KR101938374B1 - 양자점을 활용한 fret 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법 - Google Patents

양자점을 활용한 fret 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양자점을 활용한 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명의 표적 분자 검출 시스템은 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 포함하되, 상기 수용성 양자점 및 PNA에 검출대상인 표적 분자간의 표면 전하 차이에 의한 FRET 현상을 활용함으로써, 종래 생접합 공정을 통해 구현된 시스템에 비해서 준비 공정 및 검출 시간을 대폭 줄일 수 있고, 표적 분자에 대한 높은 선택성을 보이는 PNA 와 강한 형광신호세기를 제공할 수 있는 양자점과 결합으로 인해 유전자 검출감도가 향상되어, 혈액 속에 극미량 존재하는 표적 분자의 검출이 가능하므로, 암조기진단 시스템에 활용할 수 있다.

Description

양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법{FRET-BASED TARGET MOLECULE DETECTION SYSTEM, KIT THEREOF AND METHOD FOR DETECTING TARGET MOLECULE USING THE SAME}
본 발명은 양자점을 활용한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, 이하, "FRET"라 함) 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하 "PNA"라 함) 프로브를 포함하되, 상기 양자점, PNA 및 표적 분자간의 표면 전하 차이에 의한 FRET 현상을 활용함으로써, 생접합(bio-conjugation) 공정을 거치지 않는 간결한 반응과정을 통해 단시간에 검출 가능하고 선택성 및 민감도가 우수한, 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법에 관한 것이다.
FRET 현상은 1994년에 포스터(Forster)에 의해 처음 소개된 것으로 2가지 형광 물질의 상호작용에 기반한다. 즉, 2가지 형광 물질은 장거리 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의하여 하나의 여기된 형광분자에서 다른 형광분자로 비복사 과정을 통해 에너지가 전달되는 물리적인 현상이다.
이러한 물리적인 현상이 발생되기 위해서는 두 형광물질간 일정조건이 충족되어야 한다. 즉, 에너지를 주는 분자(공여체)는 방출하는 에너지의 파장이 에너지를 받는 분자(수용체)의 흡수 스펙트럼과 중복이 되어야 한다. 또한, 외부에서 공여체를 여기시키기 위하여 조사된 에너지가 공여체에서 수용체로 전달되는 비복사 전이 과정은 공여체와 수용체 사이 일정 거리 안에서 발생하며 그 거리는 대략 10∼100Å로 알려져 있다.
본 FRET 시스템에서 공여체로 사용된 양자점은 일반적으로 사용되는 유기 염료와는 달리, 입자크기에 따라 다른 파장의 형광을 방출하는 특징을 가지고 있으며, 넓은 흡수 스펙트럼을 가지는 반면에, 방출 스펙트럼은 좁은 특성을 가지고 있어서 각종 단백질칩 및 바이오센서 분야와 바이오 이미징 같은 응용 생명과학에도 다양하게 사용 가능하다.
또한, 종래 유기 염료에서 나타나는 포토블리칭(photobleaching) 현상이 현저히 감소하며, 화학반응에 안정한 무기물이기 때문에 양자점 표면 처리 기술을 이용하여 생체 물질과의 결합이 용이하다.
이러한 양자점의 우수한 특성을 활용하여 다양한 FRET 시스템을 이용한 DNA센서가 보고되고 있다[특허문헌 1].
또한, 장(Zhang) 등에 의한 비특허문헌 1은 스트렙아비딘으로 접합된 양자점 및 2종의 표적-특이성 DNA 프로브(바이오틴으로 라벨링된 캡쳐 프로브와 형광체로 라벨링된 리포터 프로브)로 FRET 시스템을 구성함으로써, 상기 2종의 프로브와 검출하기 원하는 특이 DNA가 샌드위치 구조의 하이브리드가 형성되고 이 부분이 양자점과 바이오틴-아비딘 결합을 형성한다. 이때 양자점에서 리포터 프로브의 형광체로 FRET 현상이 발생하며, 이를 통해서 발생하는 형광체의 빛의 세기로 표적 DNA의 유무를 판단한다.
나아가 비특허문헌 2는 비특허문헌 1의 FRET 시스템에 비해 양자점과 하나의 프로브로 구성하여 훨씬 간결해진 FRET 시스템을 보고하고 있는데, 구체적으로는, 분자 비콘(Molecular beacon) 구조의 프로브에 양자점의 방출 스펙트럼을 흡수할 수 있는 소광체(Quencher)를 표지하고 다른 한쪽 끝에는 바이오틴을 표지하였다. 양자점과 분자 비콘 구조의 프로브는 바이오틴-아비딘 결합을 통해서 양자점과 소광체 사이에 FRET 현상이 발생하며 양자점의 신호 세기의 차이를 통해서 표적 DNA 검출이 가능하다.
상기 비특허문헌 1 및 2를 비롯한 대부분의 FRET 현상에 기반을 둔 종래기술들의 경우 양자점과 프로브를 생접합(Bioconjugation) 기술을 이용하여 결합한다.
