KR101776925B1

KR101776925B1 - 개선된 CGTase 변이효소를 이용한 고수율, 고순도 α-사이클로덱스트린의 수득방법

Info

Publication number: KR101776925B1
Application number: KR1020150173122A
Authority: KR
Inventors: 심재훈; 구예슬; 김나리; 고담슬; 정우재
Original assignee: 한림대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2017-09-08
Also published as: KR20170066900A

Abstract

본 발명은 개선된 CGTase 변이효소를 이용한 고수율, 고순도 α-사이클로덱스트린의 수득방법에 관한 것으로, 본 발명의 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 변이효소를 이용할 경우, α-사이클로덱스트린,β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물 중 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)만을 고수율, 고순도로 수득할 수 있다.

Description

개선된 CGTase 변이효소를 이용한 고수율, 고순도 α-사이클로덱스트린의 수득방법 {Method for production of α-cyclodextrin by advanced CGTase mutant with high yield and high purity}

본 발명은 CGTase 변이효소를 이용한 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase) 변이효소를 이용해 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin, β-CD) 및 γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin, γ-CD)을 포함하는 혼합물 중 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD) 만을 선택하여 수득하는 방법에 관한 것이다.

α-사이클로덱스트린(cyclodextrin)은 α-1,4 공유결합으로 연결된 6개의 글루코오스 단위로 구성되는 비 환원성 당질의 환상(環狀) 구조이다. α-사이클로덱스트린은 효소적 가수분해에 대해 높은 저항성을 가지고 있으므로, 식품 산업에서 특별한 응용성을 갖는다. 비록 곰팡이나 박테리아 유래의 알파 아밀레이즈는 α-사이클로덱스트린을 가수분해할 수 있지만, 인간의 침과 췌장의 아밀라아제는 α-사이클로덱스트린을 가수분해할 수 없다.

따라서, α-사이클로덱스트린은 체내 생체 이용률을 감소시키고자 하는 목적으로 식품 및 음료에 응용되고 있는데, 체중 조절, 지질 및 당 대사 개선 등의 목적으로 사용된다. 그 외, α-사이클로덱스트린은 건조 혼합물, 구운 제품, 인스턴트 차, 커피와 같은 음식의 향, 색상, 감미료의 운반체로도 사용된다.

한편, α-사이클로덱스트린은 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase)를 사용하여 전분으로부터 제조되는 것이 일반적인데, 이 반응에서는 α-사이클로덱스트린 외에 β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린도 동시에 생산되는 문제가 있다. 따라서, 이들 β-사이클로덱스트린, γ-사이클로덱스트린로부터 α-사이클로덱스트린을 선택적으로 분리하는 공정이 필요하다.

대한민국 특허공개번호 제10-1994-0024064호 (공개일자 1994.11.18)에는, 미생물의 발효에 의해 사이클로덱스트린(cyclodextrin) 생산효소인 사이클로텍스트린 글루카노트랜스퍼라아제(cyclodextrin glucanotransferase 2,4,1,19)를 제조함에 있어서, 양성전분(cationic starch)을 주탄소원으로 하는 변이주, 바실러스 마세란스(Bacillus macerans) KFCC-10789을 이용하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의한 사이클로텍스트린 글루카노트랜스퍼라아제 효소의 제조방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허등록번호 제10-0136362호 (등록일자 1998. 01. 22)에는, 입자상을 갖는 변성전분 또는 일반 전분에서 선택된 기질을 녹인 전분액을 기질 전분액의 호화 개시온도보다 30℃ 낮은 온도에서, 호화 개시온도보다 10℃ 높은 온도 범위에서 열처리시키고, 사이클로덱스트린 생성반응 온도에서 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제(Cyclodextrin glucanotransferase)를 작용시켜 생성된 사이클로덱스트린 혼합액을 원심분리, 여과 등의 물리적 방법으로 미반응 전분을 제거시키는 기술에 대해 기재되어 있다. 대한민국 특허등록번호 제10-0898384호 (등록일자 2009. 05. 12)에는, 당전이효소인 설펄로버스 설파타리쿠스 유래 내열성 당전이효소를 이용하여, 말토오실-베타-사이클로덱스트린으로부터 수용성이 증가된 다이말토오실-베타-사이클로덱스트린을 제조하는 기술에 대해 기재되어 있다.

본 발명에서는 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물 중 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)만을 효과적으로 수득하는 방법을 개발하여 제공하고자 하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase) 변이효소를 제공한다.

일반 야생형 CGTase의 경우는 다양한 종류의 올리고당을 반응 산물로 생산하는 반면, 본 발명의 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)을 고수율, 고순도로 수득할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소는, 야생형 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase)의 아미노산 서열 중 232번과 233번 아미노산이 N(Asn)과 E(Glu)로 치환된 것이다.

한편, 본 발명은 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin, β-CD) 및 γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin, γ-CD)을 포함하는 혼합물에, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법을 제공한다.

한편, 본 발명의 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD) 수득방법에 있어서, 상기 반응은 바람직하게 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin, β-CD) 및 γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin, γ-CD)을 포함하는 혼합물에 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소를 첨가하여 β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 개환시키는 단계 (A); 개환된 β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 가수분해시켜 글루코스(glucose)을 생성시키는 단계 (B); 및 상기 혼합물로부터 단계 (B)를 통해 생성된 글루코스(glucose)를 분리함으로써 α-사이클로덱스트린을 수득하는 단계 (C);를 포함하는 과정으로부터 α-사이클로덱스트린을 수득하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 α-사이클로덱스트린 수득방법에 있어서, 상기 글루코스 생성을 위한 가수분해는 바람직하게 α-글루코시다제(α-glucosidase, AMG)를 첨가하여 반응시키는 것이 좋다. 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase)도 가수분해 활성이 있으나, α-글루코시다제(α-glucosidase, AMG)를 추가로 첨가해 줄 경우, 가수분해 속도를 한층 증가시킬 수 있기 때문이다.

한편, 본 발명의 α-사이클로덱스트린 수득방법에 있어서, 상기 단계 (B)의 글루코스(glucose)의 분리는 일 예로, 글루코스와 α-사이클로덱스트린의 수용성 차이를 이용할 수 있다.

한편, 본 발명의 α-사이클로덱스트린 수득방법에 있어서, 상기 반응은 30~60℃에서 1~24시간 동안 수행한 후, 가열하여 반응을 정지시키는 것이 좋다. 가열을 하면 효소가 실활되어 반응이 정지된다. 가열시 온도는 효소 실활 온도 이상으로 수행하면 되는데, 일 예로는 반응액을 끓여 수행할 수 있다.

본 발명에서와 같이, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 변이효소(CGTase)를 이용할 경우, α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 포함하는 혼합물 중 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)만을 고순도, 고수율로 수득할 수 있다.

도 1은 CGTaseH233Y 효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터 맵이다.
도 2는 시그날 펩타이드 포함 CGTaseH233Y 효소의 아미노산 서열이다.
도 3은 정제된 CGTaseH233Y 효소의 전기영동 사진이다.
도 4는 CGTaseNE 효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터 맵이다.
도 5는 CGTaseNE 효소의 아미노산 서열이다.
도 6은 정제된 CGTaseNE 효소의 전기영동 사진이다.
도 7은 제조예 1의 CGTaseH233Y 효소를 이용한 α-CD, β-CD, γ-CD 의 개환 실험 결과이다.
도 8은 제조예 2의 CGTaseNE 효소를 이용한 α-CD, β-CD, γ-CD 의 개환 실험 결과이다.

α-CD는 식품산업에서 활용도가 높고, 여러 종류의 CD들 중 유일하게 유럽연합에서 GRAS로 인정되어 식이섬유 대체 물질로 각광받고 있다. 본 발명에서는 본 발명자가 이미 발명한 CGTase 변이효소, CGTaseH233Y의 특성이 개선된 새로운 CGTase 변이효소, 'CGTaseNE mutant'를 개발하였다.

기존에 발명된 효소(CGTaseH233Y; 대한민국 출원번호 10-2015-0052509)는, CGTase가 생산하는 α-, β-, γ-CD 혼합액에서 β-, γ-CD만을 선별적으로 가수분해하여 α-CD만을 남길 수 있어, 이를 통해 α-CD를 분리해 낼 수 있었다.

하지만, 본 발명자는 기발명된 효소가 장시간 반응시 α-CD도 다소 가수분해함을 확인하였고, 이를 극복할 수 있는 새로운 효소를 개발하고자 하였다. 그 결과, 기존의 CGTase 변이효소, CGTaseH233Y보다 성능이 개선된 효소인 CGTaseNE를 개발할 수 있었다.

동일한 조건에서 상기 두 효소를 각각의 CD와 반응 후 TLC 상에서 시간대 별로 반응 산물을 분석하였다. CGTaseH233Y 효소는 장시간 반응시 α-CD에서도 가수분해 반응이 일어나 α-CD가 감소함과 동시에 소량의 다당류가 생산됨을 알 수 있었다.

하지만, 본 발명의 CGTaseNE 효소 경우, 오버-나이트(over-night) 반응에서도 α-CD가 거의 가수분해되지 않은 반면, β-CD와 γ-CD는 개환하여 가수분해되는 것으로 확인되었다.

본 발명자가 기개발한 CGTaseH233Y 효소도 안정적이기는 하나, 대량공정 수행시 정확한 반응시간 제어라는 어려운 난제가 있으므로, 본 발명의 CGTaseNE 효소를 사용할 경우, 더욱 안정적으로 α-CD의 손실 없이, α-CD를 수득할 수 있는 것으로 판단된다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 제조예 1: 싸이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 변이효소, CGTaseH233Y의 제조]

본 제조예에서는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소, CGTaseH233Y를 제조하고자 하였다.

호알칼리성 바실러스 균(Bacillus sp.)Ⅰ-5로부터 유래한 CGTase 유전자의 특정부위변이(site-directed mutagenesis)를 위하여 하기 표 1의 프라이머들을 사용하였다. 돌연변이를 주기 위하여 원본 DNA(pR2CGT Ⅰ-5)에 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 95℃에서 2분 동안 1회 실시한 후, 95℃에서 30초, 53.5℃에서 45초, 72℃에서 7분을 30회 PCR을 실시하였다.

정방향 프라이머(forward primer)	5'-GTC AAG TAT ACG CCA TTC GGC TGG-3'
역방향 프라이머(reverse primer)	5'-GTT CGT ATA CGG TAA GCC GAC CG-3'

상기 반응이 끝난 후 PCR 산물을 벡터 (도 1)에 클로닝하고, CaCl₂법을 이용하여 대장균(E. coli) MC1016에 형질전환 하였다. 형질전환 유전자를 지니는 대장균 균주를 스크리닝(screening) 하기 위하여 앰피실린 (최종농도 100 ㎍/㎖)을 함유한 'LB agar' 배지에 평판 도말하여 내성을 지니는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 아미노산 서열 중 233번 아미노산이 His에서 Tyr로 변형된 상태의 돌연변이된 CGTase (CGTaseH233Y)를 생산할 수 있는데, CGTaseH233Y는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는다 (도 2 참조). 도 1은 CGTaseH233Y 효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터 맵이고, 도 2는 시그날 펩타이드 포함 CGTaseH233Y 효소의 아미노산 서열이다.

상기 선별된 균주를 1 L의 LB 배지에 접종하여 24시간 가량 37℃에서 교반(200 rpm)하여 키운 후, 원심분리기를 이용하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 다시 pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액에 재부유(resuspension)한 후, 초음파로 세포파쇄를 실시하였다.

세포파쇄로부터 수득된 조효소액을 12,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이후, 상층액을 β-CD가 결합된 세파덱스 수지(sephadex resin)가 담긴 컬럼에 흡착시킨 후, 다시 1% β-CD를 포함하는 pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액을 주입하는 'β-CD 친화 크로마토그래피법'으로 정제하여 CGTaseH233Y를 수득하였다 (도 3 참조). 도 3은 정제된 CGTaseH233Y 효소의 전기영동 사진이다.

[ 제조예 2: 싸이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 변이효소, CGTaseNE의 제조]

본 제조예에서는 싸이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈 변이효소, CGTaseNE를 제조하고자 하였다.

모든 실험 재료 및 방법은 상기 제조예 1에 준해 수행하였고, 예외적으로 CGTaseNE 돌연변이 효소를 만들기 위한 점 돌연변이 프라이머 서열 (point mutation primer sequence)은 하기 표 2에 기재된 서열을 사용하였다.

정방향 프라이머(forward primer)	5-GAC GCG GTC AAC GAA ACG CCA TTC GGC TGG-3
역방향 프라이머(reverse primer)	5-GAA TGG CGT TTC GTT GAC CGC GTC CAC GCG-3

실험결과, CGTase 돌연변이 효소로, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CGTaseNE를 수득할 수 있었다. 도 4는 CGTaseNE 효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 벡터 맵이고, 도 5는 CGTaseNE 효소의 아미노산 서열이다. 도 5에서 밑줄 친 부분이 돌연변이된 아미노산 서열이다. 야생형은 232번과 233번 아미노산이 K(Lys)와 H(His)이었으나, 본 돌연변이 효소에서는 각각 N(Asn)과 E(Glu)로 치환되었다. 도 6은 정제된 CGTaseNE 효소의 전기영동 사진이다.

[ 실시예 1: 제조예 1의 CGTaseH233Y 효소를 이용한 α-CD, β-CD, γ-CD의 개환 및 분해 실험]

본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 수득한 CGTaseH233Y 효소의 반응 시간 경과에 따른, α-CD, β-CD 및 γ-CD의 반응(개환 및 분해) 여부를 확인하고자 하였다.

pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액에, α-CD, β-CD, γ-CD (1%)와 상기 제조예 1에서 수득한 CGTaseH233Y 효소 22.6 μL(0.08779 unit, 1.8 mg/mL) 를 각각 넣고, 45℃에서 하기 표 3에 기재된 시간으로 각각 반응시킨 후, 5분간 끓여 반응을 정지하였다. 이후, TLC 분석을 실시하였다. 하기 표 3은 각 샘플별 처리 조건을 정리해서 보여준다. 본 실험예 및 하기 실험예에서 사용한 TLC의 전개용매 조건은 모두 'n-butanol:ethanol:water' (5:5:3, v/v/v)로 하였다.

NO.	CGTaseH233Y	사이클로덱스트린	시간 (h)
lane 1	22.6 μL(0.08779 unit, 1.8 mg/mL)	α-CD 1%	control
lane 2			1
lane 3			3
lane 4			5
lane 5			7
lane 6			9
lane 7			12
lane 8			over-night
lane 9		β-CD 1%	control
lane 10			1
lane 11			3
lane 12			5
lane 13			7
lane 14			9
lane 15			12
lane 16			over-night
lane 17		γ-CD 1%	control
lane 18			1
lane 19			3
lane 20			5
lane 21			7
lane 22			9
lane 23			12
lane 24			over-night

실험결과, 도 7에서 보는 바와 같이, CGTaseH233Y 효소는 β-CD, γ-CD를 모두 개환시키고, 분해하는 것으로 확인되었다. 하지만, 5시간이 경과하면서 α-CD도 일부 가수분해되는 것으로 나타났고, 시간이 경과함에 따라, 그 분해율은 더욱 증가하는 것으로 나타났다.

[ 실시예 2: 제조예 2의 CGTaseNE 효소를 이용한 α-CD, β-CD, γ-CD의 개환 및 분해 실험]

본 실험예에서는 상기에 제조예 2에서 수득한 CGTaseNE 효소의 반응 시간 경과에 따른, α-CD, β-CD 및 γ-CD의 반응(개환 및 분해) 여부를 확인하고자 하였다.

pH 6.0의 50 mM NaOAC 완충용액에, α-CD, β-CD, γ-CD (1%)와 상기 제조예 1에서 수득한 CGTaseNE 효소 22.6 μL(0.08779 unit, 1.8 mg/mL) 를 각각 넣고, 45℃에서 하기 표 4에 기재된 시간으로 각각 반응시킨 후, 5분간 끓여 반응을 정지하였다. 이후, TLC 분석을 실시하였다. 하기 표 3은 각 샘플별 처리 조건을 정리해서 보여준다. 본 실험예 및 하기 실험예에서 사용한 TLC의 전개용매 조건은 모두 'n-butanol:ethanol:water' (5:5:3, v/v/v)로 하였다.

NO.	CGTaseNE	사이클로덱스트린	시간 (h)
lane 1	22.6 μL(0.08779 unit, 1.8 mg/mL)	α-CD 1%	control
lane 2			1
lane 3			3
lane 4			5
lane 5			7
lane 6			9
lane 7			12
lane 8			over-night
lane 9		β-CD 1%	control
lane 10			1
lane 11			3
lane 12			5
lane 13			7
lane 14			9
lane 15			12
lane 16			over-night
lane 17		γ-CD 1%	control
lane 18			1
lane 19			3
lane 20			5
lane 21			7
lane 22			9
lane 23			12
lane 24			over-night

실험결과, 도 8에서 보는 바와 같이, CGTaseNE 효소는 β-CD, γ-CD를 모두 개환시키고, 분해하는 것으로 확인되었다.

그런데, CGTaseNE는 상기 제조예 1의 CGTaseH233Y5와 달리, 시간이 경과하여도 α-CD를 개환 및 가수분해하지 않았으며, 심지어 오버-나이트 조건에서도 개환 및 분해를 거의 하지 않았다.

따라서, 본 발명의 CGTaseNE 효소를 이용할 경우, 세부적인 공정조건(일 예로, 반응시간)의 섬세한 설정 없이도, α-CD를 고순도, 고수율로 생산할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Method for production of alpha-cyclodextrin by advanced CGTase mutant with high yield and high purity <130> AP-2015-0237 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> Bacillus sp. I-5 <400> 1 Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn 20 25 30 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu 35 40 45 Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 Glu Asn Ile Tyr Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val His Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr 100 105 110 Gly Thr Met Gln Asp Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His 115 120 125 Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His 165 170 175 His Tyr Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp 195 200 205 Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp 210 215 220 Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys Tyr Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 Ser Phe Met Ser Thr Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly 245 250 255 Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe 260 265 270 Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys 275 280 285 Ala Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys 290 295 300 Ala Met Leu Glu Gly Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn 325 330 335 Gly Asp Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser 340 345 350 Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly 355 360 365 Gly Asn Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser 385 390 395 400 Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn 405 410 415 Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val 420 425 430 Ala Ile Asn Arg Asn Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val 435 440 445 Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu 450 455 460 Asn Gly Asn Thr Leu Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe 465 470 475 480 Thr Leu Ala Pro Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala 485 490 495 Thr Ala Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly 500 505 510 Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Ala Ser Ala Arg Gln Gly Thr Val 515 520 525 Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu 530 535 540 Asp Thr Gln Ile Gln Val Lys Ile Leu Arg Val Pro Gly Gly Ile Tyr 545 550 555 560 Asp Ile Arg Val Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp 565 570 575 Asn Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile 580 585 590 Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn 595 600 605 Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met 610 615 620 Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser 625 630 635 640 Val Pro Ala Gly Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly 645 650 655 Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro 660 665 670 Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro 675 680 685 <210> 2 <211> 685 <212> PRT <213> Bacillus sp. I-5 <400> 2 Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val 1 5 10 15 Ile Tyr Gln Ile Phe Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn 20 25 30 Asn Pro Thr Gly Ala Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu 35 40 45 Tyr Cys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly 50 55 60 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val 65 70 75 80 Glu Asn Ile Tyr Ser Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val His Asn Thr Ala 85 90 95 Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr 100 105 110 Gly Thr Met Gln Asp Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His 115 120 125 Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala 130 135 140 Ser Ser Asp Asp Pro Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn 145 150 155 160 Gly Asn Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His 165 170 175 His Tyr Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys 180 185 190 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp 195 200 205 Val Tyr Leu Lys Asp Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp 210 215 220 Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Asn Glu Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys 225 230 235 240 Ser Phe Met Ser Thr Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly 245 250 255 Glu Trp Phe Leu Gly Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe 260 265 270 Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys 275 280 285 Ala Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys 290 295 300 Ala Met Leu Glu Gly Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln 305 310 315 320 Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn 325 330 335 Gly Asp Arg Arg Lys Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser 340 345 350 Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly 355 360 365 Gly Asn Asp Pro Asp Asn Arg Ala Arg Ile Pro Ser Phe Ser Thr Thr 370 375 380 Thr Thr Ala Tyr Gln Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser 385 390 395 400 Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Ser Thr Gln Glu Arg Trp Ile Asn Asn 405 410 415 Asp Val Ile Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val 420 425 430 Ala Ile Asn Arg Asn Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val 435 440 445 Thr Ser Leu Pro Gln Gly Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu 450 455 460 Asn Gly Asn Thr Leu Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe 465 470 475 480 Thr Leu Ala Pro Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala 485 490 495 Thr Ala Pro Ile Ile Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly 500 505 510 Val Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Ala Ser Ala Arg Gln Gly Thr Val 515 520 525 Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu 530 535 540 Asp Thr Gln Ile Gln Val Lys Ile Leu Arg Val Pro Gly Gly Ile Tyr 545 550 555 560 Asp Ile Arg Val Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp 565 570 575 Asn Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile 580 585 590 Asn Asn Ala Thr Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn 595 600 605 Val Ser Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met 610 615 620 Tyr Asn Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser 625 630 635 640 Val Pro Ala Gly Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly 645 650 655 Ser Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro 660 665 670 Thr Ser Gly Thr Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro 675 680 685

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase) 변이효소.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소는,
야생형 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase)의 아미노산 서열 중 232번과 233번 아미노산이 N과 E로 치환된 것을 특징으로 하는 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glucanotransferase, CGTase) 변이효소.
α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin, β-CD) 및 γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin, γ-CD)을 포함하는 혼합물에, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법.
제3항에 있어서,
상기 반응은,
α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD), β-사이클로덱스트린(β-cyclodextrin, β-CD) 및 γ-사이클로덱스트린(γ-cyclodextrin, γ-CD)을 포함하는 혼합물에 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 사이클로덱스트린 글루카노트랜스퍼레이즈(CGTase) 변이효소를 첨가하여 β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 개환시키는 단계 (A);
개환된 β-사이클로덱스트린 및 γ-사이클로덱스트린을 가수분해시켜 글루코스(glucose)을 생성시키는 단계 (B); 및
상기 혼합물로부터 단계 (B)를 통해 생성된 글루코스(glucose)를 분리함으로써 α-사이클로덱스트린을 수득하는 단계 (C);를 포함하는 것을 특징으로 하는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법.
제4항에 있어서,
상기 글루코스 생성을 위한 가수분해는,
α-글루코시다제(α-glucosidase, AMG)를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법.
제3항에 있어서,
상기 반응은,
30~60℃에서 1~24시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 α-사이클로덱스트린(α-cyclodextrin, α-CD)의 수득방법.