤であるNH4Clの存在下での感染細胞のウイルスRNAコピー数と比較した。図8Aに示されているように、P9は、明確に定義された後期エンドソーム阻害剤である塩化アンモニウム(NH4Cl)の阻害に最適な濃度(10mM)で処理したしたときと同等のウイルス感染阻害効果を示した(“Lakadamyali,M.,M.J.Rust,H.P.Babcock,and X.Zhuang.2003.Visualizing infection of individual influenza viruses.Proc Natl Acad Sci USA 100:9280−9285”および“Matlin,K.S.,Reggio,H.,Helenius,A.&Simons,K.Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line.J Cell Biol 91,601−613(1981)参照)。ウイルスRNAに対するP9の阻害効果は、感染後3.5時間で最高値に達し、P9を事前処理したウイルスから得られたウイルスRNAのコピー数は10mM NH4Clで処理したときに比べ、少しだけ低かった。ウイルスRNAに対するP9の阻害効果は、感染後6.5時間で10mM NH4Clで処理したときと同等のレベルに達した。
P9中の豊富な塩基性アミノ酸が後期エンドソーム内のpH低下を抑制するのに重要な働きを担っているかどうかを確認するために、P9アナログペプチドをデザインし、P9のC末端側の1〜3の塩基性アミノ酸を中性または酸性アミノ酸に置き換えるか、または、P9のN末端側に3つの酸性アミノ酸もしくは3つの塩基性アミノ酸を付加することによって合成した(表3)。これらのアナログペプチドのウイルスタンパクHAに対する結合親和性はELISAによって検出した(図9A)。この結果は、1個および2個の塩基性アミノ酸(P9−S1およびP9−S2)の減少ならびに3個の酸性アミノ酸(P9−aci−1)または3個の塩基性アミノ酸(P9−KHR)の付加は、これらのP9アナログペプチドの結合親和性に影響を与えなかったことを示す。3個の塩基性アミノ酸の減少(P9−S3)は、ウイルスタンパクHAへの結合親和性を有意に低下させた。さらに、ウイルスHAタンパクの血球凝集に対するペプチドの阻害活性をHAIアッセイによって測定した。示されたペプチド(50μg/ml)は2倍ずつ順次希釈した。希釈されたペプチドおよびPBS(Invitrogen,USA)(陰性コントロール)はH1N1ウイルスと室温で1時間事前にインキュベートし、50μlの5%(v/v)七面鳥赤血球細胞(TRBC)を各ウェルに添加した。その結果、PBSコントロールでは典型的な赤血球凝集が観察され、赤血球凝集を阻害するペプチドの最も高い希釈(HAI活性)が記録された。この結果から、HAI活性を示すP9−S1およびP9−aci−1の両方がP9の活性と同等であることが示された(図9B)(希釈率を縦軸に示す)。さらに、MDCK細胞でのP9アナログペプチドの抗ウイルス効果はリアルタイムRT−PCRを用いて検出した。ウイルス(50PFU/well)は示されたペプチド(50μg/ml)またはPB(図9CにおいてVCと示す)と室温で1時間事前にインキュベートし、MDCK細胞に接種した。感染細胞は接種後の表示された時点で採取し、ウイルスRNAコピー数をリアルタイムRT−PCRで検出した。データは3つの独立した実験の平均±SDとして示した。この結果から、1個または2個の塩基性アミノ酸の減少(P9−S1およびP9−S2)ならびに3つの酸性アミノ酸の付加(P9−aci−1)はこれらのP9アナログペプチドの抗ウイルス効果を低下させた(図9C)。しかし、P9のN末端の3つの塩基性アミノ酸の付加(P9−KHR)は、抗ウイルス効果を低下させなかった。これらの結果から、実際にP9の豊富な塩基性アミノ酸はウイルス感染の阻害において重要な働きを担っていることが解明された。
別のペプチドP8はP9のC末端領域の20アミノ酸を含むP9の短い形態であるが、すべての6塩基アミノ酸がP9と同じである(表1)。しかし、P9と比較すると抗ウイルス効果はかなり低かった(図2Aおよび図9C)。P8のウイルスタンパクHAへの結合親和性はELISAを用いて検出され(図9A)、HAIを決定した(図9B)。その結果、P8はP9に比べて、HAへの結合親和性が有意に低いことが示された。すなわち、この種類の抗ウイルスペプチドの抗ウイルスの有効性はペプチド内の塩基性アミノ酸の数だけではなく、ウイルスへの結合親和性によっても決定される。
