CN112301047A - 一种精确调控重组蛋白表达的方法 - Google Patents

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吕永维
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Abstract

本发明公开了一种精确调控重组蛋白表达的方法，其包括1)cNDA库设计：根据设定规则设计编码目标蛋白的多条cDNA序列，同时合成设计的所有cDNA序列，形成cDNA库；2)cNDA库表达：然后将cDNA库克隆到适宜的表达载体中，在指定的表达宿主或表达体系中表达；3)表达筛选：根据所表达蛋白的特性或使用其它物理、化学或生物的方法对克隆进行筛选；4)克隆验证：最终挑选出最大限度满足蛋白表达需要的克隆。本发明通过设计合成编码目标蛋白的cDNA库，在指定的表达宿主或体系中表达筛选，最终挑选出最大限度满足蛋白表达需要的克隆。

Description

一种精确调控重组蛋白表达的方法
【技术领域】
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种精确调控重组蛋白表达的方法。
【背景技术】
基因表达是指储存在cDNA序列中的遗传信息经过转录和翻译，最终生成具有生物活性的蛋白质分子的过程。基因工程、蛋白质工程、生物制药以及合成生物学的快速发展需要将各种不同的重组蛋白在各种特定的宿主细胞或人工表达系统中表达出来。通常用来表达蛋白的宿主细胞包括细菌、酵母、昆虫、植物、动物细胞和无细胞表达体系等。根据最终的目的和用途，对所表达重组蛋白的量、可溶度和生物活性都有严格要求。但因为重组蛋白的cDNA序列往往与异源宿主细胞或非细胞表达体系不相匹配，重组蛋白的表达会受到很大影响，多数情况下不能满足实验要求。目前常用的密码子计算机软件设计因为种种限制也无法预测和控制蛋白表达效果，因此迫切需要一种精确有效的控制重组蛋白表达的实验方法。
【发明内容】
本发明的主要目的在于提供一种精确调控重组蛋白表达的方法，通过设计合成编码目标蛋白的cDNA库，在指定的表达宿主或体系中表达筛选，最终挑选出最大限度满足蛋白表达需要的克隆。
本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种精确调控重组蛋白表达的方法，其包括以下步骤：
1)cNDA库设计：根据设定规则设计编码目标蛋白的多条cDNA序列，同时合成设计的所有cDNA序列，形成cDNA库。
具体的，所述cNDA库设计具体包括：
11)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，选择使用频率在设定区间的密码子，而不是单纯选择使用频率最高的密码子；
12)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，选择设定GC％含量的密码子；
13)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，在蛋白序列的设定区域内通过选择不同GC％含量的密码子，控制该区域的平均GC％含量；
14)通过选择不同的密码子，减少DNA二级结构；
15)通过选择不同的密码子，减少DNA重复序列；
16)通过选择不同的密码子，删除不需要的DNA序列；
17)经过上述选择后得到cDNA库。
2)cNDA库表达：然后将cDNA库克隆到适宜的表达载体中，在指定的表达宿主或表达体系中表达。
3)表达筛选：根据所表达蛋白的特性或使用其它物理、化学或生物的方法对克隆进行筛选。
所述表达筛选包括以下步骤：
31)表达蛋白；
32)提取蛋白；
33)通过蛋白的物理、化学或生物特性进行筛选，例如使用所表达蛋白或酶本身的物化特性或生物活性进行筛选；使用共表达的融合标记蛋白，如GFP等荧光蛋白、LacZ等显色蛋白、His6、GST等亲和力标记；使用高通量、自动化的筛选方式，如酶标仪、质谱仪、自动图像识别处理装置等。
4)克隆验证：最终挑选出最大限度满足蛋白表达需要的克隆。
优选地，所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，加大所指定的表达宿主或表达体系所偏好的密码子使用频率。
优选地，所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，减小各cDNA序列间的相似度。
