KR102233294B1 - 표적 dna 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 dna의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 dna의 정량 방법 - Google Patents

표적 dna 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 dna의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 dna의 정량 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 A'영역을 포함하는 염기서열을 가지는 표적 DNA를 검출하기 위한 조성물로, 상기 조성물은, 염기서열이 A영역-B영역-C영역-D영역-E영역-F영역-D'영역-C'영역-B'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제1헤어핀 DNA; 염기서열이 C영역-D영역-F'영역-E'영역-B'영역-A'영역-E영역-F영역-D'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제2헤어핀 DNA; 염기서열이 F'영역-E'영역-A영역-B영역-D'영역-C'영역-B'영역-A'영역-E영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제3헤어핀 DNA; 및 염기서열 중 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점;을 포함하며, 이때, 상기 A영역은 A'영역과, B영역은 B'영역과, C영역은 C'영역과, D영역은 D'영역과, E영역은 E'영역과, F영역은 F'영역과, X영역은 X'영역과 각각 상보 결합되는 염기서열을 가지는 것인, 표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법, 및 이를 이용한 표적 DNA 정량 방법에 관한 것이다.

Description

표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 DNA의 정량 방법 {Composition for detecting target DNA, and method for detecting target DNA using the same, and method for quantifying target DNA using the same}
본 발명은 표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 DNA의 정량 방법에 관한 것이다.
특정 염기서열을 갖는 DNA(deoxyribonucleic acid), 즉 표적 DNA(target DNA)의 검출은 병원성 질병이나 유전성 질병의 진단에 응용될 수 있어 많은 관심을 받고 있다.
표적 DNA의 검출 방법은 표적 DNA를 증폭시키는 방법인 표적 DNA 서열 증폭, 프로브 분자 자체를 증폭시키는 프로브 증폭, 각 프로브가 나타내는 신호를 복합 프로브 또는 연결 프로브 기술에 의해 증가시키는 신호 증폭이 있다.
그중에서도 중합 효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 DNA의 증폭 방법으로, 상보적 서열의 각 가닥(strand)을 주형으로 사용하여 프라이머(primer)에 의하여 DNA의 합성이 반복적으로 진행됨으로써, 상보적 서열의 복제본이 합성된다.
이와 같은 PCR 과정을 수행하기 위해서는 미리 프로그램된 열 순환 장비(thermal cycling instrument)가 필요한데, 이 방법은 비용이 많이 들고, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 각 사이클 시 표적온도에 도달하기 위한 지연 시간이 필요하므로 증폭 반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하며, 결과를 재현하기 위해서는 수행 단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다. 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술을 요구하므로 경제적인 부담이 더욱 큰 단점을 가지고 있다.
이에 대한 대안으로 SDA(strand displacement amplification), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification), TMA(transcriptionMediated amplification) 등의 등온 증폭법(isothermal amplification)이 제안되었다. 등온 증폭법은 반응 온도를 변화시킬 필요 없이 단일 온도(상온 또는 65℃ 이하의 온도)에서 표적 DNA의 증폭이 가능하므로 고가의 온도조절장치를 필요로 하지 않으며, 일반적인 PCR에서는 구현이 어려운 현장진단이 용이하다는 장점이 있다.
그러나, SDA 방법에 따른 DNA 증폭은 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되고, NASBA 및 TMA와 같은 전사-기초 증폭방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 이러한 단점 때문에, 이들 전사-기초 증폭 방법에 의한 DNA 표적의 증폭 메카니즘은 잘 수립되어 있지 않다. 아울러, 이 역시 가격이 비싼 효소를 사용하기 때문에 경제적 부담이 크다는 단점이 있으며, 효소를 안정화 시키기 위한 물질이 추가적으로 사용됨에 따라 안정성 및 민감도가 저하되는 문제점이 있다.
이에 따라, 효소와 같은 추가적인 화학 물질 없이도 표적 DNA를 효과적으로 검출할 수 있는 바이오센서 및 그 방법에 대한 개발이 요구되고 있다.
이와 유사한 선행문헌으로는 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0064540호가 제시되어 있다.
대한민국 공개특허공보 제10-2017-0064540호 (2017.06.09)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 효소와 같은 추가적인 화학 물질 없이도 표적 DNA를 효과적으로 검출할 수 있으며, 우수한 민감도, 선택성 및 신속성을 가지는 표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 DNA의 정량 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양태는 A'영역을 포함하는 염기서열을 가지는 표적 DNA를 검출하기 위한 조성물로, 상기 조성물은, 염기서열이 A영역-B영역-C영역-D영역-E영역-F영역-D'영역-C'영역-B'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제1헤어핀 DNA; 염기서열이 C영역-D영역-F'영역-E'영역-B'영역-A'영역-E영역-F영역-D'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제2헤어핀 DNA; 염기서열이 F'영역-E'영역-A영역-B영역-D'영역-C'영역-B'영역-A'영역-E영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제3헤어핀 DNA; 및 염기서열 중 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점;을 포함하며, 이때, 상기 A영역은 A'영역과, B영역은 B'영역과, C영역은 C'영역과, D영역은 D'영역과, E영역은 E'영역과, F영역은 F'영역과, X영역은 X'영역과 각각 상보 결합되는 염기서열을 가지는 것인, 표적 DNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 일 양태에 있어, 상기 염기서열의 X영역은 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하는 것일 수 있다.
상기 일 양태에 있어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA는 표적 DNA에 의해 연쇄적으로 자기 조립되어 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 것일 수 있으며, 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는 것일 수 있다. 또한, 상기 하이드로젤은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
[관계식 1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.8
(상기 관계식 1에서, PL 1은 표적 DNA와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 표적 DNA와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
또한, 본 발명의 다른 일 양태는 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 이용한 표적 DNA의 검출 방법에 관한 것이다.
상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 표적 DNA의 검출 방법은 형광 공명 에너지 전달(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용하는 것일 수 있다.
상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 표적 DNA의 검출 방법은, a) 표적 파장 영역에서 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기 PL 1을 측정하는 단계; b) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계; c) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 2를 측정하는 단계; 및 d) 상기 PL 1과 PL 2를 비교하여 표적 DNA의 존재 유무를 판단하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
보다 상세하게, 상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 표적 DNA의 검출 방법은, ⅰ) 표적 DNA를 포함하는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 표적 DNA에 의해 자기 조립된 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 단계; 및 ⅱ) 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는 단계;를 포함하며, 상기 ⅱ)단계에서 상기 하이드로젤의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
[관계식 1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.8
(상기 관계식 1에서, PL 1은 표적 DNA와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 표적 DNA와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
또는, 상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 표적 DNA의 검출 방법은, ⅰ) 표적 DNA를 포함하지 않는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 Y자 형태로 자기 조립되지 못 하고 각각 존재하는 단계; 및 ⅱ) 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합되지 못 하고 각각 존재하는 단계;를 포함하며, 상기 ⅱ)단계에서 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 소광체로 이동하지 못하여 하기 관계식 2를 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
[관계식 2]
0.9 ≤ PL 2/PL 1 ≤ 1
(상기 관계식 2에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 b)단계는 20분 이상 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 이용한 표적 DNA의 정량 방법에 관한 것이다.
상기 또 다른 일 양태에 있어, 상기 표적 DNA의 정량 방법은, A) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계; B) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 3을 측정하는 단계; 및 C) 상기 PL 3과 표준 최대 형광 세기를 비교하여 표적 DNA의 양을 정량하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물은, 1차적으로 표적 DNA의 촉매 작용에 의해 Y-DNA 자기조립체의 수가 증폭되며, 2차적으로 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성함으로써 FRET 신호가 증폭되어, 두 증폭 과정에 의해 FRET 효율이 더욱 향상됨으로써 fM 가량의 매우 미량의 표적 DNA 검출이 가능할 수 있으며, 우수한 민감도를 확보할 수 있다.
아울러, 표적 DNA에서 하나의 염기 또는 두 개의 염기가 다른(mismatched) 유사 표적 DNA 조차도 Y-DNA 자기조립체를 형성하지 못 함에 따라 표적 DNA에 대한 매우 우수한 검출 선택성을 가질 수 있다는 장점이 있다.
또한, 매우 짧은 시간에도 높은 FRET 효율을 보임에 따라 표적 DNA의 검출 시간을 크게 줄일 수 있으며, 이와 같은 우수한 검출 신속성으로 인하여 현장 진단 시 매우 유용하게 활용할 수 있다는 장점이 있다.
뿐만 아니라, 고가의 열 순환 장비와 효소가 필요하지 않음에 따라 비용을 절감할 수 있어 경제성이 우수하며, 효소가 필요하지 않아 이를 안정화시키기 위한 물질을 추가적으로 사용하지 않을 수 있어 조성물의 안정성 및 검출 민감도의 저하를 방지할 수 있어 좋다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA 검출용 조성물에 있어, Y-DNA 자기조립체의 증폭 과정 및 FRET 원리를 간략하게 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 Y-DNA 자기조립체의 염기서열 구성을 간략하게 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따른 자기조립체 1의 염기서열 구성을 간략하게 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따른 자기조립체 2의 염기서열 구성을 간략하게 도시한 것이다.
도 5는 단계적으로 자기 조립되는 Y-DNA 자기조립체의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE) 분석 결과이다.
도 6은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE) 분석 결과로, 표적 DNA 존재 유무에 따른 Y-DNA 자기조립체의 형성 여부를 확인한 자료이다.
도 7은 비접촉 모드(non-contact mode)의 원자간력 현미경(AFM, atomic force microscopy) 분석 자료이다.
도 8은 표적 DNA의 농도에 따른 Y-DNA 자기조립체의 증폭 플롯 분석 자료이다.
도 9는 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점(QD-ssDNA)이 결합된 QD-DNA 하이드로젤의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE) 분석 결과이다.
도 10은 표적 DNA가 포함되지 않은 QD-ssDNA/HD 혼합물과, QD-ssDNA/HD 혼합물에 표적 DNA가 포함되어 형성된 QD-DNA 하이드로젤의 투과 전자현미경(TEM) 측정 결과이다.
도 11은 Y-DNA 자기조립체의 비율 및 배양 시간에 따른 FRET 효율 분석 결과이다.
도 12는 표적 DNA의 존재 유무에 따른 FRET 효율 분석 결과이다.
도 13은 표적 DNA의 존재 유무에 따른 수력학적 직경(hydrodynamic diameter) 분석 자료이다.
도 14는 표적 DNA 첨가량에 따른 형광 세기 및 FRET 효율 분석 결과이다.
도 15는 표적 DNA 첨가량 및 배양 시간에 따른 FRET 효율 분석 결과이다.
도 16은 비교예 1(도 16의 a 및 b) 및 실시예 5(도 16의 c)의 배양 시간에 따른 형광 세기 증가 분석 결과이다.
도 17은 비교예 2(도 17의 a) 및 실시예 6(도 17의 b)의 배양 시간에 따른 형광 세기 증가 분석 결과이다.
도 18은 비교예 2 및 실시예 6의 배양 시간에 따른 FRET 효율 분석 결과이다.
도 19는 실시예 7, 비교예 3, 비교예 4 및 비교예 5의 배양 시간에 따른 형광 세기 증가 분석 결과와 FRET 효율 분석 결과이다.
이하 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 DNA의 정량 방법에 대하여 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 도면들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다. 또한 명세서 전체에 걸쳐서 동일한 참조번호들은 동일한 구성요소들을 나타낸다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한, 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
전술한 바와 같이, 중합 효소 연쇄 반응(PCR, polymerase chain reaction)과 등온 증폭법(isothermal amplification)은 가장 광범위하게 사용되고 있는 증폭법이다.
그러나, PCR의 경우, PCR 과정을 수행하기 위해 고가의 열 순환 장비(thermal cycling instrument)가 필요하며, 특이성이 비교적 낮을 뿐 아니라, 각 사이클 시 표적온도에 도달하기 위한 지연 시간이 필요하므로 증폭 반응이 완료될 때까지 장시간이 필요하고, 결과를 재현하기 위해서는 수행 단계를 극도로 표준화시켜야 하는 단점이 있다. 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술을 요구하므로 경제적인 부담이 더욱 큰 단점을 가지고 있다.
등온 증폭법의 경우, SDA 방법에 따른 DNA 증폭은 규정된 제한효소를 위한 부위가 존재해야 하므로 응용성이 제한되고, NASBA 및 TMA와 같은 전사-기초 증폭방법은 프라이머에 의한 중합효소 프로모터 서열과 증폭 생성물의 결합이 필요하며, 이 과정은 비-특이적 증폭을 가져오는 경향이 있다. 아울러, 이 역시 가격이 비싼 효소를 사용하기 때문에 경제적 부담이 크다는 단점이 있으며, 효소를 안정화 시키기 위한 물질이 추가적으로 사용됨에 따라 안정성 및 민감도가 저하되는 문제점이 있다.
이에 본 발명자는 고가의 열 순환 장비(thermal cycling instrument) 및 효소와 같은 추가적인 화학 물질 없이도 표적 DNA를 효과적으로 검출할 수 있는 방법에 대하여 거듭 연구한 끝에, 특정 염기서열을 가진 세 종류의 헤어핀 DNA(hairpin DNA)와 또 다른 특정 염기서열을 가진 DNA로 표면이 개질된 양자점(quantum dot)을 사용하여 표적 DNA를 검출할 시 물질의 증폭뿐만 아니라 신호 증폭이 가능하여 표적 DNA의 검출 효율을 크게 향상시킬 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상세하게, 본 발명의 일 양태는 A'영역을 포함하는 염기서열을 가지는 표적 DNA를 검출하기 위한 조성물로,
상기 조성물은, 염기서열이 A영역-B영역-C영역-D영역-E영역-F영역-D'영역-C'영역-B'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제1헤어핀 DNA;
염기서열이 C영역-D영역-F'영역-E'영역-B'영역-A'영역-E영역-F영역-D'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제2헤어핀 DNA; 염기서열이 F'영역-E'영역-A영역-B영역-D'영역-C'영역-B'영역-A'영역-E영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제3헤어핀 DNA; 및 염기서열 중 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점;을 포함하며,
이때, 상기 A영역은 A'영역과, B영역은 B'영역과, C영역은 C'영역과, D영역은 D'영역과, E영역은 E'영역과, F영역은 F'영역과, X영역은 X'영역과 각각 상보 결합되는 염기서열을 가지는 것인, 표적 DNA 검출용 조성물에 관한 것이다.
이와 같이, 표적 DNA에 의해 헤어핀 구조의 루프가 오픈되는 제1헤어핀 DNA와, 오픈된 제1헤어핀 DNA에 의해 연쇄적으로 루프가 오픈되는 제2헤어핀 DNA, 및 오픈된 제2헤어핀 DNA에 의해 연쇄적으로 루프가 오픈되는 제3헤어핀 DNA를 함께 사용함으로써 도 1 및 2에 도시된 바와 같은 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성할 수 있다.
이때, 상기 염기서열의 X영역은 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하는 것일 수 있으며, 염기서열의 X영역이 5' 말단에 위치할 경우 표적 DNA는 제1헤어핀 DNA의 3' 말단인 A영역에 상보 결합될 수 있으며, 반대로 염기서열의 X영역이 3' 말단에 위치할 경우, 도 3에 도시된 바와 같이, 표적 DNA는 제1헤어핀 DNA의 5' 말단인 A영역에 상보 결합될 수 있다.
또한, 이 Y-DNA 자기조립체 말단의 X영역 염기서열과 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점 말단의 X'영역이 서로 상보적으로 결합하여 3차원 네트워크 구조를 가진 하이드로젤을 형성할 수 있으며, 이를 통해 Y-DNA 자기조립체 말단의 소광체와 양자점 표면 간의 거리가 매우 가까워져 양자점에 의한 형광을 매우 효과적으로 소광시킬 수 있음으로써 우수한 형광 공명 에너지 전달(FRET, F
Figure 112019060634160-pat00001
rster resonance energy transfer) 효율을 가진 표적 DNA 검출용 조성물을 제공할 수 있다.
이때, FRET이란 두 개의 서로 다른 파장 영역을 갖는 형광물질이 서로 인접하였을 경우, 한 형광물질의 형광을 일으키는 에너지가 다른 형광물질에 전달되는 공명 현상이 발생함으로써 처음 형광물질의 형광과는 다른 형광(acceptor or quencher)이 발생되는 현상을 이용한 것으로, 에너지를 주는 형광물질을 공여체(donor)라 하고 에너지를 받는 형광물질을 수용체(acceptor or quencher)라고 한다.
본 발명에서의 공여체는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이며, 수용체는 각 헤어핀 DNA의 말단 또는 Y-DNA 자기조립체의 말단에 위치한 소광체일 수 있다. 즉, Y-DNA 자기조립체 말단의 소광체와 양자점 표면 간의 거리가 매우 가까워져 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의한 형광 공명 에너지가 보다 더 쉽게 Y-DNA 자기조립체 말단의 소광체로 전달됨으로써, 동일 파장 영역대를 기준으로, 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의한 형광의 세기가 크게 줄어들 수 있으며, 이로부터 우수한 FRET 효율을 확보할 수 있어 표적 DNA의 존재 여부를 쉽게 확인할 수 있다는 장점이 있다.
아울러, Y-DNA 자기조립체 형성 시, 초기 개시제 역할을 하는 표적 DNA가 Y-DNA 자기조립체의 형성 완료 후 방출되어 다시 제1헤어핀 DNA의 루프를 오픈시킴으로써 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 지속적으로 Y-DNA 자기조립체를 형성할 수 있으며, 이와 같은 표적 DNA의 촉매 작용에 의해 Y-DNA 자기조립체의 수가 증폭되어 FRET 효율을 보다 향상시킬 수 있다.
이처럼 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물은 1차적으로 Y-DNA 자기조립체의 수를 증폭시키고, 2차적으로 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성함으로써 FRET 신호를 증폭시켜, 두 증폭 과정에 의해 FRET 효율을 더욱 향상시킴으로써 fM 가량의 매우 미량의 표적 DNA 검출이 가능할 수 있으며, 우수한 민감도를 확보할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물은 표적 DNA에서 하나의 염기 또는 두 개의 염기가 다른(mismatched) 유사 표적 DNA 조차도 Y-DNA 자기조립체를 형성하지 못 함에 따라 표적 DNA에 대한 검출 선택성이 매우 높다는 장점이 있다.
또한, 매우 짧은 시간에도 높은 FRET 효율을 보임에 따라 표적 DNA의 검출 시간을 크게 줄일 수 있으며, 이와 같은 우수한 검출 신속성으로 인하여 현장 진단 시 매우 유용하게 활용할 수 있다는 장점이 있다.
뿐만 아니라, 고가의 열 순환 장비와 효소가 필요하지 않음에 따라 비용을 절감할 수 있어 경제성이 우수하며, 효소가 필요하지 않아 이를 안정화시키기 위한 물질을 추가적으로 사용하지 않을 수 있어 조성물의 안정성 및 검출 민감도의 저하를 방지할 수 있어 좋다.
이하, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA 검출용 조성물의 각 구성 요소에 대하여 보다 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA(target DNA)에 대하여 설명한다. 상기 표적 DNA는 검출하고자 하는 DNA로, 특정 염기서열을 가진 단일가닥 DNA일 수 있으며, 상세하게 A'영역을 포함하는 염기서열을 가지는 것일 수 있다.
이와 같은 염기서열을 가짐에 따라, 상기 표적 DNA의 A'영역과 제1헤어핀 DNA의 말단인 토홀드의 A영역의 상보 결합이 효과적으로 시작되어 제1헤어핀 DNA의 루프를 오픈시킬 수 있으며, Y-DNA 자기조립체 형성 후에는 형성된 Y-DNA 자기조립체로부터 방출되어 다시 새로운 제1헤어핀 DNA를 오픈할 수 있어, 개시제와 촉매의 역할을 동시에 할 수 있다.
이때, 상기 표적 DNA는 A'영역을 포함하는 염기서열을 가지기만 하면 제1헤어핀 DNA의 루프를 효과적으로 오픈시킬 수 있으며, A'영역 외 다른 어떤 영역을 더 포함하여도 무방하다. 구체적인 일 예로, 상기 표적 DNA는 A'영역과, B영역, B'영역, C영역, C'영역, D영역, D'영역, E영역, E'영역, F영역, F'영역 및 G영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 영역을 더 포함할 수 있다. 보다 좋게는 제1헤어핀 DNA와의 특히 효과적인 상보 결합을 위하여 A'영역-B'영역-C'영역-D'영역을 포함하는 염기서열을 가진 단일가닥 DNA를 표적 DNA로 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
다음으로, 본 발명의 일 예에 따른 헤어핀 DNA(hairpin DNA)에 대하여 설명한다. 상기 헤어핀 DNA는 단일가닥의 루프(loop)와 이중 가닥의 스템(stem) 및 2개의 단일가닥 토홀드(toehold)로 구성되며, 특히 헤어핀 DNA의 일단인 X영역 말단에는 소광체가 위치하여 차후 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합 시 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광을 효과적으로 소광시킬 수 있다.
보다 상세하게, 본 발명의 일 예에 따른 헤어핀 DNA는 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA일 수 있으며, 각기 다르게 디자인된 염기서열을 가짐으로써 연쇄적인 루프 오픈 및 자기 조립을 통해 Y-DNA 자기조립체를 효과적으로 형성할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 제1헤어핀 DNA는 상기 표적 DNA에 의해 루프가 오픈되며, 표적 DNA와 상보 결합하여 자기조립체 1을 형성할 수 있는 것으로, 염기서열이 A영역-B영역-C영역-D영역-E영역-F영역-D'영역-C'영역-B'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 것일 수 있다.
이와 같은 염기서열을 가짐에 따라, 표적 DNA가 존재하지 않을 시에는 B영역-B'영역, C영역-C'영역 및 D영역-D'영역이 서로 상보 결합된 스템이 되며, E영역 및 F영역은 루프가, A영역 및 X영역은 각각 토홀드가 되어 헤어핀 구조를 안정적으로 유지할 수 있다.
반면, 표적 DNA가 존재할 시, 표적 DNA에 의해 제1헤어핀 DNA의 A영역 말단부터 표적 DNA의 A'영역 말단과 상보 결합되어, 그 구동력에 의해 제1헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 3에 도시된 바와 같은 구조의 자기조립체 1이 형성될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 제2헤어핀 DNA는 상기 자기조립체 1에 의해 루프가 오픈되며, 자기조립체 1과 상보 결합하여 자기조립체 2를 형성할 수 있는 것으로, 염기서열이 C영역-D영역-F'영역-E'영역-B'영역-A'영역-E영역-F영역-D'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 것일 수 있다.
이와 같은 염기서열을 가짐에 따라, 표적 DNA가 존재하지 않을 시에는 D영역-D'영역, F영역-F'영역 및 E영역-E'영역이 서로 상보 결합된 스템이 되며, B'영역 및 A'영역은 루프가, C영역 및 X영역은 각각 토홀드가 되어 헤어핀 구조를 안정적으로 유지할 수 있다.
반면, 표적 DNA가 존재할 시, 표적 DNA와 제1헤어핀 DNA가 자기 조립된 자기조립체 1이 형성되고, 이 자기조립체 1에 의해 제2헤어핀 DNA의 C영역 말단부터 자기조립체 1와 상보 결합되며, 그 구동력에 의해 제2헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 4에 도시된 바와 같은 구조의 자기조립체 2가 형성될 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 제3헤어핀 DNA는 상기 자기조립체 2에 의해 루프가 오픈되며, 자기조립체 2와 상보 결합하여 자기조립체 3을 형성할 수 있는 것으로, 염기서열이 F'영역-E'영역-A영역-B영역-D'영역-C'영역-B'영역-A'영역-E영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 것일 수 있다.
이와 같은 염기서열을 가짐에 따라, 표적 DNA가 존재하지 않을 시에는 E영역-E'영역, A영역-A'영역 및 B영역-B'영역이 서로 상보 결합된 스템이 되며, C'영역 및 D'영역은 루프가, F'영역 및 X영역은 각각 토홀드가 되어 헤어핀 구조를 안정적으로 유지할 수 있다.
반면, 표적 DNA가 존재할 시, 표적 DNA와 제1헤어핀 DNA가 자기 조립된 자기조립체 1이 형성되고, 이 자기조립체 1에 의해 제2헤어핀 DNA이 형성되어, 상기 제3헤어핀 DNA의 F'영역 말단부터 자기조립체 2와 상보 결합되며, 그 구동력에 의해 제3헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 2에 도시된 바와 같은 구조의 Y-DNA 자기조립체가 형성될 수 있다.
즉, 본 발명의 일 예에 따른 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA는 표적 DNA에 의해 연쇄적으로 자기 조립되어 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 것일 수 있다.
한편, 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA의 X'영역 말단에는 소광체가 위치하며, 상기 소광체는 형광물질에서 발하는 형광을 소광시킬 수 있는 물질로, 본 발명에서는 양자점에서 발하는 형광을 소광시킬 수 있는 물질일 수 있다.
상기 소광체는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것이라면 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있으며, 구체적인 일 예시로, 블랙홀 소광체(Black Hole Quencher Dyes, Biosearch Technologies사 제품; BHQ), 블랙베리 소광체(Black Berry Quencher, BERRY&ASSOCIATES사 제품; BBQ) 및 이들의 유도체 등으로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있으며, 형광체의 종류에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA는 세 헤어핀 DNA가 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 것임에 따라 제1헤어핀 DNA: 제2헤어핀 DNA: 제3헤어핀 DNA의 몰비는 1 : 0.8 내지 1.2 : 0.8 내지 1.2일 수 있으며, 보다 좋게는 제1헤어핀 DNA: 제2헤어핀 DNA: 제3헤어핀 DNA의 몰비는 1 : 0.9 내지 1.1 : 0.9 내지 1.1일 수 있으며, 바람직하게는 동일 몰수로 첨가되는 것이 미결합 되는 헤어핀 DNA의 수를 줄일 수 있어 좋다.
다음으로, 본 발명의 일 예에 따른 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점(quantum dot)에 대하여 설명한다.
상기 양자점은 나노 사이즈의 결정으로서, 사이즈에 따른 스펙트럼 변화(즉, 사이즈 변화에 따라 다른 파장의 빛을 방출하는 특성), 개선된 휘도, 광 표백(photo bleaching)에 대한 우수한 안정성, 동시 다중 형광 여기 등과 같은 특유의 광학 특성을 나타낸다. 이와 같이, 양자점의 넓은 흡수 스펙트럼 및 좁은 방출 스펙트럼으로 인하여 FRET 현상을 기반으로 하는 바이오센서 또는 진단 시스템 등의 기술 분야에서 많이 이용되어 오고 있다.
본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA 검출용 조성물의 경우, 상기 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 표적 DNA의 존재 하에 형성된 Y-DNA 자기조립체를 결합시킴으로써 FRET 현상을 유발할 수 있다.
보다 상세하게, 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X' 영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성할 수 있으며, 이를 통해 양자점에서 방출되는 형광 공명 에너지가 Y-DNA 자기조립체의 말단에 위치한 소광체로 전이되어 동일 파장 영역대에서의 형광 세기가 약해질 수 있고, 이와 같은 FRET 현상을 기반으로 표적 DNA를 검출할 수 있다.
보다 상세하게, 상기 하이드로젤은 X' 영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
[관계식 1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.8
(상기 관계식 1에서, PL 1은 표적 DNA와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 표적 DNA와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
한편, 본 발명의 일 예에 있어, 상기 양자점은 통상적으로 사용되는 것이라면 특별히 한정하지 않고 사용할 수 있으며, 구체적인 일 예시로 Ⅱ-Ⅵ족 반도체 화합물, Ⅲ-Ⅴ족 반도체 화합물, Ⅳ족 반도체 화합물 및 I-III-VI족 반도체 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다. 더욱 구체적인 일 예시로, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe, GaAs, InGaAs, InP, InAs, Ge, Si, CuInS2, AgInS2 및 이들의 조합물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 혼합물일 수 있다. 보다 바람직하게는, Ⅱ-Ⅵ족 반도체 화합물로서 CdS, CdSe, CdTe, ZnS, ZnSe, ZnTe 또는 CdSeTe을, Ⅲ-Ⅴ족 반도체 화합물로서 InP, GaP 또는 InAs를 사용할 수 있다.
상기 양자점의 사이즈는 특별히 한정하지 않으나, 0.5 내지 50 ㎚, 보다 구체적으로 1 내지 40 ㎚, 더욱 구체적으로 약 1 내지 20 ㎚, 더욱 더 구체적으로 1 내지 10 ㎚일 수 있으나, 이용하고자 하는 형광의 파장 영역대에 따라 그 크기를 선택할 수 있음은 물론이다.
아울러, 상기 양자점의 형상은 특별히 제한되는 것은 아니며, 구, 로드, 와이어, 피라미드, 입방체, 코어쉘 등 다양한 형상을 가질 수 있으며, 바람직하게는 구 형상일 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 양자점은 X' 영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 것일 수 있다. 이때, X' 영역은 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하는 것일 수 있다. 이처럼, 말단에 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질됨으로써 차후 표적 DNA 존재 시 형성된 Y-DNA 자기조립체와 효과적으로 상보 결합됨으로써, 양자점에서 방출되는 형광 공명 에너지가 Y-DNA 자기조립체의 말단에 위치한 소광체로 보다 잘 전이되어 동일 파장 영역대에서의 형광 세기가 약해질 수 있으며, 이와 같은 FRET 현상을 기반으로 표적 DNA를 검출할 수 있다.
이때, 상기 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA는 5' 말단 또는 3' 말단의 포스포디에스터 골격(phosphodiester backbone)이 포스포로티오에이트(phosphorothioate)로 개질된 아데닌(adenine)을 함유하는 것일 수 있으며, 구체적인 일 예시로, 5' 말단 또는 3' 말단의 아데닌의 수는 3 내지 10개일 수 있으나, 이는 하나의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA를 양자점 합성 시 첨가할 시 양자점 표면의 양전하성 금속 원자에 포스포로티오에이트기의 S-가 정전기적 상호작용으로 붙어 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점은 특별히 그 첨가량이 한정되지 않으며, FRET 효율을 향상시키는 측면에서 제1헤어핀 DNA의 몰수를 기준으로 0.1 내지 20 몰배로 첨가될 수 있으며, 보다 좋게는 0.5 내지 10 몰배, 더욱 좋게는 1 내지 5 몰배로 첨가될 수 있다.
이처럼, 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물이 우수한 표적 DNA 검출 효율을 가짐에 따라, 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 표적 DNA를 검출하기 위한 바이오센서로 활용이 가능할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 이용한 표적 DNA의 검출 방법에 관한 것이다.
전술한 바와 같이, 상기 표적 DNA 검출용 조성물은 표적 DNA가 존재할 때에만 Y-DNA 자기조립체가 형성되고, 이 Y-DNA 자기조립체가 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합되어 FRET 신호를 증폭시킴에 따라, Y-DNA 자기조립체 수의 증폭 및 FRET 신호 증폭에 의해 매우 효과적으로 표적 DNA를 검출할 수 있다.
반면, 표적 DNA가 존재하지 않을 시 제1헤어핀 DNA의 루프가 오픈되지 않음에 따라 Y-DNA 자기조립체가 형성되지 않으며, 이에 따라 Y-DNA 자기조립체가 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합되지 못 하여 수력학적 크기가 거의 증가하지 않는 것을 확인할 수 있다(도 13). 즉, 이와 같은 결과는 표적 DNA가 없을 시 FRET 현상이 일어나지 않음을 의미하는 것으로, 도 12에 도시된 바와 같이, FRET 효율이 거의 증가하지 않는 것으로부터 확인할 수 있다.
이처럼, 본 발명에 따른 표적 DNA의 검출 방법은 표적 DNA의 존재 유무에 따라 FRET 효율이 전혀 다르게 측정됨에 따라 표적 DNA를 효과적으로 검출할 수 있다는 장점이 있다.
특히, 표적 DNA 검출용 조성물의 설명부에서 전술한 바와 같이, 표적 DNA의 검출 방법에 이용되는 표적 DNA 검출용 조성물은 1차적으로 표적 DNA의 촉매 작용에 의해 Y-DNA 자기조립체가 증폭되며, 2차적으로 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성함으로써 FRET 신호가 증폭되어, 두 증폭 과정에 의해 FRET 효율이 더욱 향상됨으로써 fM 가량의 매우 미량의 표적 DNA 검출이 가능할 수 있으며, 우수한 민감도를 확보할 수 있다.
아울러, 표적 DNA에서 하나의 염기 또는 두 개의 염기가 다른(mismatched) 유사 표적 DNA 조차도 Y-DNA 자기조립체를 형성하지 못함에 따라 표적 DNA에 대한 매우 우수한 검출 선택성을 가질 수 있다는 장점이 있다.
또한, 매우 짧은 시간에도 높은 FRET 효율을 보임에 따라 표적 DNA의 검출 시간을 크게 줄일 수 있으며, 이와 같은 우수한 검출 신속성으로 인하여 현장 진단 시 매우 유용하게 활용할 수 있다는 장점이 있다.
뿐만 아니라, 고가의 열 순환 장비와 효소가 필요하지 않음에 따라 비용을 절감할 수 있어 경제성이 우수하며, 효소가 필요하지 않아 이를 안정화시키기 위한 물질을 추가적으로 사용하지 않을 수 있어 조성물의 안정성 및 검출 민감도의 저하를 방지할 수 있어 좋다.
이하, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA의 검출 방법에 대하여 보다 상세히 설명한다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA의 검출 방법은 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 이용하여 수행될 수 있으며, 형광 공명 에너지 전달(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용하는 것일 수 있다.
즉, 표적 DNA 존재 시 형성된 Y-DNA 자기조립체 말단의 소광체와 양자점 표면 간의 거리가 매우 가까워져 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의한 형광 공명 에너지가 보다 더 쉽게 Y-DNA 자기조립체 말단의 소광체로 전달됨으로써 동일 파장 영역대를 기준으로 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의한 형광의 세기가 크게 줄어들 수 있으며, 이와 같은 FRET 현상을 이용하여 표적 DNA의 존재 여부를 쉽게 확인할 수 있다.
보다 상세하게, 상기 표적 DNA의 검출 방법은,
a) 표적 파장 영역에서 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기 PL 1을 측정하는 단계; b) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계; c) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 2를 측정하는 단계; 및 d) 상기 PL 1과 PL 2를 비교하여 표적 DNA의 존재 유무를 판단하는 단계;를 포함하여 수행될 수 있다.
이처럼 표적 파장 영역에서의 최대 형광 세기를 분석함으로써 표적 DNA의 존재 여부를 판단할 수 있다.
이때, 상기 PL 1과 PL 2는 통상적인 방법을 통해 측정될 수 있으며, 단 동일한 조건으로 측정되어야 함은 물론이다. 구체적인 일 예시로, 상기 PL 1 및 PL 2는 형광 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다.
먼저, a) 표적 파장 영역에서 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기 PL 1을 측정하는 단계를 수행할 수 있으며, 이때 상기 표적 DNA 검출용 조성물은 전술한 바와 동일함에 따라 중복 설명은 생략한다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 a)단계는 표적 DNA를 검출하기 전 초기 상태의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기 PL 1을 측정하기 위한 단계로, 표적 DNA 검출용 조성물 내 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA, 제3헤어핀 DNA 및 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 서로 독립적으로 존재하고 있는 상태에서의 최대 형광 세기 PL 1를 측정하는 것일 수 있으며, 이때 형광은 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의해 방출되는 형광일 수 있다.
다음으로, b) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계를 수행할 수 있다. 이때 혼합 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 특별히 그 방법을 제한하지는 않는다.
본 단계를 통해 FRET 현상이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 이를 통해 차후 표적 DNA의 존재 여부를 판단할 수 있다.
바람직하게, 상기 b)단계는 20분 이상 수행될 수 있으며, 보다 좋게는 30분 이상, 더욱 좋게는 60분 이상 수행될 수 있다. 이처럼 배양 시간을 증가시킴으로써 보다 큰 폭으로 형광 세기가 감소된 PL 2를 확보할 수 있어, 더욱 명확하며 정밀하게 표적 DNA의 존재 여부를 판단할 수 있다. 이때, 배양 시간의 상한은 특별히 한정하지 않으며, 표적 DNA 검출용 조성물 내 각 구성 요소의 첨가량 및 표적 DNA의 농도에 따라 달라질 수 있다. 표적 DNA의 농도가 클 경우 짧은 시간에도 Y-DNA 자기조립체를 많이 형성하여 FRET 효율이 빠르게 증가할 수 있으며, 표적 DNA의 농도가 작을 경우 보다 긴 시간을 배양해야 유의미한 FRET 효율을 확보할 수 있다. 아울러, 표적 DNA 검출용 조성물 내 각 구성 요소의 첨가량이 적을 경우, 배양 시간을 늘려도 FRET 효율이 일정 이상 증가하지 않음에 따라 적정하게 배양 시간을 조절하여 주는 것이 필요하다. 비 한정적인 일 예시로, 상기 b)단계는 6시간 이하로 수행될 수 있으나, 이는 하나의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 일 예시로, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA 검출용 조성물은 6 nM의 동일 몰수로 첨가되는 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA, 및 3 nM로 첨가되는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점을 포함할 수 있으며, 이를 기준으로 상기 PL 1 및 PL 2가 각각 측정된 것일 수 있다.
다음으로, c) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 2를 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 c)단계는 분석시료가 표적 DNA 검출용 조성물과 혼합된 혼합물의 최대 형광 세기 PL 2를 측정하기 위한 단계로, 표적 DNA가 존재할 시 표적 DNA 검출용 조성물 내 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA이 서로 단계적 자기 조립되어 Y-DNA 자기조립체를 형성하며, 이 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 서로 결합되어 FRET 현상이 발생할 수 있으며, 이에 따라 PL 1과 PL 2의 형광 세기 차이가 커질 수 있다. 반면, 표적 DNA가 존재하지 않을 경우, 유의미한 FRET 현상이 발생하지 않을 수 있으며, 이에 따라 PL 1과 PL 2의 차이가 거의 없을 수 있으며, 기계적 오차 및 실험적 오차로 인한 미미한 차이는 발생할 수 있다.
보다 구체적인 일 예시로, 분석시료에 표적 DNA가 존재하는 경우,
상기 표적 DNA의 검출 방법은, ⅰ) 표적 DNA를 포함하는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 표적 DNA에 의해 자기 조립된 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 단계; 및 ⅱ) 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는 단계;를 포함하며,
상기 ⅱ)단계에서 상기 하이드로젤의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
[관계식 1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.8
(상기 관계식 1에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
더욱 상세하게, 상기 ⅰ)단계는 Y-DNA 조립체가 형성되는 단계로, 표적 DNA의 존재 시, 표적 DNA에 의해 제1헤어핀 DNA의 A영역 말단부터 표적 DNA의 A'영역말단과 상보 결합되며, 그 구동력에 의해 제1헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 3에 도시된 바와 같은 구조의 자기조립체 1이 형성될 수 있다. 연쇄적으로 상기 자기조립체 1에 의해 제2헤어핀 DNA의 C영역 말단부터 자기조립체 1과 상보 결합되며, 그 구동력에 의해 제2헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 4에 도시된 바와 같은 구조의 자기조립체 2가 형성될 수 있다. 연쇄적으로 상기 자기조립체 2에 의해 상기 제3헤어핀 DNA의 F'영역 말단부터 자기조립체 2와 상보 결합되며, 그 구동력에 의해 제3헤어핀 DNA의 루프가 오픈되어 도 2에 도시된 바와 같은 구조의 Y-DNA 자기조립체가 형성될 수 있다.
이때, 상기 표적 DNA는 Y-DNA 자기조립체의 형성 후 방출되어 다시 제1헤어핀 DNA를 오픈하는 촉매 역할을 할 수 있음에 따라, 매우 미량이 존재하더라도 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 Y-DNA 자기조립체의 수를 증폭시킬 수 있어 FRET 효율을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.
다음으로, ⅱ) 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는 단계를 수행할 수 있다.
더욱 상세하게, 상기 ⅱ)단계는 ⅰ)단계에서 생성된 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 결합됨으로써, 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의해 발생하는 형광 공명 에너지가 Y-DNA 자기조립체의 말단에 위치한 소광체로 전이되어, 특정 영역에서의 최대 형광 세기가 약해질 수 있다.
구체적으로, 전술한 바와 같이, 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해질 수 있다.
[관계식 1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.8
상기 관계식 1에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.
이처럼, 60분의 짧은 배양 시간에도 불구 최대 형광의 세기가 크게 감소될 수 있으며, 배양 시간을 더욱 증가시킬 경우 PL 2는 더욱 큰 폭으로 감소될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이때 표적 DNA 검출용 조성물은 6 nM의 동일 몰수로 첨가되는 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA, 및 3 nM로 첨가되는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점을 포함할 수 있으며, 이를 기준으로 상기 PL 1 및 PL 2가 각각 측정된 것일 수 있다.
보다 좋게는 하기 관계식 1-1을 만족하도록 형광의 세기가 약해질 수 있다.
[관계식 1-1]
PL 2/PL 1 ≤ 0.75
(상기 관계식 1-1에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
이처럼, 60분의 짧은 배양 시간에도 불구 최대 형광의 세기가 크게 감소될 수 있다.
반면, 분석시료에 표적 DNA가 존재하지 않는 경우,
상기 표적 DNA의 검출 방법은, ⅰ) 표적 DNA를 포함하지 않는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 Y자 형태로 자기 조립되지 못 하고 각각 존재하는 단계; 및 ⅱ) 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합되지 못 하고 각각 존재하는 단계;를 포함하며,
상기 ⅱ)단계에서 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 소광체로 이동하지 못하여 하기 관계식 2를 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것일 수 있다.
상기 전술한 바와 같이 표적 DNA 존재 시에는 Y-DNA 자기조립체가 형성되어 결과적으로 최대 형광 세기가 약해지는 것과 달리, 표적 DNA가 존재하지 않을 경우, 각각의 헤어핀 DNA가 서로 결합되지 못 하고 독립적으로 존재하며, 각각의 헤어핀 DNA는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과도 결합되지 못 할 수 있다. 이에 따라 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점에 의해 발생하는 형광 공명 에너지가 각 헤어핀 DNA의 말단에 위치한 소광체로 전이되지 않으며, 이에 따라 특정 영역에서의 최대 형광 세기가 거의 약해지지 않을 수 있다.
구체적으로, 하기 관계식 2를 만족하도록 형광의 세기가 약해질 수 있다. 즉 최대 형광 세기가 거의 변하지 않을 수 있다.
[관계식 2]
0.9 ≤ PL 2/PL 1 ≤ 1
(상기 관계식 2에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
이처럼, 표적 DNA 존재 시에는 60분의 짧은 배양 시간에도 불구 최대 형광의 세기가 의미 있는 수준으로 감소되는 반면, 표적 DNA가 존재하지 않을 시 동일 시간 동안 배양을 시켜도 최대 형광 세기가 유의미한 수준으로 감소되지 않을 수 있다.
다음으로, d) 상기 PL 1과 PL 2를 비교하여 표적 DNA의 존재 유무를 판단하는 단계를 수행할 수 있다.
상세하게, 전술한 단계를 통해 각각 측정된 PL 1 및 PL 2를 상기 관계식 1 또는 2에 대입하여 표적 DNA의 존재 유무를 판단할 수 있는데, 60분의 짧은 배양 시간에도 불구 관계식 1을 만족할 시 표적 DNA가 존재한다고 판단할 수 있으며, 반면 관계식 1을 불만족 하거나, 동일 배양 시간에도 불구 관계식 2를 만족할 경우 표적 DNA가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 양태는 표적 DNA의 정량 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게, 본 발명의 일 예에 따른 표적 DNA의 정량 방법은, A) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계; B) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 3을 측정하는 단계; 및 C) 상기 PL 3과 표준 최대 형광 세기를 비교하여 표적 DNA의 양을 정량하는 단계;를 포함할 수 있다.
이때, 측정되는 PL 3을 토대로 표적 DNA의 양을 정량하기 위해서는 표적 DNA의 양에 따른 최대 형광 세기를 미리 표준화한 데이터베이스를 구축하는 작업이 필히 선행되어야하며, 구축된 데이터베이스는 정밀도 및 신뢰도가 있어야 한다. 아울러, 각 헤어핀 DNA의 몰수, 단일가닥으로 표면 개질된 양자점의 크기 및 몰수, 그리고 배양 시간 등에 의해 최대 형광 세기 및 파장 영역대가 달라질 수 있음에 따라, 표적 DNA의 첨가량 외 모든 조건을 동일하게 컨트롤하여야 함은 물론이며, 각 변수에 따른 데이터베이스를 미리 구축하는 것도 좋다.
먼저, A) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계를 수행할 수 있다. 이때 혼합 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 특별히 그 방법을 제한하지는 않는다. 아울러, 상기 표적 DNA 검출용 조성물은 전술한 바와 동일함에 따라 중복 설명은 생략한다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 A)단계는 Y-DNA와 단일가닥으로 표면 개질된 양자점이 결합된 하이드로젤을 형성하거나 또는 형상하지 못 하는 단계로, 표적 DNA가 존재할 시 표적 DNA 검출용 조성물 내 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA이 서로 단계적 자기 조립되어 Y-DNA 자기조립체를 형성하며, 이 Y-DNA 자기조립체와 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점이 서로 결합되어 하이드로젤을 형성함으로써, 이후 최대 형광 세기 측정 시, 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기와 비교하여 PL 3이 크게 저하될 수 있다. 반면, 표적 DNA가 존재하지 않을 경우, 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기와 비교 시, 최대 형광 세기가 거의 차이 나지 않을 수 있다.
바람직하게, 상기 A)단계는 20분 이상 수행될 수 있으며, 보다 좋게는 30분 이상, 더욱 좋게는 60분 이상 수행될 수 있다. 이처럼 배양 시간을 증가시킴으로써 보다 큰 폭으로 PL 3을 감소시킬 수 있어, 더욱 명확하게 표적 DNA의 양을 정량할 수 있다. 이때, 상한은 특별히 한정하지 않으며, 표적 DNA 검출용 조성물 내 각 구성 요소의 첨가량 및 표적 DNA의 농도에 따라 달라질 수 있다. 표적 DNA의 농도가 클 경우 짧은 배양 시간에도 Y-DNA 자기조립체를 많이 형성하여 최대 형광 세기가 빠르게 감소할 수 있으며, 표적 DNA의 농도가 작을 경우 보다 긴 시간을 배양해야 유의미한 최대 형광 세기의 감소를 확보할 수 있다. 아울러, 표적 DNA 검출용 조성물 내 각 구성 요소의 첨가량이 적을 경우, 배양 시간을 늘려도 최대 형광 세기는 일정 이상 감소하지 않음에 따라 적정하게 구성 요소의 첨가량 및 배양 시간을 조절하여 주는 것이 필요하다. 비 한정적인 일 예시로, 상기 A)단계는 6시간 이하로 수행될 수 있으나, 이는 하나의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
단, 이는 하나의 예시일 뿐, 정밀한 표준 DNA의 정량화를 위해서는 각 헤어핀 DNA의 몰수, 단일가닥으로 표면 개질된 양자점의 크기 및 몰수, 그리고 배양 시간 등에 의해 최대 형광 세기 및 파장 영역대가 달라질 수 있음에 따라, 표적 DNA의 양 외 모든 조건을 동일하게 컨트롤하여야 함은 물론이며, 각 변수에 따른 데이터베이스를 미리 구축하는 것도 좋다.
다음으로, B) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 3을 측정하는 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 예에 있어, 상기 B)단계는 분석시료가 표적 DNA 검출용 조성물과 혼합된 혼합물의 최대 형광 세기 PL 3을 측정하기 위한 단계로, 상기 PL 3은 형광 분광광도계를 사용하여 측정될 수 있다.
다음으로, C) 상기 PL 3과 표준 최대 형광 세기를 비교하여 표적 DNA의 양을 정량하는 단계를 수행할 수 있다.
언급한 바와 같이, 이를 위해서는 표적 DNA의 양에 따른 최대 형광 세기를 정밀성 및 신뢰성 있게 미리 표준화한 데이터베이스를 구축하는 작업이 필히 선행되어야하며, 구축된 데이터베이스의 표준 최대 형광 세기와 상기 B)단계에서 측정된 PL 3을 비교하여, 측정된 최대 형광 세기와 동일한 표준 최대 형광 세기에서의 표준 표적 DNA의 양을 분석시료 내 표적 DNA의 양이라고 분석할 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 DNA의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 DNA의 정량 방법에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
또한 달리 정의되지 않은 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 또한 명세서에서 특별히 기재하지 않은 첨가물의 단위는 중량%일 수 있다.
[실험예]
1) DNA 준비 :
모든 DNA 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 한국 바이오니아 사(Bioneer Inc)에서 구입하여 사용하였다. 사용된 헤어핀 DNA와 Y-DNA 자기조립체의 염기서열은 NUPACK 소프트웨어를 사용하여 디자인되었으며, 모든 DNA 올리고뉴클레오타이드의 염기서열은 하기 표 1에 기재된 것과 같다.
염기서열(5' → 3')
HD 1 GCTTGA GATGTT ACTAAG GATGTT AACATC CACAAC AACATC CTTAGT AACATC ATCCATCCT
HD 2 ACTAAG GATGTT GTTGTG GATGTT AACATC TCAAGC AACATC CACAAC AACATC ATCCATCCT
HD 3 GTTGTG GATGTT GCTTGA GATGTT AACATC CTTAGT AACATC TCAAGC AACATC ATCCATCCT
TD AACATC CTTAGT AACATC TCAAGC
SM-TD AACAT G CTTAGT AACATC TCAAGC
DM-TD AACAT G CTTAGT AACATC A CAAGC
R-TD ATGTGT AGCGGT AAAATG CGTAAA
pt-DNA AAAAAA AAAAAA AGGATGGAT GATGTT
상기 표 1에서, HD 1 은 제1헤어핀 DNA이며, HD 2 는 제2헤어핀 DNA이며, HD 3 은 제3헤어핀 DNA이며, TD 는 표적 DNA이며, SM-TD 는 표적 DNA에서 하나의 염기서열이 달라진 DNA(single-base mismatched target DNA)이며, DM-TD 는 표적 DNA에서 두 개의 염기서열이 달라진 DNA(double-base mismatched target DNA)이며, R-TD 는 랜덤 표적 DNA이며, pt-DNA 는 포스포로티오에이트 DNA(phosphorothioate DNA)이며, 이때, 상기 표 1에는 생략되었으나, HD 1, HD 2 및 HD 3의 3' 말단에는 소광체(black hole quencher-2, Biosearch Technologies Inc.(미국))가 각각 표지되어 있다(한국 바이오니아 사(Bioneer Inc)로부터 구입).
2) 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점(QD-ssDNA) 준비:
격렬한 교반 하에 Cd(NO3) 2 77.12 ㎎ (0.25 mmol)과 3-머캅토프로피온산(MPA) 50 ㎕를 탈이온수 50 ㎖에 용해시켜 Cd 전구체 용액을 제조한 후 1 M NaOH를 사용하여 용액의 pH를 12.2로 조정하였다.
그 다음, 용액을 진공 하에 30분 동안 탈기시키고, 아르곤(Ar)으로 30분 동안 버블링(bubbling)시켰다. 아르곤 버블링 하에, Cd 전구체 용액에 0.5 M NaHTe 용액 (약 20 ㎕) 한 방울을 주입했다. CdTe 코어 양자점 (이하, QD)은 투명에서 희미한 황색으로 색상이 변경되어 합성된 것을 확인하였다.
이후, QD이 합성된 용액을 발광 피크(emission peak)가 490 ㎚ 파장 영역에 도달할 때까지 4℃에서 숙성시킨 후, 에탄올(25 부피%)을 첨가하여 정제하고, 이어서 6,500 rcf에서 15 분간 원심 분리하였다.
침전된 QD을 120 nM의 농도가 되도록 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 물에 재분산하여 QD 용액을 제조하였다. QD의 농도는 보고된 방법[W. W. Yu, L. Qu, W. Guo, X. Peng, Chem. Mater.2003, 15, 2854]을 통해 계산되었다.
다음으로, 1 ㎖의 QD 용액을 25 mM Cd(NO3) 45 ㎕와 25 mM MPA 90 ㎕와 혼합하여 1분간 초음파 처리하고, 20 μM 포스포로티오에이트 DNA (pt-DNA) 0.5 ㎖를 첨가하여 부드럽게 볼텍싱하였다. 1 M NaOH를 추가로 첨가하여 pH 12.2로 조정하고, 반응액이 담긴 바이알을 90℃에서 40분 동안 중탕 가열한 후, 상온의 수조에 담가 냉각시켰다.
마지막으로 0.5 ㎖의 반응액을 0.5 ㎖ Amicon 필터(MWCO 50 KDa)로 옮기고 4,600 rcf에서 3분간 원심 분리하였다. 농축액을 DEPC로 처리된 물 400 ㎕와 혼합하고 4,600 rcf에서 3분간 다시 원심 분리하였다. 이를 3번 반복하여 농축된 QD-ssDNA 를 수득하였으며, 이를 50 nM의 농도로 DEPC로 처리된 물에 희석시켰다.
상기 QD-ssDNA 의 경우, 발광 피크(emission peak)가 630 내지 640 ㎚ 파장 영역에서 나타나는 것을 확인하였다.
3) Y-DNA 자기조립체 분석:
상기 HD 1, HD 2 및 HD 3 각각을 인산 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline. PBS, pH 7.4)에 완전히 용해시키고, 95℃에서 5분간 가열한 후 열순환기(T100TM, Bio-Rad)를 사용하여 5분 동안 10℃로 냉각시켜 헤어핀 구조를 안정화하였다.
다음으로, Y-DNA 자기조립체의 형성을 확인하기 위하여 단계적인 자기 조립 분석을 수행하였다. 결과물은 1X TAE(트리즈마 염기(Trizma base), 아세트산 및 0.5 M EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0) 완충액에서 12% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(PAGE)을 통해 150 V에서 50분 동안 분석하였다. 겔을 GelRed® (Biotium)로 5분 동안 염색하고, GelDoc-IT TS 이미징 시스템을 사용하여 시각화 하였으며, 그 결과를 도 5에 도시하였다.
먼저, 표적 DNA(라인 1), HD 1(라인 2), HD 2(라인 3) 및 HD 3(라인 4) 각각을 전기영동법으로 분석하였다. HD 1, HD 2 및 HD 3 각각은 비 특이적인 뭉침 없이 단분산된 헤어핀 구조의 형성을 나타내는 하나의 밝은 단일 대역만을 나타냈다.
다음으로, 1 μM의 표적 DNA 2 ㎕와 1 μM의 HD 1 2 ㎕를 혼합하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다(시료 1). 그 결과, 라인 5에 도시된 바와 같이, 표적 DNA와 HD 1이 상보 결합된 자기조립체 1(TD+HD 1)이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
상기 시료 1에 HD 1과 동일 몰수의 HD 2를 추가한 후 실온에서 1시간 동안 추가 배양하였다(시료 2). 그 결과, 라인 6에 도시된 바와 같이, 자기조립체 1과 HD 2가 연쇄적으로 상보 결합된 자기조립체 2(TD+HD 1+HD 2)가 생성된 것을 확인할 수 있었다.
상기 시료 2에 HD 1과 동일 몰수의 HD 3을 추가한 후 실온에서 1시간 동안 추가 배양하였다(시료 3). 그 결과, 라인 7에 도시된 바와 같이, 자기조립체 2와 HD 3이 연쇄적으로 상보 결합된 Y-DNA 자기조립체가 생성된 것을 확인할 수 있었다.
반면, 표적 DNA 없이 HD 1, HD 2 및 HD 3만을 혼합한 경우, 48시간의 배양에도 불구하고, 라인 8에 도시된 바와 같이, Y-DNA 자기조립체가 형성되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 표적 DNA가 없는 상태에서 각 헤어핀 DNA는 안정적인 헤어핀 구조를 잘 유지할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 토대로, HD 1, HD 2 및 HD 3이 모두 혼합된 시료에 표적 DNA를 첨가하는 경우에도 Y-DNA 자기조립체가 잘 형성되는지를 조사하였다. 상세하게, 동일한 몰수의 HD 1, HD 2 및 HD 3을 혼합한 후, 상기와 동일한 양의 표적 DNA를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 표적 DNA를 첨가하지 않은 경우 밴드 시프트(shift)가 일어나지 않았으나, 표적 DNA를 첨가한 경우에는 3개의 밴드 시프트가 관찰되었으며, 이는 단계적 자가 조립에 의해 제조된 결과물의 전기영동 결과와 정확히 일치하였다. 이는 Y-DNA 자기조립체의 형성에 있어, 표적 DNA가 개시제로 작용함을 확인할 수 있는 결과이다.
한편, 도 7은 비접촉 모드(non-contact mode)의 원자간력 현미경(AFM, atomic force microscopy) 분석 자료로, 제조된 Y-DNA 자기조립체는 약 30 ㎚의 평균 입경을 가지는 구형의 나노입자를 잘 분산시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이로부터 DNA 사슬이 엉켜서 뭉치지 않고 잘 분산된 상태로 존재함을 확인할 수 있었다.
도 8은 표적 DNA의 농도에 따른 Y-DNA 자기조립체의 증폭 플롯 분석 자료로, 각기 다른 농도의 표적 DNA를 첨가하고 1시간 동안 배양한 후 젤 밴드 강도를 추정하였으며, 이때 각 HD의 농도는 200 nM이었다. 그 결과, 표적 DNA 농도 0.12 nM 내지 250 nM 각각에서 증폭된 Y-DNA 자기조립체는 표적 DNA의 농도가 증가함에 따라 점차 그 젤 밴드 강도가 증가하다가 62.5 nM에서 포화 상태에 도달하였다. 합성된 Y-DNA 자기조립체의 합성 수율은 동적 평형으로 인하여 약 78%이었다. 이와 같은 결과는 표적 DNA의 농도가 낮더라도 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 표적 DNA가 효과적으로 재순환하여 Y-DNA 자기조립체를 계속 생산할 수 있음을 강력하게 나타낸다.
4) QD-DNA 하이드로젤 분석:
상기 각각 제조된 QD-ssDNA 3 nM과 Y-DNA 자기조립체 6 nM을 1:2의 몰비율로 혼합하여 QD-DNA 하이드로젤을 제조하였다.
상세하게, QD-ssDNA에 결합된 포스포로티오에이트 DNA(pt-DNA)와 Y-DNA 자기조립체 말단이 서로 상보 결합을 통해 자기조립 되어 QD-DNA 하이드로젤이 형성되었다.
상기와 동일한 방법을 통해 전기영동 분석을 수행한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, QD-ssDNA는 약 25 bp 내지 70 bp의 스미어(smear) 밴드를 보였으며, 약 3 개의 pt-ssDNA가 각 QD에 강하게 부착되어 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 표적 DNA가 있는 경우, QD-ssDNA와 헤어핀 DNA의 혼합물은 고 분자량의 스미어 밴드로 훨씬 느리게 이동하며, 이는 QD-DNA 하이드로젤의 성공적인 형성을 나타낸다.
QD-DNA 하이드로젤에 있어, QD 표면과 소광체인 BHQ-2 사이에 5 nt의 단일 사슬 DNA가 존재함에 따라, QD 표면과 소광체인 BHQ-2 사이의 이론적 계산 거리는 1.7 ㎚(염기쌍 사이의 거리 0.34 ㎚ × 5 nt)이며, 효율적인 에너지 전달이 가능할 정도로 매우 가까운 것을 확인할 수 있었다.
아울러, 도 10에 도시된 바와 같이, 표적 DNA를 포함하지 않는 QD-ssDNA/HD 혼합물에서의 무작위로 응집된 QD와 대조적으로, 표적 DNA를 포함하는 QD-ssDNA/헤어핀 DNA 혼합물에서의 QD는 QD-DNA 하이드로젤의 형성으로 인해 밀접하게 분포되어 있음을 투과 전자현미경(TEM)을 통해 확인할 수 있었다.
5) 표적 DNA의 검출:
상기 HD 1, HD 2 및 HD 3 각각을 인산 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline. PBS, pH 7.4)에 완전히 용해시키고, 95℃에서 5분간 가열한 후 열순환기(T100TM, Bio-Rad)를 사용하여 5분 동안 10℃로 냉각시켜 헤어핀 구조를 안정화하였다.
다음으로, Y-DNA 자기조립체를 증폭하기 위해 동일 몰수의 HD 1, HD 2 및 HD 3 용액(in PBS)을 혼합한 후 HD 1 대비 0.5배의 몰수에 해당하는 QD-ssDNA를 첨가하여 분석시료를 제조하였다. 400 ㎚에서 여기(excitation)하는 F-7000 형광 분광광도계(Hitachi High-technologies, Tokyo, Japan)를 사용하여 상기 분석시료의 형광 세기 PL 1을 측정하였다.
이후, 상기 분석시료에 표적 DNA를 첨가하고, 배양하여 하이드로젤을 제조하였다. 이 분석시료의 형광 세기 PL 2를 상기와 동일한 방법으로 측정하였다.
이때, QD-ssDNA 및 표적 DNA 각각의 첨가량 및 배양 시간은 후술하는 실시예 1 내지 7에 구체적으로 기재하였다.
1. FRET 효율 분석
[실시예 1] QD-ssDNA와 Y-DNA 자기조립체 혼합 비율에 따른 FRET 효율 분석
상기 준비예와 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, QD-ssDNA : Y-DNA 자기조립체의 몰비를 1:0.1, 1:0.5, 1:2, 1:5로 각각 달리하여 QD-ssDNA와 Y-DNA 자기조립체 혼합 비율 및 배양 시간에 따른 FRET 효율을 분석하였다. 이때, Y-DNA 자기조립체의 몰수는 HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수를 조정하여 정밀하게 조절하였으며, QD-ssDNA와 Y-DNA 자기조립체 혼합 비율에 따른 FRET 효율 분석을 위해 QD-ssDNA와의 혼합 전 Y-DNA 자기조립체를 충분히 증폭시켰다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 0.3, 1.5, 6, 15 nM이었고, 표적 DNA는 각 HD와 동일한 몰수로 첨가하였다.
도 11에 도시된 바와 같이, Y-DNA 자기조립체의 비율 및 배양 시간이 증가함에 따라 FRET 효율도 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해 QD-ssDNA와 Y-DNA 자기조립체가 분자 자기 조립을 통해 하이드로젤을 형성함으로써 FRET 효율도 배양 시간에 따라 점진적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
상세하게, 60분 동안 배양 시, FRET 효율은 QD-ssDNA : Y-DNA 자기조립체의 몰비 1:0.1이 0.02, 1:0.5가 0.26, 1:2가 0.32, 1:5가 0.34이었다.
[실시예 2] 표적 DNA 첨가 유무에 따른 FRET 효율 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, 표적 DNA 첨가 유무 및 배양 시간에 따른 FRET 효율을 분석하였다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 6 nM이었고, 표적 DNA는 10 nM로 첨가하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, 표적 DNA의 존재 유무에 따라 FRET 효율이 완전히 달라짐에 따라 표적 DNA를 매우 효과적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
표적 DNA를 첨가하지 않은 경우, Y-DNA 자기조립체가 형성되지 않고, 그에 따라 QD-ssDNA와 결합된 하이드로젤이 형성되지 않기 때문에 유의미한 FRET의 신호 변화는 관찰되지 않았다. 상세하게, 60분 동안 배양한 후 표적 DNA를 첨가한 경우의 FRET 효율은 표적 DNA를 첨가하지 않은 경우 대비 5.8배 더 높았다.
아울러, 표적 DNA를 첨가한 경우, 40분까지는 FRET 효율이 선형적으로 증가하다가 그 이후 포화되는 것을 확인할 수 있는데, 이는 헤어핀 DNA가 완전히 소모되었기 때문이다.
도 13은 수력학적 직경(hydrodynamic diameter) 분석 자료로, 표적 DNA를 첨가하지 않은 경우에는 배양 시간이 증가하여도 수력학적 직경이 거의 증가하지 않았으나, 표적 DNA를 첨가한 경우 배양 시간의 증가에 따라 수력학적 직경이 점차 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이 또한 배양 시간에 따라 수력학적 직경이 점차적으로 증가하다가 약 50-60분 이후 포화(2390.5 ㎚ ± 718.8 ㎚)되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] 표적 DNA 첨가량에 따른 형광 세기 및 FRET 효율 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, 표적 DNA의 첨가량을 달리하여 형광의 세기를 측정하였다. 이때, 표적 DNA는 6 nM부터 0 nM의 공시료(control)까지 그 몰수를 점차 줄여 각각 형광의 세기를 측정하였으며, 배양 시간은 60분으로 동일하게 조절하였다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 6 nM이었다.
도 14에 도시된 바와 같이, 표적 DNA의 첨가량이 감소할수록 형광의 세기가 강해져 FRET 효율이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이때, 평균 블랭크 신호는 0.089로, 검출 한계(limit of detection, LOD)는 60 fM이었으며, 이때 FRET 효율은 9.1%이었다.
아울러, 표적 DNA의 첨가 유무 및 첨가량에 따라 PL 스펙트럼의 현저한 피크 시프트가 관찰되지 않았는데, 이로부터 안정한 광 안정성을 가짐을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] 배양 시간에 따른 FRET 효율 분석
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, 배양 시간을 달리하여 FRET 효율을 분석하였다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 6 nM이었고, 표적 DNA는 1.5 nM, 3 nM 및 10 nM의 농도로 각각 첨가되었다.
그 결과, 도 15에 도시된 바와 같이, 동일 배양 시간에서 표적 DNA의 첨가량이 많을수록 FRET 효율이 더 빠르게 증가하였으며, 더 빠르게 포화 상태에 도달하였다. 그러나, 배양 시간이 길어짐에 따라 1.5 nM 및 3 nM로 첨가된 경우도 거의 유사한 정도의 FRET 효율에 도달하였으며, 이는 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 FRET 신호가 충분히 증가하게 되기 때문이다.
2. 검출 민감도 분석:
[실시예 5] 하이드로젤
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, 배양 시간을 달리하여 형광의 세기를 측정하였다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 6 nM이었고, 표적 DNA는 10 nM로 첨가하였다.
[실시예 6] 하이드로젤
상기 실시예 5와 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하되, 배양 시간 및 표적 DNA의 농도를 0.5 nM로 달리하여 형광의 세기를 측정하였다.
[비교예 1] 샌드위치 타입 결합체
상기 실시예 5와 달리, 세 종류의 헤어핀 DNA를 사용하지 않고 QD-ssDNA, HD 1 및 표적 DNA를 혼합하여 도 16의 a에 도시된 것과 같은 샌드위치 타입 결합체를 제조하였다. 이때, QD-ssDNA의 몰수는 3 nM이었으며, HD 1, HD 2 및 HD 3의 몰수는 각각 6 nM이었고, 표적 DNA는 10 nM로 첨가하였다.
[비교예 2] 샌드위치 타입 결합체
세 종류의 헤어핀 DNA를 사용하지 않고 QD-ssDNA, HD 1 및 표적 DNA를 혼합하여 샌드위치 타입 결합체를 제조한 것 외 실시예 6과 동일하게 수행하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 실시예 5의 하이드로젤은 형광의 세기가 배양 시간이 길어짐에 따라 크게 감소하나, 비교예 1의 샌드위치 타입 결합체는 형광의 세기가 실시예 5 대비 더 작게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
이는 하이드로젤이 QD 및 소광체가 밀집된 3차원 네트워크 구조를 가짐으로써 매우 효과적으로 형광 신호를 소광할 수 있음을 보여주는 것이며, 궁극적으로 표적 DNA를 높은 민감도로 검출할 수 있음을 시사하는 것이다.
특히, 본 발명의 경우, 표적 DNA가 Y-DNA 자기조립체를 형성한 후 다시 방출되어 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 Y-DNA 자기조립체를 지속적으로 형성하는 촉매의 역할을 할 수 있음에 따라, 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 FRET 신호가 증가되는 반면, 비교예 1의 경우, 표적 DNA가 HD 1에 상보 결합된 채 QD-ssDNA와 결합되기 때문에 표적 DNA가 완전히 소모되면 더 이상 FRET 신호가 증가하지 않았다.
도 17에 도시된 바와 같이, 실시예 6 및 비교예 2 역시 실시예 5 및 비교예 1과 유사한 결과를 보였다. 상세하게, 실시예 6의 하이드로젤은 형광의 세기가 배양 시간이 길어짐에 따라 크게 감소하나, 비교예 2의 샌드위치 타입 결합체는 비교예 1 대비 표적 DNA의 농도가 크게 감소함에 따라 형광의 세기가 거의 줄어들지 않은 것을 확인할 수 있었다.
보다 구체적인 배양 시간 별 각 최대 형광 세기(PL 세기)를 하기 표 2에 기재하였다.
배양시간
(분) 		실시예 6 비교예 2
PL 세기 PL2/PL1 PL 세기 PL2/PL1
0 666.5 - 666.5 -
10 613.0467 - 633.634885 -
20 570.464015 - 626.383365 -
30 532.9334 - 624.650465 -
60 461.064705 0.692 623.72403 0.936
상기 표 2에 기재된 것과 같이, 실시예 6의 경우, PL 2/PL 1의 값이 약 0.70으로 관계식 1을 만족하여 표적 DNA의 농도가 크게 감소되었음에도 불구하고 표적 DNA가 효과적으로 검출된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예 2의 샌드위치 타입 결합체의 경우, PL 2/PL 1의 값이 약 0.94로 관계식 1을 불만족하는 것을 확인할 수 있었으며, 이로부터 표적 DNA의 검출 효율이 좋지 않음을 확인할 수 있었다.
아울러, 도 18은 실시예 6 및 비교예 2 각각의 FRET 효율 분석 자료로, 비교예 2는 20분 내 FRET 효율이 포화 상태가 된 반면, 실시예 6의 경우 약 50분 후 포화 상태에 도달한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 약 50분 배양 후 실시예 6의 FRET 효율은 비교예 2 대비 약 4.8배 더 높았다.
보다 구체적인 배양 시간 별 각 FRET 효율을 하기 표 3에 기재하였다.
배양시간(분) 실시예 6 비교예 2
0 0 0
10 0.0802 0.04931
20 0.14409 0.06019
30 0.2004 0.06279
60 0.30823 0.06418
이처럼, 본 발명에 따른 표적 DNA 검출용 조성물은 표적 DNA의 농도가 매우 낮더라도 표적 DNA가 촉매 역할을 하여 헤어핀 DNA가 완전히 소모될 때까지 Y-DNA 자기조립체를 지속적으로 형성함에 따라 매우 우수한 민감도를 가지는 것을 확인할 수 있었다.
3. 선택성 분석:
[실시예 7] 표적 DNA 첨가
상기 실시예 6과 동일한 방법으로 하이드로젤을 제조하였다.
[비교예 3] SM-TD(single-base mismatched target DNA) 첨가
표적 DNA(TD) 대신 SM-TD를 사용한 것 외 모든 과정을 실시예 7과 동일하게 진행하였다.
[비교예 4] DM-TD(double-base mismatched target DNA) 첨가
표적 DNA(TD) 대신 DM-TD를 사용한 것 외 모든 과정을 실시예 7과 동일하게 진행하였다.
[비교예 5] R-TD(random target DNA) 첨가
표적 DNA(TD) 대신 R-TD를 사용한 것 외 모든 과정을 실시예 7과 동일하게 진행하였다.
도 19에 도시된 바와 같이, 실시예 7의 경우, 배양 시간이 증가함에 따라 형광의 세기가 점차 감소하는 반면, 비교예 3 내지 5의 경우 형광의 세기가 거의 감소하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
이는 완벽하게 매칭되는 염기서열을 가진 표적 DNA만을 높은 선택성으로 검출할 수 있음을 의미하는 것으로, 겨우 10-20분의 매우 짧은 배양 시간만으로도 표적 DNA를 선택적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 특정된 사항들과 한정된 실시예를 통해 본 발명이 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. A'영역을 포함하는 염기서열을 가지는 표적 DNA를 검출하기 위한 조성물로,
    상기 조성물은,
    염기서열이 A영역-B영역-C영역-D영역-E영역-F영역-D'영역-C'영역-B'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제1헤어핀 DNA;
    염기서열이 C영역-D영역-F'영역-E'영역-B'영역-A'영역-E영역-F영역-D'영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제2헤어핀 DNA;
    염기서열이 F'영역-E'영역-A영역-B영역-D'영역-C'영역-B'영역-A'영역-E영역-X영역으로 구성되며, X영역 말단에 소광체를 포함하는 제3헤어핀 DNA; 및
    염기서열 중 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점;을 포함하며,
    이때, 상기 A영역은 A'영역과, B영역은 B'영역과, C영역은 C'영역과, D영역은 D'영역과, E영역은 E'영역과, F영역은 F'영역과, X영역은 X'영역과 각각 상보 결합되는 염기서열을 가지며,
    상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA는 표적 DNA에 의해 연쇄적으로 자기 조립되어 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하고,
    상기 Y-DNA 자기조립체는 표적 DNA에 의해 증폭되며, 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는, 표적 DNA 검출용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 염기서열의 X영역은 5' 말단 또는 3' 말단에 위치하는 것인, 표적 DNA 검출용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 하이드로젤은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것인, 표적 DNA 검출용 조성물.
    [관계식 1]
    PL 2/PL 1 ≤ 0.8
    (상기 관계식 1에서, PL 1은 표적 DNA와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 표적 DNA와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
  6. 제 1항, 제 2항 및 제 5항에서 선택되는 어느 한 항의 표적 DNA 검출용 조성물을 포함하는 바이오센서.
  7. 제 1항, 제 2항 및 제 5항에서 선택되는 어느 한 항의 표적 DNA 검출용 조성물을 이용한 표적 DNA의 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 표적 DNA의 검출 방법은 형광 공명 에너지 전달(FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) 현상을 이용하는 것인, 표적 DNA의 검출 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 표적 DNA의 검출 방법은,
    a) 표적 파장 영역에서 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기 PL 1을 측정하는 단계;
    b) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계;
    c) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 2를 측정하는 단계; 및
    d) 상기 PL 1과 PL 2를 비교하여 표적 DNA의 존재 유무를 판단하는 단계;
    를 포함하는, 표적 DNA의 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 표적 DNA의 검출 방법은,
    ⅰ) 표적 DNA를 포함하는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 표적 DNA에 의해 자기 조립된 Y자 형태의 Y-DNA 자기조립체를 형성하는 단계; 및
    ⅱ) 상기 Y-DNA 자기조립체의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 3차원 네트워크 구조로 결합되어 하이드로젤을 형성하는 단계;를 포함하며,
    상기 ⅱ)단계에서 상기 하이드로젤의 각 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 Y-DNA 자기조립체의 소광체로 이동하여 하기 관계식 1을 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것인, 표적 DNA의 검출 방법.
    [관계식 1]
    PL 2/PL 1 ≤ 0.8
    (상기 관계식 1에서, PL 1은 표적 DNA와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 표적 DNA와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 표적 DNA의 검출 방법은,
    ⅰ) 표적 DNA를 포함하지 않는 분석시료에 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합되어, 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA가 Y자 형태로 자기 조립되지 못 하고 각각 존재하는 단계; 및
    ⅱ) 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 말단은 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점과 결합되지 못 하고 각각 존재하는 단계;를 포함하며,
    상기 ⅱ)단계에서 X'영역을 포함하는 단일가닥 DNA로 표면 개질된 양자점의 형광 공명 에너지가 상기 제1헤어핀 DNA, 제2헤어핀 DNA 및 제3헤어핀 DNA 각각의 소광체로 이동하지 못하여 하기 관계식 2를 만족하도록 형광의 세기가 약해지는 것인, 표적 DNA의 검출 방법.
    [관계식 2]
    0.9 ≤ PL 2/PL 1 ≤ 1
    (상기 관계식 2에서, PL 1은 분석시료와 혼합하기 전의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기이며, PL 2는 분석시료와 혼합하고 60분 후의 표적 DNA 검출용 조성물의 최대 형광 세기로, 이때, PL 1과 PL 2는 500 내지 750 ㎚ 파장 영역에서의 최대 형광 세기이다.)
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 b)단계는 20분 이상 수행되는, 표적 DNA의 검출 방법.
  13. 제 1항, 제 2항 및 제 5항에서 선택되는 어느 한 항의 표적 DNA 검출용 조성물을 이용한 표적 DNA의 정량 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 표적 DNA의 정량 방법은,
    A) 표적 DNA를 포함하거나 포함하지 않는 분석시료와 상기 표적 DNA 검출용 조성물을 혼합하는 단계;
    B) 표적 파장 영역에서 상기 표적 DNA 검출용 조성물이 혼합된 분석시료의 최대 형광 세기 PL 3을 측정하는 단계; 및
    C) 상기 PL 3과 표준 최대 형광 세기를 비교하여 표적 DNA의 양을 정량하는 단계;
    를 포함하는, 표적 DNA의 정량 방법.
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Zhang 등, Nature Communications, Vol. 8, No. 381, 페이지 1-9(2017.08.29.)*

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