KR101800904B1

KR101800904B1 - 재조합 단백질 발현을 개선시키는 방법

Info

Publication number: KR101800904B1
Application number: KR1020127005781A
Authority: KR
Inventors: 하워드 로버트 그라함 클라크
Original assignee: 씨엠씨 아이코스 바이올로직스, 인크.
Priority date: 2009-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2017-12-20
Also published as: US10066231B2; ES2563073T3; HRP20160162T1; WO2011017606A1; SI2462237T1; DK2462237T3; AU2010279294A1; NZ598275A; US20160076043A1; HUE028655T2; US20120214203A1; US9212367B2; PL2462237T3; EP2462237A1; CA2771410C; EP2462237A4; KR20120041245A; EP2462237B1; SMT201600147B; CA2771410A1

Abstract

재조합 숙주 세포에서 형질감염된 관심 유전자의 발현을 증가시키는 재료 및 방법을 제공한다.

Description

재조합 단백질 발현을 개선시키는 방법{Methods for improving recombinant protein expression}

본 출원은 2009년 8월 6일자로 제출된, 제목“Methods for Improving Recombinant Protein Expression”(Attorney Docket No. 31351/44743)의 미국 가출원 번호 61/231,906(이는 전문이 참고문헌에 통합됨)에 대해 우선권을 청구한다.

발명의 분야

본 발명은 벡터 상에서 선택압(selection pressure)을 증가시키고, 이에 의해 벡터에 연합된 이종(heterologous) 단백질 발현을 증가시킴으로써 진핵생물 세포들에서 재조합 단백질 발현 분야에 실질적인 용도를 가진다.

재조합 단백질 생산 분야에서, 형질감염(transfect) 유전자의 발현을 증가시키는 것은 세포계 발달 동안 기본적으로 중요한 것이다. 이종 단백질의 역가를 증가시키기 위한 심도있는 연구의 모든 목표는 전사, 해독, 단백질 폴딩 및 분비를 개선시키는 것이다.

과거에 이용된 방법들과는 무관하게, 당업계에서 원하는 단백질의 생산량을 증가시키기 위한 재조합 단백질의 더 나은 생산 방법들이 여전히 필요하다.

발명의 요약

한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서 이종 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 단백질 발현을 허용하는 조건하에서 이종 단백질을 인코드하는 제 1 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 이때 제 1 폴리뉴클레오티드는 벡터상에 인코드되어 있으며, 숙주 세포는 선택성 표식 단백질의 단백질 코딩 서열을 가지는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하며, 이때 제 2 폴리뉴클레오티드는 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형(wild-type) 폴리뉴클레오티드와 비교하였을 때, 서열 변형(modification)을 보유하며, 이러한 서열 변형은 제 2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 mRNA의 해독 효율을 감소시키고, 제 2 폴리뉴클레오티드는 이러한 서열 변형과 선택성 표식 단백질에 대한 동일한 아미노산 서열을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드를 보유한다. 한 측면에서, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 2 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터내에 있고, 그리고 이 측면의 한 구체예에서, 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 2 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 프로모터의 전사 조절하에 있다. 다른 측면들에 있어서, 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 2 폴리뉴클레오티드는 별개의 벡터에 있다. 또다른 측면에서, 제 1 폴리뉴클레오티드와 제 2 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터의 전사 조절하에 있다.

이 방법의 한 구체예에서, 이 변형은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드의 비해독 영역내에 있고, 특정 측면들에 있어서, 이 변형은 5' 비해독 영역내에 있고 및/또는 변형은 3' 비해독 영역내에 있다.

이 방법의 또다른 구체예에서, 이 변형은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 유전자의 단백질 코딩 영역내에 있다. 한 측면에서, 이 변형은 선택성 표식 유전자 코딩 서열의 단백질 코딩 영역의 개시 코돈의 25개, 20개, 15개, 10개, 또는 5개 코돈내에 있다.

이 방법의 또다른 측면에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 이 변형된 코돈은 숙주 세포용 인코드된 아미노산에 대해 선호되는 코돈은 아니다. 한 측면에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 이 변형된 코돈은 숙주 세포용 인코드된 아미노산에 대해 최하위 선호(least preferred) 코돈이다.

이 방법의 또다른 측면에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 그리고 이 변형은 mRNA의 해독 효율을 감소시키는 mRNA의 2차 구조에 변화를 인도한다. 이 방법의 한 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 그리고 이 변형은 mRNA에서 코돈 페어링(pairing)을 증가시킨다. 이 방법의 또다른 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 그리고 이 변형은 mRNA의 G+C 함량을 변경시킨다. 다양한 측면에서, 이 변형은 mRNA의 G+C 함량을 증가시키고, 다양한 측면에서, G+C 함량은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 증가한다. 다른 측면들에 있어서, G+C 함량은 100% 이상 증가한다.

본 발명의 여전히 또다른 측면에서, 제 2 폴리뉴클레오티드 서열내 단백질 코딩 서열은 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드내 야생형 코돈이 아닌 최소한 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 그리고 이 변형은 mRNA의 A+T 함량을 변경시킨다. 한 구체예에서, 이 변형은 mRNA의 A+T 함량을 감소시키고, 특정 측면들에서, A+T 함량은 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 감소한다.

이 방법의 다른 측면들에 있어서, 선택성 표식 단백질을 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드 단백질 코딩 서열내 코돈의 최소한 1%, 최소한 2%, 최소한 3%, 최소한 4%, 최소한 5%, 최소한 6%, 최소한 7%, 최소한 8%, 최소한 9%, 최소한 10%, 최소한 11%, 최소한 12%, 최소한 13%, 최소한 14%, 최소한 15%, 최소한 16%, 최소한 17%, 최소한 18%, 최소한 19%, 최소한 20%, 최소한 21%, 최소한 22%, 최소한 23%, 최소한 24%, 최소한 25%, 최소한 26%, 최소한 27%, 최소한 28%, 최소한 29%, 최소한 30%, 최소한 31%, 최소한 32%, 최소한 33%, 최소한 34%, 최소한 35%, 최소한 36%,최소한 37%, 최소한 38%, 최소한 39%, 최소한 40%, 최소한 41%, 최소한 42%, 최소한 43%, 최소한 44%, 최소한 45%, 최소한 46%, 최소한 47%, 최소한 48%, 최소한 49%, 최소한 50%, 최소한 51%, 최소한 52%, 최소한 53%, 최소한 54%, at최소55%, 최소한 56%, 최소한 57%, 최소한 58%, 최소한 59%, 최소한 60%, 최소한 61%, 최소한 62%, 최소한 63%, 최소한 64%, 최소한 65%, 최소한 66%, 최소한 67%, 최소한 68%, 최소한 69%, 최소한 70%, 최소한 71%, 최소한 72%, 최소한 73%, 최소한 74%, 최소한 75%, 최소한 76%, 최소한 77%, 최소한 78%, 최소한 79%, 최소한 80%, 최소한 81%, 최소한 82%, 최소한 83%, 최소한 84%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99% 또는 100% 는 변형된 코돈들이다.

