KR101779030B1 - Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof - Google Patents
Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR101779030B1 KR101779030B1 KR1020160121342A KR20160121342A KR101779030B1 KR 101779030 B1 KR101779030 B1 KR 101779030B1 KR 1020160121342 A KR1020160121342 A KR 1020160121342A KR 20160121342 A KR20160121342 A KR 20160121342A KR 101779030 B1 KR101779030 B1 KR 101779030B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- zinc content
- base
- rice
- wild type
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/101—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties radioactivity, e.g. radioactive labels
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/125—Electrophoretic separation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분자마커를 벼 작물에 적용하면, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 벼 작물을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 벼 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 벼 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.The present invention relates to a molecular marker for selecting a plant having an increased zinc content and a use thereof. When a molecular marker according to the present invention is applied to a rice plant, the rice plant with increased zinc content, And it is expected to be very useful for reducing the time, cost and effort required for breeding. In addition, the spread of rice cultivars cultivated by the method of the present invention is expected to enable production and supply of high quality rice to farmers and consumers.
Description
본 발명은 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물, 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이, 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a molecular marker for screening a plant having an increased zinc content and a use thereof. More particularly, the present invention relates to a method for screening a plant having a wild-type GW2 gene comprising the deleted GW2 gene at position 316 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: An oligonucleotide composed of at least 8 consecutive nucleotides including a 315th base and a 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, or a complementary oligonucleotide thereof, A kit for screening plants having increased zinc content compared to a wild type comprising a primer set for selecting a plant, a probe and a microarray, a set of the primer and a reagent for carrying out an amplification reaction, wherein the zinc content is increased compared to the wild type, Plants with increased zinc content compared to wild type using sets It relates to a method for screening.
작물 개량을 위해 분자유전학을 이용하는 목표 중의 하나는 필요한 유용유전자의 탐색, 특성 규명, 분리 및 이용을 통해 우수한 신품종을 육성하는 것이다. 지난 10여 년 동안 작물의 게놈(genome) 연구를 위한 다양한 기술이 개발되었는데, 이 중 DNA 표지인자를 이용한 기술은 전통적인 육종 방법으로 해결하기 힘든 여러 문제들에 대한 해법을 제시해 주고 있으며, 대표적인 것들로 양적형질 유전자좌(QTL: quantitative trait locus)의 분석과 야생종 등의 유전자원에서 유용유전자의 탐색 및 이용 등을 들 수 있다.One of the goals of using molecular genetics for crop improvement is to foster an excellent new variety by searching, characterizing, isolating and exploiting the necessary useful genes. Over the past decade, a variety of techniques have been developed for the genome research of crops. Among them, DNA marker technology provides a solution to many problems that can not be solved by traditional breeding methods. Analysis of quantitative trait locus (QTL) and search and use of useful genes in wild genomes.
식물 게놈 분석 기술의 진보로 양적형질 유전자좌에 관여하는 유전적 변이의 연구가 가능해졌으며, 목표유전자의 이전 및 선발에 MAS(marker-assisted selection)가 효율적으로 이용될 수 있게 되었는데, 특히 양적형질 유전자좌 (QTLs: quantitative trait loci) 분석은 분자표지인자를 이용하고 측정이 가능한 형질에 관여하는 염색체의 특정 부분을 확인함으로써, 특정 환경에서 수량성, 과실 무게, 출수기 등 주요 형질에 관여하는 유전자의 수 및 염색체 위치, 개개 유전자의 영향력, 상위작용, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.The progress of plant genome analysis technology has enabled the study of genetic mutations involved in quantitative trait loci and has enabled the efficient use of marker-assisted selection (MAS) in the transfer and selection of target genes, Quantitative trait loci analysis (QTLs) uses molecular markers and identifies specific parts of chromosomes that are involved in measurable traits so that the number of genes involved in major traits such as yield, fruit weight, heading, and chromosomes You can get general and direct information about the genetic background of major agricultural traits such as location, influence of individual genes, interaction, interactions between quantitative trait loci and environment, and interactions between quantitative trait loci and genetic background .
야생벼는 작물의 수량성뿐만 아니라 병해충저항성, 스트레스 저항성 및 이와 관련된 형질들의 개선을 위한 유용 유전자들의 중요한 공급원이다. 야생 유용유전자를 탐색하여 이들을 재배종에 도입하고 마커를 이용하여 선발하는(marker-assisted selection) 일련의 기술은 수량성, 각종 저항성 등을 개선하는데 있어서 효과적인 수단으로 알려져 있다. 현재, 전 세계적으로 유전자은행에 보관중인 많은 양의 유전자들이 수량 및 기타 유용한 형질들에 관여하는 새로운 유전자들을 탐색하는데 있어서 기초 연구 자료로 광범위하게 활용되고 있다.Wild rice is an important source of useful genes for improving crop yield, pest resistance, stress resistance and related traits. A range of marker-assisted selection techniques have been found to be effective tools for improving yield, resistance, etc., by exploring wildly useful genes, introducing them into cultivars, and selecting them using markers. Currently, large numbers of genes stored in gene banks around the world are widely used as basic research data in the search for new genes involved in yield and other useful traits.
