KR101783463B1

KR101783463B1 - 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법

Info

Publication number: KR101783463B1
Application number: KR1020150092468A
Authority: KR
Inventors: 한상무; 문은경; 오석흥; 김수곤; 유지현; 이요셉
Original assignee: 유한회사 대신환경개발; 우석대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-10-10
Also published as: KR20170002779A

Abstract

본 발명은 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 팽화미, 누룩, 조효소제, 효모, 유산균스타터 및 아르기닌을 포함하는 막걸리 키트를 제공함으로써, 가정에서 누구나 손쉽게 생막걸리를 만들어 마실 수 있음은 물론, 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있는 아미노산인 오르니틴의 함유량을 현저히 높인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법은 팽화미 100 중량부에 대하여, 당화제 8~12 중량부, 효모 0.3~0.5 중량부, 유산균스타터 0.1~0.2 중량부 및 아르기닌 0.01~0.03 중량부를 준비하는 단계; 상기 당화제 및 효모를 혼합하여 당화 혼합물을 제조하는 단계; 상기 팽화미, 당화 혼합물, 유산균스타터 및 아르기닌을 각각 폴리에틸렌 내포장지에 담아 열접착으로 밀봉하여 각각의 내포장물을 형성하는 단계; 상기 각각의 내포장물을 박스에 담아 포장하는 단계; 를 포함하며, 상기 당화제는 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP를 포함하여, 당화력이 47~65 SP이고, 상기 당화력은 일반적으로 당화력이 360~420 SP인 전통누룩과 1200~1500 SP인 개량누룩과 600~800 SP인 조효소제를 각각 상기 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP로 맞추기 위하여, 상기 당화제 8~12 중량부는 전통누룩 5~6 중량부, 개량누룩 1~2 중량부, 조효소제 2.5~3.5 중량부로 이루어지며, 상기 유산균스타터는 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 이용하여 제조한다.

Description

오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법 {The method for manufacturing Makgeolli kit with Ornithine producing lactic acid bacteria}

본 발명은 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 팽화미, 누룩, 조효소제, 효모, 유산균스타터 및 아르기닌을 포함하는 막걸리 키트를 제공함으로써, 가정에서 누구나 손쉽게 생막걸리를 만들어 마실 수 있음은 물론, 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있는 아미노산인 오르니틴의 함유량을 현저히 높인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법에 관한 것이다.

한국의 전통적인 발효주인 '막걸리'는 탁주 또는 농주(農酒)라고도 하며 이것은 찹쌀, 멥쌀, 보리, 밀가루 등을 쪄서 누룩과 물을 섞어 발효시킨 술덧을 여과하지 않고 혼탁하게 만들어낸 곡주이다. 막걸리는 발효 후, 여과과정을 거치지 않은 특성 탓에 발효에 관여한 효모, 유산균 등이 포함되어있는 발효산물 전체를 음용하는 세계 유일의 술로서, 다른 주류에 비하여 알코올 도수가 상대적으로 낮아, 위에 부담을 주지 않을 뿐더러 단백질, 식이섬유 등이 풍부하게 함유되어있다. 또한 다양한 유기산과 inositol, acetylcholine, riboflavin, 비타민 B복합체 등 다양한 생리활성 물질을 포함하고 있으며, 인체 내의 신진대사에 관여하는 10여종의 필수 아미노산을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 최근, 막걸리의 건강기능성 관련한 연구로는 3T3-L1 세포주를 사용하여 분화억제를 통한 항비만 효과, 항염증, 신생혈관생성억제 효과와 막걸리와 막걸리 지게미의 혈행 개선 효과 등이 이루어지고 있다.

최근 기능성 식품에 대한 관심이 높아지고 있으며 특히 비만을 예방하는 기능성 식품에 관심이 많이 쏠리고 있다. 막걸리에도 이러한 기능성 식품에 대한 관심이 더해져 막걸리의 기능성 및 기호도가 증진되고 있다. 그에 따라 크렌베리, 당귀열수추출물, 석류 등과 같이 여러 기능성 물질을 넣은 막걸리에 관한 연구가 많이 이루어지고 있는 실정이다. 하지만 이러한 연구들은 품질평가에 그치고 기능성 효과를 증명하지 못하는 한계를 지니고 있다.

