KR101764005B1

KR101764005B1 - 도파민 검출 방법

Info

Publication number: KR101764005B1
Application number: KR1020150098506A
Authority: KR
Inventors: 김종성; 조비
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-10
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2017-08-02
Also published as: KR20170007653A

Abstract

본 발명은 도파민 검출 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 (i) 가교제를 사용하여 코어/쉘 양자점을 도파민 함유 용액과 접촉시키는 단계; (ii) 상기 양자점에 결합된 도파민을을 산화시킨 후 상기 양자점의 형광 소광도를 검출하는 단계; 및 (iii) 상기 형광 소광도와 기준 형광 소광도와 비교하여 상기 도파민의 농도를 구하는 단계를 포함하는, 도파민 검출 방법에 관한 것이다.

Description

도파민 검출 방법{Method for Detecting Dopamine}

최근에, 용이하고, 저비용으로, 더 정확한 신호를 발생시키는 장점을 가지는 다양한 형태의 바이오센서를 제조하기 위한 몇가지 연구가 수행되었다(A. P. F. Turner, Chem . Soc . Rev . 42, 3184 (2013)).

도파민(dopamine (DA); 3,4-디하이드록시페닐에틸아민)은 가장 중요한 카테콜 신경전달물질 중 하나이다. 1958년에, 스웨덴 과학자 Arivd Carlsson은, 도파민이 선조체(striatum) 내에 고농도로 존재하는데, 전체 뇌의 약 70%이고, 도파민이 뇌에서 신경전달물질이라는 점을 최초로 보고하였다.

호르몬, 신장, 심근 및 중추신경계의 기능에서 도파민의 중요한 역할이 잘 알려져 있다. 파킨슨씨병 및 간질과 같은 몇가지 심각한 질병은 도파민 결핍과 관련 있다. 도파민 농도가 생물학적 연구 및 임상 진단에 대한 주요한 마커이기 때문에, 선택적이고, 민감하며 신속한 도파민 검출물질을 제조할 필요가 있다.

그러나 생체 내에서 도파민의 농도는 매우 낮다. 예를 들면, 중추신경계의 세포외 체액 내의 도파민 농도는 100 nM 미만이다. 더욱이, 도파민 농도는 시간 및 위치에 따라 1.0×10^-7 M 내지 1.0×10^-3 M로 매우 광범위하게 변한다.

양자점은 삼차원의 모든 방향으로 구속된 여기자(confined exciton)를 가지는 형광 반도체 나노입자이다. 유기 형광 염료와 비교하여, 양자점은 높은 양자 수율, 좁은 방출 피크, 강한 신호 강도, 및 조절가능한 광발광과 같은 유망한 광학적 성질 및 매력적인 전기화학적 특성을 가지는데, 이로써 다양한 분야에의 응용에 대한 관심을 모으고 있다. 구체적으로, 양자점을 생물학적 탐침에 응용하는 데 있어서 현저한 발전이 이루어지고 있다. 기능화된 양자점의 작은 크기 때문에, 표적 분자 표면으로의 신속한 전자 에너지 전달(EET)을 통한 현저한 형광 소광(fluorescent quenching)이 일어난다.

흐름주입분석법(flow-injection analysis), 분광광도법(spectrophotometry), HPLC(high performance liquid chromatography), 트랜지스터-기반 감지, 및 전기화학적 검출을 포함하는 도파민의 직접 측정을 위한 방법들이 개발되었다. 나노기술의 등장으로 나노물질을 사용하는 새로운 도파민 검출 방법이 개발되었다. 예를 들면, Ganguly 등은 은 나노입자에 기반한 도파민 센서를 제작하였고(M. Ganguly, C. Mondal, J. Jana, A. Pal, and T. Pal, Langmuir 30, 4120 (2014)), Sabzi 등은 탄소 나노튜브 기반의 도파민 센서를 제작하였으며(R. E. Sabzi, K. Rezapour and N. Samad, J. Serb . Chem . Soc . 75, 537 (2010)), Zhao 등은 도파민의 양자점-증강 화학발광 검출(QD-enhanced chemiluminescence detection)을 보였다(Y. Zhao, S. Zhao, J. Huang, and F. Ye, Talanta 85, 2650 (2011)). 그러나 이러한 선행기술들은 나노물질의 표면개질에 기반한 2단계의 검출법을 사용한다.

본 발명에서, 카르복실 CdSe/ZnS 양자점을 사용하는 인시츄 도파민 검출 방법을 개시한다. 가교제인 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드와 설포-N-하이드록시석신이미드를 사용하여 도파민을 양자점과 접합시킨다. 도파민에 의한 양자점의 형광 소광을 통해 인시츄로(in situ) 도파민을 검출한다.

본 발명의 목적은 (i) 가교제를 사용하여 코어/쉘 양자점을 도파민 함유 용액과 접촉시키는 단계; (ii) 상기 양자점에 결합된 도파민을을 산화시킨 후 상기 양자점의 형광 소광도를 검출하는 단계; 및 (iii) 상기 형광 소광도와 기준 형광 소광도와 비교하여 상기 도파민의 농도를 구하는 단계를 포함하는, 도파민 검출 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명은 양자점의 형광 소광을 통해 시료 내에 미량으로 존재하는 도파민 농도를 간단하고 용이하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 (i) 가교제를 사용하여 코어/쉘 양자점을 도파민 함유 용액과 접촉시키는 단계; (ii) 상기 양자점에 결합된 도파민을을 산화시킨 후 상기 양자점의 형광 소광도를 검출하는 단계; 및 (iii) 상기 형광 소광도와 기준 형광 소광도와 비교하여 상기 도파민의 농도를 구하는 단계를 포함하는, 도파민 검출 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

본 명세서에서, "형광 소광(fluorescence quenching)"이란 어떤 물질의 형광 강도를 감소시키는 어떠한 과정을 의미한다. 다양한 분자 상호작용이 상기 형광 소광을 초래한다. 이러한 분자 상호작용에는 여기상태 반응(excited-state reactions), 분자 정렬(molecular rearrangements), 에너지 전달, 기저상태 착화합물 형성(ground-state complex formation), 및 충돌 소광(collisional quenching)이 포함된다.

본 명세서에서, "전자 에너지 전달(electronic energy transfer (EET))"이란 두 개의 광민감성 분자(발색단(chromophore)) 사이의 에너지 전달을 설명하는 메카니즘이다. 초기에 전자적 여기상태에 있는 공여 발색단(donor chromophore)은 비방사성 다이폴-다이폴 커플링(dipole-dipole coupling)을 통해 수용 발색단(dipole-dipole coupling)으로 에너지를 전달할 수 있다. 이러한 에너지 전달의 효율은 공여체와 수용체 간의 거리의 6승에 반비례하기 때문에, EET는 분자간 거리에 대단히 민감하다.

본 발명의 방법에서, 상기 가교제는 N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) 및 sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS)의 혼합물일 수 있다.

본 명세서에서, 상기 양자점은 코어(core)/쉘(shell) 구조의 양자점을 사용하는 것이 바람직하다. 양자점은 표면적 대 부피 비율이 대단히 커서 구성 원자들의 대부분이 표면에 노출되므로 원자 또는 분자 궤도가 완전히 결합되지 않는 형태로 남게 되고, 이는 양자점의 형광을 소광하는 결함부위로서 작용할 수 있다. 이 때문에 보다 넓은 밴드 간격을 갖는 다른 반도체의 쉘을 코어 표면에서 성장시켜 전자 절연효과를 얻는다. 더욱이, 쉘은 여기된 코어에 의하여 방출되는 형광을 안정화하고 강화시키는 역할을 하며, 바람직하게는 코어보다 높은 밴드 갭을 갖도록 하여 코어를 부동태화(passivation)함으로써 양자점의 여기가 코어로 한정되도록 하고, 산화로부터 보호할 뿐만 아니라, Cd/Se이 주변 용액 내로 용출(leeching)되는 것을 방지한다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 CdSe/ZnS 코어/쉘 구조의 양자점을 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 코어 양자점의 크기는, 바람직하게는 약 5 nm 내지 약 12 nm일 수 있다. 직경이 지나치게 작거나 큰 경우에는 안정성 저하에 따라 광 방출 특성을 구현하기 곤란하거나, 원하는 파장대의 빛을 방출하기 어려울 수 있으므로, 상술한 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 코어가 3 nm CdSe인 양자점은 520 nm 광을 방출하는 한편 코어가 5.5 nm CdSe인 양자점은 630 nm 광을 방출하며, 발광 폭(emission width)는 사이즈 분포에 의하여 영향을 받는다.

본 발명의 방법에서 상기 코어 양자점은 II-VI족 화합물로서 CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, ZnO, HgS, HgSe, HgTe 등의 이원소 화합물, CdSeS, CdSeTe, CdSTe, ZnSeS, ZnSeTe, ZnSTe, HgSeS, HgSeTe, HgSTe, CdZnS, CdZnSe, CdZnTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, HgZnS, HgZnSe 등의 삼원소 화합물, 또는 HgZnTe, CdZnSeS, CdZnSeTe, CdZnSTe, CdHgSeS, CdHgSeTe, CdHgSTe, HgZnSeS, HgZnSeTe, HgZnSTe 등의 사원소 화합물로부터 선택되거나; III-V족 화합물로서 GaN, GaP, GaAs, GaSb, AlN, AlP, AlAs, AlSb, InN, InP, InAs, InSb 등의 이원소 화합물, GaNP, GaNAs, GaNSb, GaPAs, GaPSb, AlNP, AlNAs, AlNSb, AlPAs, AlPSb, InNP, InNAs, InNSb, InPAs, InPSb, GaAlNP 등의 삼원소 화합물, 또는 GaAlNAs, GaAlNSb, GaAlPAs, GaAlPSb, GaInNP, GaInNAs, GaInNSb, GaInPAs, GaInPSb, InAlNP, InAlNAs, InAlNSb, InAlPAs, InAlPSb 등의 사원소 화합물로부터 선택되거나; IV-VI족 화합물로서 SnS, SnSe, SnTe, PbS, PbSe, PbTe 등의 이원소 화합물 또는 SnSeS, SnSeTe, SnSTe, PbSeS, PbSeTe, PbSTe, SnPbS, SnPbSe, SnPbTe 등의 삼원소 화합물, 또는 SnPbSSe, SnPbSeTe, SnPbSTe 등의 사원소 화합물로부터 선택되거나; IV족 화합물로서 Si, Ge 등의 단일 원소 또는 SiC, SiGe 등의 이원소 화합물로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 쉘 부분은 ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdO, CdS, CdSe, CdTe, MgS, MgSe, GaAs, GaN, GaP, GaAs, GaSb, HgO, HgS, HgSe, HgTe, InAs, InN, InP, InSb, AlAs, AlN, AlP, 또는 AlSb일 수 있다. 상기 쉘 부분의 두께는 8 nm 내지 10 nm일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시 태양에 있어서, 상기 코어/쉘 양자점은 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점이다. 본 발명의 하나의 실시 태양에 따르면, 상기 양자점의 쉘 표면에 카르복실기를 도입하여 도파민과의 결합을 용이하게 할 수 있다. 상기 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점을 함유하는 용액을, 도파민을 함유하는 물질과 접촉시킨다. 이때, 상기 양자점과 상기 도파민을 접합시킬 가교제로서 EDC 및 sulfo-NHS를 사용하여 상기 CdSe/ZnS 코어/쉘 양자점과 도파민을 접합시킨다. 또한, 상기 양자점과 도파민의 결합 과정의 pH는 1-13일 수 있다.

상기 양자점과 도파민이 접합된 후에 도파민은 산소나 전자 공여체에 의해 쉽게 산화된다. 도파민이 산화된 후, 상기 양자점으로부터 도파민 옥사이드(dopamine oxide)의 o-퀴논기(o-quinone group)로의 전자 에너지 전달에 의해 상기 양자점의 형광 강도가 소광된다. 이때, 상기 양자점의 형광 소광도는 도파민 농도에 의존한다. 따라서 이러한 도파민-접합 양자점의 형광 소광도를 측정함으로써 도파민의 양을 측정할 수 있다.

형광 소광의 원리가 도 1에 나타나 있다. 먼저, 양자점의 표면에 도파민을 접합시키고, 알칼리 용액 내에서 상기 도파민을 도파민-o-퀴논으로 산화시킨다. 상기 양자점으로부터 상기 도파민 옥사이드의 o-퀴논기로의 전자 전달에 의해 상기 양자점의 형광 세기를 소광시킨다. 도파민 농도가 다르면 형광 소광도가 달라진다. 이러한 형광 소광에 근거하여 도파민을 검출할 수 있다.

보다 구체적으로, 도파민의 농도를 아는 샘플을 이용하여 pH 1-13에 대하여 형광 소광도를 구한다. 이러한 형광 소광도 데이터를 이용하여 기준(reference) 형광 소광도 그래프를 작성한다(도 3h 참조). 이후, 도파민 농도를 모르는 미지의 샘플에 대하여 pH 값을 조절한 후(예를 들면, pH 9), 상기 미지의 샘플에 대한 형광 소광도를 측정한다. 마지막으로, 상기 미지의 샘플의 pH 및 형광 소광도 값을 상기 기준 형광 소광도 그래프(도 3h)에 내삽하여 상기 미지의 샘플의 농도를 구할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 양자점 기반의 바이오센서를 통해 나노스케일로 도파민을 인시츄 검출할 수 있다. 본 발명의 방법은 매우 간단하고 매우 낮은 검출 한계를 가지기 때문에, 도파민의 생체내 직접 검출에 응용될 수 있다.

도 1은 도파민-접합 양자점의 구조 및 전자 에너지 전달을 통한 광발광 소광을 보여 준다.
도 2(a) 내지 2(g)는 수용액 내에서 pH의 증가에 따른 도파민-접합 양자점의 광발광 강도 스펙트럼을 보여 주고((a) pH =1; (b) pH = 3; (c) pH = 5; (d) pH = 7; (e) pH = 9; (f) pH = 11; (g) pH = 13), 도 2(h)는 방출 피크에서 양자점의 형광 강도를 도파민 농도의 함수로서 보여 준다.
도 3(a) 내지 3(g)는 다양한 외부 pH 조건 하에서 일정한 도파민 농도((a) 1 nM; (b) 10 nM; (c) 100 nM; (d) 1 μM; (e) 10 μM; (f) 100 μM; 및 (g) 1 mM)를 가지는 도파민-접합 양자점의 광발광 스펙트럼을 보여 주고, 도 3(h)는 방출 피크에서 양자점의 광발광(형광) 소광을 pH의 함수로서 보여 준다.
도 4는 도파민 농도가 10 μM일 때 도파민-접합 양자점의 1일 후의 광발광 방출 스펙트럼이다.
도 5는 여분의 양자점을 첨가한 후 도파민-접합 양자점의 광발광 스펙트럼이다(pH 9).

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

EDC/sulfo-NHS 가교화 방법을 사용하여 CdSe/ZnS 카르복실 양자점(CdSe/ZnS carboxyl QD)을 도파민과 접합시켰다. 상기 양자점의 광발광 강도(PL intensity)를 다양한 도파민 농도 및 다양한 pH의 용액에서 측정하였다.

먼저, 5 μL의 카르복실 CdSe/ZnS 양자점(QD605-Carboxyl, Invitrogen) 및 10 μM의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)를 100 μL의 인산염완충식염수(pH 5.5)에 첨가하였다. 5분 후, 상기 혼합물을 5 mL의 탈이온수에 용해하였다. 10배 평균 구간(10-fold average interval)으로 도파민의 농도를 1 nM 내지 1 mM로 변화시키면서, 5 μM의 sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide)를 함께 첨가하였다. 용액의 pH를 1에서 13까지 점진적으로 변화시키면서 실험을 수행하였다. 큐빅 셀-이용 분광형광계(cubic cell-utilizing spectrofluorometer)를 사용하여 형광 소광도를 조사하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 도파민 분자를 CdSe/ZnS 양자점의 표면에 접합시켰다. 도파민은, 특히 알칼리성 용액 내에서, 산소뿐만 아니라 전자 공여체에 의해서도 쉽게 산화된다. 전자 에너지 전달로 인하여, 도파민-접합 양자점(dopamine-comjugated quantum dot; DA@QD)의 방출 광발광 강도(emission PL intensity)는 쉽게 소광된다. 더욱이, 높은 알칼리도 하에서, 도 2에 나타난 바와 같이 DA@QD 형광은 강하게 소광되었다. 도파민 주입 전에 광발광 강도를 상기 양자점의 강도에 기초하여 정규화하였다. 모든 실험들(총 7개)을 확실한 pH 값으로 수행하였다.

도 2는 상기 양자점의 형광 소광이 도파민 농도에 의존한다는 점을 보여 준다. 일반적으로, 상기 양자점의 광발광 강도는 도파민 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 그러나, 도 2(f)에 나타난 바와 같이, 100 μM의 도파민에서의 광발광 강도는 1 mM의 도파민에서의 광발광 강도보다 더 컸고, 이는 도파민의 산화 때문일 것이다. pH 13에서 도파민이 가장 많이 산화됨으로써, 더 많은 형광 방출이 일어났다. 또한, 도 2f는 광발광 강도가, 더 많은 도파민이 산화되는 알칼리 용액 내에서 더 강하게 소광되었고, 양자점으로부터 여기된 전자의 전달이 증가하며, 차례로, 더 강한 형광 소광이 일어났다는 점을 보여 준다. 그러나 pH가 9보다 큰 경우에, 산화된 도파민으로부터의 형광은, 특히 높은 도파민 농도에서, 전자 에너지 전달(EET)을 통한 형광 소광을 상회하였다. 도 2(h)는 방출 피크에서 양자점의 형광 소광의 정규화도(normalized degree)를 도파민 농도의 함수로서 보여 준다. 동일한 도파민 농도에서, DA@QD는 pH 9에서 가장 높은 형광 소광도를 나타냈다. 즉, 도파민에 대한 광발광 신호는 pH 9에서 더 민감하였다. 도 3은 양자점의 광발광 스펙트럼을 일정한 도파민 농도 하에서의 pH의 함수로서 보여 준다((a) 1 nM; (b) 10 nM; (c) 100 nM; (d) 1 μM; (e) 10 μM; (f) 100 μM; 및 (g) 1 mM). 다양한 pH 값을 갖는 용액에서 I를 양자점의 광발광 강도로, IQ를 DA@QD의 광발광 강도로 놓았다. 따라서 형광 소광도는 (1 - IQ/I)로 정의된다. 도 3(h)는 방출 피크에서 형광 소광의 강도를 pH의 함수로서 보여 준다. 높은 pH 조건 하에서, 더 많은 양의 도파민이 상기 양자점에 접합하였다. 양자점의 최고 형광 소광도는 약 90%이었고 pH 9에서 1 mM의 도파민의 경우에 발생했다. 그러나 DA@QD의 광발광 방출 피크는 고농도에서의 더 큰 산화된 도파민의 광발광 방출로 인하여 관찰되지 않았다. pH 9가 고농도(1 mM) 및 저농도(1 nM) 사이의 범위에서 도파민을 검출하기에 가장 적당한 조건으로 보였다.

도 4는 하룻밤 지난 후의 DA@QD의 광발광 방출 스펙트럼을 보여 준다. 산성 조건 하에서, 도파민은 산화되지 않았다. pH 1에서, DA@QD에 속하는 뚜렷한 방출 피크가 605 nm에서 관찰되었다. 그러나 pH 7 내지 pH 13에서는, 산화된 도파민에 기인한 현저한 방출 피크가 약 480 nm에서 나타났다. DA@QD와 형광 도파민 산화 착화합물 사이의 전자 에너지 전달에 의해 광발광 강도가 소광되었다고 판단된다.

또한, 이러한 가정을 증명하기 위한 실험을 수행하였다. 여분의 양자점을 상기 DA@QD 혼합물에 첨가하였고 1분 후 및 1일 후에 광발광 스펙트럼을 측정하였다. 이러한 착화합물의 광발광 스펙트럼이 도 5(pH 9)에 나타나 있다. 적색으로 표시된 DA@QD의 방출 스펙트럼은, 도파민의 산화를 의미하는 480 nm에서의 한 개의 피크, 및 양자점에 의한 605 nm에서의 또 다른 피크를 보였다. 여분의 양자점을 첨가한 후, 605 nm에서의 피크는 즉시 향상되었고, 480 nm에서의 피크는 변하지 않았는데, 이는 도파민이 산화되지 않았다는 것을 의미한다. 그러나 24시간 후, 605 nm에서의 피크는 완전히 소광되었고, 480 nm에서의 피크는 향상되었는데, 이는 여분의 양자점에 의해 증가된 도파민의 산화때문일 것이다. 이러한 결과는, 형광 소광을 통해 DA@QD가 pH, 산소 및 다른 산화제의 검출용 감지 매질(sensing media)로서 사용될 수 있다는 것을 보여 준다.

발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

가교제를 사용하여 코어/쉘 양자점을 도파민 함유 용액과 접촉시키는 단계;
상기 양자점에 결합된 도파민을 산화시킨 후 상기 양자점의 형광 소광도를 측정하는 단계; 및
상기 형광 소광도와 기준 형광 소광도와 비교하여 상기 도파민의 농도를 구하는 단계를 포함하는 도파민 검출방법으로서,
상기 양자점의 표면에 카르복실기가 존재하고,
상기 방법은 상기 가교제로 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) 및 sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide)를 사용하고, 상기 도파민 함유 용액의 pH는 1~13이고,
상기 도파민 농도를 구하는 단계는 상기 도파민 함유 용액의 pH 값과 측정된 형광소광도를 미리 측정된 기준 형광도 그래프에 내삽하여 도파민 농도를 구하는 단계인 것을 특징으로 하는 도파민 검출 방법.
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