优选地，所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，减少各cDNA序列中的二维结构。
优选地，所设计合成的编码目标蛋白的cDNA库包含的序列数大于或等于100。
利用所表达蛋白本身的物理、化学或生物活性，如颜色、荧光、酶活性、其它生物活性或对其它物质分子的亲和性等。如果所表达蛋白没有可用来筛选的特性，则可以借助其它有可筛选特性的蛋白来辅助筛选，比如荧光或颜色蛋白以及酶等。
与现有技术相比，本发明一种精确调控重组蛋白表达的方法的有益效果在于：可以就指定靶蛋白高效设计，筛选出具有最高的或指定的、期望的表达量和可溶性兼容的cDNA序列，而现有技术只能提高或改变蛋白总表达量，不涉及可溶性，且成功率不能保证。
【附图说明】
图1为本申请发明的方法全过程示意图；
图2为应用本方案设计合成出的lacZαcDNA库在大肠杆菌中的表达情况，其中(2a)中显示了将1296个表达不同lacZαcDNA的大肠杆菌菌落依颜色强度分类，(2b)中柱状图显示了琼脂平板上1468种表达不同lacZαcDNA的随机菌落颜色深度分布；
图3为使用本方案对多种重组蛋白质表达的优化结果；其中(3a)中列出了其中15中蛋白的数据，每对泳道显示的均为大肠杆菌内的总蛋白，左泳道为原生型(WT)，右边是优化后的克隆(Op)，箭头标示的较粗的条带是高度表达的原生型转录因子-GFP融合蛋白，泳道M是蛋白质分子量标准；(3b)为余下59种蛋白的表达结果。
【具体实施方式】
实施例1：lacZα的密码子变异基因的表达筛选
在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在下，lacZα的表达可使宿主大肠杆菌菌落呈现蓝色。首先，参照非偏好性密码子使用表，设计出一系列lacZα密码子变异基因，在该表中对应同一种氨基酸的各种密码子使用频率相同。
之后，构建了一个lacZα密码子变异基因库，由1296个的表达不同lacZα密码子变异基因组成，并将其全部转化到大肠杆菌感受态细胞中。取出一小部分涂布在琼脂糖固体平皿上，并通过自动成像分析实时测定各个单克隆菌落的蓝色深度。菌落颜色深浅的差别显示着蛋白质表达水平不同。随机挑选琼脂糖固体平皿上的单克隆菌落进行统计，得到了关于密码子变异基因表达水平的钟形分布图。大约三分之一的变异基因显示出比原生型lacZα更高的表达水平。原生型基因的表达水平稍高于所有表达量可测的克隆的中等水平。
图2显示了应用本发明所述方法在芯片上合成(在芯片上合成是指在基因合成芯片上进行引物和基因合成，有别于常用的手工基因合成)出的lacZα密码子变异基因在大肠杆菌中的表达情况。图2a中显示了将1296个的表达不同lacZα密码子变异基因的大肠杆菌菌落依颜色强度分类。原始图片是使用HP PhotosmartC7180平板扫描仪对琼脂平皿进行扫描获得的。图2b中柱状图显示了琼脂平板上1468种表达不同lacZα密码子变异基因的随机菌落颜色深度分布。对几百个蓝色克隆的测序证实，由于芯片合成的密码子变异基因库很大，在一块平板上得到相同克隆的几率极低。原生型lacZα的表达水平用虚线表示。
尽管这种分布的原因尚需进一步研究，但通过该分布图已能够估计大肠杆菌中lacZα基因的潜在翻译能力。这些实验结果显示出本专利公开的这种在芯片上合成基因的方法，实现了在给定的表达体系中筛选出具有可靠且理想的蛋白表达水平的基因序列，具有高度的可行性和可靠性。
实施例2：果蝇转录因子蛋白结构域的表达筛选
为了直接测定蛋白质在大肠杆菌中的表达水平，在每种目标基因上加上绿色荧光蛋白(GFP)报告基因标签。蛋白质表达水平越高，该单克隆菌落发出的荧光越强。
本发明应用对74种果蝇转录因子蛋白的结构域进行了表达的优化和筛选，这些蛋白是被用于制备ENCODE工程(DNA元件的百科全书)的抗体。首先，针对15种在大肠杆菌中不表达的候选基因，并根据大肠杆菌密码子使用表，设计并应用本专利公开的芯片基因合成方法合成了密码子变异基因库。在此应用中，没有使用错配内切酶错误修复体系，因为非常相关的密码子变异基因之间可能会形成异类双链DNA。合成出的基因与GFP的N端融合，并使用非序列依赖型的聚合酶循环延伸克隆的方法(CPEC)插入到pAcGFP表达载体中。质粒转化到大肠杆菌细胞内，在琼脂平板上培养。持续监测所有菌落发出的荧光，荧光很强的部分克隆被挑选出来进行测序。所有克隆中所含有的质粒，带有不同密码子变异基因的，贯穿了候选蛋白的序列。
将序列已确定的、荧光较强的克隆于液体培养基中培养，在聚丙烯酰胺凝胶上对总蛋白提取物进行电泳以确定蛋白结构域的表达情况。使用这种方法，15种候选蛋白均筛选得到具有高表达量的克隆。相比之下，克隆到相同的载体中，并在相同的条件下培养的原生型对照组检测不到蛋白表达量。这种结果表明，本专利公开的芯片基因合成方法能够可靠地从不可检测的水平将蛋白质的表达量提高到占细胞中蛋白总质量的50-60％。
图3显示了使用高通量、高保真芯片基因合成技术对蛋白质表达的优化结果。图3a中列出了其中15种蛋白的数据。每对泳道显示的均为大肠杆菌内的总蛋白，左侧泳道为原生型(WT)，右边是优化后的克隆(Op)。箭头标示的较粗的条带是高度表达的原生型转录因子-GFP融合蛋白。在原生型的泳道内，检测不到有原生型转录因子-GFP融合蛋白被表达。每块NuPage 4-12％梯度胶上分离的细胞内总蛋白的量相同。用EZBIue凝胶染色试剂染色。泳道M是Novex预染蛋白质分子量标准混合物(购自Invitrogen公司)。
对其余59种蛋白进行了相同的密码子优化实验。图3b中为余下59中蛋白表达结果。
本实施例74种果蝇转录因子基因片段经优化后在大肠杆菌中表达，针对每种基因片段均合成了大约1000-1500种密码子变异基因，与GFP基因一起克隆到表达载体的开放阅读框架中，经表达筛选出荧光最强的菌落。测序和蛋白凝胶电泳结果证实所测试的所有候选蛋白都如预期得到了高表达量的克隆。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1)cNDA库设计：根据设定规则设计编码目标蛋白的多条cDNA序列，同时合成设计的所有cDNA序列，形成cDNA库；
2)cNDA库表达：然后将cDNA库克隆到适宜的表达载体中，在指定的表达宿主或表达体系中表达；
3)表达筛选：根据所表达蛋白的特性或使用其它物理、化学或生物的方法对克隆进行筛选；
4)克隆验证：最终挑选出最大限度满足蛋白表达需要的克隆。
2.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述cNDA库设计包括：
11)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，选择使用频率在设定区间的密码子，而不是单纯选择使用频率最高的密码子；
12)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，选择设定GC％含量的密码子；
13)根据对蛋白表达量和可溶性的设定要求，在蛋白序列的设定区域内通过选择不同GC％含量的密码子，控制该区域的平均GC％含量；
14)通过选择不同的密码子，减少DNA二级结构；
15)通过选择不同的密码子，减少DNA重复序列；
16)通过选择不同的密码子，删除不需要的DNA序列；
17)经过上述选择后得到cDNA库。
3.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述表达筛选包括以下步骤：
31)表达蛋白；
32)提取蛋白；
33)通过蛋白的物理、化学或生物特性进行筛选。
4.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述步骤33)中所使用的方法包括
331)使用所表达蛋白或酶本身的物化特性或生物活性进行筛选；
332)使用共表达的融合标记蛋白，其包括荧光蛋白、显色蛋白、亲和力标记；或采用酶标仪、质谱仪、自动图像识别处理装置进行自动筛选。
5.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，加大所指定的表达宿主或表达体系所偏好的密码子使用频率。
6.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，减小各cDNA序列间的相似度。
7.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所述步骤1中在设计编码目标蛋白的多条cDNA序列时，减少各cDNA序列中的二维结构。
8.如权利要求1所述的精确调控重组蛋白表达的方法，其特征在于：所设计合成的编码目标蛋白的cDNA库包含的序列数大于或等于100。
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