KR101767420B1 - 식품 내 어육 검출용 ｐｃｒ 프라이머 세트 및 이를 이용한 어육 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 식품 내 어육 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트를 이용하면 식품 내 어육이 함유되었는지 확인이 가능하므로, 돼지고기, 닭고기 등의 식육과 어육을 구별하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 어육 검출 방법에 대한 것이다.
도축 후 가공처리를 거친 육제품과 가공 혼합육의 제조에 이용된 동물성 원료의 구분을 위해 DNA 정보에 기반하여 PCR 기법을 응용한 연구들이 보고되었다. 종 동정이나 첨가된 다른 종을 식별하는 방법은 미토콘드리아 DNA 내 16S rRNA 유전자를 이용한 종-특이적인 PCR, PCR-RFLP 방법 등이 개발된 바 있다. 그 예로 일본 등록특허공보 제5205525호는 '어류의 식별 방법'에 관한 것으로, 어류 피검체 유래의 미토콘드리아 DNA에 대해서, 16S rRNA 유전자 영역을 증폭하여 제한 효소로 처리하고, 절단된 DNA 단편 길이의 패턴을 비교하여 어종을 식별하는 방법을 개시하고 있다(특허문헌 1).
그러나 16S rRNA 유전자의 경우 종간 상동성이 높아 종-특이적인 분석 효율에 다소 의문이 가며, 종 내에서도 해당 유전자 내에 삽입/결실 돌연변이가 다수 존재하는 것으로 알려져 있어 PCR 프라이머의 정확한 결합 여부도 의심된다. 또한, 동일 종 내에서 품종 간 변이가 심하여, 엄격한 조건 하에서 종-특이 PCR을 수행해야한다는 점 등은 분자 종 판별에 있어 16S rRNA 유전자를 활용할 때 일정 수준의 오류를 내포하고 있음을 말한다.
이에 본 발명에서는 16S rRNA 부위가 아닌 다른 미토콘드리아 DNA 부위 및 핵 DNA 유전자 부위에서 어육 특이적 서열을 발견하여 높은 특이성으로 식품 내 어육을 검출할 수 있는 프라이머를 개발하였다.
본 발명의 목적은 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식품 내 어육 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식품 내 어육 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트, 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트이다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 어육 특이적 프라이머 세트이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 Fish_mtF 및 Fish_mtR이며, 이를 이용하여 PCR을 수행하면 어류의 미토콘드리아 DNA의 ND4(NADH dehydrogenase subnunit 4) 유전자 부위에서 특이적인 150 bp의 산물이 증폭된다. 또한, 상기 프라이머를 이용하여 돼지고기, 닭고기, 어육의 DNA를 증폭하면 돼지 DNA, 닭 DNA, 돼지와 닭의 혼합 DNA에서는 증폭산물이 관찰되지 않고 어육에서만 증폭되므로 식품 내 어육이 함유되어 있음을 특이적으로 확인할 수 있다.
상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 Meat_mc3F 및 Meat_mc3R이며, 이를 이용하여 PCR을 수행하면 돼지(Sus scrofa), 닭(Gallus gallus demesticus), 어류의 MC3R(melanocortin 3 receptor) 유전자의 DNA 부위에서 특이적인 산물을 증폭한다. 이 때, 돼지 DNA 및/또는 닭 DNA가 함유되어 있는 경우 264 bp의 PCR 산물이 증폭되며, 어육 DNA가 함유되어 있는 경우 480 bp의 PCR 산물이 증폭되므로 식품 내 어육이 함유되어 있음을 특이적으로 확인할 수 있다. 또한, 어육의 함유뿐만 아니라 돼지고기 및/또는 닭고기가 함유되어 있는지 여부도 확인할 수 있다.
상기 식품이란 식육을 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 식품을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 축산물의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 더욱 바람직하게는 돼지고기, 닭고기, 어육의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 가장 바람직하게는 어육을 함유하는 소시지일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "어육"이란 생선의 가식부(fish meat)을 의미하는 것으로, 어류 유래의 고기를 말한다. 어육이 될 수 있는 어류의 종으로는 대구, 대서양 대구, 명태, 백조기, 조기, 성대, 양태, 갈치, 실꼬리돔, 참돔, 감성돔, 황돔, 붉은돔, 고등어, 다랑어가 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트와 이의 PCR 반응 혼합물을 포함하는 어육 검출용 PCR 키트를 제공한다.