L-ornithine은 식품에 통상적으로 함유 되어있는 아미노산으로 뇌하수체에서 성장호르몬의 분비를 촉진하여 탄수화물, 단백질, 지질의 대사를 활성화시켜 근육 합성과 체내 지방의 대사를 촉진한다. 또한 미국에서 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로 널리 사용되고 있다. 이외에도 다량영양소의 대사에 관여하는 역할 뿐만 아니라, 인슐린 분비의 증가와 면역반응의 향상에도 관여한다. 현재 ornithine에 관련된 항비만 연구는 지방 축적억제와 지질합성관련 유전자의 감소에 대한 ornithine의 효과 (in vitro), 김치에서 분리한 ornithine의 항비만 효과 (in vivo)가 보고되어져 있다.

다양한 기능성을 가진 L-ornithine은 ornithine 2-oxoglutarate(alpha-ketoglutarate; OKG)의 형태로 근육증강, 면역증진 및 비만예방 소재로 이용되고 있고, 간장장애를 개선하는 의약품으로는 ornithine-aspartate의 형태로 이용되고 있다.

이러한 상기 오르니틴과 관련하여 본 출원인에 의해 출원된 대한민국 등록특허 제10-1481794호에서는 오르니틴 생산능력이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 AYO-1 균주를 이용한 오르니틴을 함유하는 요구르트 제조방법을 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-1481791호에서는 오르니틴 생산력이 우수한 페디오코커스 에시디락티시 DM-9 균주를 이용하여 오르니틴을 함유하는 청국장의 제조방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 누룩에서 새로 분리 및 동정한 오르니틴 생성능이 있는 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 이용하여 막걸리 키트를 제조하는 기술은 개시되어 있지 않다.

대한민국 등록특허 제10-1481794호(2015.01.06.) 대한민국 등록특허 제10-1481791호(2015.01.06.)

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 발명된 것으로서, 팽화미, 누룩, 조효소제, 효모, 유산균스타터 및 아르기닌을 포함하는 막걸리 키트를 제공함으로써, 가정에서 누구나 손쉽게 생막걸리를 만들어 마실 수 있음은 물론, 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있는 아미노산인 오르니틴의 함유량을 현저히 높인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법은 팽화미 100 중량부에 대하여, 당화제 8~12 중량부, 효모 0.3~0.5 중량부, 유산균스타터 0.1~0.2 중량부 및 아르기닌 0.01~0.03 중량부를 준비하는 단계; 상기 당화제 및 효모를 혼합하여 당화 혼합물을 제조하는 단계; 상기 팽화미, 당화 혼합물, 유산균스타터 및 아르기닌을 각각 폴리에틸렌 내포장지에 담아 열접착으로 밀봉하여 각각의 내포장물을 형성하는 단계; 상기 각각의 내포장물을 박스에 담아 포장하는 단계; 를 포함하며, 상기 당화제는 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP를 포함하여, 당화력이 47~65 SP이고, 상기 당화력은 일반적으로 당화력이 360~420 SP인 전통누룩과 1200~1500 SP인 개량누룩과 600~800 SP인 조효소제를 각각 상기 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP로 맞추기 위하여, 상기 당화제 8~12 중량부는 전통누룩 5~6 중량부, 개량누룩 1~2 중량부, 조효소제 2.5~3.5 중량부로 이루어지며, 상기 유산균스타터는 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 이용하여 제조한다.

상기와 같이 제시된 본 발명에 의한 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법은 제공되는 키트를 이용하여 가정에서 누구나 손쉽게 직접 생막걸리를 만들어 마실 수 있으므로, 도수 및 풍미를 취향에 맞게 조절할 수 있고, 인공감미료 및 첨가물이 들어가지 않는 웰빙식품이라는 효과가 있다.