이 방법의 여전히 또다른 측면에서, 선택성 표식 단백질은 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (npt II), 하이그로마이신 포스포트란스퍼라제 (hpt), 디하이드로포에이트 환원효소 (dhfr), 제오신(zeocin), 플레오마이신(phleomycin), 블레오마이신 저항성 유전자 ble, 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트란스퍼라제, 아세토락테이트 합성효소 (als)의 돌연변이 형, 브로모옥시닐 니트릴라제, 포스피노트리친 아세틸 전이효소 (bar), 에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 (EPSP) 합성효소 (aro A), 근육 특이적 티로신 키나제 수용체 분자 (MuSK-R), 구리-아연 슈퍼옥시드 디스무타제 (sod1), 메탈로티오닌즈 (cup1, MT1), 베타-락타메이즈 (BLA), 퓨로마이신 N-아세틸-전이효소 (pac), 블라스티씨딘 아세틸 전이효소 (bls), 블라스티씨딘 데아미네이즈 (bsr), 히스티디놀 데하이드로게나제 (HDH), N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보티드 (SAICAR) 합성효소 (ade1), 아르기노숙시네이트 리아제 (arg4), 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제 (leu2), 전화효소(invertase) (suc2), 오로티딘-5'-포스페이트 (OMP) 데카르복실라제 (ura3) 및 이들 표식 단백질중 임의의 분화동안 공통조상으로부터 유래된 유전자(ortholog)로 구성된 군으로부터 선택된다.

이 방법의 다양한 구체예들에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이고, 숙주 세포는 포유류 세포이며, 숙주 세포는 인간 세포이고, 숙주 세포는 Chinese 햄스터 세포이고, 숙주 세포는 Chinese 햄스터 난소 세포이고, 숙주 세포는 효모 세포이고, 숙주 세포는 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae) 세포이고, 숙주 세포는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포이고, 숙주 세포는 원핵생물 세포이고, 숙주 세포는 대장균(Escherichia coli) 세포이고, 숙주 세포는 곤충 세포이고, 숙주 세포는 스포도프테라 후루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포, 숙주 세포는 식물 세포이고, 또는 숙주 세포는 곰팡이 세포다.

이 발명의 한 측면에서, 발현 벡터는 Chinese 햄스터 신장 인자 1 (CHEF1) 발현 벡터다. 또다른 측면에서, 이 방법은 도 2에 제시한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 한 구체예에서, 제 2 폴리뉴클레오티드는 Chinese 햄스터 신장 인자 1 (CHEF1) 발현 벡터 안에 도 2에 제시한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

도 1A는 DHFR-인코딩 폴리뉴클레오티드이고, 도 1B는 무스 무스쿨루스(Mus musculus) cDNA BC005796과 동일한 코돈 역최적화(deoptimization)를 위하여 이용된 DHFR 폴리펩티드 서열이다.
도 2는 crippled (cr) 및 worst (wst)로 표시된 코돈 역최적화된 DHFR 서열의 DNA 서열을 나타낸다.
도 3은 야생형 (wt) 서열과 배열된 역최적화된 DHFR (worst, wst 및 crippled, cr)을 나타낸다. 햄스터 최하위 선호 코돈 (표 4 참고) 및 새로운 직렬 코돈 쌍(표 5에서 굵게 표시된 부분 참고)을 포함하는 뉴클레오티드 변화(*)를 나타낸다. 축퇴(Degenerate) 기호는 다음과 같다: B (C 또는 G 또는 T), D (A 또는 G 또는 T), H (A 또는 C 또는 T), V (A 또는 C 또는 G).
도 4는 야생형 (WT) DHFR을 가진 CHEF1 발현 벡터, pDEF38를 나타낸다. 코돈 역최적화된 DHFR는 WT DHFR를 대체하여, pDEF81 (crippled DHFR) 및 pDEF82 (worst DHFR)을 만든다. 리포터 유전자 FIGI는 XhoI - XbaI 클로닝부위로 클론되어, pDEF38:FIGI, pDEF81:FIGI 및 pDEF82:FIGI을 만든다.
도 5에서는 코돈 역최적화된 DHFR를 이용하면 단백질 발현이 증가한다는 것을 보여준다. CHO 세포들은 관심 단백질(FIGI)을 공동발현시키는 야생형 (wt) 및코돈 역최적화된 (crippled, pDEF81:FIGI 및 worst, pDEF82:FIGI) DHFR으로 형질감염되었다. 단백질 A HPLC에 의해 결정되었으며, ㎍/㎖으로 보고된 역가(Titer values)는 두 가지 독립적인 형질감염의 평균으로, 각각은 3중 측정되었다(총 6회 생산 분석). 이들 결과는 야생형 DHFR 풀(pools)과 비교하여 코돈 역최적화된 DHFR 선택된 형질감염 풀(pool)에 대한 발현 역가에서 명백한 개선을 나타낸다.
도 6에서는 코돈 역최적화된 세포 계에서 형질감염 풀 페드(fed)-배취(batch) 생산 모델은 개선된 생산성을 제공한다는 것을 설명한다. 이 실험은 모아진 형질감염체를 가진 50㎖ 스핀 튜브에서 12일간 실행되었다; 관심 FIGI 단백질을 공동발현시키는 야생형 (pDEF38:FIGI, 블루) 및 코돈 역최적화된 (pDEF81:FIGI, 자색 및 pDEF82:FIGI, 핑크) DHFR. 2가지 형질감염 풀 (A 및 B)은 이중으로 실시하였다. 코돈 역최적화된 풀은 야생형 시료보다 더 큰 생산성을 보인다.
도 7에서는 코돈 역최적화된 DHFR 선택된 세포들은 감소된 DHFR와 관심 단백질의 증가된 발현을 가진다는 것을 보여준다. CHO 세포들은 관심 FIGI 단백질을 공동발현시키는 야생형 (T462) 및 코돈 역최적화된 (pDEF81:FIGI, T463 및pDEF82:FIGI, T464) DHFR로 형질감염된다. 형질감염 풀은 FIGI (RPE)를 인지하는 형광 라벨된 항체를 탐지하기 위하여 형광 메토트렉세이트(F-MTX)로 모두 착색시켰다. 착색된 세포들은 FACSCalibur 상에서 유동세포분석법으로 분석하였다. 도 7A는 DHFR (F-MTX)과 FIGI (RPE:FIGI)의 복합 발현을 플롯팅한 각 형질감염으로부터 10,000개 개별 세포의 이중 착색 FACS 프로파일을 보여준다. 도 7B는 각 형질감염에 대해 평균을 낸 10,000개 세포의 두 집단에서 평균 F-MTX (DHFR)와 RPE 형광 강도를 나타낸다. 이들 결과는 코돈 역최적화된 DHFR 풀(pool) 모두다 야생형 세포들과 비교하였을 때, 감소된 DHFR과 증가된 FIGI 생산을 가진다는 것을 나타낸다.
도 8에서는 코돈 역최적화된 DHFR 클론은 감소된 DHFR와 관심 단백질의 증가된 발현을 가진다는 것을 설명한다. CHO 세포 형질감염 풀(야생형 T462, crippled T463 및 worst T464)은 한계 희석(limiting dilution)에 의해 클론되고, 각 형질감염으로부터 23개의 확인된 단일클론성 세포계를 확장시켰다. 클론 세포들은 DHFR과 RPE-라벨된 항-FIGI 형광 항체(FIGI RFU)를 탐지하기 위하여 형광 메토트렉세이트(DHFR RFU)로 모두 착색시켰다. 각 클론 집단으로부터 총 10,000개의 착색된 세포는 FACSCalibur 상에서 유동세포분석법으로 분석하였다. 도 8A는 F-MTX 착색된 세포들의 평균 형광을 나타낸다. 각 데이터 점은 개별 클론이다. 클론은 평균 형광이 낮은 것부터 높은 순으로 정렬한다. 도 8B는 RPE 착색된 세포들의 평균 형광을 나타낸다. 각 데이터 점은 개별 클론이다. 클론은 평균 형광이 낮은 것부터 높은 순으로 정렬한다.
도 9에서는 야생형 클론과 비교하여 코돈 역최적화된 클론은 개선된 생산성을 가진다는 것을 보여준다. 6-웰 생산 모델로부터 8일째 수득한 상청액에서 단백질 A HPLC에 의해 클론 역가를 결정하였다. 클론은 역가가 높은 것에서 낮은 순으로 정렬한다. 코돈 역최적화된 클론, pDEF81:FIGI 및 pDEF82:FIGI는 야생형 DHFR 클론 (pDEF38:FIGI)보다 더 큰 FIGI 생산성을 보인다.