한편, 한국등록특허 제1255336호에는 미량 원소 함량이 증가된 벼 품종 및 이를 이용한 기능성 식품에 대해 개시하고 있으며, 일본공개특허 제2011-131023호에는 벼의 철 등의 금속 착체 흡수 또는 수송에 관여하는 트랜스포터 및 그 유전자에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 아직 언급된 바가 없다.On the other hand, Korean Patent No. 1255336 discloses rice varieties with increased trace element content and functional foods using the same, and Japanese Patent Laid-Open No. 2011-131023 discloses rice varieties having an increased content of trace elements and which are involved in the absorption or transport of metal complexes such as iron Transporters and their genes. However, the molecular markers for selecting plants with increased zinc content of the present invention and their uses have not yet been mentioned.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 종자 무게를 조절한다고 알려진 GW2 유전자가 아연 함량조절에도 관여한다는 것을 확인하였다. 따라서, GW2 유전자 분석을 통해 GW2 유전자의 염기서열 중에 316번째 염기가 결손(Deletion)되어 야생형(wild type)에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 용이하게 선별할 수 있는 분자마커를 개발하여 제공함으로써, 본 발명을 완성하였다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and the present inventors have found that GW2 It was also confirmed that the gene is also involved in zinc content regulation. Therefore, GW2 By analyzing the gene, a 316th base in the base sequence of the GW2 gene is deleted and a molecular marker capable of easily selecting a plant having increased zinc content compared to the wild type has been developed and provided, Completed.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a molecular marker composition for selecting a plant having an increased zinc content as compared to a wild type, wherein the 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 contains a deleted GW2 gene.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트, 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing an oligonucleotide comprising an oligonucleotide consisting of 8 or more consecutive nucleotides comprising the 315st base and the 316st base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary oligonucleotide thereof, A primer set for selecting a plant, a probe, and a microarray.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for selecting a plant having increased zinc content as compared to a wild type, comprising the primer set and a reagent for carrying out an amplification reaction.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening plants having increased zinc content compared to wild type using the primer set.
본 발명에 따른 분자마커를 벼 작물에 적용하면, 야생형(wild type)에 비해 아연 함량이 증가된 벼 작물을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 벼 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 벼 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.When the molecular markers according to the present invention are applied to rice crops, it is possible to efficiently select and cultivate rice crops having an increased zinc content compared to the wild type, so that it is very useful for reducing the time, cost and effort required for breeding It is expected to do. In addition, the spread of rice cultivars cultivated by the method of the present invention is expected to enable production and supply of high quality rice to farmers and consumers.
도 1은 HG101의 양적형질 유전자좌(QTL)를 분석한 결과(A)이며, 화성벼(Hwaseong)와 HG101의 종자 크기를 비교한 결과(B)이다. HG101은 화성벼의 유전적 배경에 야생벼(Oryza grandiglumis)의 염색체가 부분적으로 이전된 근동질계통(near-isogenic lines, NILs)을 나타낸 것이다.
도 2는 화성벼(Hwaseong)와 HG101에서 현미 및 왕겨의 아연 함량(A)과 종자크기(B)를 비교한 결과이다.
도 3은 11개의 벼 품종에서 현미의 아연 함량을 비교한 결과이다.FIG. 1 is a result (A) of the quantitative trait locus (QTL) of HG101, and is a result (B) of seed size comparison between Hwaseong and HG101. HG101 represents near-isogenic lines (NILs) in which the chromosomes of wild rice ( Oryza grandiglumis ) are partially transferred to the genetic background of the rice flour .
FIG. 2 shows the results of comparing the zinc content (A) and the seed size (B) of brown rice and rice hull in Hwaseong and HG101.
Figure 3 shows the zinc content of brown rice in 11 rice varieties.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 분자마커 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for detecting a deletion of GW2 Wherein the zinc content is increased as compared to the wild type.
본 발명에서 상기 서열번호 1은 야생형(wild type)인 GW2 유전자의 염기서열을 나타내며, 상기 316번째 염기는 A(adenine)을 나타내는 것이다.In the present invention, SEQ ID NO: 1 represents the nucleotide sequence of the wild type GW2 gene, and the 316th nucleotide represents A (adenine).
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트를 제공한다.Further, the present invention provides a method for producing a wild-type (preferably, homologous) oligonucleotide comprising an oligonucleotide composed of 8 or more consecutive nucleotides including the 315th base (A) and the 316th base (C) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary oligonucleotide thereof The present invention provides a primer set for screening plants having increased zinc content.
본 발명의 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째인 A(adenine)가 결손(Deletion)된 GW2 유전자의 염기서열로서 서열번호 1의 염기서열 중 315번째 염기가 A(adenine)이고, 316번째 염기인 A(adenine)가 결손되었으며, 317번째 염기가 C(cytosine)인 염기서열을 나타내는 것이다. 따라서, 서열번호 2의 염기서열에서 315번째 염기는 A이고 316번째 염기는 C이다.The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 of the present invention is GW2 (deleted) in which the A (adenine) at position 316 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is deleted As a nucleotide sequence of the gene, the 315th base is A (adenine), the 316th base is A (adenine) is missing, and the 317th base is C (cytosine). Therefore, the 315th base is A and the 316th base is C in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자를 포함하는 식물은 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물이므로, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기 결손 여부를 검출할 수 있는 프라이머 세트이어야 한다. 따라서, 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손(Deletion)된 GW2 유전자는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손됨으로 인해 315번째 염기와 317번째 염기가 인접하게 되며, 상기 프라이머 세트는 인접된 315번째 염기와 317번째 염기, 즉 서열번호 2의 315번째 염기(A)와 316번째 염기(C)를 포함하는 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 세트이어야 한다. 이러한 프라이머는 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하여 증폭 산물이 생성되면 식물 시료는 아연 함량이 야생형에 비해 증가된 시료인 것이며, 증폭 산물이 생성되지 않으면 아연 함량이 증가되지 않은 야생형으로 판별할 수 있는 것이다. 즉, 야생형은 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손되지 않고 남아 있어 프라이머 어닐링이 되지 않아 본 발명의 프라이머 세트로는 증폭 산물이 생성되지 않는 것이다.The 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is the deleted GW2 Since the plant containing the gene is a plant having an increased zinc content compared to the wild type, the plant selection screening primer set for increasing the zinc content compared to the wild type is a primer set capable of detecting the 316th base defect in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: . Therefore, when the 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is deleted, GW2 The 315th base and the 317th base are adjacent to each other due to the deletion of the 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the primer set includes the adjacent 315th base and 317th base, that is, the 315th base of SEQ ID NO: (A) and the 316th base (C). Such a primer may comprise an oligonucleotide composed of 8 or more consecutive nucleotides comprising the 315th base (A) and the 316th base (C) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary oligonucleotide thereof. When the amplified product is generated by amplifying the target sequence using the primer set, the plant sample is a sample whose zinc content is increased compared to that of the wild type, and if the amplification product is not produced, it can be discriminated as a wild type in which the zinc content is not increased . That is, in the wild type, the 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 remains unremoved and does not undergo primer annealing, so that no amplification product is generated with the primer set of the present invention.
본 발명에서 상기 올리고뉴클레오티드는 8개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15개 내지 50개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 15개 내지 30개의 뉴클레오티드, 더 더 바람직하게는 15개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the oligonucleotide may be composed of at least 8 nucleotides, preferably 15 to 50 nucleotides, more preferably 15 to 30 nucleotides, even more preferably 15 to 20 nucleotides , But is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term "nucleotide" is a deoxyribonucleotide or ribonucleotide present in single-stranded or double-stranded form and includes analogs of natural nucleotides unless specifically stated otherwise (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews, 90: 543-584 (1990)).
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. In the present invention, a "primer" refers to a single strand oligonucleotide sequence complementary to a nucleic acid strand to be copied, and may serve as a starting point for synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primer should allow the synthesis of the extension product to begin. The specific length and sequence of the primer will depend on the primer usage conditions such as temperature and ionic strength, as well as the complexity of the desired DNA or RNA target.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.In the present invention, the oligonucleotide used as a primer may also include a nucleotide analogue such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate, or peptide nucleic acid, or And may include an intercalating agent. In addition, primers can incorporate additional features that do not alter the primer properties of primers that serve as a starting point for DNA synthesis. The primer nucleic acid sequence of the present invention may, if necessary, comprise a label that is detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g. horse radish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g. biotin) ). The appropriate length of the primer is determined by the characteristics of the primer to be used, but is usually 15 to 30 bp in length. The primer need not be exactly complementary to the sequence of the template, but should be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 프로브를 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing an oligonucleotide comprising an oligonucleotide consisting of 8 or more consecutive nucleotides comprising the 315st base and the 316st base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary oligonucleotide thereof, A probe for screening a plant is provided.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "probe" in the present invention refers to a hybridization probe, which means a linear oligomer having a natural or modified monomer or linkage comprising a deoxyribonucleotide and a ribonucleotide capable of sequence-specific binding to the complementary strand of the nucleic acid. The probe of the present invention is an allele-specific probe in which a polymorphic site exists in a nucleic acid fragment derived from two members of the same species and hybridizes to a DNA fragment derived from one member but does not hybridize to a fragment derived from another member . Preferably, the probe may be a single strand, more preferably a deoxyribonucleotide, but is not limited to, for maximum efficiency in hybridization.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기 및 316번째 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 마이크로어레이를 제공한다.In addition, the present invention relates to a method for producing an oligonucleotide comprising an oligonucleotide consisting of 8 or more consecutive nucleotides comprising the 315st base and the 316st base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a complementary oligonucleotide thereof, A microarray for plant selection is provided.
본 발명에서 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체 선별용 마이크로어레이는 본 발명의 분자마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 올리고뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.In the present invention, a plant selection microarray having an increased zinc content as compared to a wild-type microarray means a microarray having a substrate on which the molecular markers of the present invention are immobilized. The term "microarray" refers to a group of oligonucleotides immobilized on a substrate at a high density. The oligonucleotide groups are immobilized in a predetermined region. Such microarrays are well known in the art. Microarrays are described, for example, in U.S. Patent Nos. 5,445,934 and 5,744,305, the contents of which are incorporated herein by reference.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.The term "substrate" refers to any substrate that has hybridization properties and to which the marker can be attached under conditions where the background level of hybridization is kept low. Typically, the substrate may be a microtiter plate, a membrane (e.g., nylon or nitrocellulose), a microsphere (bead), or a chip. Prior to application or immobilization to the membrane, nucleic acid probes can be modified to promote immobilization or improve hybridization efficiency. Such modifications may include homopolymer tailings, coupling with aliphatic groups, different reactive functional groups such as NH2, SH and carboxyl groups, or coupling with biotin, hapten, or proteins.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 키트는 상기 프로브 또는 상기 마이크로어레이가 포함된 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, the present invention provides a kit for selecting a plant having increased zinc content as compared to a wild type, comprising the primer set and a reagent for carrying out an amplification reaction. The reagents for carrying out the amplification reaction may include, but are not limited to, DNA polymerases, dNTPs, and buffers. The dNTPs include dATP, dCTP, dGTP and dTTP. The DNA polymerase can be a commercially available polymerase such as Taq DNA polymerase and Tth DNA polymerase as a heat-resistant DNA polymerase. In addition, the kit of the present invention may further include a user's manual describing optimal reaction performing conditions. Also, in the present invention, the kit for selecting plants having increased zinc content compared to the wild type may be a kit including the probe or the microarray, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;The present invention also relates to a method for isolating genomic DNA from a rice sample,
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set; And
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 식물체를 선별하기 위한 방법을 제공한다.And detecting the amplification product. The present invention provides a method for screening a plant having increased zinc content compared to a wild-type plant.
본 발명의 방법에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열 중 316번째 염기가 결손된 서열에 특이적인 프라이머 세트이므로, 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭하여 증폭 산물이 생성되면 벼 시료는 아연 함량이 야생형에 비해 증가된 시료인 것이며, 증폭 산물이 생성되지 않으면 아연 함량이 증가되지 않은 야생형으로 판별할 수 있는 것이다.In the method of the present invention, since the primer set is a primer set specific to the sequence lacking the 316th base in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, when the amplified product is generated by amplifying the target sequence using the primer set, The zinc content is an increased sample compared to the wild type, and if the amplification product is not produced, it can be discriminated as a wild type without increased zinc content.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA의 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법, CTAB 분리법 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다. The method of the present invention comprises isolating genomic DNA from a rice sample. The genomic DNA may be extracted from the sample using phenol / chloroform extraction method, SDS extraction method, CTAB isolation method, or commercially available DNA extraction kit, which are conventionally used in the art.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 증폭 산물이 서열번호 2의 염기서열 중 315번째 염기(A) 및 316번째 염기(C)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.In the method according to one embodiment of the present invention, the amplification product may include, but is not limited to, the 315th base (A) and the 316th base (C) in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. The target sequence can be amplified by performing amplification reaction using the separated genomic DNA as a template and using the primer set of the present invention as a primer. Methods for amplifying a target nucleic acid include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, Strand displacement amplification or amplification with Q [beta] replicase, or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among them, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a pair of primers that specifically bind to a target nucleic acid using a polymerase. Such PCR methods are well known in the art, and commercially available kits may be used.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.In the method of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. In one embodiment, the labeling material can be, but is not limited to, a fluorescent, phosphorescent or radioactive substance. When the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution, the amplification product may be synthesized and the radioactive substance may be incorporated into the amplification product and the amplification product may be labeled as radioactive. The set of one or more oligonucleotide primers used to amplify the target sequence is as described above.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 서열분석, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 서열분석 방법은 Sanger 방법, 마이크로 전기영동 서열분석, 파이로 서열분석, 나노 포어 단일 DNA 서열분석 등을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.The method of the present invention comprises detecting said amplification product. The detection of the amplification product can be performed by DNA chip, gel electrophoresis, sequencing, radioactivity measurement, fluorescence measurement or phosphorescence measurement, but is not limited thereto. As one method of detecting the amplification product, gel electrophoresis can be performed. Gel electrophoresis can be performed using agarose gel electrophoresis or acrylamide gel electrophoresis depending on the size of the amplification product. In addition, the sequence analysis method can be a Sanger method, micro electrophoresis analysis, pyrosequencing, and nanopore single DNA sequence analysis. Also, in the fluorescence measurement method, Cy-5 or Cy-3 is labeled at the 5'-end of the primer. When PCR is carried out, the target is labeled with a fluorescent label capable of detecting the target sequence. The labeled fluorescence is measured using a fluorescence meter can do. In addition, in the case of performing the PCR, the radioactive isotope such as 32 P or 35 S is added to the PCR reaction solution to mark the amplification product, and then a radioactive measurement device such as a Geiger counter or liquid scintillation counter The radioactivity can be measured using a liquid scintillation counter.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are merely illustrative of the present invention and that the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1. One. 양적형질Quantitative trait 유전자좌Locus (( QTLQTL , , quantitativequantitative traittrait lociloci ) 분석) analysis
화성벼를 자방친, 야생벼(Oryza grandiglumis , CCDD 게놈, IRGC Acc. no. 101154)를 화분친으로 하여 생산된 F1에 화성벼를 반복친으로 여교잡하여 BC5F1 후대를 작성하였으며, 이들을 자식시킨 후 표현형적으로 고정된 한 계통을 선정하여 HG101이라 명명하였다. HG101은 화성벼의 유전적 배경에 야생벼(Oryza grandiglumis)의 염색체가 부분적으로 이전된 근동질계통(near-isogenic lines, NILs)으로 종자중 등 작물학적 특성에서 화성벼와 차이를 보였다. HG101로 이전된 특정 염색체 단편이 어느 형질에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 화성벼/HG101 간 교잡을 실시하여 150개의 F2:3 계통을 육성하였다. 150개 계통과 양친을 난괴법 2반복으로 포장에 공시하여 출수기 등 주요 특성을 조사하고, 야생벼(Oryza grandiglumis)의 특이적 밴드와 형질 간의 관련성을 알아보기 위해 유전자지도를 작성하고 QTL 분석을 실시하였다. 그 결과, 염색체 2번의 마커 RM290 지역에서 종자중(tgw2) 종자폭(gw2) 및 종자두께(gt2)에 관여하는 QTL이 탐지되었다(도 1A). 또한, 도 1B에 개시된 바와 같이 화성벼(Hwaseong)와 HG101의 종자 크기가 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.Wild rice, wild rice ( Oryza grandiglumis , CCDD genome, IRGC Acc. no. 101 154) were right backcrossing the progeny BC5F1 repeatedly hitting hwaseongbyeo the F 1 produced by the pollen parent, was named HG101 by selecting a system fixed to the phenotypic After these children. HG101 showed near-isogenic lines (NILs) in which the chromosome of wild rice ( Oryza grandiglumis ) was partially transferred to the genetic background of the rice seedlings. In order to investigate the effect of specific chromosomal fragments transferred to HG101 on one trait, 150 F2: 3 lines were cultivated by crossing between HG101 / HG101. 150 strains and their parents were reported to the pavement in 2 repetitions and genetic maps were made and QTL analysis was conducted to investigate the major characteristics such as heading date and the relationship between specific bands and traits of wild rice ( Oryza grandiglumis ). Respectively. As a result, QTLs related to the seed width (gw2) and the seed thickness (gt2) of seeds (tgw2) were detected in the marker RM290 region of chromosome 2 (FIG. 1A). Also, as shown in FIG. 1B, it was confirmed that the seed sizes of Hwaseong and HG101 were different from each other.