또한 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리는 누룩에서 오르니틴 생성능을 보유하고 있는 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4를 분리 및 동정하여, 이를 막걸리에 첨가함으로써 막걸리의 오르니틴의 함량을 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.

아울러 상기 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4와 함께 오르니틴의 전구물질인 아르기닌을 더 첨가함으로써 막걸리의 오르니틴 함량을 현저히 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.

상기 오르니틴의 함유량이 증진됨에 따라 오르니틴의 효능이 기대되는 막걸리를 주조하여 마실 수 있다. 즉, 오르니틴(L-ornithine)은 식품에 통상적으로 함유 되어있는 아미노산으로 뇌하수체에서 성장호르몬의 분비를 촉진하여 탄수화물, 단백질, 지질의 대사를 활성화시켜 근육 합성과 체내 지방의 대사를 촉진한다. 또한 미국에서 기초대사를 촉진시켜 비만을 예방하는 식품소재로 널리 사용되고 있다. 이외에도 다량영양소의 대사에 관여하는 역할 뿐만 아니라, 인슐린 분비의 증가와 면역반응의 향상에도 관여한다. 다양한 기능성을 가진 오르니틴(L-ornithine)은 ornithine 2-oxoglutarate(alpha-ketoglutarate; OKG)의 형태로 근육증강, 면역증진 및 비만예방 소재로 이용되고 있고, 간장장애를 개선하는 의약품으로는 ornithine-aspartate의 형태로 이용되고 있다. 이러한 오르니틴의 함유량을 증대시켜 막걸리의 영양 기능성을 향상시킬 수 있다는 효과가 있다.

보다 구체적으로 상기 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리는 지방세포의 중성지방축적량을 측정한 결과 막걸리를 처리하지 않은 샘플에 비해 20% 감소한 중성지방축적량을 보여, 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있다는 효과가 있다.

또한 상기 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리는 세포 독성 시험에서 막걸리를 처리하지 않은 세포와 막걸리를 처리한 세포의 유의적 차이가 나타나지 않은바, 세포에 대하여 독성을 나타내지 않는다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법을 나타내는 순서도.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조를 위하여, TLC를 이용한 오르니틴 생성능이 있는 유산균 선별결과.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조를 위하여, 오르니틴 생성능이 있는 유산균의 염기서열 분석결과.
도 4는 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 아르기닌 함유 유무에 따른 막걸리의 오르니틴 함량을 나타내는 그래프(MC : 아르기닌이 함유되지 않은 막걸리, OM : 아르기닌이 함유된 막걸리).
도 5는 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 세포독성시험 결과를 나타내는 그래프(C : control(대조군), 0.0125 ~ 0.8 : 막걸리의 처리 농도).
도 6은 일실시예에 따른 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 지방세포 중성지방축적량에 미치는 영향을 나타내는 그래프(Control: 대조군, OM : 오르니틴 막걸리 처리).

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

본 발명인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법은 팽화미 100 중량부에 대하여, 당화제 8~12 중량부, 효모 0.3~0.5 중량부, 유산균스타터 0.1~0.2 중량부 및 아르기닌 0.01~0.03 중량부를 준비하는 단계; 상기 당화제 및 효모를 혼합하여 당화 혼합물을 제조하는 단계; 상기 팽화미, 당화 혼합물, 유산균스타터 및 아르기닌을 각각 폴리에틸렌 내포장지에 담아 열접착으로 밀봉하여 각각의 내포장물을 형성하는 단계; 상기 각각의 내포장물을 박스에 담아 포장하는 단계; 를 포함한다.

상기 팽화미는 쌀(백미)을 고압상태에서 열을 가하다 급속하게 압력을 제거하여 부피가 팽창한 쌀을 의미하며, 팽창하는 과정에서 쌀알은 다공질이 되며 쌀의 수분을 제거하여 전분이 호화된 상태(a-상태)로 유지되기 때문에 소화가 잘 되며, 별도의 호화 과정 없이 바로 미생물에 의해서 이용될 수 있다.

상기 당화제는 상기 팽화미를 당화시켜 막걸리를 제조하기 위하여 포함되는 구성물로, 전통누룩, 개량누룩 및 조효소제를 포함한다. 이러한 당화제가 8 중량부 미만이면 완성된 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트로 막걸리 제조 시 발효 숙성의 초기에 상기 당화제를 구성하는 누룩의 증식속도가 늦어지므로 발효가 원활히 이루어지지 않게 되어 막걸리의 맛이 저하될 수 있다는 문제점이 있으며, 12 중량부를 초과하면 상기 누룩이 일정 개체수만큼 증식된 후 더 이상 증식되지 못한다는 문제점이 있다.

또한 상기 당화제는 당화력(Saccharogenic power, SP)이 팽화미 1 g에 대하여 47~65 SP인 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 일반적으로 당화력이 360~420 SP인 전통누룩과 1200~1500 SP인 개량누룩과 600~800 SP인 조효소제를 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP로 맞춘다. 이를 맞추기 위하여, 상기 당화제 8~12 중량부에는 전통누룩 5~6 중량부, 개량누룩 1~2 중량부, 조효소제 2.5~3.5 중량부가 포함되는 것이 바람직하다.

이때 상기 당화제의 당화력을 팽화미 1 g에 대하여 47~65 SP로 제공하는 이유는 당화력이 47 SP 미만시 당화력이 낮아지기 때문에 팽화미의 당화가 잘 이루어지지 않으며, 알코올 생성이 늦고, 당도는 낮아지며, 풍미가 저하된다. 또한 당화력이 65 SP 초과시 당화력은 높아지지만 팽화미의 양은 한정되어 있기 때문에, 현저한 당화력의 차이를 보이지 않으므로 투입되는 당화제의 낭비는 물론, 한정된 양의 팽화미를 빠른 시간 내에 당화시키기 때문에 오히려 풍미가 저하된다는 문제점이 있다. 따라서, 47~65 SP가 팽화미를 당화시키기 가장 좋은 당화력의 범위로, 팽화미를 이용한 막걸리에서 가장 좋은 맛을 낼 수 있기 때문이다.

또한 상기 전통누룩, 개량누룩 및 조효소제를 상기와 같은 비율로 구성함으로써, 각각의 당화력에 맞춰 팽화미가 분해되어 술이 되기 좋은 비율로, 막걸리의 맛을 좋게 해주는 적어도 2종류의 누룩 및 조효소제의 배합비율이 된다. 따라서, 막걸리의 풍미를 증진시키고, 오미를 충족시키는 술을 빚을 수 있다는 효과가 있다. 반면, 적어도 2종류의 누룩 및 조효소제의 배합비율이 달라져서 당화력이 달라지게 된다면 관능적 특성이 저하될 수 있다.

상기 효모는 막걸리 제조 시 발효를 돕기 위하여 첨가하는 물질로, 상기 당화제와 마찬가지로 함유량이 상기 조성비의 최소치 미만이거나 최대치를 초과하면 막걸리 제조 시 발효가 원활히 이루어지지 않을 수 있다는 문제점이 있다.

상기 유산균스타터는 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 MRS배지에 23~27℃로 45~50시간 배양한 뒤, 5,000rpm으로 10분간 원심분리하여 수집된 세포를 동결건조하여 제조한다. 이때 상기 유산균스타터가 0.1 중량부 미만이면 오르니틴 생성량이 저하될 수 있고, 0.2 중량부를 초과하면 유산균이 일정 개체수만큼 증신된 후 더 이상 증식되지 못하지 때문에 오르니틴 생성량을 증가시키지는 못한다.

또한 상기 아르기닌은 오르니틴의 전구물질로, 아르기닌을 첨가함으로써 오르니틴의 생성량을 증대시킬 수 있는데, 아르기닌이 0.01 중량부 미만이면 오르니틴 생성량 증대 효과가 저하될 수 있고, 0.03 중량부를 초과하면 아르기닌을 오르니틴으로 전환시키는 유산균의 수는 한정되어 있기 때문에 오르니틴 생성량을 증가시키지는 못한다.

이러한 상기 유산균스타터와 아르기닌을 막걸리 제조에 첨가함으로써 오르니틴의 함유량을 현저히 높일 수 있다는 효과가 있다.

상기 제조가 완료된 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트를 술제조 용기에 집어넣은 후 혼합하고, 상기 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트에 포함되는 팽화미 양의 1.8~2.2배의 양에 해당되는 물, 즉 상기 팽화미 100 중량부에 대하여, 물 180~220 중량부를 붓고 저어준 뒤, 24~26℃의 온도 조건에서 72~96시간 발효시키면 막걸리의 제조가 완료된다. 이때 상기 물의 양에 따라 막걸리의 도수(알코올 함량)을 조절할 수 있고, 팽화미는 누룩과 효모에 의해서 당화와 발효가 진행되어 걸쭉한 죽과 같은 형태로 변화하게 된다.

본 발명인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트를 이용하면 상기와 같이 간단한 제조방법으로 막걸리의 제조가 가능하여, 가정에서 누구나 손쉽게 직접 생막걸리를 만들어 마실 수 있음은 물론, 세계 어디서나 생막걸리를 맛볼 수 있다는 효과가 있다.

또한 막걸리를 직접 만듦으로써, 도수 및 풍미를 취향에 맞게 조절할 수 있고, 인공감미료 및 첨가물이 들어가지 않는다는 효과가 있다.

또한 기능성 물질인 오르니틴 생성능을 가진 유산균을 첨가하여 막걸리 제조 시 발효가 진행되면서 오르니틴의 함유량을 막걸리에서 현저히 높일 수 있다는 효과가 있다.

< 실시예 1> 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트를 이용한 오르니틴 막걸리의 제조

팽화미 100 중량부에 대하여, 당화제 9.6 중량부, 효모 0.4 중량부, 유산균스타터 0.1 중량부 및 아르기닌 0.02 중량부를 준비하고, 상기 당화제 및 효모를 혼합하여 당화 혼합물을 제조한 뒤, 상기 팽화미, 당화 혼합물, 유산균스타터 및 아르기닌을 각각 폴리에틸렌 내포장지에 담아 열접착으로 밀봉하여 각각의 내포장물을 형성하고, 상기 각각의 내포장물을 박스에 담아 포장하여 막걸리 키트의 제조를 완료한다.

이때 상기 당화제는 전통누룩, 개량누룩, 조효소제를 포함하되, 전통누룩 5.4 중량부, 개량누룩 1.2 중량부, 조효소제 3 중량부로 구성하여, 팽화미 1g에 대하여 당화력이 47~65 SP의 범위 내인 54 SP로 제조하였다.

또한 상기 유산균스타터는 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 MRS배지 10L에 25℃로 48시간 배양한 뒤, 5,000rpm으로 10분간 원심분리하여 수집된 세포를 동결건조하여 제조하였다.

상기 제조가 완료된 막걸리 키트를 술제조 용기에 집어넣은 후 혼합하며, 상기 팽화미 100 중량부에 대하여 물 200 중량부를 붓고 저어준 뒤, 입구를 통기가 되도록 천 종류로 막아 햇빛이 들지 않는 응달에서 25℃의 온도로 72시간 발효시켜 막걸리를 제조하였다.

이하 모든 실험결과는 평균과 표준편차로 나타내었고, SPSS 12.0 package program(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 one-way AVOVA(analysis of variance)로 유의성 검정을 하고 P<0.05 수준에서 Duncan’multiple range test를 통해 각 군간의 차이를 검증하였다. 또한 두 그룹간의 비교에 대한 데이터는 Indipendent t-tests를 실시하여 분석하였다(P<0.05).

< 실험예 1> 누룩 유래 ornithine 생성능 보유 유산균 Pediococcus 속 균주 분리 및 동정

유산균의 분리는 100 mL MRS에 누룩을 1% 첨가한 뒤 25℃에서 48시간 배양 후 배양액을 1% 펩톤수로 10^-1~10^-8 범위로 희석하였고, 희석액을 0.1 mL씩 분주하여 DE MAN, ROGOSA, and SHARPE(MRS)(Difco, USA) 고체 배지에 배양하였다. 배지에는 0.002% bromophenol blue(BCP, Sigma, USA)가 첨가되었고, 콜로니를 얻기 위해 25℃에서 48시간 동안 배양하였다. 콜로니 중에서 환을 형성하지 않으면서 진한 노랑색을 띄는 것을 Pediococcus속 후보군으로 분리하였다. 이어 ornithine 생성능 시험을 위하여 분리된 유산균을 1% arginine이 첨가된 MRS 배지에 배양(25℃, 48 h)하여 TLC를 이용하여 유산균의 ornithine 생성능을 조사하였다. TLC는 silica gel F₂₅₄(Merck, Dam-stadt, Germany)과 표준 ornithine(Merck, Dam-stadt, Germany), 이동상(butanol:acetic acid:dichoromethanol:water = 5:3:3:3)을 이용하여 실시하였다.

Ornithine 생성능이 있는 누룩 유산균주 동정은 16S rDNA sequence 분석으로 하여 동정하였다. 균주 동정을 위해 후보 균주로부터 genomic DNA를 DNeasy Blood＆Tissue kit(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하였고, DNA의 정제는 제조사의 지침을 따라 추출하였다. 16S rDNA의 클로닝을 위해 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(Forward), 5'-ACGGGCGGGTGTGTRC-3' (Reverse)의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 증폭은 100 ng 주형 DNA, 0.5 μM의 프라이머 DNA, 0.2 mM dNTPs, 10×Ex Taq 완충액 및 Taq 중합효소 0.025 U/μL을 사용하여 95℃에서 30초 변성, 55℃에서 30초의 annealing, 72℃에서 1분 30초의 신장으로 하는 35cycle을 Biometra thermocycler로 증폭시켰다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 확인하였다. 16S rDNA sequencing 통해 염기서열 정보를 얻었다. 얻어진 16S rDNA의 서열정보를 이용하여 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 DNA의 상동성 조사에 활용하여 분석하였다.

누룩으로부터 분리한 유산균주의 ornithine 생성 가능성은 TLC를 이용하여 조사 하였다. TLC를 통한 ornithine 후보 균주 17개 중 9개를 선별하여 Arginine 전환이 우수한 균주를 2차 선별하여 염기서열 분석을 하고 가장 우수한 TNO-4를 선정하였다(도 2 및 도 3).

< 실험예2 > Ornithine 막걸리 함량 분석

Ornithine 추출은 Baum 등이 사용한 아미노산 분석방법을 변형하여 추출하였다. 간략하게 800 μL의 용매(methanol:chloroform:water = 12:5:3)를 200±10 mg 시료에 가하여 혼합 하였다. 혼합액을 원심분리(13,000×g, 4℃, 15min)하여 수용액 층인 상등액을 1차 회수 하였고, 유기용매층에 클로로포름과 물(1:2) 혼합액 600 μL를 가하여 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 2차 회수하였다. 1, 2차 회수한 상등액을 합하여 동결건조 하였고, 초순수로 용해하여 0.45 μm PVDF 막을 통과시켜 TLC 및 HPLC를 이용하여 ornithine 함유량을 비교하였다.

Ornithine 생성 유산균인 Pediococcus pentodsaceus TNO-4을 이용하여 제조한 막걸리의 ornithine 함량을 측정하였다. Arginine 무첨가 막걸리에서는 44.76 mg/100g 이였으며 arginine 첨가 막걸리 함량은 127.25 mg/100g 으로 arginine 첨가에 따른 ornithine 함량이 3배 증가 되는 것을 확인 할 수 있었다(도 4). Ornithine 생성 유산균인 Pediococcus pentodsaceus TNO-4는 arginase 또는 arginine deiminase를 이용하여 ornithine의 전구물질인 arginine을 전환시켜 ornithine을 생성하는 것으로 판단된다.

< 실험예 3> 세포 독성 시험

마우스 배아에서 유래한 3T3-L1 세포주(American Type Culture Collection;ATCC, Manassas, VA, USA)를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 10% bovine serum(BS, Gibco, Grand Island, New York, USA)과 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지로 배양하였다. 3T3-L1 preadipocyte는 신선한배지로 2일마다 교환하였으며, 80~90% confluent하게 되면 1 mM trypsin-EDTA(hyclone)를 처리하여 계대배양 하였다.

본 실험에서 개발한 ornithine 막걸리가 3T3-L1 preadipocyte에 독성을 나타내는지 알아보기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 96-well culture plate에 2.5×10³ cell/well을 분주하여 24시간 동안 부착 시킨 후 시료는 농도 별로 처리하여 24, 48시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 시간별로 EZ-Cytox(Daeil lab service)시약이 포함된 배지로 교체하여 2시간동안 반응시킨 후 microplate reader(MRX Ⅱ, Dynex Techologies, Chantilly, VA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포의 증식율(%)은 시료처리군 흡광도/control군 흡광도의 평균 ×100으로 계산하였다.

MTT assay는 지방세포 분화 전 지방전구세포의 세포증식 활동을 측정하는 실험이다. 시료를 처리하지 않은 control의 초기 성장률(100%) 대비 다양한 농도의 시료 처리 후 24시간과 48시간의 세포성장률의 측정 결과는 도 5에 나타내었다. ornithine 막걸리의 처리 농도와 배양시간에 따라 유의차이가 없는 것을 확인할 수 있는데, 이는 ornithine 막걸리의 처리가 preadipocytes의 세포사멸에 관여하지 않고 독성을 나타내지 않았다고 해석할 수 있다. 이는 분화억제를 위한 시료 처리 시 참고하였던 Lee 등의 지방전구세포의 결과와 일치한다.

< 실험예 4> 지방세포의 중성지방축적량 ( Triglyceride 함량 측정과 Oil Red O 염색)

3T3-L1 preadipocyte를 6-well culture plate에서 100% confluence 상태가 될 때까지 배양하고 2일 후 분화배지[MDI solution(0.5mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone, 10 μg/mL insulin]를 3일동안 처리하였고 다시 10% FBS와 insulin(10 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 배양하여 지방세포로 분화시켰다. Ornithine 막걸리샘플은 0.05 mg/mL의 농도로 분화과정의 각 단계마다 처리하였다. 분화가 완료된 3T3-L1 세포를 PBS로 2회 세척하고 5% triton-X100으로 homogenize한 후 heating과 cooling을 2회 반복하여 원심분리하고 상등액을 취한 뒤 10배 희석하였다. Triglyceride quantification kit(Biovision Inc., Mountain View, CA, USA)의 protocol에 따라 지방구 생성량을 측정하였다. 결과는 대조군(adipocyte control) 대비 중성지방 축적율(%)로 나타내었으며, 시료처리군 TG량/adipocyte 대조군 TG량의 평균 ×100으로 계산하였다. Oil Red O 염색을 위해서 10% formalin으로 고정한 세포에 Oil Red O solution을 처리한 후 실온에서 30분간 염색하였다. 그 이후에 Oil Red O solution을 제거하고 증류수로 세척하여 건조시킨 후 현미경 관찰 하였다.

전구지방세포에 MDI(IBMX, dexamethasone, insulin)와 같은 분화유도물질을 처리하여 호르몬과 영양을 과잉 공급하여 지방세포로의 분화를 유도한다. 지방세포 크기는 한계가 있기 때문에, 과잉의 영양공급 시, 에너지의 신속한 저장을 위하여 지방세포수의 증가가 일어나며 지방이 축적 된다. 지방세포 분화 유도 시 ornithine 막걸리 0.05 mg/mL의 농도를 처리하여 중성지방 농도를 측정함으로써 지방세포 분화에서의 영향을 평가하였다. 분화 시 처리되었던 농도는 시중 막걸리에서 10~50% 중성지방축적 저해 효과를 보였던 농도를 따라 설정하였다. 도 6과 같이 ornithine 막걸리 처리 시 샘플을 처리하지 않은 대조군에 비해 중성지방축적량이 유의적으로 감소하였고, 약 20%의 지방구 형성 감소를 나타냈다. 이는 상기의 시판 막걸리의 전구지방 세포 분화 억제 효과와 일치하는 결과를 나타냈다. 지방세포의 수의 증가와 지방의 과잉축적은 비만의 원인이 된다. 따라서 지방세포의 분화정도 뿐만 아니라, 세포 안의 지방축적을 억제하는 것은 지질대사 개선과 항비만 효과에 일조한다. 따라서 세포수준에서 중성지방 축적 억제 효과가 있는 ornithine 막걸리의 지질수준개선의 가능성을 시사 하는 결과로 사료된다.

이로써 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리는 누룩에서 오르니틴 생성능을 보유하고 있는 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4를 분리 및 동정하여, 이를 막걸리에 첨가함으로써 막걸리의 오르니틴의 함량을 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.

또한 상기 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4와 함께 오르니틴의 전구물질인 아르기닌을 더 첨가함으로써 막걸리의 오르니틴 함량을 현저히 증진시킬 수 있다는 효과가 있다.

아울러 상기 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리는 지방세포의 중성지방축적량을 측정한 결과 막걸리를 처리하지 않은 샘플에 비해 20% 감소한 중성지방축적량을 보여, 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있다는 효과가 있다.

Claims

팽화미 100 중량부에 대하여, 당화제 8~12 중량부, 효모 0.3~0.5 중량부, 유산균스타터 0.1~0.2 중량부 및 아르기닌 0.01~0.03 중량부를 준비하는 단계;

상기 당화제 및 효모를 혼합하여 당화 혼합물을 제조하는 단계;

상기 팽화미, 당화 혼합물, 유산균스타터 및 아르기닌을 각각 폴리에틸렌 내포장지에 담아 열접착으로 밀봉하여 각각의 내포장물을 형성하는 단계;

상기 각각의 내포장물을 박스에 담아 포장하는 단계; 를 포함하며,

상기 당화제는 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP를 포함하여, 당화력이 47~65 SP이고,

상기 당화력은 일반적으로 당화력이 360~420 SP인 전통누룩과 1200~1500 SP인 개량누룩과 600~800 SP인 조효소제를 각각 상기 팽화미 1 g에 대하여, 전통누룩 18~24 SP, 개량누룩 11~17 SP, 조효소제 18~24 SP로 맞추기 위하여, 상기 당화제 8~12 중량부는 전통누룩 5~6 중량부, 개량누룩 1~2 중량부, 조효소제 2.5~3.5 중량부로 이루어지며,

상기 유산균스타터는 누룩으로부터 분리하여 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4(Pediococcus pentosaceus TNO-4)를 이용하여 제조하고,

상기 유산균스타터는 오르니틴 생성능을 지닌 페디오코커스 펜토사세우스 TNO-4를 MRS배지에 23~27℃로 45~50시간 배양한 뒤, 5,000rpm으로 10분간 원심분리하여 수집된 세포를 동결건조하여 제조하는 것을 특징으로 하며,

1%의 아르기닌을 첨가함으로써 오르니틴 함량이 아르기닌 첨가 전 보다 3배 증가되어 중성지방 축적 억제 및 비만을 예방할 수 있는 오르니틴의 함류량을 현저히 높인 오르니틴 생성능을 지닌 유산균을 포함한 막걸리 키트의 제조방법.
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