본 발명은 재조합 단백질 산출량을 개선시키는 새로운 발현 벡터의 생성 및 이의 용도를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포내에서 관심 유전자(GOI)의 발현 증가를 허용하고, 함께 형질변형된 선택성 표식의 해독 효율을 감소시킴으로써, 선택 엄격성(stringency)을 증가시킨다. 선택성 표식은 숙주 세포 단백질 결핍을 보충하거나 또는 그렇지않으면 독성 물질에 대한 저항성을 부여하기 위하여 형질감염 실험에 이용되고, 이에 의해 공동-형질변환된 관심 유전자의 존재(발현)에 대해 선택된다. 선택성 표식 단백질의 감소된 해독 효율을 제공하는 벡터는 선택성 표식 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 매개변수에 대해 "역최적화"되도록 기획된다. 제공된 벡터의 이용은 재조합 단백질의 강화된 발현을 위해 실행되는 재료 및 방법에 반직관적이다. 실제로, 개선된 단백질 발현은 관심 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 “최적화(optimizing)”와 이에 의해 해독 효율 및 단백질 발현의 증가에 의해 일반적으로 영향을 받는다. 확대해서, 동일한 방식으로 선택성 표식 유전자에 대한 단백질 코딩 영역을 최적화할 것이다. 그러나, 여기에서, 관심 유전자내 유사한 변화를 만드는 것과는 관계없이, 선택성 표식 유전자 서열을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 해독에 대해 다소 덜 최적화되도록 변형시키면 GOI를 인코드하는 폴리뉴클레오티드와 선택성 표식을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 형질변환된 또는 형질감염된 숙주 세포의 분리를 허용하며, 이때 GOI에 의해 인코드된 단백질은 예상밖의 높은 수준으로 발현된다는 의외의 사실을 보여준다.

따라서, 여기에서 폴리뉴클레오티드에 대해 사용된 용어 "역최적화된(deoptimized)"은 폴리뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 단백질의 해독이 폴리뉴클레오티드가 도입된 숙주 세포에 있어서 최적이라고 할 수 없도록(less than optimal) 변형되었다는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 다수의 방식으로 역최적화되며, 본 발명은 여기에서 예시화된 방법들로 한정되지 않는다.

코돈 최적화를 위한 방법들은 여러 사람들에 의해 설명되어왔다(Itakura 1987, Kotula 1991, Holler 1993, Seed 1998). 그러나, 코돈 역최적화 실용성의 예들은 제한적이다. 이러한 예시중 하나는 최하위 선호 코돈 또는 비-무작위화된 코돈 쌍을 통합시킴으로써 복제 적합성을 감소시키기 위하여 바이러스 유전자를 역최적화시키는 것이다(Burns 2006, Mueller 2006, Coleman 2008, Kew 2008). 종-특이적 최하위 선호 코돈과 직렬 코돈 쌍을 통합시킴으로써, 숙주 세포에서 사용하기 위한 dhfr 유전자의 해독 효율을 감소시키기 위한 방법적 고려사항을 설명한다. 제시된 방법들은 종 특이적 숙주을 위한 임의의 선택적 표식을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드내에서 코돈의 역최적화에 일반적으로 적용가능하다.

임의의 특정 작용 기전에 결부하지 않고, 선택성 표식의 해독 감소는 해독이외의 대체 경로, 가령, 무능한 유전자를 담고 있는 세포의 생존이 가능하도록 전사 또는 분비의 증가를 통하나, 이에 한정되지 않는 경로를 통하여 동일한 단백질의 생산에서 상보적인 증가로 이어질 수 있다. 따라서, 표식 유전자의 쇠약을 극복하고, 따라서 생존할 수 있는 이러한 숙주 세포들은 또한 GOI를 증가된 속도로 발현시킬 수 있을 것이다. 정확한 기전과는 무관하게, 통상적인 통념과는 대조적으로, 해독 효율을 감소시키는 방식으로 선택성 표식 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키면 GOI를 인코드하는 공동-형질감염된 유전자의 발현이 예상밖으로 다소 증가한다는 것을 보여준다.

본 발명의 벡터 및 방법들은 양성 선별을 제공하는 임의의 선택성 표식 유전자와 함께 이용에 용이하다. 예시적인 선택성 표식은 네오마이신 포스포트란스퍼라제 (npt II), 하이그로마이신포스포트란스퍼라제 (hpt), 디하이드로포에이트 환원효소 (dhfr), 제오신, 플레오마이신, 블레오마이신 저항성 유전자 ble (효소는 알려지지 않음), 젠타마이신 아세틸트란스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트란스퍼라제, 아세토락테이트 합성효소 (als)의 돌연변이 형, 브로모옥시닐 니트릴라제, 포스피노트리친 아세틸 전이효소(bar), 에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 (EPSP) 합성효소 (aro A), 근육 특이적 티로신 키나제 수용체 분자 (MuSK-R), 구리-아연 슈퍼옥시드 디스무타제 (sod1), 메탈로티오닌즈 (cup1, MT1), 베타-락타메이즈 (BLA), 퓨로마이신 N-아세틸-전이효소 (pac), 블라스티씨딘 아세틸 전이효소 (bls), 블라스티씨딘 데아미네이즈 (bsr), 히스티디놀 데하이드로게나제 (HDH), N-숙시닐-5-아미노이미다졸-4-카르복사미드 리보티드 (SAICAR) 합성효소 (ade1), 아르기노숙시네이트 리아제 (arg4), 베타-이소프로필말레이트 데하이드로게나제 (leu2), 전화효소 (suc2) 및 오로티딘-5'-포스페이트 (OMP) 데카르복실라제 (ura3)를 인코드하는 항생제 저항성 유전자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

당업계에 잘 인지되는 것과 같이, 유전자 코드는 해독된 폴리펩티드에 특이적 아미노산의 추가를 지시하는 코돈이다. 또한 당업계에 잘 인지되는 것과 같이, 20개의 자연적으로 발생되는 아미노산들은 각 아미노산에 대해 1개 내지 6개의 상이한 코돈으로 된 상이한 수의 코돈에 의해 인코드된다. 여기에서 사용된 것과 같이, 동일한 아미노산을 인코드하는 상이한 코돈은 “동의적(synonymous) 코돈”이라고 한다. 이러한 동의적 코돈은 아래 표 1에 제시한다.