그러나 상기 생접합하기 위해서는 양자점 및 프로브를 사전에 특별히 제조하거나 화학 처리가 수반되며, 생접합 시에 반응시간 및 복잡한 반응 과정을 거치게 되고, 생접합된 양자점의 분산성이 낮아질 위험성이 있다.
따라서 양자점을 활용한 FRET 현상에 기반한 DNA 검출 시스템의 장점은 그대로 유지하면서, 생접합에 의해서 발생하는 시스템의 복잡성, 반응시간 및 안정성 문제를 해결할 수 있는 FRET 기반의 새로운 DNA 검출 시스템 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 종래 문제점을 개선하고자 노력한 결과, 종래 DNA 프로브 대신에 PNA 프로브를 사용한 FRET 시스템을 통해, 양자점, PNA, 표적 분자 사이의 표면 전하 차이에 의한 PNA 자가배열(Self-assembly) 현상에 기반하여, 간결한 반응과정을 통해서 짧은 반응시간 안에 검출 가능한 선택성 및 민감도가 우수한 표적 분자 검출 시스템을 제공하고, 그를 통해 양자점과 PNA 사이의 생접합 과정을 거치지 않고 표적 핵산의 효율적인 검출을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
1. 대한민국특허 제1674412호 (2016.11.03)
1. Nature Materials, 2005, 4, 826. 2. Nanotechnology 2007, 18, 195105.
본 발명의 목적은 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 양자점 및 소광체가 표지된 PNA 프로브를 구비한 표적 분자 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 검출 시스템을 이용한 표적 분자의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브를 포함하되,
상기 양자점 표면 근처에서 소광체가 표지된 PNA가 자가배열 현상에 의해 FRET이 가능한 거리를 유지하여, 양자점 형광의 소광(turn-off) 단계 및 상기 단계의 PNA와 표적 분자간의 반응에 의해 FRET이 발생되는 거리이상으로 양자점과 이격되어 양자점의 형광 회복에 의한 형광신호(turn-on)를 측정하는 단계로 이루어진 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 제공한다.
본 발명의 검출 시스템에서 사용되는 양자점은 12-16족 계열의 반도체, 13-15족 계열의 반도체, 14-16족 계열의 반도체 및 14족 계열의 반도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 이루어진 단일 코어 구조이거나; 상기 단일 코어 구조에 12-6족 계열의 반도체가 캡핑된 코어/쉘 구조인 것이다.
특히 본 발명의 검출 시스템에서 사용되는 양자점은 카르복실산인 수용성 리간드로 표면개질된 수용성 양자점이다.
상기에서 표면개질은 3-머캅토프로판산(3-mercaptopropionic acid), 6-머캅토핵산산(6-mercaptohexanoic acid), 11-머캅토운데칸산(11-mercaptoundecanoic acid), L-시스테인(L-cysteine), 리포익산(lipoic acid) 및 다이하이드로리포익산(Dihydrolipoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물로 개질될 수 있다.
본 발명의 검출 시스템에서, 상기 PNA 프로브가 C’말단에 표지된 수용체로 선택된 양자점의 방출 파장과 중복되는 흡수 파장을 가지는 소광체 중 선택되는 하나 이상이 표지된 것이며, 상기 소광체로는 Dabcyl, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, Iowa black FQ, Iowa black RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
또한, 본 발명의 검출 시스템에서, 상기 PNA 프로브는 소광체 표지된 반대편에 염료가 표지되어 이중(DOUBLE) FRET이 유도되도록 할 수 있다.
이때, 염료는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 텍사스 레드(texas red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 표지되는 것이다.
본 발명은 상기의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 활용하여, 수용성 양자점; 및 소광체가 표지된 PNA 프로브;를 구비한 표적 분자 검출용 키트를 제공한다.
상기 표적 분자 검출용 키트는 표적 분자로서 DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 양자점 합성단계, 2) 상기 양자점의 표면개질단계, 3) 상기 표면개질된 양자점 표면 근처에 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브가 FRET 발생거리로 유지된 양자점-PNA 조성물 형성 단계 및 4) 상기 양자점-PNA 조성물에 표적 분자를 반응시켜 양자점으로부터 FRET 발생거리 이상으로 이격되어 양자점의 회복된 형광신호를 측정하는 단계로 이루어진 수행된 표적 분자의 검출방법을 제공한다.
상기에서 표적 분자는 DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 또는 그 이상이며, 상기 표적분자가 DNA일 때, 형광 융해 곡선을 추가로 측정하여 유사 표적 DNA를 구분하는 단계를 더 포함한다.
이때, 본 발명의 PNA 프로브의 백본은 전하를 띠지 않은 중성이므로, 양자점, PNA, 표적 분자 사이의 표면 전하 차이에 의한 PNA 자가배열(Self-assembly)된다.
상술한 바에 따라, 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템에 따르면, 양자점, PNA 및 표적 분자의 표면 전하 차이에 의한 FRET 현상을 활용함으로써, 종래 생접합 공정을 통해 구현된 센서에 비해서 준비 공정 및 검출 시간을 대폭 감소할 수 있다.
또한, 양자점을 이용한 종래의 FRET 시스템의 장점을 계승하면서 양자점 및 PNA 프로브의 특성을 그대로 활용함으로써 표적 분자 검출 시스템의 장시간 안정성을 확보할 수 있다.
이러한 간편성 및 안정성에 기초한 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템 종래 DNA 기반 진단기술의 한계점인 비특이 문제 및 낮은 안정성 문제를 극복 가능할 것이다.
따라서, 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템, 그를 이용한 표적 분자 진단키트 기술을 통해, 혈액 기반의 진단 기술로서 의료산업에 적용된다면 진단 비용의 감소를 가져와 각종 질병 진단 및 치료 효과를 획기적으로 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 이용한 표적 DNA 검출 모식도이고,
도 2는 본 발명의 FRET 시스템에 있어서 공여체인 양자점의 형광 스펙트럼과 수용체인 소광체(BHQ1)의 흡수 스펙트럼이고,
도 3은 본 발명의 FRET 시스템에 있어서 종래 분자 비콘 구조를 가진 DNA와 PNA 비율에 따른 소광효율(청색)이고, 본 발명의 양자점을 가진 DNA와 PNA 비율에 따른 소광효율(적색)이고,
도 4는 상보적 DNA[50 nM] 첨가시 DNA 및 PNA 분자 비콘 시스템에서 양자점의 형광세기 비에 따른 결과이고,
도 5은 본 발명의 양자점-PNA 시스템에서 DNA 종류에 따른 형광 스펙트럼이고,
도 6은 본 발명의 양자점-PNA 시스템에서 표적 DNA의 염기 수 차이에 따른 형광 융해 곡선 그래프이고,
도 7은 본 발명의 양자점-PNA 시스템에서 1일 간격으로 총 7일 동안 시간에 따른 형광 스펙트럼을 통해 시스템의 안정성 평가결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 제공한다.
도 1은 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 이용한 표적 DNA 검출 모식도로서, 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 PNA 프로브를 포함하되, 상기 양자점 표면 근처에서 소광체가 표지된 PNA가 자가배열 현상에 의해 FRET이 가능한 거리를 유지하여, 양자점 형광의 소광(turn-off) 단계 및 상기 단계의 PNA와 표적 분자간의 반응에 의해 FRET이 발생되는 거리이상으로 양자점과 이격되어 양자점의 형광 회복에 의한 형광신호(turn-on)를 측정하는 단계로 이루어진 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 제공한다.
본 발명의 표적 분자 검출 시스템에서는 공여체로서 표면 개질 과정을 거쳐서 수분산 가능한 양자점을 제공하는 것이다.
이때, 양자점은 12-16족 계열의 반도체, 13-15족 계열의 반도체, 14-16족 계열의 반도체 및 14족 계열의 반도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 이루어진 단일 코어 구조이거나; 상기 단일 코어 구조에 12-6족 계열의 반도체가 캡핑된 코어/쉘 구조인 것이다.
구체적으로, 상기 12-16족 계열의 반도체는 CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, ZnO, HgS, HgSe, HgTe, CdSeS, CdSeTe, CdSTe, ZnSeS, ZnSeTe, ZnSTe, HgSeS, HgSeTe, HgSTe, CdZnS, CdZnSe, CdZnTe, CdHgS, CdHgSe, CdHgTe, HgZnS, HgZnSe, HgZnTe, CdZnSeS, CdZnSeTe, CdZnSTe, CdHgSeS, CdHgSeTe, CdHgSTe, HgZnSeS, HgZnSeTe, 및 HgZnSTe로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고;
상기 13-15족 계열의 반도체는 GaN, GaP, GaAs, GaSb, AlN, AlP, AlAs, AlSb, InN, InP, InAs, InSb, GaNP, GaNAs, GaNSb, GaPAs, GaPSb, AlNP, AlNAs, AlNSb, AlPAs, AlPSb, InNP, InNAs, InNSb, InPAs, InPSb, GaAlNP, GaAlNAs, GaAlNSb, GaAlPAs, GaAlPSb, GaInNP, GaInNAs, GaInNSb, GaInPAs, GaInPSb, InAlNP, InAlNAs, InAlNSb, InAlPAs, 및 InAlPSb로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이며;
상기 14-16족 계열의 반도체는 SnS, SnSe, SnTe, PbS, PbSe, PbTe, SnSeS, SnSeTe, SnSTe, PbSeS, PbSeTe, PbSTe, SnPbS, SnPbSe, SnPbTe, SnPbSSe, SnPbSeTe 및 nPbSTe 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상이고;
상기 14족 계열의 반도체는 Si, Ge, SiC, alc SiGe으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
특히 본 발명의 검출 시스템에서 사용되는 수용성 양자점은 카르복실산인 수용성 리간드로 표면개질되어 양자점 표면이 (-)전하가 되도록 하는 것으로서, 이때, 표면개질은 3-머캅토프로판산(3-mercaptopropionic acid), 6-머캅토핵산산(6-mercaptohexanoic acid), 11-머캅토운데칸산(11-mercaptoundecanoic acid), L-시스테인(L-cysteine), 리포익산(lipoic acid) 및 다이하이드로리포익산(Dihydrolipoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물로 개질될 수 있다.
본 발명의 표적 분자 검출 시스템에서 사용되는 PNA는 DNA 유사체인 인공 합성물질로서, DNA 또는 RNA와의 상보적 결합 시 결합력이 높아 더 강하고, 특이성 및 민감도가 높으며 염 농도에 관계없이 결합하는 특성을 가진다. 또한 생물학적 및 화학적 안정성이 더 뛰어나며 특히 DNA와는 달리 PNA는 백본에 전하를 띄지 않는다.
따라서, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템은 종래 FRET 시스템과는 달리, 공여체와 수용체 사이에 생접합을 통해서 직접적인 결합이 형성되어 있지 않으며, 카르복실기를 리간드로 가지는 수용성 양자점 표면의 (-)전하와 PNA의 백본이 전기적 중성을 띄는 성질을 이용하여 양자점 표면 근처에서 PNA의 자가배열 현상을 유도한다. 이러한 표면 전하 차이에 의한 PNA의 자가배열 현상에 의해서 공여체인 양자점과 수용체인 소광체(BHQ1) 사이의 거리가 FRET이 가능한 거리를 유지하게 된다.
본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 통해, 표적 분자로서 DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 이상을 검출할 수 있는데, 본 발명의 실시예에서는 표적 분자로서 DNA로 설명하고 있으나 이에 한정되지 아니할 것이다.
상기 원리로 제작된 양자점-PNA 시스템에 비상보적 DNA가 첨가되었을 때에는 PNA와 DNA 사이의 혼성화가 발생하지 않기 때문에, 도 1의 ‘turn-off’상태가 된다. 반면에 상보적 DNA가 첨가되었을 경우 PNA와 DNA 사이의 혼성화가 발생하고 DNA 백본의 경우, (-)전하를 형성하고 있기 때문에 양자점 표면의 카르복실기와 반발력이 작용한다. 그 결과, PNA의 표지된 소광체(BHQ1)와 양자점 사이의 거리가 FRET이 발생할 수 있는 거리 이상 멀어지게 되면서, 소광된 양자점이 형광 회복되어, 도 1의 ‘turn-on’상태가 된다. 따라서 이러한 원리에 의해서 양자점의 형광 세기 차이를 통해서 표적 분자(DNA)의 검출이 가능하다.
본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템에서, 소광체(Quencher)가 표지된 PNA 프로브는 FRET 시스템의 수용체로서 한쪽 끝에 양자점의 방출 에너지를 효율적으로 흡수할 수 있는 소광체가 접합된 분자 비콘 구조의 PNA를 제공하는 것이다.
구체적으로, 상기 PNA 프로브는 C’말단에 표지된 수용체로 선택된 양자점의 방출 파장과 중복되는 흡수 파장을 가지는 소광체 중 선택되는 하나 이상이 표지하는 것으로서, 상기 소광체로는 Dabcyl, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, Iowa black FQ, Iowa black RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
도 2는 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템에 있어서 공여체인 양자점의 형광 스펙트럼과 수용체인 소광체(BHQ1)의 흡수 스펙트럼으로서, 공여체의 방출 파장과 수용체의 흡수 파장이 중복되는 결과를 통해 FRET 시스템의 필요조건을 충족한다.
이상의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템에 따르면, 양자점, PNA 및 표적 분자의 표면 전하 차이에 의한 FRET 현상을 활용함으로써, 양자점과 PNA 사이의 생접합(bio-conjugation) 과정을 거치지 않고 표적 분자를 효율적으로 검출할 수 있다. 따라서, 종래 생접합 공정을 통해 구현된 시스템에 비해서 준비 공정 및 검출 시간을 대폭 감소할 수 있다.
또한, 양자점을 이용한 종래의 FRET 시스템의 장점을 계승하면서 양자점 및 PNA 프로브의 특성을 그대로 활용함으로써 표적 분자 검출 시스템의 장시간 안정성을 확보할 수 있다.
또한, 본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템은 소광체가 표지된 PNA 프로브에 있어서, 소광체가 표지된 반대편(N’말단)에 염료를 더 표지하여 이중(DOUBLE) FRET 발생되도록 함으로써, 양자점과 PNA 사이의 FRET이 형광 측정 효율을 향상시킬 수 있다.
이때, 상기 PNA 프로브는 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 텍사스 레드(texas red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 표지된다.
나아가, 본 발명은 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 활용하여, 수용성 양자점; 및 소광체가 표지된 PNA 프로브;를 구비한 표적 분자 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 실시예에서는 표적 분자로서 DNA를 일례로 설명하고 있으나, 이외에도 RNA 또는 단백질의 검출이 가능하다.
본 발명의 표적 분자 검출용 키트는 비표적 DNA와 반응시 형광을 소광하고, 표적 DNA와 반응 시 형광을 발광하는 방식으로 선택성 및 우수한 민감도로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 활용한 표적 분자의 검출방법을 제공한다.
구체적으로는 1) 양자점 합성단계,
2) 상기 양자점의 표면개질단계,
3) 상기 표면개질된 양자점 표면 근처에 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브가 FRET 발생거리로 유지된 양자점-PNA 조성물 형성 단계 및
4) 상기 양자점-PNA 조성물에 표적 분자를 반응시켜 양자점으로부터 FRET 발생거리 이상으로 이격되어 양자점의 회복된 형광신호를 측정하는 단계로 이루어진 수행된 표적 분자의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에서, 1) 양자점, 2) 표면개질 및 4) 표적 분자는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 표적 분자의 검출방법을 통해, DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 이상의 표적 분자를 검출 할 수 있으며, 상기 표적분자가 DNA일 때, 형광 융해 곡선을 추가로 측정하여 유사 표적 DNA를 구분하는 단계를 더 포함한다.
도 6은 본 발명의 양자점-PNA 시스템에서 표적 DNA의 염기 수 차이에 따른 형광 융해 곡선 그래프로서, 본 발명의 PNA의 자가배열 현상을 이용한 양자점-PNA 프로브를 구비한 FRET 시스템에서 온도에 따른 융해곡선 분석을 통해서 표적 분자(DNA)의 염기수 1개 차이까지도 검출 가능하다.
도 7은 본 발명의 양자점-PNA 프로브를 구비한 시스템에서 1일 간격으로 총 7일 동안 시간에 따른 형광 스펙트럼을 관찰한 결과, 양자점-PNA 프로브의 형광세기는 일주일간 거의 일정하게 유지된다.
이러한 결과는 PNA 프로브의 백본은 전하를 띠지 않은 중성이므로, 양자점, PNA, 표적 분자 사이의 표면 전하 차이에 의한 PNA 자가배열(Self-assembly)에 의해, 양자점-PNA 시스템의 경우 양자점과 PNA 모두 분산성을 유지하기 때문에 안정성이 우수한다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
이는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템 제작
1. 양자점의 합성 및 표면 개질단계
CdSe/ZnS 양자점은 얼로이(alloy) 방식으로 CdO:Zn(acetate)2:올레익산:옥타데칸을 1:2:15:80의 몰비율로 반응시키며 300℃ 이상의 온도로 가열하였다. 그리고 1:10 몰비의 Se와 S를 TOP(Trioctylphosphine) 용액(97%)에 반응시킨 후, 상기 양자점을 포함하는 반응물에 주입하였다. 양자점의 표면 쉘을 강화하기 위해 싸이올기를 주입하고 반응시켜 주었다. 상온으로 냉각시킨 후 메탄올과 아세톤을 사용하여, 원심분리기를 통해 약 6nm 크기의 양자점 최종시료를 얻었다.
상기 얻어진 양자점의 표면은 올레익산 등에 의해 유기용매에 분산 가능한 지용성을 나타낸다. 본 발명에 적용 가능한 수용성 양자점을 얻기 위해서 표면 개질을 진행하였다. 구체적으로는 NaBH4(Sodium borohydride)와 리포산(Lipoic acid) 각각을 표면 개질하려는 양자점 몰수의 2만 배, 1만 배를 순수에 반응시킨 후 클로로포름에 분산된 양자점에 더하여 60℃에서 30분간 반응시켰다. 이후 정제 과정을 거쳐서 최종 양자점의 바깥표면에 수용성 리간드인 카르복실기가 부착된 수용성 양자점으로 표면개질하였다.
2. 표적 분자 검출 시스템 제작단계
본 발명의 FRET 시스템과 기존의 FRET 시스템을 비교하기 위하여, 하기 표 1과 같은 분자 비콘 프로브 2종을 사용하였다. 이때, 사용된 DNA는 (주)바이오니아(한국), PNA는 (주)파나진(한국)에서 합성 의뢰하여 사용하였다.
Figure 112017035322344-pat00001
상기 표 1에서 O는 링커, 굵은 글씨체는 췌장암, 대장암, 폐암, 담도암, 갑상선암을 포함한 인체의 다양한 여러 암에서 발견되는 KRAS 돌연변이 유전자와 상보적으로 결합 가능한 염기 서열이다. 또한, 밑줄 친 부분은 DNA의 경우, 분자 비콘 구조를 형성하기 위한 상보적 결합 서열이다.
반면에 PNA의 경우 스스로 꼬이는 성질을 가지기 때문에 별도의 염기 서열이 없이도 분자 비콘 구조와 유사한 형태를 유지하게 된다.
상기의 분자 비콘 프로브와 혼성화를 이루는 표적 DNA 올리고머는 하기 표 2와 같이 3종을 준비하여 사용하였다.
Figure 112017035322344-pat00002
상기 표 2에서 서열번호 3의 표적 DNA 서열은 KRAS 돌연변이 유전자를 모방한 것으로 분자 비콘 프로브와 완전 상보적 결합을 형성하며, 서열번호 4는 완전 상보적 결합에 필요한 염기 서열의 염기수 1개 차이, 서열번호 5는 염기수 12개 차이로 분자 비콘 프로브와 비상보적 결합을 형성한다.
3. 표적 분자의 검출단계
본 발명의 FRET 시스템은 공여체로 수용성 양자점(방출 파장: 530nm), 수용체로 분자 비콘 프로브에 표지된 소광체로서 BHQ1(Black hole quencher, 흡수 파장: 480-580nm)으로 구성되어 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 FRET 시스템은 종래 FRET 시스템과는 달리, 공여체와 수용체 사이에 생접합을 통해서 직접적인 결합이 형성되어 있지 않으며, 카르복실기를 리간드로 가지는 수용성 양자점 표면의 (-)전하와 PNA의 백본(back bone)이 전기적 중성을 띄는 성질을 이용하여 양자점 표면 근처에서 PNA의 자가배열 현상을 유도하였다. 이러한 표면 전하 차이에 의한 PNA의 자가배열 현상에 의해서 공여체인 양자점과 수용체인 BHQ1 사이의 거리가 FRET이 가능한 거리를 유지하게 된다.
상기 원리로 제작된 양자점-PNA 시스템에 비상보적 DNA가 첨가되었을 때에는 PNA와 DNA 사이의 혼성화가 발생하지 않기 때문에 도 1의 ‘turn-off’상태가 된다. 반면에 상보적 DNA가 첨가되었을 경우 PNA와 DNA 사이의 혼성화가 발생하고 DNA 백본의 경우 (-)전하를 형성하고 있기 때문에 양자점 표면의 카르복실기와 반발력이 작용한다.
그 결과, PNA의 표지된 소광체(BHQ1)와 양자점 사이의 거리가 FRET이 발생할 수 있는 거리 이상 멀어지게 되면서 도 1의 ‘turn-on’상태가 된다. 이때 이러한 원리에 의해서 양자점의 형광 세기 차이를 통해서 표적 DNA의 검출이 가능해 진다.
도 2는 본 발명의 FRET 시스템에 있어서, 실시예에 사용된 양자점 방출 파장과 소광체(BHQ1)가 표지된 PNA의 흡수 파장을 측정한 스펙트럼이다. 그 결과, 공여체의 방출 파장과 수용체의 흡수 파장이 중복되는 결과를 통해서 FRET 시스템의 필요조건을 충족함을 확인하였다.
< 실험예 1> DNA- 양자점 과 PNA- 양자점 시스템 비교
서열번호 1, 2번의 분자 비콘 프로브와 양자점을 이용하여 FRET 시스템을 구성하였고, DNA와 PNA의 특성 차이에 따라 설명한 FRET 시스템의 원리를 도 3의 결과를 통해서 확인하였다.
또한 분자 비콘 비율에 따른 실험을 통해서 최적화된 양자점-PNA 비율을 확정하였다.
본 발명의 FRET 시스템은 공여체와 수용체 사이에 생접합 과정을 생략하고 자가배열 현상을 이용함으로써, 간결한 반응 과정을 통해서 시스템이 구성되었다.
본 실시예는 적정 혼성화 버퍼 용액에 양자점 4nM과 서열번호 1번 DNA를 양자점 대비 5, 10, 20, 30 배를 첨가하였다. 또한 서열번호 3번 DNA를 50 nM 첨가한 후 분자 비콘 DNA와 상보적 DNA의 혼성화를 유도하였다. 또한 동일 조건으로 양자점과 서열번호 2번 PNA를 반응시켰다.
도 3은 분자 비콘 프로브와 양자점이 반응 후 형광 스펙트럼을 측정하여 양자점-DNA 시스템과 양자점-PNA 시스템의 소광효율을 정리 비교한 결과로서, 양자점-DNA 프로브의 경우에는 프로브의 량을 증가시켜 주어도 양자점이 소광되는 정도가 미비하였다. 반면에 양자점-PNA 프로브의 경우에는 프로브의 량을 증가시키면 양자점이 소광되는 정도가 거의 비례하였다. 또한, 분자 비콘 DNA 프로브의 경우에는 DNA 고유의 백본 부분에 (-)전하를 가지기 때문에 양자점 표면과 반발력이 존재하며, 그 결과 양자점과 소광체(BHQ1) 사이의 거리가 FRET 거리를 벗어나 소광 현상이 거의 발생하지 않았다.
반면에, 실시예 1의 3 단계인 표적 분자의 검출단계에서 설명한 바와 같이, PNA 프로브의 경우 자가배열에 의해서 양자점과 소광체가 FRET 거리를 유지하기 때문에 PNA 프로브의 량이 증가함에 따라서 소광 비율도 증가하였다.
도 4는 상보적 DNA와의 혼성화에 따른 상대적인 형광 강도, F/FO(여기에서 F0과 F는 상보적 DNA가 없는 경우와 있는 경우의 형광 강도임)를 나타내었다.
각각의 샘플에 서열번호 3번의 상보적 DNA를 50 nM씩 첨가하여 혼성화를 유도한 후, 상온에서 형광 스펙트럼을 측정하였다. 양자점-DNA 시스템의 경우 소광 자체가 거의 발생하지 않았기 때문에 혼성화 이후에도 상대적인 형광 광도 값은 모든 비율에서 1에 근접하였다.
반면에 양자점-PNA 시스템의 경우 같은 양의 상보적 DNA를 첨가하였지만, 상대적인 형광 광도의 값은 PNA 프로브의 비율에 따라서 다른 값을 나타내었다. 양자점 대비 PNA 프로브가 5, 10, 20, 30 배일 경우 상대적인 형광 광도 값은 1.44, 1.84, 2.90, 2.74 이었다. 즉, 양자점-PNA 시스템에서는 표적 DNA가 존재할 경우 양자점의 형광 세기가 증가하는 현상이 확인되었으며, PNA 프로브의 비율이 양자점 대비 20배인 경우에서 최적화되었다.
< 실험예 2> 표적 DNA 종류에 따른 양자점 -PNA 시스템
실제 암 진단 등의 분자 진단 시스템에 적용하기 하기 위해서는 표적 DNA와의 반응성뿐 아니라 비표적 DNA 및 표적 DNA와 얼마나 적은 수의 염기 차이가 나는 DNA까지 분별 가능한지가 중요하다.
본 발명의 양자점-PNA 시스템의 위와 같은 특성을 지니는지 확인해 보기 위하여 표 2의 서열번호 3, 4, 5번의 DNA를 이용하여 실험을 진행하였다. 서열번호 3번은 PNA 프로브와 완전한 상보적 결합이 가능한 염기서열을 가졌으며, 4번은 염기서열이 완전한 상보적 결합과 비교하여 1개 차이, 5번은 비상보적 염기서열을 가지는 DNA이다. 양자점을 4nM, PNA 프로브를 80nM, 각각의 표적 DNA를 80nM씩 주입하여 반응을 진행하였다.
도 5은 반응 후 각 샘플의 형광 스펙트럼을 측정한 결과이다. 표적 DNA를 주입하지 않은 샘플에 대비해서 서열번호 3, 4번을 주입했을 경우 형광세기가 3.07, 2.88배 증가하였다.
반면에, 서열번호 5번을 주입했을 경우 형광세기는 거의 동일한 값이 측정되었다. 즉, 서열번호 3, 4번의 DNA는 혼성화가 진행되어 양자점-PNA 시스템의 ‘turn-on’상태로 변화하였으나, 서열번호 5번의 DNA를 첨가하였을 경우 혼성화가 진행되지 않아서 ‘turn-off’상태를 유지한 것으로 보인다.
< 실험예 3> 양자점 -PNA 시스템의 융해 곡선 측정
상기 실험예 2의 결과로부터 상보적 DNA와 비상보적 DNA의 검출 능력은 입증되었으나, 염기서열이 1개 차이 나는 경우에는 형광세기 차이(perfect: 3.07배, 1mis-match: 2.88배)가 미비하여 실제 검출 환경에서 구별하기 어려운 수준이었다.
따라서 보다 정확하게 표적 DNA의 종류를 구분하기 위해서 두 샘플의 융해곡선을 측정하였다. 일반적인 DNA의 융해곡선은 온도에 따른 260nm에서의 DNA 흡광도 변화를 측정하며 최대 흡광도의 1/2이 되는 지점을 융해온도(Tm)로 정의하여 DNA의 구조적 특성을 밝히는데 이용된다.
본 발명에서는 서열번호 3, 4번이 주입된 양자점-PNA 시약의 온도에 따른 형광세기 변화를 측정하였다. 그 결과, 도 6에는 30℃에서 80℃까지 1분에 2℃씩 상승시키면서 형광을 측정한 융해곡선 결과를 도시하고 있다. 측정 곡선에서 최대 형광값의 1/2이 되는 온도를 융해온도로 정의하였을 때에 각 샘플의 융해온도는 완전 상보적 결합을 이루는 서열번호 3번이 주입된 샘플은 65℃, 염기수가 1개 차이 나는 상보적 결합을 이루는 서열번호 4번이 주입된 샘플은 55℃이었다. 두 샘플 사이의 융해온도의 차이는 10℃이었다. 즉, 비상보적 염기수의 차이에 의해서 PNA와 DNA 사이의 결합력 차이가 존재하며, 서열번호 4번의 샘플은 더 낮은 온도에서 PNA와 DNA 사이의 결합이 풀리게 된다. 결합이 풀린 PNA는 양자점과 다시 FRET 거리 안쪽으로 접근하여 양자점의 ‘turn-off’상태로 변화시킨다. 따라서 본 발명의 PNA의 자가배열 현상을 이용한 양자점-PNA FRET 시스템은 융해곡선 분석을 통해서 표적 DNA의 염기수 1개 차이까지도 검출 가능하다.
< 실험예 4> 양자점 -PNA 시스템의 안정성
표적 DNA의 검출에 사용되는 양자점-PNA 시약의 안정성 실험을 진행하였다. 양자점 4nM, PNA 프로브 80nM을 혼성화 버퍼 용액에 첨가하여 시약을 제조하였다.
도 7은 제작된 시약의 형광 스펙트럼을 1일 간격으로 총 일주일간 측정한 결과로서, 양자점-PNA 시약의 형광세기는 일주일간 거의 일정하게 유지되었다. 이러한 결과는 PNA의 자가배열에 의한 양자점-PNA 시스템의 경우 양자점과 PNA 모두 분산성을 유지하기 때문에 안정성 또한 우수한 것으로 추정된다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 PNA 프로브를 포함하고, 양자점, PNA 및 검출대상인 표적 분자의 표면 전하 차이에 의한 FRET 현상을 활용한 표적 분자 검출 시스템, 표적 분자 검출용 키트 및 그를 이용한 표적 분자의 검출방법을 제공하였다.
본 발명의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템은 종래 생접합 공정을 통해 구현된 센서에 비해서 준비 공정 및 검출 시간을 대폭 감소할 수 있다.
또한, 양자점을 이용한 종래의 FRET 시스템의 장점을 계승하면서 양자점 및 PNA 프로브의 특성을 그대로 활용함으로써 표적 분자 검출 시스템의 장시간 안정성을 확보할 수 있다.
종래의 검출 방법에 비해 신속성, 편리성, 정확성을 증대시킬 수 있으며, 표적 유전자에 대한 높은 선택성을 보이는 PNA 와 강한 형광신호세기를 제공할 수 있는 양자점을 결합하여 유전자 검출 감도를 크게 향상시킴으로써, 혈액 속에 극미량 존재하는 표적 유전자의 정확한 검사를 가능하게 함으로써 암조기진단 시스템에 활용할 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체 예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당 업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (14)

  1. 수용성 양자점 및 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브를 포함하되,
    상기 수용성 양자점이 카르복실산인 수용성 리간드로 표면개질되어 양자점 표면의 (-)전하와 PNA 백본의 전기적 중성 성질을 이용하여 양자점 표면 근처에서 PNA의 자가배열 현상에 의해 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer)이 발생되는 거리로 유지하는, 양자점 형광의 소광(turn-off) 단계 및
    상기 단계의 PNA와 표적 분자간의 반응에 의해 FRET이 발생되는 거리이상으로 양자점과 이격되어 양자점의 형광 회복에 의한 형광신호(turn-on)를 측정하는 단계로 이루어진 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 양자점이 12-16족 계열의 반도체, 13-15족 계열의 반도체, 14-16족 계열의 반도체 및 14족 계열의 반도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 이루어진 단일 코어 구조이거나; 상기 단일 코어 구조에 12-6족 계열의 반도체가 캡핑된 코어/쉘 구조인 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 표면 개질이 3-머캅토프로판산(3-mercaptopropionic acid), 6-머캅토핵산산(6-mercaptohexanoic acid), 11-머캅토운데칸산(11-mercaptoundecanoic acid), L-시스테인(L-cysteine), 리포익산(lipoic acid) 및 다이하이드로리포익산(Dihydrolipoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물로 개질된 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브가 C’말단에 표지된 수용체로 선택된 양자점의 방출 파장과 중복되는 흡수 파장을 가지는 소광체 중 선택되는 하나 이상이 표지된 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 소광체가 Dabcyl, BHQ1, BHQ2, BHQ3, BBQ-650, Iowa black FQ, Iowa black RQ 및 IRDye QC-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브가 N’말단에 염료가 표지되어 이중 FRET이 유도된 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 염료가 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine) 계열 염료 및 텍사스 레드(texas red)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 표지된 것을 특징으로 하는 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템.
  9. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 양자점을 활용한 FRET 기반의 표적 분자 검출 시스템을 활용한, 수용성 양자점; 및 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브;를 구비한, 표적 분자 검출용 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 분자가 DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 표적 분자 검출용 키트.
  11. 1) 양자점 합성단계,
    2) 상기 양자점이 카르복실산인 수용성 리간드로 양자점 표면을 (-)전하로 개질하는 표면개질단계,
    3) 상기 표면개질된 양자점 표면 근처에, 소광체가 표지된 펩티드핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA) 프로브가 FRET 발생거리로 유지된 양자점-PNA 조성물이 형성되되, 상기 PNA 프로브의 백본이 전기적 중성 성질로 자가배열되어 상기 양자점과 소광체 사이의 거리가 FRET 발생거리로 유지된 양자점-PNA 조성물 형성 단계 및
    4) 상기 양자점-PNA 조성물에 표적 분자를 반응시켜 양자점으로부터 FRET 발생거리 이상으로 이격되어 양자점의 회복된 형광신호를 측정하는 단계로 이루어진 수행된 표적 분자의 검출방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 분자가 DNA, RNA 또는 단백질에서 선택되는 어느 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는 표적 분자의 검출방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표적분자가 DNA일 때, 형광 융해 곡선을 추가로 측정하여 유사 표적 DNA를 구분하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 분자의 검출방법.
  14. 삭제
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