さらに発明者らは、P9がエンドソーム経路を介して標的細胞に侵入する他のエンベロープ呼吸器ウイルス、例えばインフルエンザA型ウイルス、SARS−CoVおよびMERS−CoVの他のサブタイプの感染を細胞培養中で阻害するかどうかを検出した。インフルエンザウイルスのサブタイプであるH3N2、H5N1、H7N7およびH7N9を段階希釈したP9と室温で1時間事前処理し、MDCK細胞に接種した。これらのウイルス感染に対するP9の阻害効果はプラークアッセイにて検出した。図10(a)に示すように、P9はインフルエンザA型ウイルスのサブタイプであるH3N2、H5N1、H7N7およびH7N9の感染に対して強い抗ウイルス有効性を示した。インフルエンザA型ウイルスのこれらのサブタイプの感染に対するP9のIC50は、1.5〜4.8μg/mlの範囲であり、H1N1インフルエンザウイルスに対するIC50に比べて少し高かった(図2B)。
マウスまたはヒトでの多くの防御は、in vitroおよびin vivoでの抗ウイルス活性を有することが判っていたが(“Sun,L.,et al.Human beta−defensins suppress human immunodeficiency virus infection:potential role in mucosal protection.J Virol 79,14318−14329(2005)”,“Quinones−Mateu,M.E.,et al.Human epithelial beta−defensins 2 and 3 inhibit HIV−1 replication.Aids 17,F39−48(2003)”および“Jiang,Y.,et al.Expression of mouse beta−defensin−3 in MDCK cells and its anti−influenza−virus activity.Arch Virol 154,639−647(2009)”参照)、本発明は、本開示に従って構築された組み換えマウスβデフェンシン−4(図1)が広範囲の呼吸器ウイルスの感染に対して強い抗ウイルス効果を有することを、最初に報告した。しかし、全身治療のような防御の開発は、最適ではない有効性、副作用および商業規模生産のコスト効率が良い手段がないなどのいくつかの要因によって妨げられている(“Zasloff,M.Antimicrobial peptides of multicellular organisms.Nature 415,389−395(2002)”参照)。
Claims (26)
- 化学的経路を介してまたは遺伝子工学プロセスによって合成されるペプチドであって、該ペプチドが呼吸器ウイルスの表面糖タンパクに結合可能な機能的領域を有し、呼吸器ウイルスの感染を阻害する活性を有することを特徴とするペプチド。
- さらに、細胞内の後期エンドソーム内の酸性化を妨げる機能を有する請求項1に記載のペプチド。
- 5つ以上の塩基性アミノ酸を有し、より好ましくは、そのN末端領域またはC末端領域に2つ以上の塩基性アミノ酸を有し、さらに好ましくは、そのN末端領域またはC末端領域に3つ以上の塩基性アミノ酸を有する請求項1に記載のペプチド。
- 4つ以上のシステインを有する請求項3に記載のペプチド。
- 以下に記載するアミノ酸配列(a)または(b)を有する請求項3に記載のペプチド:
(a)SEQ ID NO.:10に記載されるアミノ酸配列;または
(b)アミノ酸配列(a)において、1個またはいくつかのアミノ酸の置換、除去および/または付加によって得られたアミノ酸配列。 - アミノ酸配列(b)が、アミノ酸配列(a)と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%の相同性がある請求項5に記載のペプチド。
- ペプチドのアミノ酸配列が、SEQ ID NO.:10、SEQ ID NO.:13またはSEQ ID NO.:17に記載されているものである請求項5に記載のペプチド。
- N末端領域がペプチドのN末端アミノ酸から数えてアミノ酸10個未満の配列を含み、C末端領域がペプチドのC末端アミノ酸から数えてアミノ酸10個未満の配列を含む請求項3に記載のペプチド。
- C末端領域が2つのシステインおよび塩基性アミノ酸を有する請求項8に記載のペプチド。
- C末端領域が、以下のアミノ酸組成の10個のアミノ酸を有する請求項9に記載のペプチド:
塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸−システイン−システイン−塩基性アミノ酸−中性アミノ酸−塩基性アミノ酸-遊離カルボキシル。 - ヒトまたはマウスを起源とし、好ましくは、マウスβデフェンシン−4を起源とする請求項1に記載のペプチド。
- 呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、該インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスのサブタイプH1、H3、H5およびH7が含まれ、該コロナウイルスにはSARS−CoVおよびMERS−CoVが含まれる請求項1に記載のペプチド。
- 以下を含む組成物:
請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチド;および、
薬学的に許容される賦形剤。 - 下記プロセスを含む、標的細胞における呼吸器ウイルス感染を防御する方法:
標的細胞および呼吸器ウイルスを含む系において、請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドを呼吸器ウイルスに接触および結合させるプロセス;および、
該ペプチドにより標的細胞の後期エンドソームにウイルスRNAの放出を阻害させて、それにより標的細胞における呼吸器ウイルスの感染を妨げるプロセス;
ここで、呼吸器ウイルスはインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプH1、H3、H5およびH7が含まれ、コロナウイルスにはSARS−CoVおよびMERS−CoVが含まれる。 - ペプチドとウイルスとの結合には、ウイルスの表面糖タンパクとペプチドとの結合が含まれ、該ペプチドは後期エンドソーム内のpH低下を阻害することによってウイルスRNA放出を抑制することができる請求項14に記載の方法。
- 呼吸器ウイルスの感染の予防または治療用の医薬品の製造のための請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
- 化学的経路を介するまたは遺伝子工学プロセスによるペプチドの合成を含む請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドの製造方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離DNA。
- 作動可能にプロモータと結合した請求項18に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項19に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 以下を含む、呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングするためのキット:
請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドである陽性対照;および、
呼吸器ウイルスに感染できる標的細胞。 - さらに細胞培養液を含む請求項21に記載のキット。
- さらに陰性対照またはブランク対照を含む請求項21に記載のキット。
- 呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスおよびコロナウイルスから選択され、該インフルエンザウイルスにはインフルエンザウイルスサブタイプH1、H3、H5およびH7が含まれ、該コロナウイルスにはSARS−CoVおよびMERS−CoVが含まれる請求項21に記載のキット。
- 標的細胞が、Madin−Darbyイヌ腎細胞(MDCK、ATCC No.CCL−34)、アカゲザル胎児腎細胞(FRhK−4、ATCC No.CRL−1688)およびアフリカミドリザル腎E6細胞(Vero−E6,ATCC No.CRL−1586)から選択される請求項24に記載のキット。
- 以下のステップを含む、呼吸器ウイルスの感染を抑制できるペプチドをスクリーニングする方法:
a)単離されたまたはランダムに合成された候補ペプチドを準備するステップ;
b)請求項1〜12のいずれか一項に記載のペプチドである陽性対照を準備するステップ;
c)候補ペプチドおよび陽性対照をそれぞれ別々に呼吸器ウイルスと接触させるステップ;
d)候補ペプチドと接触した呼吸器ウイルスと、陽性対照と接触した呼吸器ウイルスをそれぞれ別々に用いて標的細胞に感染させるステップ;
e)標的細胞への呼吸器ウイルスの感染を阻害する候補ペプチドおよび陽性対照の能力を評価するステップ;および、
f)陽性対照と比較して同等または優れた阻害能力を有する候補ペプチドを選択するステップ。
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