동의적 코돈은 동일한 아미노산을 인코드하기 때문에, 야생형 코돈을 동의적 코돈으로 대체함으로써, 단백질의 코딩 서열을 변경시켜도 인코드된 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열은 변하지 않는다. 그러나, 이 단백질을 인코드하는 기반 mRNA의 서열이 변경되면, mRNA 뉴클레오티드 서열의 변화는 해독 효율에 영향을 줌으로써 유전자 발현을 변경시킬 수 있다(Ikemura 1981a, Ikemura 1981b, Ikemura 1985).

해독 효율을 결정하는 특이적 인자는 "선호" 코돈, 직렬 또는 연속(consecutive) 코돈(Rosenberg 1993), 코돈 쌍 편향(codon pair bias) (Gutman 1989, Boycheva 2003), RNA 2차 구조(Kozak 2005, Kudla 2009), GC 함량 및 뉴클레오티드 반복 구조(Hall 1982, Zhang1991 , Carlini 2003, Griswold 2003, Gustafsson 2004)의 통합을 포함한다. 이들 인자들중 많은 것들은 예를 들면, 그리고 특정 기전에 결부되지 않고, 해독을 못하게 할뿐만 아니라 단백질 폴딩 역학에도 영향을 줄 수 있는 해독 중단 부위를 야기하고, 이들 모두는 궁극적으로 단백질 발현을 변화시킨다. 해독 중지의 잘 특징화된 예는 세균에서 아미노산 생합성 유전자의 합성 동안 발생하는데, 이는 감쇠(attenuation)로 잘 알려져 있다(Watson 1988).

코돈 선호

한 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에서 선호되지 않는 코돈으로 기획된 합성 폴리뉴클레오티드에 GOI와 선택성 표식 단백질을 인코드하는 발현 벡터를 이용하여, GOI에 의해 인코드된 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 벡터 및 방법을 제공한다. 상이한 종에서 특정 동의적 코돈들은 다른 것보다 더 빈번하게 이용된다는 것은 당업계에서 잘 알려진 사실이다. 가장 빈번하게 이용되는 코돈들을 그 종의 "선호 코돈"이라고 한다. 특정 코돈의 선호는 특정 게놈에 인코드된 특이적 tRNA의 상대적 수에 대한 함수라고 일부는 제안하였고, 그리고 특이적 게놈에 인코드된 각 tRNA의 정확한 수를 결정하는 프로그램이 개발되었다(Lowe and Eddy , 1997). 따라서 한 측면에서, 덜 선호되는 코돈의 선택은 특정 숙주 세포 기원에서 동의적 코돈의 이미 결정된 사용 빈도에 근거한다.

한 측면에서, 본 발명은 선택성 표식을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 이때 폴리뉴클레오티드의 단백질 코딩 영역은 최소한 하나의 코돈 변형을 포함하며, 이 변형은 숙주 세포에 대해 선호 코돈이 아닌 코돈이 야생형 코돈을 대체하는 것이다. 또다른 측면에서, 이 변형은 숙주 세포에 대해 최하위 선호 코돈이 야생형 코돈을 대체하는 것이다. 이러한 변형의 최소 하나가 단백질 코딩 영역에 통합된다면 임의의 개수의 이러한 코돈 대체를 고려한다. 따라서, 본 발명은 선택성 표식 유전자의 단백질 코딩 영역내 이러한 변형된 하나의 코돈에서부터 모든 코돈의 변형을 고려하였다.

좀더 특별히, 다양한 측면에서 선택성 표식 유전자를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 단백질 코딩 서열내 코돈의 최소한 1%, 최소한 2%, 최소한 3%, 최소한 4%, 최소한 5%, 최소한 6%, 최소한 7%, 최소한 8%, 최소한 9%, 최소한 10%, 최소한 11%, 최소한 12%, 최소한 13%, 최소한 14%, 최소한 15%, 최소한 16%, 최소한 17%, 최소한 18%, 최소한 19%, 최소한 20%, 최소한 21%, 최소한 22%, 최소한 23%, 최소한 24%, 최소한 25%, 최소한 26%, 최소한 27%, 최소한 28%, 최소한 29%, 최소한 30%, 최소한 31%, 최소한 32%, 최소한 33%, 최소한 34%, 최소한 35%, 최소한 36%, 최소한 37%, 최소한 38%, 최소한 39%, 최소한 40%, 최소한 41%, 최소한 42%, 최소한 43%, 최소한 44%, 최소한 45%, 최소한 46%, 최소한 47%, 최소한 48%, 최소한 49%, 최소한 50%, 최소한 51%, 최소한 52%, 최소한 53%, 최소한 54%, 최소한 55%, 최소한 56%, 최소한 57%, 최소한 58%, 최소한 59%, 최소한 60%, 최소한 61%, 최소한 62%, 최소한 63%, 최소한 64%, 최소한 65%, 최소한 66%, 최소한 67%, 최소한 68%, 최소한 69%, 최소한 70%, 최소한 71%, 최소한 72%, 최소한 73%, 최소한 74%, 최소한 75%, 최소한 76%, 최소한 77%, 최소한 78%, 최소한 79%, 최소한 80%, 최소한 81%, 최소한 82%, 최소한 83%, 최소한 84%, 최소한 85%, 최소한 86%, 최소한 87%, 최소한 88%, 최소한 89%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99% 또는 100%는 변형된 코돈들이다.

당업계에 공지된 그리고 표 2와 3에서 예시화된 것과 같이(Nakamura et al ., 2000), 공개된 이용가능한 뉴클레오티드 서열 및 코돈 처리 표를 이용하여, GOI에 인코드된 재조합 단백질의 발현을 위하여 선택된 숙주 세포의 고유 종에 대한 최하위 선호 코돈을 무작위로 선택함으로써 임의의 선택성 표식의 코돈 역최적화된 형태를 새로이 만들 수 있을 것이다. 표 4는 햄스터 (Cricetulus griseus)의 최하위 선호 코돈의 예를 나타낸다. 이들 코돈은 특정 아미노산 잔기에 대해 임의의 비-선호 코돈으로 대체되도록 표적 유전자를 인코드하는 고유 유전자 서열내 선호적으로 동의적 코돈을 대체하는데 이용한다.

코돈 역최적화는 다양한 방법에 의해 실행될 수 있는데, 예를 들면, 주어진 숙주 세포에서 많이 발현되는 유전자에서 이용하기 위하여 선호한다고 할 수 없는 코돈을 선택하여 실행될 수 있다. 많이 발현되는 세균성 유전자의 코돈 선호에 대한 "Ecohigh.cod"와 같은 코돈 빈도 표를 만드는 컴퓨터 연산을 이용할 수 있으며, 그리고 University of Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, WI에서 제공한다. 기타 유용한 코돈 빈도 표는 "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod", 및 "Yeast_high.cod"를 포함한다.

코돈 쌍 편향( Codon Pair Bias )

또다른 측면에서, 본 발명은 숙주 세포 기원 종에서 최하위 선호되는 코돈 쌍으로 기획된 합성 폴리뉴클레오티드 내에 선택성 표식 단백질을 인코드하는 발현 벡터를 이용하여, 형질감염된 GOI에 의해 인코드된 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 벡터 및 방법들을 제공한다. 최근 실험 결과는 해독 속도가 해독 리보좀의 표면상 A- 및 P-부위내 인접 tRNA의 양립성(compatability)에 영향을 받는다는 사상을 뒷받침한다(Smith and Yarus , 1989 Yarus and Curran , 1992). 일부 코돈쌍은 이들 쌍의 개별 코돈 사용으로부터 예측되는 것 이상의 훨씬 많은 빈도로 이용되며(과다-제시된 코돈 쌍), 그리고 일부 코돈 쌍은 예측되는 것보다 훨씬 적은 빈도로 관찰된다(과소-제시된 코돈 쌍)는 것으로 이해한다. Coleman 및 다른 이들은(2008) 불충분하게 제시된 코돈 쌍은 과다-제시된 코돈 쌍보다 더 느리게 해독되며, 불충분한 정도가 큰 코돈 쌍일수록 더 느리게 해독된다는 것을 보여주었다.

예를 들면, 인간의 경우, Ala 코돈 GCC는 동의적 코돈 GCG 빈도의 4배로 이용되며, 그리고 다른 동의적 코돈 쌍은 예상치와 다름없이 이용되었다는 연구가 있었다(Coleman et al ., 2008). 특이적 코돈 쌍의 이러한 빈도는 "코돈 쌍 편향"이라고 한다. 예를 들면, 다시 인간의 경우, 선호 코돈 이용에 근거하여, 아미노산 쌍 Ala-Glu은 대체로 GCCGAA 와 GCAGAG에 의해 균등하게 인코드되는 것으로 본다. 사실, 코돈 쌍 GCCGAA은 가장 빈번한 Ala 코돈을 함유하지만 상당히 과소제시되며, GCAGAG의 경우보다 겨우 1/7 수준으로 이용된다.

직렬 코돈 페어링( TANDEM CODON PAIRING )

또다른 측면에서, 본 발명은 직렬 코돈 페어링으로 기획된 합성 폴리뉴클레오티드 내에 GOI와 선택성 표식 단백질을 또한 인코드하는 발현 벡터를 이용하여, GOI에 의해 인코드된 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 벡터 및 방법들을 제공한다. 유전자 서열내 코돈 쌍의 빈도 및 조성은 감쇠 (Watson 1988) 및 해독 틀 이동(Gurvich et al ., 2005)으로 증명된 것과 같이, 해독율에 영향을 줄 수 있다. 감쇠 기전은 직렬쌍 또는 동일한 코돈의 반복에서 리보좀의 중단과 관련되며, 그리고 코돈-지정된 활성화된 rRNA 농도에 의해 영향을 받는다. 희귀한 코돈들이 짝을 이룰 때, 동족 tRNA 분자들의 결핍은 중단을 야기하고 뿐만 아니라 틀 이동(frame-shifting)으로 이어질 수 있고, 이는 정확하게 해독된 단백질의 감소를 야기할 수 있다. 이러한 직렬 코돈 페어링 작용 기전 모두 선택성 표식 유전자의 발현을 역최적화시키는데 이용될 수 있다.

역최적화된 dhfr 유전자내에 통합된 햄스터 최하위 선호 직렬 코돈 쌍의 예를 표 5에 나타낸다.

따라서, 이 방법의 한 구체예에서, 직렬의 1차 구조에서 동일한 아미노산이 하나 이상의 사본에 제공되는, 선택성 표식 단백질내 직렬로 반복된 아미노산 잔기는 이 아미노산에 있어서 비-선호 코돈에 의해 인코드된다. 다른 구체예에서, 직렬의 1차 구조에서 동일한 아미노산이 하나 이상의 사본에 제공되는, 선택성 표식 단백질내 직렬로 반복된 아미노산 잔기는 이 아미노산에 있어서 최하위 선호 코돈들에 의해 인코드된다. 또다른 구체예에서, 직렬의 1차 구조에서 동일한 아미노산이 하나 이상의 사본에 제공되는 동일한 아미노산은 동일한 코돈에 의해 인코드된다.

2차 구조

또다른 측면에서, 본 발명은 RNA 2차 구조를 변경하는 서열 변형으로 기획된 폴리뉴클레오티드내 선택성 표식 단백질을 인코드하는 발현 벡터를 이용하여, GOI에 의해 인코드되는 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

이 구체예에서, 코돈 역최적화를 위한 유전자를 기획할 때 mRNA 구조를 고려한다. 예를 들면, 재 기획된 코돈의 서열 내용은 mRNA 메신져의 안정성과 해독성을 조절하는 것으로 드러났던 RNA 2차 구조를 조절할 수 있다(Griswold 2003, Kozak 2005, Kudla 2009). 코돈 역최적화된 선택성 표식을 기획하는데 고려되는 인자들에는 RNAfold (Gruber et al ., 2008)와 같은 개방 접근 RNA 구조 예측 소프트웨어에 의해 측정할 수 있는 RNA 전체 또는 RNA의 5' 단부의 최소 자유 에너지(MFE)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다. 최하위 선호 코돈의 주변 또는 일부 영역에서 역최적화된 유전자의 서열 내용 또한 중요하다. 해독 효율을 감소시킬 수 있는 인자로는 GC 함량, 코돈 제3 위치에서의 G+C (Sueoka and Kawanishi , 2000), 그리고 코돈 적합 지수 수치 (Sharp and Li , 1987)를 포함한다. 또한, mRNA내 GC 함량이 높을 수록 해독 효율을 방해할 2차 구조 형성 가능성이 증가하며, 그리고 GC 함량을 감소시키면 이러한 2차 구조를 약체화시킨다는 증가들이 드러났다(Bulmer , 1989). 그 다음 역으로 말하자면, 본 방법들에 의해 제안된 것과 같이, 해독 효율을 감소시키기 위하여, 단백질 코딩 영역내 야생형 코돈들은 GC 함량이 더 높은 동의적 코돈들로 대체시키거나, 또는 더 GC 함량을 포함하도록 단순히 비해독 영역을 변형시켜 GC 함량을 증가시킴으로써, 2차 구조에서 GC가 증가된 제공되고, 이에 의해 해독 효율이 감소된다.

mRNA 5' 넌코딩 영역의 1차 및 2차 구조는 해독 효율을 조절하는 것으로 인지되며; 해독 효율은 mRNA 5' 넌코딩 영역에서 2차 구조의 수준에 역 비례하는 것으로 드러났다. (Pelletier and Sonenberg , 1987). 또다른 측면에서, 선택성 표식 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 이 단백질 코딩 영역의 내용 밖에서 변형되고, 인코드된 mRNA의 비해독 영역은 야생형 mRNA와 비교하여 증가된 2차 구조를 가지도록 유전자에 대한 변형이 만들어지는 방법이 제공된다. 한 측면에서, 해독에 비-필수적인 5' 및/또는 3' 비해독 영역 내에 하나 이상의 변형이 도입된다. 또다른 측면에서, 이런 변형 또는 변형들은 해독에 필수적인 5' 및/또는 3' 영역 내에 도입된다.

벡터 및 숙주 세포

임의의 진핵생물 및 원핵생물 벡터는 선택된 숙주 세포에 대해 유용한 포유류, 효모, 곰팡이, 곤충, 식물 또는 바이러스성 벡터들을 포함한 본 방법들에 사용이 고려된다. 용어 "벡터"는 당업계에서 인지된 것과 같이, 숙주 세포에게 코딩 정보를 전달하는데 이용되는 임의의 분자(가령, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 지칭할 때 이용된다. 용어 "숙주 세포"는 세포에서 발현되도록 선택된 관심 유전자를 품고 있는 벡터에 의해 형질변환되었거나, 또는 형질변환될 수 있는 세포를 지칭할 때 이용된다. 숙주 세포는 포유류, 효모, 곰팡이, 곤충, 식물 및 원생동물 세포들, 그리고 부계 세포의 자손을 포함하며, 이때 자손은 원래 부계 세포와 형태학적 또는 유전적 구성이 동일하거나 동일하지 않는 것에 무관하게, 선택된 유전자가 존재한다면, 이들 자손도 포함한다. 일반적으로, 한 측면에서, 임의의 벡터가 본 발명의 방법들에서 이용될 수 있으며, 그리고 한 측면에서, GOI의 발현을 위하여 선택된 숙주 세포에 근거하여 적절한 벡터가 선택된다.

예로는 포유류 세포들, 가령, Chinese 햄스터 난소 세포들 (CHO) (ATCC No. CCL61); CHO DHFR-세포들, 인간 배아 신장 (HEK) 293 또는 293T 세포들 (ATCC No. CRL1573); 또는 3T3 세포들 (ATCC No. CCL92)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적합한 다른 포유류 세포계는 원숭이 COS-1 (ATCC No. CRL1650) 및 COS-7 (ATCC No. CRL1651) 세포계, 그리고 CV-1 세포계(ATCC No. CCL70)를 포함한다. 또다른 적합한 포유류 세포계는 Sp2/0, NS1 및 NS0 마우스 하이브리도마 세포들, 마우스 신경아종 N2A 세포들, HeLa, 마우스 L-929 세포들, Swiss, Balb-c 또는 NIH 마우스, BHK 또는 HaK 햄스터 세포 계로부터 유도된 3T3계를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이들은 또한 ATCC로부터 이용할 수 있다.

추가 예시적인 포유류 숙주 세포들은 형질변환된 세포계를 포함한 영장류 세포 계와 설치류 세포 계를 포함한다. 정상적인 이배체 세포들, 시험관 1차 조직 배양물로부터 유도된 세포 계통과 1차 외식편(explant)로부터 유도된 세포 계통 또한 적합하다.

숙주 세포들로 유사하게 유용한 예로는 다양한 계통의 대장균(E. coli)(가령, HB101, (ATCC No. 33694) DH5, DH10, 및 MC1061 (ATCCNo. 53338)), 다양한 계통의 B. 서브틸리스(B. subtilis), 슈도모나스(Pseudomonas spp .), 스트렙토미세스(Streptomyces spp .), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 이와 유사한 것을 포함한다.

당업계의 숙련자들에게 공지된 많은 계통의 효모 세포들 또한 GOI의 발현을 위한 숙주 세포로 이용가능하며, 그리고 예를 들면, 사카로미세스 세르비시에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루베로미세스 계통(Kluyveromyces strains), 칸디다(Candida), 피치아 씨페리(Pichia ciferrii) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다.

추가적으로, 바람직하다면, 곤충 세포계를 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 이러한 곤총계는 Sf-9 및 Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

예시적인 곰팡이 세포들은 테르모사쿠스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus), 아스퍼질러스 오리젬(Aspergillus oryzaem), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 테레우스(Aspergillus terreus) 및 아스퍼질러스 나이져(Aspergillus niger)를 포함하나 이에 한정되지 않는 아스퍼질러스(Aspergillus-사상균), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum)을 포함하나 이에 한정되지 않는 푸사리움(Fusarium-사상균), 페니실리움 크리소게늄(Penicillium chrysogenum), 페니실리움 씨트리늄(Penicillium citrinum), 아크레모니움 크리소게늄(Acremonium chrysogenum), 트리쵸데르마 리쎄이(Trichoderma reesei), 모르티에레라 알피나(Mortierella alpina), 및 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense)를 포함한다.

예시적인 원생동물 세포들은 테트라히메나(Tetrahymena) 계통 및 트리파노조마(Trypanosoma) 계통을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

실시예

한 구체예에서, 본 발명은 Chinese 햄스터 난소 (CHO) 세포들에서 선택에 적합한 유전자를 인코딩하는 코돈 역최적화된 DHFR (CDD)을 만들기 위하여 최하위-선호 햄스터 코돈들을 이용하여 구체화한다.

출발 유전자는 무스 무스쿨루스(Mus musculus) DHFR-인코딩 cDNA, 수탁번호 BC005796와 동일하며, 야생형 DHFR 폴리펩티드를 인코드한다(도 1 참고). 두 가지 형태의 코돈 역최적화된 DHFR-인코딩 폴리뉴클레오티드를 합성하였으며, 여기에서 crippled 및 worst로 명명하였고, 이들은 차례로 중간 수준으로 역최적화된 그리고 최대로-역최적화된 코딩 서열을 나타낸다. GENEART AG CHO 코돈 처리 연산을 이용하여 이들 폴리뉴클레오티드를 기획하였다. 코돈 역최적화된 DHFR-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 도 2에 나타낸다. 도 3에서 코돈 역최적화된 DHFR 유전자는 야생형 DHFR 유전자 서열와 함께 정렬시켰으며, 햄스터 최하위 선호 코돈들과 직렬 코돈 쌍의 도입으로 야기된 뉴클레오티드 차이는 눈에 띄도록 표시하였다. 세 가지 유전자, 즉, 야행형, crippled 및 worst의 해독 산물들은 동일하다.

야생형 DHFR 인코딩 서열을 대체하기 위하여, 코돈 역최적화된 DHFR-인코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 pDEF38, CHEF1 발현 벡터 (미국 특허 제5,888,809호) 안으로 도입시켰다(도 4). 생성된 플라스미드들은 pDEF81 (crippled DHFR) 및 pDEF82 (worst DHFR)로 명명하였다. IgG1 Fc 융합 단백질을 인코드하는 FIGI의 리포터 유전자는 pDEF38, pDEF81 및 pDEF82의 다중 클로닝 부위(XhoI에서 XbaI까지)로 클론시켜 차례로 발현 벡터들 pDEF38:FIGI, pDEF81:FIGI 및 pDEF82:FIGI를 만들었다.

이들 FIGI 발현 벡터들은 CHO DG44 세포들에게 형질감염시키고, 하이포산틴 및 티미딘(HT)을 포함하는 비-선택 배지에서 2일간 성장시키고, 그 다음 HT (-HT)가 부족한 배지에서 선별하였다. 선택된 세포 집단, 또는 풀(pools)을 확장시키고, 생산성을 평가하기 위하여 생산 모델 배양물로 분배하였다.

형질감염 풀(pools)을 희석시켜 96 웰 플레이트의 개별 웰에 단일 세포를 접종시켰다. 플레이트는 Clone Select Imager (Genetix)로 영상화시켰으며, 그리고 단일 세포로부터 유도된 FIGI를 발현시키는 세포들을 담고 있는 웰을 확장시켰다. 확인된 단일 클론 세트로부터 각 형질감염(야생형, crippled 및 worst DHFR)을 위하여 한계 희석 플레이트로부터 23개 클론을 무작위로 선택하였다.

6-웰 생산 모델에는 10% FBS를 포함한 세포 배양 배지 3㎖에 총 백만 세포가 되도록 접종을 하고, 37℃에서 4일간 성장시키고, 그 다음 34℃에서 4일간 성장시켰다. 수거 상청액은 0.2 ㎛ 필터를 통하여 여과시키고, 단백질 A HPLC를 이용하여 FIGI 생산을 분석하였다. 스핀 튜브내 10% FBS가 보충된 배양 배지에 ㎖당 50만개 세포로 페드 배취(Fed batch) 생산 모델에 접종하였다. 50mL 스핀 튜브는 15㎖ 작업 용적으로 작동하였다. 접종 후, 시료를 37℃, 6% CO₂에서 3일간 피딩(feeding)하면서 성장시켰고, 4일째 온도를 34℃로 전환시켰다. 역가 및 세포 밀도를 위한 시료 채취는 3, 5, 7, 10 및 12 일째에 시료를 수거하였다. 연구는 12일째 종결하였다.

2일째 정상적으로 성장한 세포를 수거하고, DHFR 단백질을 탐지하기 위하여 형광 이소티오시아네이트 라벨된 메토트렉세이트(F-MTX)로 착색시키고, FIGI를 탐지하기 위하여 R-피코에리틴(RPE) 라벨된 항-IgG1 Fc로 착색시켜, FACS 분석을 실행하였다.

DHFR 선택성 표식을 인코드하는 야생형 및 코돈 역최적화된 유전자를 이용하여 리포터 단백질 FIGI를 발현시키는 안정적인 세포계를 만들었다. 리포터 단백질 FIGI를 발현시키는 야생형, crippled 및 worst DHFR 플라스미드로 중복 형질감염을 실행하였다(T462 - T464, A 및 B). 각 형질감염에 대해 카운트된 개별 콜로니는 “형질감염체의 수”로 나타낸다. 표 6에서 볼 수 있는 것과 같이, 형질감염 결과는 야생형 DHFR와 비교하였을 때, 코돈 역최적화된 DHFR (CDD)를 이용하면 선택압이 증가된다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 HT가 부족한 배지에서 선택된 CDD 형질감염체의 수가 감소로 나타난다.

6-웰, 8일간 (도 5) 그리고 스핀 튜브에서, 12일간 페드 배취(도 6) 생산 모델에서 형질감염체 풀로부터 얻은 FIGI 단백질의 양은 야생형 DHFR 유전자와 비교하여, 코돈 역최적화된 DHFR 선택성 표식 유전자를 가진 GOI의 생산성이 예상밖으로 증가된 것으로 나타난다. crippled DHFR 유전자가 최대 역가를 나타낸다. 이 결과는 crippled DHFR 선택이 가장 엄격하였던 관찰과 일치하였고(표 6 참고) 집단에서의 변화는 감소될 수 있지만, 평균적으로 세포는 더 많은 POI를 발현시킨다는 것을 뒷받침한다. 이러한 결론은 도 7A의 crippled DHFR (T463) FACS 분포에서 증명되는데, 이 도면은 RPE:FIGI에 대해서는 더 밝게 착색되고, 동시에 F-MTX 착색은 감소된 세포의 조밀한 클러스트를 나타낸다. worst DHFR 세포들은 crippled DHFR와 비교하였을 때 유사한, 그러나 더 광범위한 RPE:FIGI 착색 패턴을 보여주고, 이는 생산 모델에서 약간 더 낮은 역가와 일치한다. 야생형 착색 패턴과 비교하였을 때, 두 가지 코돈 역최적화된 풀은 모두 DHFR의 감소와 증가된 FIGI와 함께 착색에서 극적인 전환을 가진다. 이러한 차이는 야생형 풀(pool)에 비교하여 CDD 풀의 평균 형광의 증가에서 더욱 분명하게 볼 수 있고(도 7B) 그리고 코돈 역최적화된 DHFR 선택은 POI 생산의 증가를 초래한다는 결론을 확증한다.

CDD 풀(pools)로 관찰된 생산성의 증가는 개별 클론으로 더 확인된다. 무작위로 선택된 클론을 확장시키고, 유동세포분석법으로 분석하였고, 6-웰 생산 모델에 넣었다. 개별 클론의 FACS 프로파일에서 코돈 역최적화된 선택된 세포들은 야생형 DHFR 선택된 클론과 비교하여 POI에 대해서는 더 밝게(도 8B), 그러나 더 낮은 DHFR 수준을 가지는 것(도 8A)으로 드러났다. 이러한 데이터들은 형질감염 풀(pool) 데이터와 일치한다. 단백질 A 분석에서 클론의 생산성을 도 9에 나타내고, CDD 선택된 풀(pools)의 무작위 클론에 대한 역가는 증가됨을 설명한다. CDD 클론에 대한 역가 차이는 야생형 보다는 2 내지 3배 범위에서 더 크다.

여기에서 설명되고 청구되는 모든 조성물 및/또는 방법은 본 내용에 근거하여 만들 수 있으며, 과도한 실험없이 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법들은 특정 구체예로 설명되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여기에서 설명된 조성물 및/또는 방법들 또는 방법의 단계들의 순서의 변화가 가능하다는 것은 당업계 숙련자에게 자명할 것이다. 더 구체적으로, 여기에서 설명된 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 그리고 생물학적으로 관련된 특정 뉴클레오티드로 대체하여 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것이 자명할 것이다. 당업계 숙련자들에게 자명한 이러한 유사한 모든 치환 및 변형은 첨부된 청구항에서 정의된 것과 같이, 본 발명의 범위 및 사상 범위내에 있는 것으로 간주된다.

여기에서 제공한 것들에 대해 예시적인 과정 또는 기타 보충 사항을 제공하는 수준으로 명세서를 통하여 언급된 참고문헌은 모두 전문이 참고문헌에 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> CMC ICOS BIOLOGICS, INC. <120> METHOD FOR IMPROVING RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION <130> 31351/44743A <140> PCT/US2010/44693 <141> 2010-08-06 <150> US-61/231,906 <151> 2009-08-06 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 564 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat tggcaagaac 60 ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 120 acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180 attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240 aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300 attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360 gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420 caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480 ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540 gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly 1 5 10 15 Ile Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe 20 25 30 Lys Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln 35 40 45 Asn Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys 50 55 60 Asn Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu 65 70 75 80 Lys Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp 85 90 95 Ala Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met 100 105 110 Val Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln 115 120 125 Pro Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu 130 135 140 Ser Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu 145 150 155 160 Pro Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile 165 170 175 Lys Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 3 <211> 564 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 3 atggttcgac cgcttaactg catagtagca gtatcacaaa acatggggat agggaaaaat 60 ggggatcttc cgtggccgcc gttgcgtaac gaattcaaat acttccaacg tatgactact 120 acttcatcag tagaagggaa acaaaacctt gtaataatgg ggcgtaaaac atggttctca 180 ataccggaaa aaaaccgtcc gcttaaagac cgtataaaca tagtactttc acgtgaactt 240 aaagaaccgc cgcgtggggc acattttctt gcaaaatcac ttgacgacgc acttcgtctt 300 atagaacaac cggaacttgc atcaaaagta gacatggttt ggatagtagg ggggtcatca 360 gtataccaag aagcaatgaa ccaaccgggg caccttcgtc ttttcgtaac tcgtataatg 420 caagaattcg aatcagacac tttcttcccg gaaatagacc ttgggaaata caaacttctt 480 ccggaatacc cgggggtatt gtcagaagta caagaagaaa aagggataaa atacaaattc 540 gaagtatacg aaaaaaaaga ctag 564 <210> 4 <211> 564 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 4 atggttcgac cgctaaactg catagtagcg gtatcgcaaa acatggggat agggaaaaat 60 ggggacttac cgtggccgcc gttacgaaac gaattcaaat acttccaacg tatgacgacg 120 acgtcgtcgg tagaagggaa acaaaaccta gtaataatgg ggcgtaaaac gtggttttcg 180 ataccggaaa aaaaccgtcc gctaaaagac cgtataaaca tagtactatc gcgtgaacta 240 aaagaaccgc cgcgtggggc gcatttttta gcgaaatcgc tagacgacgc gctacgtcta 300 atagaacaac cggaactagc gtcgaaagta gacatggttt ggatagtagg ggggtcgtcg 360 gtatatcaag aagcgatgaa ccaaccgggg cacttacgtt tattcgtaac gcgaataatg 420 caagaattcg aatcggacac gttcttcccg gaaatagacc tagggaaata caaactacta 480 ccggaatacc cgggggtact atcggaagta caagaagaaa aagggataaa atacaaattc 540 gaagtatacg aaaaaaaaga ctag 564

Claims

이종 단백질을 인코드하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 단백질 발현을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 이종 단백질 발현을 증가시키는 방법이며,
숙주 세포는 선택성 표식 단백질에 대한 단백질 코딩 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하고,
제2 폴리뉴클레오티드는 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드와 비교하였을 때 서열 변형을 보유하고, 상기 서열 변형은 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 mRNA의 해독 효율을 감소시키고,
제2 폴리뉴클레오티드는 상기 서열 변형, 및 상기 선택성 표식 단백질에 대한 동일한 아미노산 서열을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드를 보유하고,
제1 이종 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 단일 Chinese 햄스터 신장 인자 1 (CHEF1) 발현 벡터 상에 인코드되어 있고, 여기서 제1 이종 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 프로모터의 전사 조절하에 있는 것인, 숙주 세포에서 이종 단백질 발현을 증가시키는 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 서열 변형이 선택성 표식 단백질을 인코드하는 제 2 폴리뉴클레오티드의 비해독 영역 내에 있는 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 서열 변형이 5' 비해독 영역 내에, 3' 비해독 영역 내에, 또는 이들 영역 둘 다 내에 있는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 서열 변형이 선택성 표식 단백질을 인코드하는 유전자의 단백질 코딩 영역 내에 있는 것인 방법.
청구항 4에 있어서, 상기 서열 변형이 상기 선택성 표식 단백질에 대한 단백질 코딩 서열의 개시 코돈의 25, 20, 15, 10 또는 5개 코돈 내에 있는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열 내의 단백질 코딩 서열이 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드에서 야생형 코돈이 아닌 최소 하나의 변형된 코돈을 포함하며, 이러한 변형된 코돈이 숙주 세포에 있어서 상기 인코드되는 아미노산에 대한 선호 코돈이 아니거나 최하위 선호(least preferred) 코돈인 방법.
청구항 1에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 서열 내의 단백질 코딩 서열이 선택성 표식 단백질을 인코드하는 야생형 폴리뉴클레오티드에서 야생형 코돈이 아닌 최소 하나의 변형된 코돈을 포함하고, 이러한 변형이 mRNA의 2차 구조에서 mRNA의 해독 효율을 감소시키거나, mRNA에서 코돈 페어링(pairing)을 증가시키거나, mRNA의 G+C 함량을 증가시키거나, 또는 mRNA의 A+T 함량을 감소시키는 변화를 도입하는 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드 단백질 코딩 서열에서 적어도 1%의 코돈이 변형된 코돈인 방법.
청구항 1에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포인 방법.
청구항 1에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드가 서열 3 또는 서열 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 선택성 표식 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소인 방법.
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제1항에 있어서, 숙주 세포가 Chinese 햄스터 난소 세포인 방법.
이종 단백질을 인코드하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드, 및
야생형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 선택성 표식 단백질을 인코드하는 코돈 역최적화된(codon deoptimized) 선택성 표식 유전자 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오티드
를 포함하고, 여기서 상기 제1 이종 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 프로모터의 전사 조절하에 있으며, 선택성 표식 단백질이 디하이드로폴레이트 환원효소인 Chinese 햄스터 신장 인자 1 (CHEF1) 발현 벡터.
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제14항에 있어서, 제2 폴리뉴클레오티드가 서열 3 또는 서열 4의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 것인 발현 벡터.
제14항의 발현 벡터로 형질변형되거나 형질감염된 숙주 세포.
제18항에 있어서, Chinese 햄스터 세포인 숙주 세포.
제19항에 있어서, Chinese 햄스터 난소 (CHO) 세포인 숙주 세포.
제20항에 있어서, CHO DG44 세포인 숙주 세포.
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