상기 PCR 반응 혼합물은 dNTP, DNA 폴리머라아제 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 이 기술분야의 통상의 기술자가 PCR 반응에 이용할 수 있는 시약을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 식품 내 어육의 검출 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 식품으로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 제작하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하는 단계를 포함하는 식품 내 어육의 검출 방법을 제공한다.
상기 식품이란 식육을 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 식품을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 축산물의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 더욱 바람직하게는 돼지고기, 닭고기, 어육의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 가장 바람직하게는 어육을 함유하는 소시지일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 Fish_mtF 및 Fish_mtR 프라이머 세트이다.
상기 PCR은 어닐링(annealing) 온도가 63-67 ℃일 수 있으며, 가장 바람직하게는 65 ℃일 수 있다.
상기 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 PCR 산물은 150 bp 일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 돼지고기, 닭고기, 어육, 혼합육(돼지고기, 닭고기 및 어육 함유)을 시료로 하여 PCR 증폭 반응을 수행한 결과, 어육이 함유되어 있는 시료에서만 150 bp의 특이적인 PCR 산물이 증폭되었으므로 이를 이용하여 식품 내 어육을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.
또한, 본 발명은 식품 내 어육의 검출 방법을 제공한다. 구체적으로,
1) 식품으로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 제작하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 PCR 산물의 크기에 따라 식품 내 어육이 함유되었는지 확인하는 단계를 포함하는 식품 내 어육의 검출 방법을 제공한다.
상기 식품이란 식육을 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 식품을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 축산물의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 더욱 바람직하게는 돼지고기, 닭고기, 어육의 혼합육을 함유하는 가공식품일 수 있고, 가장 바람직하게는 어육을 함유하는 소시지일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 Meat_mc3F 및 Meat_mc3R 프라이머 세트일 수 있다.
상기 PCR은 어닐링(annealing) 온도가 63-67 ℃일 수 있으며, 가장 바람직하게는 65 ℃일 수 있다.
상기 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 5)의 PCR 산물이 480 bp의 PCR 산물이면 어육, 264 bp의 PCR 산물이면 돼지고기 및/또는 닭고기가 식품 내 함유되어 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 식품 내 어육 검출용 프라이머 세트를 이용한 어육 검출 방법은 유통 중인 어육 함유 가공육제품 또는 어육이 포함된 것으로 기재된 소시지 등의 농수축산물 가공식품에 어육이 함유되어 있는지를 확인하는 것이 가능하므로 혼합육에서 어육을 검출하는 데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 어육 특이적 프라이머 세트를 이용하여 대구에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Fish_mtR 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 2는 어육 특이적 프라이머 세트를 이용하여 대서양 대구에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Fish_mtR 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 3은 어육 특이적 프라이머 세트를 이용하여 그린란드 대구에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Fish_mtR 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 4는 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트를 이용하여 돼지, 닭, 대구(Gadus macrocephalus)에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Meat_mc3 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 어육 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용한 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
레인 돼지, 돼지 DNA;
레인 닭, 닭 DNA;
레인 연육, 어육 DNA(150 bp); 및
레인 돼지/닭, 돼지 및 닭의 혼합 DNA.
도 6은 본 발명의 어육 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용한 여러 가지 혼합조건의 가공육에서의 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
+, DNA 함유; 및
-, DNA 미함유.
도 7은 본 발명의 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호4)를 이용한 여러 가지 혼합조건의 가공육에서의 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
+, DNA 함유; 및
-, DNA 미함유.
도 2는 어육 특이적 프라이머 세트를 이용하여 대서양 대구에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Fish_mtR 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 3은 어육 특이적 프라이머 세트를 이용하여 그린란드 대구에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Fish_mtR 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 4는 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트를 이용하여 돼지, 닭, 대구(Gadus macrocephalus)에서 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열, 프라이머의 결합 위치(밑줄 부분), 프라이머 서열(Meat_mc3 프라이머 서열과 밑줄 친 DNA 서열이 역방향 상보적으로 결합함)을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 어육 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용한 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
레인 돼지, 돼지 DNA;
레인 닭, 닭 DNA;
레인 연육, 어육 DNA(150 bp); 및
레인 돼지/닭, 돼지 및 닭의 혼합 DNA.
도 6은 본 발명의 어육 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용한 여러 가지 혼합조건의 가공육에서의 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
+, DNA 함유; 및
-, DNA 미함유.
도 7은 본 발명의 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호4)를 이용한 여러 가지 혼합조건의 가공육에서의 PCR 증폭 결과를 나타낸 도이다:
레인 M, 100 bp Plus DNA ladder;
+, DNA 함유; 및
-, DNA 미함유.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<
실시예
1>
어육
특이적
프라이머
, 및
혼합육
원료 동시판별용
프라이머의
제작
NCBI database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용하여 대구(Gadus macrocephalus), 대서양 대구(Gadus morhua), 명태(Gadus chalcogrammus), 백조기(Pennahia argentata)의 미토콘드리아 DNA 서열정보를 수집하였다. 그리고 미토콘드리아 서열 (NCBI Accession number : 대구, DQ356937 및 DQ356938; 대서양 대구, EU877729; 명태, DQ356946, NC_004449 및 AB182300; 및 백조기, KC545800)의 ND4(NADH dehydrogenase subnunit 4) 유전자의 DNA 부위를 타겟으로 하여 어육 특이적 프라이머 세트를 설계하였다. 설계된 프라이머는 Fish_mtF(서열번호 1)와 Fish_mtR(서열번호 2)로 명명하여 제작을 의뢰(CosmoGenetech, Korea)하였으며, PCR 산물의 크기는 150 bp 이었다. 대구(Gadus macrocephalus), 대서양 대구(Gadus morhua) 또는 그린란드 대구(Gadus ogac)를 시료로 하여 어육 특이적 프라이머 세트(서열번호 1 및 서열번호 2)를 이용하여 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열과 프라이머의 결합 위치는 각각 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.
또한, 어류(제브라피쉬, Danio rerio), 돼지(Sus scrofa), 닭(Gallus gallus demesticus)의 핵 DNA 유전자인 MC3R(melanocortin 3 receptor) 유전자 (NCBI Accession number : 제브라피쉬, NAY161849; 돼지, FJ185221; 및 닭, AB017137)의 DNA 부위를 타겟으로 하여 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트를 설계하였다. 설계된 프라이머는 Meat_mc3F(서열번호 3)과 Meat_mc3R(서열번호 4)로 명명하여 제작을 의뢰(CosmoGenetech, Korea)하였으며, PCR 산물의 크기는 돼지 또는 닭의 경우 264 bp, 어육의 경우 480 bp 이었다. 돼지(Sus scrofa), 닭(Gallus gallus demesticus) 또는 대구(Gadus macrocephalus)을 시료로 하여 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용하여 증폭한 PCR 산물의 DNA 서열과 프라이머의 결합 위치는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 어류를 시료로한 PCR 산물의 DNA 서열은 어류의 종에 따라 다형성이 발견될 수 있는 것으로, 어류 중 대구(Gadus macrocephalus)를 대표로 나타낸 것일 뿐이다.
하기 표 1에 본 발명의 프라이머를 나타내었다.
| 구분 | 서열번호 | 프라이머 명칭 | 방향 | 서열(5'→3') | 증폭 온도 | PCR 산물의 길이 (bp) |
| 어육 특이적 프라이머 세트 | 서열번호 1 | Fish_mtF | 정방향 | TCTTACCGGGGTTGGAACTTTA | 65℃ | 150 |
| 서열번호 2 | Fish_mtR | 역방향 | AGGGGGATTAGATGAAGGGCTA | |||
| 혼합육 원료 동시판별용 프라이머 세트 | 서열번호 3 | Meat_mc3F | 정방향 | GGGATCATCAGCCTGCTGGA | 65℃ | - 돼지 또는 닭: 264 - 어육 : 480 |
| 서열번호 4 | Meat_mc3R | 역방향 | CAAGAGGTTGCAAATTGAGGC |
<
실시예
2>
어육
특이적
프라이머의
특이성 측정
<2-1> 시료의 준비 및 DNA 추출
돼지고기, 닭고기, 어육(혼합육 제조 시 사용된 원료 연육), 혼합육은 국립축산과학원 축산물이용과로부터 준비하였다. 상기 준비한 시료에서 핵 가수분해 용액(nuclei lysis solution) (27% sucrose, 1X SSC, 1mM EDTA, 1% SDS)과 200 ㎍/ml 프로테이나제(proteinase) K를 이용하여 용해하고, 3M 아세트산나트륨(sodium acetate)을 이용하여 단백질을 침강시켜 제거하였다. 이후 이소프로판올(iso-propanol) 동량을 첨가하여 각각의 DNA를 추출하였다.
<2-2> 어육 특이적 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭 시험
제작한 어육 특이적 프라이머(Fish_mtF 및 Fish_mtR)의 어육 특이성을 확인하기 위하여, 돼지, 닭, 어육 시료에서 추출한 DNA를 <실시예 1>에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다.
구체적으로, <실시예 2-1>에서 추출한 DNA 100ng과 <실시예 1>에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열로 이루어지는 프라이머 세트 10nanomole 및 DNA 중합효소 0.4 unit을 10X PCR buffer(GenetBio, Korea)에 각각 첨가하여 PTC-200(MJ Research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 30초 변성, 65℃에서 45초 어닐링, 72℃에서 45초 신장을 35회 수행하는 조건에서 PCR을 수행하였다. 이는 돼지, 닭, 어육의 추출 DNA 및 돼지-닭 혼합 DNA 각각에 대하여 수행하였다. PCR 증폭 산물은 EtBr이 포함된 1.5% 아가로스겔 상에서 100 bp DNA 래더(Bioneer, Korea)와 함께 전기영동한 후 관찰하였다.
도 4에 나타난 것과 같이, 어육 특이적인 150 bp PCR 산물이 어육 DNA에서만 증폭되고, 돼지 DNA, 닭 DNA, 돼지와 닭의 혼합 DNA에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다. 따라서, Fish_mtF(서열번호 1) 및 Fish_mtR(서열번호 2) 프라이머는 어육에서만 특이성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
<2-3> 여러 가지 혼합조건의 가공육에 대한 PCR 증폭 시험
여러 가지 혼합조건의 가공육에 대해서도 본 발명의 어육 특이적 프라이머가 특이성을 가지는지 확인하기 위하여, 다양한 혼합 시료에 대하여 PCR 증폭 시험을 하였다.
실시예 <2-2>의 PCR 조건과 같은 조건에서 시료 DNA의 종류만을 달리하여 PCR 증폭하였다. 이 때 이용한 시료는 돼지의 단독 DNA, 어육의 단독 DNA, 돼지와 어육의 혼합 DNA, 닭의 단독 DNA, 닭과 어육의 혼합 DNA, 돼지와 닭의 혼합 DNA로 다양하게 혼합 조건을 설정하였다(표 2). 표 2에서 + 는 시료 DNA의 함유, - 는 시료 DNA의 미함유를 나타낸다. 레인 1 내지 레인 7의 조건으로 PCR 증폭한 결과는 도 5에 나타내었다.
| 레인 1 | 레인 2 | 레인 3 | 레인 4 | 레인 5 | 레인 6 | 레인 7 | |
| 돼지 | + | + | + | + | + | + | + |
| 닭 | - | + | - | - | - | + | + |
| 어육 | - | - | + | - | + | + | + |
도 5에 나타난 것과 같이, 어육 특이적인 150 bp PCR 산물이 어육이 포함된 DNA를 주형으로 한 경우(레인 3, 5, 6, 7)만 증폭되고, 어육 DNA를 포함하지 않는 돼지 단독 DNA, 닭 단독 DNA, 돼지와 닭의 혼합 DNA에서는 증폭산물이 관찰되지 않았다.
따라서, Fish_mtF(서열번호 1) 및 Fish_mtR(서열번호 2) 프라이머는 다양한 조건의 돼지, 닭, 어육의 혼합 시료에서 어육의 DNA를 포함하는 시료에서만 특이성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
<
실시예
3>
혼합육
원료 동시판별용
프라이머를
이용한
PCR
증폭 시험
제작한 혼합육 원료 동시판별용 프라이머(Meat_mtF 및 Meat_mtR)가 여러 가지 혼합조건의 가공육에 대해서 원료 종을 특이적으로 검출하는지 확인하기 위하여, 다양한 혼합시료에 대하여 <실시예 1>에서 제작한 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열로 이루어지는 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 각각 수행하였다.
구체적으로, 실시예 <2-2>의 PCR 조건과 같은 조건에서 프라이머의 종류와 시료 DNA의 종류만을 달리하여 PCR 증폭하였다. 프라이머는 Meat_F(서열번호 3) 및 Meat_R(서열번호 4) 프라이머를 이용하였으며, 시료는 돼지의 단독 DNA, 어육의 단독 DNA, 돼지와 어육의 혼합 DNA, 닭의 단독 DNA, 닭과 어육의 혼합 DNA, 돼지와 닭의 혼합 DNA로 다양하게 혼합 조건을 설정하였다(표 4). 표 3에서 + 는 시료 DNA의 함유, - 는 시료 DNA의 미함유를 나타낸다. 레인 1 내지 레인 10의 조건으로 PCR 증폭한 결과는 도 6에 나타내었다.
| 레인 1 | 레인 2 | 레인 3 | 레인 4 | 레인 5 | 레인 6 | 레인 7 | 레인 8 | 레인 9 | 레인 10 | |
| 어육 | - | - | + | + | + | - | - | + | - | - |
| 돼지 | + | + | - | - | + | - | - | - | + | + |
| 닭 | - | - | - | - | - | + | + | + | + | + |
도 3에 나타난 바와 같이, 돼지(레인 1, 2), 닭(레인 6, 7), 돼지 및 닭 혼합 DNA(레인 9, 10)에서는 264 bp의 PCR 산물만 관찰되었으며, 어육 단독(레인 3, 4) 시료에서는 480 bp의 PCR 산물만이 관찰되었고, 돼지 또는 닭이 어육과 혼합된 시료(레인 5, 8)에서는 264 bp, 480 bp의 PCR 산물이 모두 관찰되었다(도 6).
따라서, 본 발명의 Meat_F(서열번호 3) 및 Meat_R(서열번호 4) 프라이머 세트는 다양한 조건의 돼지, 닭, 어육 혼합 시료에서 어육의 DNA가 포함된 시료의 경우 특이적으로 480 bp의 산물을 증폭하고, 돼지 및/또는 닭의 DNA가 포함된 시료의 경우 특이적으로 264 bp의 산물을 증폭함을 알 수 있었다.
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detecting using the same
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<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fish_mtF
<400> 1
tcttaccggg gttggaactt ta 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fish_mtR
<400> 2
agggggatta gatgaagggc ta 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Meat_mc3F
<400> 3
gggatcatca gcctgctgga 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Meat_mc3R
<400> 4
caagaggttg caaattgagg c 21
Claims (9)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 1) 식품으로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 어류의 미토콘드리아 DNA의 ND4(NADH dehydrogenase subunit 4) 유전자 부위에서 특이적인 150 bp의 PCR 산물을 증폭하는, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트를 제작하는 단계;
3) 상기 단계 1)에서 추출된 DNA를 상기 프라이머 세트를 이용하여 63~67℃의 어닐링(annealing) 온도에서 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 PCR 산물을 전기영동으로 분리하는 단계를 포함하는 식품 내 어육의 검출 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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| KR101219763B1 (ko) | 2012-06-01 | 2013-01-24 | 대한민국 | 식품원료 내 어류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법 |
| KR101277800B1 (ko) | 2012-06-01 | 2013-06-27 | 대한민국 | 식품원료 내 연체류 원료의 혼입여부를 판별하는 방법 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Meat Science, Vol. 76, Issue 4, pp. 666-674 (2007.08.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101767423B1 (ko) | 2017-08-16 |
| KR20160058679A (ko) | 2016-05-25 |
| KR20170088811A (ko) | 2017-08-02 |
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