실시예Example 2. 2. GW2GW2 유전자의 염기서열 분석 및 아연 함량 조절 확인 Sequence analysis of genes and confirmation of zinc content regulation
상기 실시예 1에서 QTL로 탐지된 종자중에 관여하는 GW2 유전자의 특징은 중국 연구자들에 의해 보고되었다. GW2의 모본인 FAZ1 대립유전자의 게놈 및 cDNA의 서열비교를 통해, 8개 엑손(exon) 및 7개 인트론(intron)을 확인하였으며, FAZ1 GW2 대립유전자는 약 47kDa의 425개의 폴리펩티드를 코딩할 것으로 예상하였다. GW2의 FAZ1 및 종자중이 큰 벼 품종인 WY3 대립유전자의 염기서열 비교를 통해, 엑손 1 및 8에서 아미노산 변이를 일으키지 않는 2개의 염기 치환(substitution)과 WY3 대립유전자의 엑손 4에서 조기중지코돈(premature stop codon)을 야기하는 1bp 결손(deletion)을 확인하였다. 상기 조기중지코돈은 310개 아미노산 잔기의 절단(truncation)을 유도하였으며, 잔여 단백질은 13kDa의 115개의 폴리펩티드로 구성되었다(Song et al. 2007. Nature Genetics 39(5) A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase).In the seeds detected by QTL in Example 1, GW2 The characteristics of the gene have been reported by Chinese researchers. A comparison of genomic and cDNA sequences of the FAZ1 allele, a model of GW2, revealed eight exons and seven introns, and the FAZ1 GW2 allele was predicted to encode 425 polypeptides of about 47 kDa Respectively. A comparison of the nucleotide sequence of WY3 allele, FAZ1 of GW2 and the large rice varieties of seeds, revealed two base substitutions that did not cause amino acid mutations in
중국 연구자들에 의해 분석된 종자중에 관여하는 GW2 유전자에 대하여 본 발명에서는 상기 GW2 유전자의 추가적인 기능을 확인하기 위해, 미량원소 함량을 측정하였다. 아연 함량을 조사하기 위해 포장에서 수확한 정조에서 현미와 왕겨를 분리하였다. 시료당 200립을 채취하여 현미와 왕겨로 분리하여 각각 무게를 측정한 후 160℃에서 65%의 질산(nitric acid)으로 분해하였다. 아연 함량은 ICP-MS(inductively coupled plasma mass spectrometry; Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 두 계통 간에 아연(Zn) 함량의 차이가 있음을 확인하였다(도 2). 현미(grain)에서는 HG101(gw2 ql)이 종자 1kg에 34mg으로 화성벼(HS)의 28mg보다 약 22% 정도 높았고, 왕겨(husk)는 화성벼가 약 34% 높았는데 이러한 결과는 왕겨에서 현미로의 아연 전이효율성이 HG101에서 더 높다는 것을 시사한다. 또한, 종자중에 관여하는 GW2 유전자가 동시에 아연함량을 조절하는지 알아보기 위해, 150개 계통 중에서 출수기가 화성벼와 유사한 56개 계통을 선정하여 GW2와 밀접히 연관된 RM290 유전자형 간에 아연함량의 차이를 확인하였다. 그 결과, 표 1에 개시된 바와 같이 마커 유전자형에 따른 아연함량의 차이가 고도로 유의한 것을 확인할 수 있었다(P<0.02).Regarding the GW2 gene involved in the seeds analyzed by Chinese researchers, in the present invention, the GW2 To confirm the additional function of the gene, the trace element content was measured. In order to investigate the zinc content, brown rice and rice hull were separated from the paddy harvested from the pavement. 200 lips per sample were collected, separated into brown rice and rice husks, weighed, and then decomposed into 65% nitric acid at 160 ° C. The zinc content was measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS; Perkin Elmer, Wellesley, MA, USA). As a result, it was confirmed that there was a difference in zinc content between the two lines (Fig. 2). In the grain, HG101 (gw2 ql) was 34 mg per kg of seed, which was about 22% higher than that of 28 mg of HS, and husk was about 34% higher than that of husk. Suggesting that the transfer efficiency is higher in HG101. In addition, GW2 To investigate whether the gene regulates zinc content simultaneously, we selected 56 strains of 150 strains, similar to those of Hwasung, and identified differences in zinc content between RM290 genotypes closely related to GW2 . As a result, it was confirmed that the difference in zinc content according to the marker genotype was highly significant as shown in Table 1 (P <0.02).
@: 화성벼와 HG101 동형접합체의 상대적인 표현형 평균값, &: 각각의 유전자형 클래스에서 라인 수.@: Relative phenotypic mean value of HG101 homozygotes, &: Number of lines in each genotype class.
또한, HG101의 염기서열을 분석한 결과, 중국연구자들이 사용한 종자중이 큰 벼 품종인 WY3가 보인 염기서열과 동일한 변이를 보인 것으로 보아, 동일한 기작에 의해 종자중 및 아연함량이 조절되는 것으로 판단된다. 전 세계적으로 다양한 대립벼 유전자원이 존재하는데 중국연구자들이 대립벼인 JZ1560도 GW2 유전자에서 WY3와 동일한 염기변이를 보임을 보고하였다(Ying et al. 2012. Journal of Genetics and Genomics 39: 325-333). 그리고 2종의 대립벼(JZ1581 및 SLG1)와 국내 육성종 5종(화선찰, 드래찬, 화성벼, 보람찬, 일품)의 아연함량을 조사한 결과, HG101 및 WY3와 동일한 염기변이를 보이는 대립벼인 JZ1581 및 SLG1가 국내 육성종에 비해 통계적으로 유의하게 높은 아연함량을 보였다(도 3). 이는 GW2 유전자가 종자중에 관여하는 동시에 아연함량의 조절에도 관여함을 보여주는 결과이다. As a result of analyzing the nucleotide sequence of HG101, it was judged that the seed and zinc contents were controlled by the same mechanism, as the Chinese researchers showed the same mutation as the nucleotide sequence of WY3 . There are a variety of different genetic resources in the world, and Chinese researchers have reported that JZ1560, the antagonistic rice, also exhibits the same base mutation as WY3 in the GW2 gene (Ying et al., 2012. Journal of Genetics and Genomics 39: 325-333) . As a result of investigation of zinc content of two kinds of confounding rice (JZ1581 and SLG1) and five kinds of domestic breeding species (Hwa Seon, Drachan, Hwasung, And SLG1 showed a statistically significant higher zinc content than domesticated species (Fig. 3). This result shows that GW2 gene is involved in the regulation of zinc content while being involved in seeds.
따라서, 본 발명에서 육성된 HG101 등 후대계통들은 종간잡종에서 유래한 계통으로 앞으로 아연함량이 증진된 계통을 육성하는데 중요한 교배모본으로 이용될 수 있을 것이다. Therefore, the later lines such as HG101 cultivated in the present invention may be used as an important crossbreeding example for breeding a system in which the zinc content is increased in the future.
<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof <130> PN16381 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaaactcc cagttatgct gtggagtatc gtggtgtaaa gacaaaggag 360 gaaaggagca tagaacaatt tgaagagcag aaagtcatag aagcacaaat gaggatgcgc 420 cagcaagcac ttcaagatga agaagataag atgaaaagaa aacagaacag gtgctcttct 480 agcagaacaa tcacaccgac caaagaagtg gagtatagag atatttgcag cacatccttt 540 tcagtgccgt cataccgatg tgctgagcaa gaaactgaat gctgttcatc ggaaccttca 600 tgctctgccc agactagcat gcgccctttc cattctaggc ataaccgtga tgataacatt 660 gacatgaata tagaggatat gatggttatg gaagcgattt ggcgttccat tcaggagcag 720 ggaagtatag ggaatcctgt ctgtggcaac tttatgcctg taactgagcc atctccgcgt 780 gaacgccagc cattcgttcc agctgcttct ctagaaatac ctcatggtgg tggattttcc 840 tgtgcggttg cggcaatggc tgagcaccag ccacccagta tggacttctc ttacatggct 900 ggcagcagcg cattcccagt tttcgacatg ttccggcgac catgcaacat tgctggtgga 960 agcatgtgta atctggagag ctcaccggag agctggagcg ggatagcacc aagctgcagc 1020 agggaagtgg taagagaaga aggagagtgc tcggctgacc actggtcgga gggtgcagag 1080 gccggaacaa gctacgcggg ctcagacatc gtggcagatg ccgggaccat gccgcagctg 1140 cctttcgccg agaacttcgc catggcgcca agccacttcc gcccggagag catcgaagaa 1200 cagatgatgt tttccatggc tctttcttta gcagatggtc atggaagaac acactcgcaa 1260 gggttggcat ggttgtag 1278 <210> 2 <211> 1277 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaactccc agttatgctg tggagtatcg tggtgtaaag acaaaggagg 360 aaaggagcat agaacaattt gaagagcaga aagtcataga agcacaaatg aggatgcgcc 420 agcaagcact tcaagatgaa gaagataaga tgaaaagaaa acagaacagg tgctcttcta 480 gcagaacaat cacaccgacc aaagaagtgg agtatagaga tatttgcagc acatcctttt 540 cagtgccgtc ataccgatgt gctgagcaag aaactgaatg ctgttcatcg gaaccttcat 600 gctctgccca gactagcatg cgccctttcc attctaggca taaccgtgat gataacattg 660 acatgaatat agaggatatg atggttatgg aagcgatttg gcgttccatt caggagcagg 720 gaagtatagg gaatcctgtc tgtggcaact ttatgcctgt aactgagcca tctccgcgtg 780 aacgccagcc attcgttcca gctgcttctc tagaaatacc tcatggtggt ggattttcct 840 gtgcggttgc ggcaatggct gagcaccagc cacccagtat ggacttctct tacatggctg 900 gcagcagcgc attcccagtt ttcgacatgt tccggcgacc atgcaacatt gctggtggaa 960 gcatgtgtaa tctggagagc tcaccggaga gctggagcgg gatagcacca agctgcagca 1020 gggaagtggt aagagaagaa ggagagtgct cggctgacca ctggtcggag ggtgcagagg 1080 ccggaacaag ctacgcgggc tcagacatcg tggcagatgc cgggaccatg ccgcagctgc 1140 ctttcgccga gaacttcgcc atggcgccaa gccacttccg cccggagagc atcgaagaac 1200 agatgatgtt ttccatggct ctttctttag cagatggtca tggaagaaca cactcgcaag 1260 ggttggcatg gttgtag 1277 <110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Molecular marker for selecting plant with reduced zinc content and uses <130> PN16381 <160> 2 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaaactcc cagttatgct gtggagtatc gtggtgtaaa gacaaaggag 360 gaaaggagca tagaacaatt tgaagagcag aaagtcatag aagcacaaat gaggatgcgc 420 cagcaagcac ttcaagatga agaagataag atgaaaagaa aacagaacag gtgctcttct 480 agcagaacaa tcacaccgac caaagaagtg gagtatagag atatttgcag cacatccttt 540 tcagtgccgt cataccgatg tgctgagcaa gaaactgaat gctgttcatc ggaaccttca 600 tgctctgccc agactagcat gcgccctttc cattctaggc ataaccgtga tgataacatt 660 gacatgaata tagaggatat gatggttatg gaagcgattt ggcgttccat tcaggagcag 720 ggaagtatag ggaatcctgt ctgtggcaac tttatgcctg taactgagcc atctccgcgt 780 gaacgccagc cattcgttcc agctgcttct ctagaaatac ctcatggtgg tggattttcc 840 tgtgcggttg cggcaatggc tgagcaccag ccacccagta tggacttctc ttacatggct 900 ggcagcagcg cattcccagt tttcgacatg ttccggcgac catgcaacat tgctggtgga 960 agcatgtgta atctggagag ctcaccggag agctggagcg ggatagcacc aagctgcagc 1020 agggaagtgg taagagaaga aggagagtgc tcggctgacc actggtcgga gggtgcagag 1080 gccggaacaa gctacgcggg ctcagacatc gtggcagatg ccgggaccat gccgcagctg 1140 cctttcgccg agaacttcgc catggcgcca agccacttcc gcccggagag catcgaagaa 1200 cagatgatgt tttccatggc tctttcttta gcagatggtc atggaagaac acactcgcaa 1260 gggttggcat ggttgtag 1278 <210> 2 <211> 1277 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atggggaaca ggataggggg gaggaggaag gcgggggtgg aggagaggta cacgaggccg 60 caggggctgt acgagcacag ggacatcgac cagaagaagc tccggaagct gatcctcgag 120 gccaagctcg cgccgtgcta catgggcgcc gacgacgccg ccgccgccgc cgacctcgag 180 gagtgcccca tctgcttcct gtactaccca agtcttaacc gatcaaagtg ttgctcaaaa 240 gggatatgca ccgagtgctt tctccaaatg aaaccaactc acactgctca gcctacacaa 300 tgtccattct gcaaactccc agttatgctg tggagtatcg tggtgtaaag acaaaggagg 360 aaaggagcat agaacaattt gaagagcaga aagtcataga agcacaaatg aggatgcgcc 420 agcaagcact tcaagatgaa gaagataaga tgaaaagaaa acagaacagg tgctcttcta 480 gcagaacaat cacaccgacc aaagaagtgg agtatagaga tatttgcagc acatcctttt 540 cagtgccgtc ataccgatgt gctgagcaag aaactgaatg ctgttcatcg gaaccttcat 600 gctctgccca gactagcatg cgccctttcc attctaggca taaccgtgat gataacattg 660 acatgaatat agaggatatg atggttatgg aagcgatttg gcgttccatt caggagcagg 720 gaagtatagg gaatcctgtc tgtggcaact ttatgcctgt aactgagcca tctccgcgtg 780 aacgccagcc attcgttcca gctgcttctc tagaaatacc tcatggtggt ggattttcct 840 gtgcggttgc ggcaatggct gagcaccagc cacccagtat ggacttctct tacatggctg 900 gcagcagcgc attcccagtt ttcgacatgt tccggcgacc atgcaacatt gctggtggaa 960 gcatgtgtaa tctggagagc tcaccggaga gctggagcgg gatagcacca agctgcagca 1020 gggaagtggt aagagaagaa ggagagtgct cggctgacca ctggtcggag ggtgcagagg 1080 ccggaacaag ctacgcgggc tcagacatcg tggcagatgc cgggaccatg ccgcagctgc 1140 ctttcgccga gaacttcgcc atggcgccaa gccacttccg cccggagagc atcgaagaac 1200 agatgatgtt ttccatggct ctttctttag cagatggtca tggaagaaca cactcgcaag 1260 ggttggcatg gttgtag 1277
Claims (8)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 아연 함량이 증가된 벼 식물체를 선별하기 위한 방법.Isolating the genomic DNA from the rice sample;
Amplifying the target sequence by using the separated genomic DNA as a template and carrying out an amplification reaction using the primer set of claim 2; And
And detecting the amplified product. A method for screening rice plants with increased zinc content compared to wild type.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR20150147157 | 2015-10-22 | ||
KR1020150147157 | 2015-10-22 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170047163A KR20170047163A (en) | 2017-05-04 |
KR101779030B1 true KR101779030B1 (en) | 2017-09-15 |
Family
ID=58743414
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160121342A KR101779030B1 (en) | 2015-10-22 | 2016-09-22 | Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR101779030B1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111154911B (en) * | 2020-03-06 | 2023-01-24 | 河南省农业科学院 | Molecular marker of wheat grain zinc content QTL qZn-3B |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005030950A1 (en) | 2003-09-26 | 2005-04-07 | Japan Science And Technology Agency | Transporter participating in the absorption and transportation of complex of metal such as iron in rice and gene thereof |
KR101255336B1 (en) | 2009-12-10 | 2013-04-16 | 포항공과대학교 산학협력단 | Rice cultivar with enhanced metal contents and functional foods |
-
2016
- 2016-09-22 KR KR1020160121342A patent/KR101779030B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005030950A1 (en) | 2003-09-26 | 2005-04-07 | Japan Science And Technology Agency | Transporter participating in the absorption and transportation of complex of metal such as iron in rice and gene thereof |
KR101255336B1 (en) | 2009-12-10 | 2013-04-16 | 포항공과대학교 산학협력단 | Rice cultivar with enhanced metal contents and functional foods |
JP2013513381A (en) | 2009-12-10 | 2013-04-22 | ポステック・アカデミー‐インダストリー・ファウンデーション | Rice varieties with increased trace element content and their uses |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
J Genet Genomics. 2012 Jul 20;39(7):325-33. "Dissecting the genetic basis of extremely large grain shape in rice cultivar 'JZ1560'." |
J Integr Plant Biol. 2009 Jan;51(1):84-92 "Genetic identification of quantitative trait loci for contents of mineral nutrients in rice grain" |
Journal of Integrative Plant Biology 2009, 51 (1): 84-92 "Genetic Identification of Quantitative Trait Loci for Contents of Mineral Nutrients in Rice Grain" |
Nat Genet. 2007 May;39(5):623-30. "A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase." |
Transgenic Res. 2015 Feb;24(1):109-22 "Over-expression of the MxIRT1 gene increases iron and zinc content in rice seeds." |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20170047163A (en) | 2017-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106282394B (en) | Method for high-throughput detection of southern rust resistance genotyping of corn and kit thereof | |
US10577623B2 (en) | Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof | |
Hirotsu et al. | Protocol: a simple gel-free method for SNP genotyping using allele-specific primers in rice and other plant species | |
KR101680570B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for discerning purple cabbage cultivar and uses thereof | |
US20200093087A1 (en) | Quantitative trait loci (qtl) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof | |
US20220010325A1 (en) | Quantitative trait loci (qtl) associated with shattering-resistant capsules in sesame and uses thereof | |
Bagge et al. | Functional markers in wheat: technical and economic aspects | |
CN111471790B (en) | Molecular marker closely linked with wheat grain filling rate QTL QGfr. sicau-7D.1 and application thereof | |
KR101724372B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for selecting cabbage of low content progoitrin and uses thereof | |
KR101677714B1 (en) | Molecular marker for selecting powdery mildew resistant or susceptible tomato cultivar and selection method using the same molecular marker | |
KR101961653B1 (en) | SNP molecular marker for selecting cultivars of sweet potatoes and uses thereof | |
CN111647677B (en) | Molecular marker closely linked with wheat grain filling rate QTL QGfr. sicau-6D and application | |
KR101779030B1 (en) | Molecular marker for selecting plant with enhanced zinc content and uses thereof | |
KR101714764B1 (en) | Molecular marker for discrimination of Alexandre melon F1 cultivars and use thereof | |
KR101464247B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for selecting fusarium wilt-resistant or sensitive cabbage cultivar and uses thereof | |
KR102296889B1 (en) | Molecular marker for selecting Gray leaf spot resistant or susceptible tomato cultivar and selection method using the same molecular marker | |
KR102144673B1 (en) | KASP primer set based on SNP for discriminating Korean melon cultivar and F1 hybrid purity checking and uses thereof | |
KR101987278B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage of high content of glucobrassicin and uses thereof | |
El-Malky et al. | Detection of genetic diversity using microsatellites in rice (Oryza sative, L.) | |
KR100981042B1 (en) | Complementary recessive genes involved in rice hybrid breakdown and screening marker thereof | |
KR102665741B1 (en) | Molecular marker for discriminating bacterial wilt-resistant pepper and uses thereof | |
KR102212518B1 (en) | SSR marker for discriminating cultivars or resources of Atractylodes japonica and uses thereof | |
KR102575912B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for discriminating cabbage having low content of sinigrin and uses thereof | |
KR102418879B1 (en) | KASP primer set derived on mitochondira for classifying Panax ginseng cultivar and genotype and uses thereof | |
KR101801019B1 (en) | Single nucleotide polymorphism marker for discerning leaf blight-resistant lily cultivar based on 60s ribosomal gene and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |