KR101768091B1 - 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 이를 이용한 목표 유전자의 발현량 정량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석에서 사용되는 표준 발현 유전자를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 목표 유전자의 발현량 정량 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 유전자 PPIA, TBP, HSPCB, RPL4, RPS18 및 TOP2B 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물, 키트, 표준 발현 유전자 선발 방법 및 이를 이용한 돼지의 목표 유전자 발현량 정량 방법에 관한 것이다. 본 발명을 활용하면 돼지 품종별 목표 유전자의 정확한 발현량의 측정이 가능하다.
Description
본 발명은 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석에서 사용되는 돼지 표준 발현 유전자를 포함하는 조성물 및 이를 이용한 목표 유전자의 발현량 정량 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 돼지 품종별 정확한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석을 가능하게 하는 표준 발현 유전자를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 키트, RT-qPCR 분석용 표준 발현 유전자 선발 방법 및 상기 표준 발현 유전자를 이용한 돼지 품종별 목표 유전자 발현량 정량 방법에 관한 것이다.
정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-qPCR)은 민감성, 특정성, 정확성 및 비용효과 때문에 mRNA 발현량 분석을 위해 가장 자주 사용되는 실험 기법 중 하나이다. 하지만, RT-qPCR을 이용한 mRNA 발현량은 RNA 추출 단계에서 RNA의 품질 및 순도, 다른 샘플의 양, 역전사 단계에서 효소의 효율성 및 PCR 효율성과 같은 다양한 변수에 의해 영향을 받을 수 있다. 그러므로, 본질적으로 발현되는 유전자, 즉 표준 발현 유전자 또는 내부 통제 유전자를 이용한 표준화 과정이 실시되어야 한다. 이전의 연구에서, GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), β-actin과 같은 하우스키핑 유전자가 mRNA 발현량을 표준화하기 위해 사용되었다.
돼지(Sus scrofa)는 고기 생산을 위해 경제적으로 중요한 가축이다. 돼지는 또한 비슷한 게놈 크기 및 조직 때문에 사람의 질병 연구에 적합한 동물 모델이다. 그러므로, 고기의 품질을 향상하고 사람의 질병을 연구하기 위해 다양한 돼지 종류에서 RT-qPCR 실험을 이용한 목표 유전자의 정량 분석이 실행되어 왔다. 몇몇의 표준 발현 유전자에 대한 연구는 다양한 돼지 조직 샘플 및 다른 배아기 샘플에서 행해져 왔다.
본 발명 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 발명에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 목적은 돼지 품종별 정확한 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석을 가능하게 하는 돼지 표준 발현 유전자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지를 포함한 모든 동물 종의 연구에서 적용 가능한 RT-qPCR 분석용 표준 발현 유전자 선발 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 표준 발현 유전자를 이용하는 돼지 품종별 목표 유전자의 발현량 정량 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.
본 발명의 일 측면에 의하면, 돼지 유전자 PPIA, TBP, HSPCB, RPL4, RPS18 및 TOP2B 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 돼지 유전자 PPIA, TBP 및 HSPCB 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 버크셔 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 돼지 유전자 PPIA 및 TBP 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 두록 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 돼지 유전자 PPIA, TBP, RPL4 및 RPS18 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 랜드레이스 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 돼지 유전자 PPIA, TOP2B, RPL4 및 RPS18 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 요크셔 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 조성물을 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면,
후보 유전자의 안정성 값(M값)을 구하는 단계;
상기 유전자의 발현 편차에 따른 안정성 값을 구하는 단계;
상기 유전자의 상관관계 계수(r값), 변동계수(CV값) 및 표준편차(SD값)를 구하는 단계; 및
상기 M값, 발현 편차에 따른 안정성 값, r값, CV값 및 SD값에 기초해 표준 발현 유전자(reference genes)를 선발하는 단계를 포함하는 RT-qPCR 분석용 표준 발현 유전자의 선발 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TBP 및 HSPCB 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 버크셔 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA 및 TBP 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 두록 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TBP, RPL4 및 RPS18 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 랜드레이스 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TOP2B, RPL4 및 RPS18 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 요크셔 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 돼지 품종별 목표 유전자의 정확한 발현량의 측정이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 돼지의 등지방, 근내지방 등과 같은 특성과 관련된 돼지고기의 품질을 향상시킬 수 있는 유전자의 정확한 선발 및 연구가 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 돼지의 목표 유전자의 정확한 발현량 측정을 통해 목표 유전자 사이의 연관성 및 목표 유전자의 기능에 대한 연구결과의 정확도를 높여 사람 질병 연구를 위한 동물모델로써 돼지의 사용을 가능하게 한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 돼지를 포함한 모든 동물 종의 연구에서 적용 가능한 RT-qPCR 분석용 표준 발현 유전자의 선발 방법이 제공될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 버크셔, 두록, 랜드레이스 및 요크셔 돼지로부터 추출된 15개의 후보 표준 발현 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크셔, 두록, 랜드레이스 및 요크셔 돼지의 간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장 및 대장으로부터 추출된 15개의 후보 표준 발현 유전자의 멜팅 패턴을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 geNorm 프로그램을 이용한 15개의 후보 표준 발현 유전자의 범주를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 보정되어야 할 표준 발현 유전자의 적합한 수의 결정을 위한 분석을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 버크셔, 두록, 랜드레이스 및 요크셔 돼지의 간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장 및 대장으로부터 추출된 15개의 후보 표준 발현 유전자의 멜팅 패턴을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 geNorm 프로그램을 이용한 15개의 후보 표준 발현 유전자의 범주를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 보정되어야 할 표준 발현 유전자의 적합한 수의 결정을 위한 분석을 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 돼지 유전자 PPIA, TBP, HSPCB, RPL4, RPS18 및 TOP2B 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에서 "표준 발현 유전자(reference genes)"는 다른 시료 간의 비교적 정확한 유전자 발현 비교를 위해 mRNA 발현량의 표준화에 가장 보편적으로 사용될 수 있는 유전자이다. RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), qRT-PCR(quantitative real time PCR), 유전자발현계열분석(serial analysis of gene expression: 이하 SAGE) 및 마이크로어레이(microarray)에 이르는 유전자 발현 분석법들에 내인성 표준 발현 유전자를 보편적으로 사용하고 있다. 내인성 표준 발현 유전자로써 통상적으로 활용되는 글리세르알데히드삼인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: 이하, GAPDH) 및 β-액틴(β-actin: 이하 ACTB)의 유전자들은 상기 유전자들이 유래의 다양성에 상관없이 시료 간에 일정한 수준으로 발현되며 실험적 처리에 의해 변하지 않을 것이라는 가정하에 적절한 검증 없이 사용돼 오고 있다. 그러나, 조직 및 세포 종류에 따라 다르며 시료의 처리, 발생학적 단계(developmental stage) 및 병리학적 상태(pathological states)를 포함한 실험 조건들에 의해 조절될 수 있다는 사실은 이미 잘 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 유전자는 미국국립보건원의 GeneBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있다 (표 1).
본 발명에 있어 "조성물"은 상기 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트, 상기 유전자 또는 그로부터 발현된 핵산 발현 산물과의 혼성화 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 제제에는 반응의 매질이 되는 버퍼, 용매 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 11 및 12로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 서열번호 17 및 18로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 서열번호 19 및 20으로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 서열번호 21 및 22로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트, 서열번호 25 및 26으로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트; 및 서열번호 27 및 28로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 작용하는 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로서 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 상기 프라이머 세트는 정배열 프라이머 및 역배열 프라이머가 하나의 세트로 구성된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 돼지 품종은 버크셔, 두록, 랜드레이스 또는 요크셔 돼지인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표준 발현 유전자는 간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장 또는 대장에서 발현되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지 유전자 PPIA, TBP 및 HSPCB 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 버크셔 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지 유전자 PPIA 및 TBP 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 두록 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지 유전자 PPIA, TBP, RPL4 및 RPS18 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 랜드레이스 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 돼지 유전자 PPIA, TOP2B, RPL4 및 RPS18 표준 발현 유전자로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종 이상의 표준 발현 유전자(reference genes)를 포함하는 요크셔 돼지의 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 키트가 제공될 수 있다.
본 발명에 있어서 "키트"는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면,
후보 유전자의 안정성 값(M값)을 구하는 단계;
상기 유전자의 발현 편차에 따른 안정성 값을 구하는 단계;
상기 유전자의 상관관계 계수(r값), 변동계수(CV값) 및 표준편차(SD값)를 구하는 단계; 및
상기 M값, 발현 편차에 따른 안정성 값, r값, CV값 및 SD값에 기초해 표준 발현 유전자(reference genes)를 선발하는 단계를 포함하는 RT-qPCR 분석용 표준 발현 유전자의 선발 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 표준 발현 유전자의 선발 방법은 RT-qPCR 분석을 위한 표준 발현 유전자의 최적의 개수를 구하기 위해 표준화 요소(Normalization factor; NF)의 값(V값)을 구하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 M값, 발현 편차에 따른 안정성 값, r값, CV값 및 SD값에 기초해 표준 발현 유전자(reference genes)를 선발하는 단계에서 후보 유전자의 M값, 발현 편차에 따른 안정성 값, CV값 및 SD값이 비교 유전자 보다 낮고,
후보 유전자의 r값이 비교 유전자보다 높은 경우 후보 유전자가 비교 유전자보다 안정한 표준 발현 유전자인 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 있어 "후보 유전자"란 후보 표준 발현 유전자를 의미한다. 예로써, 본 발명의 사용자가 표준 발현 유전자라고 예측하여 상기 표준 발현 유전자 선발 방법으로 표준 발현 유전자인지 확인하는 것을 원하는 유전자를 의미하며, 유전자의 종류에 특별한 한정은 없다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 M값은 geNorm 프로그램;
상기 발현 편차에 따른 안정성 값은 NormFinder 프로그램; 및
상기 r값, CV값 및 SD값은 BestKeeper 프로그램을 이용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 있어 "geNorm"은 모든 후보 유전자의 상기 M값을 측정 및 비교하고, 가장 높은 상기 M값을 가진 유전자를 제거하는데, 두 개의 유전자가 남을 때까지 상기 과정을 되풀이한다. 상기 M값은 다른 후보 유전자와 비교해서 후보 유전자의 변형을 나타낸다. 남아있는 후보 유전자의 마지막 쌍이 최적의 표준 발현 유전자로써 제의된다. geNorm에서는 발현 편차에 따른 안정성 값이 낮을수록, 발현이 안정한 유전자라고 판단된다. geNorm 프로그램 상에서 표준 발현 유전자의 최적의 개수를 구하기 위해 표준화 요소(Normalization factor; NF)의 값(V값)을 구하는 단계가 더 포함될 수 있다. 상기 V값이 0.15 이하이면 다른 표준 발현 유전자가 추가적으로 필요 없는 것으로 제의된다.
본 발명에 있어 "NormFinder"는 후보 유전자의 그룹의 정보를 고려하여 각각의 그룹 안에서뿐만 아니라 하위 그룹 사이의 유전자 발현의 변수를 고려하여 발현 편차에 따른 안정성 값을 측정한다. NormFinder는 발현 편차에 따른 안정성 값이 낮을수록, 발현이 안정한 유전자라고 판단한다.
본 발명에 있어 "BestKeeper"는 상기 r값, CV값 및 SD값을 기초로 10개의 후보 유전자 중에 가장 적합한 표준 발현 유전자들을 결정하고, 상기 유전자들을 하나의 인덱스로 병합한다. 상기 인덱스는 표준 발현 유전자를 선발하기 위해 또 다른 10개의 후보 유전자들과 비교될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TBP 및 HSPCB 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 버크셔 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA 및 TBP 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 두록 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TBP, RPL4 및 RPS18 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 랜드레이스 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 PPIA, TOP2B, RPL4 및 RPS18 중 적어도 어느 하나의 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 요크셔 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법이 제공될 수 있다.
일반적으로 사용되는 RNA를 수득하는 방법 및 이로부터 cDNA를 합성하는 방법은 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이 과정에 대한 자세한 설명은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); 및 Noonan, K. F. 등에 개시되어 있어 본 발명의 참조로서 삽입될 수 있다.
본 발명에서 상기 "정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계"는 당업자에게 공지된 PCR 증폭 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 증폭 방법은 중합효소연쇄반응(PCR; Realtime PCR을 포함), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계는 iQTM5 and MyiQTM real-time PCR detection system과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하는 것을 통해 이루어질 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1: 후보 표준 발현 유전자의 선발
4 돼지 품종 (버크셔, 랜드레이스, 두록 및 요크셔)의 7 조직(간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장 및 대장)에서 적절한 표준 발현 유전자를 선발하기 위해 안정하게 발현이 유도되는 이전 연구에서 공통적으로 사용되어온 유전자들 중에서 15개의 후보 표준 발현 유전자를 선택했다(도 1). 또한, 상호 조절의 위험성을 최소화하기 위해 다른 기능적 분류에 포함되는 유전자를 선택했다. 이들 기준에 의해 ACTB, ALDOA, B2M, GAPDH, HPRT1, HSPCB, PGK1, PPIA, POLR2G, RPL4, RPS18, SDHA, TBP, TOP2B, 및 YWHAZ 등이 선발되었다(도 2). RT-qPCR은 버크셔, 랜드레이스, 두록, 요크셔의 4품종으로부터 간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장, 대장 등의 샘플을 확보하여 수행하였다. RT-qPCR을 위해 사용된 프라이머 및 RT-qPCR의 결과는 하기 표 1에 서술되어 있다.
실시예
2:
GeNorm
분석에 의한 후보 표준 발현 유전자의 발현 안정성 검사
15개의 후보 표준 발현 유전자의 안정성 값 (M값)은 geNorm 프로그램을 사용하여 계산되었다(도 3). PPIA와 TBP는 버크셔와 두록에서 각각 0.21과 0.15로서 낮은 M값으로 가장 안정한 2개의 유전자로 발견되었다(도 3A와 B). RPL4와 RPS18은 랜드레이스와 요크셔에서 각각 0.16과 0.18으로 낮은 M값으로써 가장 안정한 2개의 유전자였다(도 3C와 D). 버크셔에서 PPIA와 TBP (0.21) 이외에 다른 유전자의 M값은 HSPCB (0.23), RPS18 (0.24), RPL4 (0.27), POLR2G (0.36), B2M (0.43), PGK1 (0.50), TOP2B (0.56), GAPDH (0.61), YWHAZ (0.68), ALDOA (0.73), ACTB (0.76), SDHA (0.84), HPRT1 (0.97) 등으로 나타났다. 두록에서 PPIA와 TBP (0.15) 이외에 다른 유전자의 M값은 RPL4 (0.25), HSPCB (0.36), RPS18 (0.41), TOP2B (0.46), B2M (0.50), ALDOA (0.53), POLR2G (0.58), GAPDH (0.61), ACTB (0.66), YWHAZ (0.69), PGK1 (0.72), SDHA (0.80), 및 HPRT1 (0.90) 등으로 관찰되었다. 랜드레이스에서 RPL4와 RPS18 (0.16) 이외에 다른 유전자의 M값은 PPIA (0.28), TOP2B (0.35), TBP (0.38), HSPCB (0.41), ALDOA (0.46), ACTB (0.50), YWHAZ (0.53), GAPDH (0.57), B2M (0.61), POLR2G (0.65), PGK1 (0.69), SDHA (0.76), 및 HPRT1 (0.87) 등으로 관찰되었다. 요크셔에서 RPL4와 RPS18 (0.18) 이외에 다른 유전자의 M값은 PPIA (0.30), TOP2B (0.33), HSPCB (0.38), POLR2G (0.42), TBP (0.45), B2M (0.48), ACTB (0.52), ALDOA (0.56), YWHAZ (0.59), GAPDH (0.63), PGK1 (0.66), SDHA (0.75), HPRT1 (0.87) 등으로 나타났다.
GeNorm 프로그램에서 가장 안정한 표준 발현 유전자의 일정한 개수 이상의 이용이 표준화 요소(Normalization factor; NF)의 계산을 위해 요구되었다. 따라서 RT-qPCR로부터 신뢰성 있는 결과를 얻기 위해 요구되는 최적 수를 분석했다(도 4). 개발자에 의해 제의된 geNorm 프로그램 상에 cut-off 값(V값)은 0.15이며, 이 값 이하에서는 다른 표준 발현 유전자가 추가적으로 필요 없는 것으로 제의되었다. 쌍으로 된 편차 V2/3가 버크셔에서 0.070, 두록에서 0.098, 랜드레이스에서 0.110, 요크셔에서 0.116 이었고, 모든 값들이 0.15 보다 낮았다. 그러나 추가적인 표준 발현 유전자가 첨가되면서 더욱 V값이 낮아졌다. 그래서 좀 더 정확한 NF의 계산에서, 두록에서는 2개의 유전자, 버크셔와 요크셔는 3개의 유전자, 랜드레이스에는 4개의 유전자가 가장 안정한 표준 발현 유전자로서 요구되었다.
실시예
3:
NormFinder
분석 결과
NormFinder는 후보 표준 발현 유전자의 발현 편차에 따르는 안정성 값과 표준편차를 계산한다. NormFinder 분석 결과로부터 PPIA가 사용된 모든 돼지 품종에서 가장 낮은 값을 나타내는 가장 안정한 표준 발현 유전자로 나타났다 (표 2). 버크셔에서는 TBP (0.073), HSPCB (0.073), RPS18 (0.106), RPL4 (0.161), TOP2B (0.393), GAPDH (0.395), POLR2G (0.410), PGK1 (0.447), B2M (0.467), ALDOA (0.618), YWHAZ (0.643), ACTB (0.670), SDHA (0.811), HPRT1 (1.212) 등의 순서로 안정성 값을 보였고, 두록에서는 TBP (0.079), RPL4 (0.131), HSPCB (0.297), TOP2B (0.305), GAPDH (0.341), POLR2G (0.377), RPS18 (0.381), B2M (0.403), ALDOA (0.424), PGK1 (0.454), ACTB (0.574), YWHAZ (0.615), SDHA (0.822), HPRT1 (1.002) 등의 순서로, 랜드레이스에서는 TBP (0.134), RPL4 (0.156), RPS18 (0.174), TOP2B (0.250), GAPDH (0.288), HSPCB (0.369), POLR2G (0.393), ALDOA (0.404), B2M (0.476), PGK1 (0.494), ACTB (0.501), YWHAZ (0.557), SDHA (0.718), HPRT1 (1.054) 등의 순서로, 요크셔에서는 TOP2B (0.176), POLR2G (0.201), RPS18 (0.204), RPL4 (0.218), TBP (0.250), HSPCB (0.289), GAPDH (0.356), B2M (0.387), PGK1 (0.411), ACTB (0.475), ALDOA (0.495), YWHAZ (0.573), SDHA (0.824), HPRT1 (1.110) 등의 순서로 안정한 표준 발현 값을 보였다.
실시예
4:
BestKeeper
분석 결과
BestKeeper 프로그램에서 상관관계 계수(r값), CV값, SD값 등에 기반하여 최적합 표준 발현 유전자를 결정하였다(표 3). 이 프로그램에서는 10 유전자 이상의 r값을 계산할 수 있다. 따라서 geNorm과 NormFinder 프로그램의 결과에 의해 가장 적합한 10 후보 유전자를 선발하였다. BestKeeper 프로그램에서 보다 높은 r값(≥0.900)과 보다 낮은 CV와 SD값이 안정하고 적합한 표준 발현 유전자이다. 버크셔에서 POLR2G 유전자가 10 후보 유전자 중에서 가장 낮은 CV (2.13)와 SD (0.39)값을 보였고, 모든 분석된 샘플에서 안정하게 발현되었다. 그러나 POLR2G 낮은 r값(0.616)으로 다른 후보 표준 발현 유전자와 상관관계가 없는 것을 나타내고 있다. 따라서 BestKeeper 프로그램으로 선발된 안정한 표준 발현 유전자는 다음과 같다. 버크셔와 두록은 TBP, 랜드레이스는 RPL4, 요크셔는 TOP2B 등이 선발되었다.
위의 결과를 종합해, 버크셔에서 PPIA, TBP, HSPCB , 랜드레이스에서는 PPIA, TBP, RPL4, RPS18, 두록에서는 PPIA , TBP, 요크셔에서는 PPIA, TOP2B, RPL4, RPS18 등이 안정하고 적절한 표준 발현 유전자인 것으로 나타났다(표 4).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Gyeongnam national university of science and technology
<120> Composition for RT-qPCR analysis according to pig breeds and
method for assessing the expression levels of genes of interest
using the same
<130> NPF-27543
<160> 30
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
tctggcacca caccttct 18
<210> 2
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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tgatctgggt catcttctca c 21
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<212> DNA
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<400> 3
gaaccaacgg cgagacaa 18
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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atgatggcga gggaggag 18
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 5
ttcacaccgc tccagtag 18
<210> 6
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<213> Sus scrofa
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ccagatacat agcagttcag g 21
<210> 7
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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atcctgggct acactgagga 20
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 8
tgtcgtacca ggaaatgagc t 21
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ccgaggattt ggaaaaggt 19
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 10
ctatttctgt tcagtgcttt gatgt 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ggcagaagac aaggagaac 19
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<212> DNA
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cagactggga ggtatggtag 20
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agataacgaa caaccagagg 20
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<213> Sus scrofa
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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ctcaagtcaa caaggtcgga c 21
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<213> Sus scrofa
<400> 16
gtcccaacaa tcttcaggcg 20
<210> 17
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 17
cacaaacggt tcccagtttt 20
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 18
tgtccacagt cagcaatggt 20
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<212> DNA
<213> Sus scrofa
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aggaggctgt tctgcttctg 20
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<213> Sus scrofa
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tccagggatg tttctgaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
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gcgattaagg gtgtaggacg 20
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<213> Sus scrofa
<400> 22
gacctggctg tacttcccat 20
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<212> DNA
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gaaccgaaga tggcaaga 18
<210> 24
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<213> Sus scrofa
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agcagcacag tacgagcaa 19
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ctatttctgt tcagtgcttt gatgt 25
Claims (17)
- 돼지 유전자 TBP 증폭용 서열번호 25 및 26으로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트; 및
돼지 유전자 RPS18 증폭용 서열번호 21 및 22로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트를 포함하여 표준 발현 유전자 TBP 및 RPS18을 증폭하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
돼지 유전자 HSPCB 증폭용 서열번호 11 및 12로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트; 및
돼지 유전자 TOP2B 증폭용 서열번호 27 및 28로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 세트 중 1 이상을 더 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 돼지 품종은 버크셔, 두록, 랜드레이스 또는 요크셔 돼지인 것을 특징으로 하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 표준 발현 유전자는 간, 폐, 신장, 비장, 위, 소장 또는 대장에서 발현되는 것을 특징으로 하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 TBP와 HSPCB 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 버크셔 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법. - 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 TBP 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 두록 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법. - 피검체로부터 수득된 RNA로부터 cDNA를 수득하는 단계;
상기 cDNA를 주형 DNA로 하여 목표 유전자, 및 TBP, RPL4 및 RPS18 표준 발현 유전자를 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
상기 표준 발현 유전자의 발현 정도를 이용하여 상기 목표 유전자의 발현 정도를 보정하는 단계를 포함하는 랜드레이스 돼지의 목표 유전자의 발현량 정량 방법. - 삭제
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| KR1020150031125A KR101768091B1 (ko) | 2015-03-05 | 2015-03-05 | 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 이를 이용한 목표 유전자의 발현량 정량 방법 |
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| KR1020150031125A KR101768091B1 (ko) | 2015-03-05 | 2015-03-05 | 돼지 품종별 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 분석용 조성물 및 이를 이용한 목표 유전자의 발현량 정량 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR101768091B1 (ko) |
-
2015
- 2015-03-05 KR KR1020150031125A patent/KR101768091B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Animal Science Papers and Reports, Vol. 29 (2011) No. 1, pp.53-63 |
| BMC Research Notes 2011, 4:441, pp.1-13* |
| Meat Science, Vol.87 (2011), pp.191-195 |
| NCBI BLAST* |
| Theriogenology, Vol. 76 (2011), pp.1058-1069* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20160108713A (ko) | 2016-09-20 |
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| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |