KR101759688B1 - 사이클램 유도체 화합물 및 이의 약학적 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사이클램 유도체 화합물 및 이의 약제학적 용도에 관한 것으로, 상기 사이클램 유도체 화합물은 암 세포 표면에서 과발현되는 CXCR4를 선택적으로 인지하여 효율적인 약물 전달이 가능하고, 비선택적인 약물 전달의 독성을 감소시킬 뿐 아니라 표적세포에서의 약물의 효과를 증강시킬 수 있어 약물의 부작용을 완화할 수 있다.
Description
본 발명은 암 세포 표면에서 과발현되는 CXCR4(C-X-C Chemokine receptor type 4)를 선택적으로 인지하는 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물 및 이의 약제학적 용도에 관한 것이다.
케모카인(chemokines)은 면역 반응 시 백혈구의 이동을 조절하는 작은 분비 단백질로 세포 수송 및 신혈관형성을 조절하고 또한 종양 미세환경에서 중요한 역할을 하는 약 50개의 소 단백질 군이다. 이는, NH2- 말단 시스테인(cystein) 잔기의 위치에 기초하여 두 가지의 주요 서브패밀리, CC 및 CXC로 나누어지고, G-단백질과 연결된 수용체에 결합하며, 이들 주요 서브패밀리를 CCR 및 CXCR 이라 명명된다. CXCR의 한 그룹 중 하나인 CXCR4는 림프구 상에서 과발현되어있고 주화성을 활성화 시키는 7 트랜스멤브레인 G-단백질 결합 수용체(seven transmembrane G-protein coupled receptor)이다. 건강한 성인에서는 주로 B 및 T 세포, 단핵구, 대식세포, NK, 및 수지상 세포 등 조혈 계통 세포 상에서 발현되며 (문헌 [Lee MK, Heaton J, Cho MW., Virology. 1999, 257(2), 290]). 또한, 내피 및 상피 세포, 성상세포, 및 뉴런 상에서도 CXCR4가 저수준으로 발현된다(문헌 [Gupta SK, Lysko PG, Pillarisetti K, Ohlstein E, Stadel JM., J. Biol. Chem. 1998, 273(7), 4282]; [Hesselgesser J, Halks-Miller M, DelVecchio V, Peiper SC, Hoxie J, Kolson DL, Taub D, Horuk R., Curr. Biol. 1997, 7(2), 112]). 하지만 CXCR4는 백혈병, 림프종, 췌장, 유방, 난소, 폐, 전립선 및 결장직장 종양을 포함하는 많은 수의 암에서 과다발현되고 있다(문헌 [Mohle R, Failenschmid C, Bautz F, Kanz L.,Leukemia. 1999, 13(12), 1954]; [Kato M, Kitayama J, Kazama S, Nagawa H., Breast Cancer Res. 2003 5(5), 144]; [Sun YX, Wang J, Shelburne CE, Lopatin DE, Chinnaiyan AM, Rubin MA, Pienta KJ, Taichman RS., J. Cell. Biochem. 2003, 89(3), 462]; [Phillips RJ, Burdick MD, Lutz M, Belperio JA, Keane MP, Strieter RM., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 2003, 167(12), 1676]; [Scotton CJ, Wilson JL, Scott K, Stamp G, Wilbanks GD, Fricker S, Bridger G, Balkwill FR., Cancer Res. 2002 62(20), 5930]; [Koshiba T, Hosotani R, Miyamoto Y, Ida J, Tsuji S, Nakajima S, Kawaguchi M, Kobayashi H, Doi R, Hori T, Fujii N, Imamura M., Clin. Cancer Res. 2000, 6(9), 3530]; [Barbero S, Bajetto A, Bonavia R, Porcile C, Piccioli P, Pirani P, Ravetti JL, Zona G, Spaziante R, Florio T, Schettini G., Ann. N. Y. Acad. Sci. 2002 973, 60]).
이에, 본 발명자들은 CXCR4에 결합하는 화합물을 합성하고 이를 약물이나 이미징 물질들과 함께 나노 입자에 탑재하여 암 세포에 특이적으로 전달하는 기술을 개발하고자 하였다.
Bungo Furusato and Johng S. Rhim, "CXCR4 and Cancer", Humana Press, a part of Springer Science & Business Media, LLC 2009, pp.31-45
본 발명의 목적은 표적화 리간드로서 암 세포에서 과발현되어 있는 CXCR4에 특이적으로 결합하는 사이클램 유도체 화합물, 이를 포함하는 CXCR4 인지형 나노복합체 및 이의 약제학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1 및 2에서,
A는 지질, 생분해성 고분자, 그래핀과 π-π 결합성이 있고 근적외선 파장에서 흡광도를 갖는 저분자 화합물 및 방향족 고리를 갖는 펩타이드의 올리고머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 물질을 나타내고,
L은 스페이서이며,
B는 상기 화학식 2의 화합물을 나타내고, 여기서, R1 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 또는, 
를 나타내고, 여기서, R7 내지 R9는 각각 독립적으로 수소 또는 
이다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체; 및 치료제 및 진단제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물이 π-π 결합을 통해 그래핀(graphene), 산화 그래핀(graphene oxide) 및 환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 중에서 선택된 그래핀 소재 나노시트에 결합된 형태의 제형을 가진 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체를 포함하는 암의 광열요법(photothermal therapy)에 사용하기 위한 의약 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물은 CXCR4 과발현된 암 세포 표면에 있는 CXCR4에 특이적으로 결합하는 특성을 가지므로, 효율적인 약물 전달이 가능하고, 비선택적인 약물 전달의 독성을 감소시킬 뿐 아니라 표적세포에서의 약물의 효과를 증강시킬 수 있어 약물의 부작용을 완화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-0의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 2는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-1의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 3은 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-3의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 4는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 5는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-24의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 6는 본 발명의 사이클램 유도체 화합물, PLA-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 7은 본 발명의 사이클램 유도체 화합물, IR-808-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 8은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기(FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 9는 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노제제의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 10은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 11은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 고분자 나노입자의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로 A는 미처리군, B는 비교예 2, C는 실시예 28의 고분자 나노입자를 처리한 군의 결과이다.
도 12는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 리포좀의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 13은 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 14는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 15는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질(IR-808) 유도체 화합물(IR-825-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 6, C는 실시예 24의 그래핀 나노시트를 처리한 군의 결과이다.
도 16은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 1, C는 실시예 8, D는 실시예 9, E는 실시예 10, F는 실시예 11, G는 실시예 12의 리포좀을 처리한 군의 결과이다.
도 17은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 18은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 19는 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 20은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 2, C는 실시예 13, D는 실시예 14, E는 실시예 15, F는 실시예 16, G는 실시예 17의 고분자 나노입자를 처리한 군의 결과이다.
도 21은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 3, C는 실시예 18, D는 실시예 19, E는 실시예 20, F는 실시예 21, G는 실시예 22의 그래핀 나노시트를 처리한 군의 결과이다.
도 22는 CXCR4을 과발현하는 비인두 표피암 KB 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 현미경을 사용해 이미지화한 결과로, A 및 D는 미처리군, B 및 E는 비교예 1, C 및 F는 실시예 11의 리포좀을 처리한 군의 결과이다.
도 23은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 파클리탁셀 리포좀에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 KB 세포주에서 확인한 결과이다.
도 24는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 파클리탁셀 고분자 나노입자에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 KB 세포주에서 확인한 결과이다.
도 25는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물(IR-808-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 광열 치료 효과에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 SCC7 세포주에서 확인한 결과이다.
도 26은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지(A), 상기 광학 이미지의 형광 강도를 정량화한 그래프(B), 장기별로 분포한 리포좀의 광학 이미지(C)로 평가한 결과이다.
도 27은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 물질 함유 고분자 나노입자의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지(A)와 상기 광학 이미지의 형광 강도를 정량화한 그래프(B)로 평가한 결과이다.
도 28은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광물질 함유 고분자 나노입자의 생체 분포를 장기를 적출하여 광학 이미지로 평가한 결과로, A는 나노입자 처리 후 2시간 후에 장기별로 분포한 나노입자의 광학 이미지이고, B는 나노입자 처리 후 24시간 후에 장기별로 분포한 나노입자의 광학 이미지이다.
도 29는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물(IR-808-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지로 평가한 결과로, A는 그래핀 나노시트 처리 후 2시간 후에 장기별로 분포한 나노시트의 광학 이미지이고, B는 그래핀 나노시트 처리 후 24시간 후에 장기별로 분포한 나노시트의 광학 이미지이다.
도 30 내지 도 33은 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물의 합성에 사용되는 주요 예시 물질의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-1의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 3은 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-3의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 4는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 5는 본 발명의 사이클램 지질 유도체 화합물, DSPE-PEG2000-AMD-24의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 6는 본 발명의 사이클램 유도체 화합물, PLA-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 7은 본 발명의 사이클램 유도체 화합물, IR-808-PEG2000-AMD-6의 구조(A)와 그 구조를 Maldi-TOF를 사용해 분석한 결과이다(B).
도 8은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기(FACS)를 사용해 분석한 결과이다.
도 9는 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노제제의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 10은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 11은 CXCR4를 과발현하는 비인두 표피암 세포주인 KB에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 고분자 나노입자의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로 A는 미처리군, B는 비교예 2, C는 실시예 28의 고분자 나노입자를 처리한 군의 결과이다.
도 12는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 리포좀의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 13은 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 14는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 15는 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질(IR-808) 유도체 화합물(IR-825-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 SCC7 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 6, C는 실시예 24의 그래핀 나노시트를 처리한 군의 결과이다.
도 16은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 1, C는 실시예 8, D는 실시예 9, E는 실시예 10, F는 실시예 11, G는 실시예 12의 리포좀을 처리한 군의 결과이다.
도 17은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 18은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 A549 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 19는 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과이다.
도 20은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 고분자 나노입자의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 2, C는 실시예 13, D는 실시예 14, E는 실시예 15, F는 실시예 16, G는 실시예 17의 고분자 나노입자를 처리한 군의 결과이다.
도 21은 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-0~24)이 포함된 그래핀 나노시트의 H1299 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 유세포분석기를 사용해 분석한 결과로, A는 미처리군, B는 비교예 3, C는 실시예 18, D는 실시예 19, E는 실시예 20, F는 실시예 21, G는 실시예 22의 그래핀 나노시트를 처리한 군의 결과이다.
도 22는 CXCR4을 과발현하는 비인두 표피암 KB 세포주에서 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 KB 세포 표면 CXCR4 인지능을 형광 현미경을 사용해 이미지화한 결과로, A 및 D는 미처리군, B 및 E는 비교예 1, C 및 F는 실시예 11의 리포좀을 처리한 군의 결과이다.
도 23은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 파클리탁셀 리포좀에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 KB 세포주에서 확인한 결과이다.
도 24는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 파클리탁셀 고분자 나노입자에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 KB 세포주에서 확인한 결과이다.
도 25는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물(IR-808-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 광열 치료 효과에 의한 암 세포 사멸 효능을 MTT 염색법을 사용하여 SCC7 세포주에서 확인한 결과이다.
도 26은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 지질 함유 리포좀의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지(A), 상기 광학 이미지의 형광 강도를 정량화한 그래프(B), 장기별로 분포한 리포좀의 광학 이미지(C)로 평가한 결과이다.
도 27은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광 물질 함유 고분자 나노입자의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지(A)와 상기 광학 이미지의 형광 강도를 정량화한 그래프(B)로 평가한 결과이다.
도 28은 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)이 포함된 형광물질 함유 고분자 나노입자의 생체 분포를 장기를 적출하여 광학 이미지로 평가한 결과로, A는 나노입자 처리 후 2시간 후에 장기별로 분포한 나노입자의 광학 이미지이고, B는 나노입자 처리 후 24시간 후에 장기별로 분포한 나노입자의 광학 이미지이다.
도 29는 CXCR4 인지 가능한 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물(IR-808-PEG2000-AMD-6)이 포함된 그래핀 나노시트의 종양동물모델에서의 생체분포를 광학 이미지로 평가한 결과로, A는 그래핀 나노시트 처리 후 2시간 후에 장기별로 분포한 나노시트의 광학 이미지이고, B는 그래핀 나노시트 처리 후 24시간 후에 장기별로 분포한 나노시트의 광학 이미지이다.
도 30 내지 도 33은 본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물의 합성에 사용되는 주요 예시 물질의 구조를 도시한 것이다.
이하 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 1 및 2에서,
A는 지질, 생분해성 고분자, 그래핀과 π-π 결합성이 있고 근적외선 파장에서 흡광도를 갖는 저분자 화합물 및 방향족 고리를 갖는 펩타이드의 올리고머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 소수성 물질을 나타내고,
L은 스페이서이며,
B는 상기 화학식 2의 화합물을 나타내고, 여기서, R1 내지 R6은 각각 독립적으로, 수소 또는, 
를 나타내고, 여기서, R7 내지 R9는 각각 독립적으로 수소 또는 
이다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물로서, 나노 제형으로 제조하는데 필요한 소수성 물질(A)과 사이클램 유도체(B)가 스페이서(L)에 의해 연결된 구조를 가진다.
상기 소수성 물질은 지질, 생분해성 고분자, 그래핀과 π-π 결합성이 있고 근적외선 파장에서 흡광도를 갖는 저분자 화합물 또는 방향족 고리를 갖는 펩타이드 올리고머 중에서 선택될 수 있고,
상기 스페이서는 소수성 물질 및 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 각각과 반응할 수 있는 반응기를 갖는 친수성 물질일 수 있으며, 상기 사이클램 유도체는 화학식 2의 화합물을 사용할 수 있다.
상기 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-distearoly-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DSPE), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC), 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol, PG) 또는 콜레스테롤(cholesterol) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(polylactic acid, PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid, PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL), 폴리(카프로락톤-락타이드) 랜덤 공중합체(PCLA), 폴리(카프로락톤-글리콜라이드) 랜덤 공중합체(PCGA) 또는 폴리(락타이드-글리콜라이드) 랜덤 공중합체(PLGA) 중 어느 하나일 수 있다.
상기 그래핀과 π-π 결합성이 있고 근적외선 파장에서 흡광도를 갖는 저분자 화합물은 근적외선 조사 시 선택적 형광을 나타내면서 동시에 그래핀과 π-π 결합이 가능하여 화학식 1의 화합물이 그래핀 소재 나노시트에 π-π 결합에 의해 결합되어 근적외선 조사에 의한 암의 광열 치료에 효과적으로 사용할 수 있다. 상기 저분자량 화합물질로, 헵타마틴 다이 IR-808(heptamethine dye IR-808), 헵타마틴 다이 IR-825(heptamethine dye IR-825), 인도시아닌 그린(Indocyanine Green, ICG), 클로린 e6(chlorin e6, Ce6), 미톡산트론(mitoxanthrone) 또는 독소루비신(doxorubicin, DOX) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 방향족 고리를 갖는 펩타이드의 올리고머는 페닐알라닌 올리고머 또는 트립토판 올리고머 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 스페이서는 생체적합성/생분해성이 우수하여 생체내 안정성을 구현할 수 있도록 하는 물질로, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리글리세롤, 폴록사머, 폴리톡실레이티드 탈로우 아민(polythoxylated tallow amine, POEA) 또는 폴리에틸렌이민 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다. 상기 폴리에틸렌글리콜의 중량평균분자량이 300 내지 5000인 것을 사용할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 소수성 물질과 스페이서가 결합된 형태의 변형 화합물이 화학식 2의 사이클램 유도체와 결합되어 있을 수 있다.
상기 소수성 물질과 스페이서로 사용되는 대표적인 예시 물질의 구조는 하기 도면 30 내지 33에서 볼 수 있다.
상기 화학식 2의 사이클램 유도체는 바람직하게는, 하기 화학식 2a 내지 2e 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 2a]
[화학식 2b]
[화학식 2c]
[화학식 2d]
[화학식 2e]
상기 화학식 2의 사이클램 유도체는 일 구체예에 따르면, 하기 반응식 1과 같이, 촉매 하에서 사이클램(1번 화합물)의 3개의 비반응성 질소 원자에 Boc 보호기를 결합시키고(2번 화합물), 상기의 질소 원자에 Boc 보호기가 결합된 사이클램(2번 화합물)과 다이브로모 자일렌 화합물을 반응시켜 중간물질(3번 화합물)를 합성한 다음, 상기 2번 화합물과 상기 중간물질(3번 화합물)을 반응시켜 AMD-0(1,4-bis((1,4,9,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzene)을 합성할 수 있다. AMD-1(1,8-bis(4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)은 AMD-0와 상기 중간물질(3번 화합물)을 촉매 하에서 반응시켜 합성할 수 있다. AMD-3(1,4,8,11-tetrakis(4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane)는 사이클램(1번 화합물)과 상기 중간물질(3번 화합물)을 촉매 하에서 반응시켜 합성할 수 있다. AMD-6(1,4-bis((1,4,8,11-tris(4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzene)은 AMD-0과 상기 중간물질(3번 화합물)을 촉매 하에서 반응시켜 합성할 수 있다. AMD-24(1,4-bis((4,8,11-tris(4-((4,8,11-tris(4-((1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzyl)-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-1-yl)methyl)benzene)는 AMD-6과 상기 중간물질(3번 화합물)을 촉매 하에서 반응시켜 합성할 수 있다.
[반응식 1]
상기 화학식 2의 사이클램 유도체는 말단이 모두 NH로 되어 있어 모핵 구조에 있는 사이클램의 질소 원자, 모핵 구조로부터 중심 사슬에 위치한 사이클램의 질소 원자, 또는 모핵 구조로부터 가지가 갈라져 나간 위치에 있는 사이클램의 질소 원자가 반응에 관여하여 스페이서에 직접(예컨대, 알킬화) 또는 아마이드 결합, 우레아 포메이션 등을 통한간접적 결합을 통해 연결될 수 있어 상기 화학식 2의 사이클램 유도체가 스페이서에 결합되는 위치는 특별히 제한하지는 않는다.
상기 스페이서와 화학식 2의 사이클램 유도체 간의 결합의 일예로, 하기 반응식 2를 참조할 수 있다:
[반응식 2]
상기 화학식 1의 화합물은 촉매 하에서 소수성 물질, 스페이서 및 사이클램 유도체를 유기용매에서 일정 몰비로 혼합하고 실온에서 일정 시간 동안 반응시켜 합성할 수 있다. 하기 실시예들은 상술한 예시 소수성 물질과 다양한 종류의 사이클램 유도체를 선택하여 제조한 CXCR4 결합성 사이클램 유도체 화합물을 개시하고 있다.
상기 소수성 물질과 사이클램 유도체는 필요에 따라 적량의 몰비로 혼합할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 촉매는 소수성 물질과 사이클램 유도체의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있어 특별히 제한하지는 않으나, N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-Diisopropylethylamine), EDC(ethylene dichloride), HOBt(hydroxybenzotriazole) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물은 예컨대, 하기 화학식 1a 내지 1g 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 1a]
[화학식 1b]
[화학식 1c]
[화학식 1d]
[화학식 1e]
[화학식 1f]
[화학식 1g]
상술한 화학식 1 또는 2의 화합물의 합성에 사용되는 용매는 다이메틸포름아마이드 같은 유기용매를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물을 포함하는 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체에 관한 것이다.
상기 화학식 1의 화합물은 사이클램 모핵에 기반한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 및 고분자 유도체 화합물로, 암 세포에서 과발현된 CXCR4를 선택적으로 인지하는 특성을 가지고 있다.
본 발명의 나노복합체는 리포좀, 미셀 등 지질을 이용한 제형, 또는 고분자 나노입자의 제형을 가질 수 있다.
지질을 이용하여 상기 제형을 갖는 지질 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 다양한 제형을 갖는 지질 나노입자의 제조를 위해서는 본 발명의 화학식 1의 화합물 이외에도 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질로부터 선택되는 보조 지질을 추가로 사용할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 리포좀의 제조를 위해서는 양하전 지질 및 중성 지질을, 중성 리포좀의 제조를 위해서는 중성 지질을, 음이온성 리포좀의 제조를 위해서는 음하전 지질 및 중성 지질을 본 발명의 화학식 1의 화합물과 유기 용매상에서 혼합하고 유기 용매를 모두 증발시킨 후 중성 pH의 완충용액으로 수화시켜 제조할 수 있다. 지질 나노입자의 제조를 위해 사용할 수 있는 양하전 지질, 중성 지질 및 음하전 지질은 당업계에 공지되어 있다.
또한, 고분자 나노입자를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
하기 실시예에서는 본 발명의 화학식 1의 화합물을 이용하여 다양한 제형의 지질 나노입자 또는 고분자 나노입자를 제조하는 방법에 대해 구체적으로 설명한다. 표적 세포로 전달하고자 하는 치료제 또는 진단제와 같은 약물은 나노입자의 제조 시 제형 내로 봉입하거나, 제형의 표면에 결합시킬 수 있다. 하기 실시예에서는 나노입자의 제조 시 형광 지질, 항암제 등을 도입하여 본 발명의 나노복합체의 CXCR4 인지능과 약물전달능을 평가한다.
또한, 본 발명의 나노복합체는 상기 화학식 1의 화합물이 π-π 결합을 통해 그래핀(graphene), 산화 그래핀(graphene oxide) 및 환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 중에서 선택된 그래핀 소재 나노시트에 결합된 형태의 제형을 가질 수 있다.
상기 그래핀 소재 나노시트는 그래핀(graphene), 산화 그래핀(graphene oxide), 또는 환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 '그래핀'은 '그래핀 나노시트' 또는 '그래핀 소재 나노시트'와 혼용되어 사용하며, 층상구조의 그래파이트(graphite)를 기계적 또는 초음파 처리를 통해 박리하거나, epitaxial growth, chemical vapor deposition(CVD) 법에 의하여 합성되며, 수 층의 2차원 시트 형상을 가지며, 구조적, 전기적 특성(전기전도도)이 그래파이트와 유사하다. 상기 그래파이트의 산화반응에 의해 합성되는 그래파이트 옥사이드(graphite oxide)는 그래파이트와 유사한 층상구조를 가지며, 층간 및 층 표면에 산소 함유 기능기(oxygen containing functional group), 예컨대, 에폭시, 하이드록시, 카르복실기 등이 존재하여 층간 거리가 그래파이트(0.34nm) 보다 넓은 약 0.7nm 이상을 가진다. 이러한 층간거리의 증가는 층간 산소 간의 정전기적 반발력으로 인해 쉽게 박리될 수 있으며, 이러한 박리된 그래파이트 옥사이드(graphite oxide)를 '산화 그래핀(graphene oxide) 또는 산화 그래핀 나노시트'라고 명명한다. 산화 그래핀에 존재하는 옥사이드는 탄소와 공유결합하여 원래 탄소간의 sp2 결합을 sp3로 바뀌어 전기전도도가 크게 낮은 특성을 보인다. 낮은 전기전도도를 향상시키기 위해 산소를 제거하여 합성되는 그래핀을 '환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 또는 환원형 산화 그래핀 나노시트'라고 명명한다. 산화 그래핀의 환원은 주로 열적 또는 화학적 방법으로 이뤄지며, 열적 환원에 의한 산소 제거 시 CO 또는 CO2 형태로 제거되어 표면에 다수의 디펙트(defect)가 존재하며, 화학적 환원에 의한 산소 제거 시 잔존하는 산소가 다수 존재한다. 이러한 디펙트(defect)와 잔존 산소가 존재하는 환원형 산화 그래핀은 그래파이트의 박리에 의해 합성된 그래핀(graphene)에 비해 전기전도도 특성이 떨어지는 특징이 있다.
본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체를 통해 약물을 전달받는 표적 세포는 치료 또는 진단이 요구되는 세포일 수 있다. 이러한 표적 세포는 CXCR4 과발현 암 세포일 수 있다. 예컨대, CXCR4를 과발현하는 암 세포는 백혈병, 림프종, 췌장암, 유방암, 난소암, 폐암, 결장직장암, 흑색종 또는 전립선암 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
이와 같이, 본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체는 표적세포의 CXCR4를 타겟팅하여 선택적으로 약물을 전달하는 약물전달체로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체; 및 치료제 및 진단제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체를 이용하여 표적세포로 전달할 수 있는 약물은 치료제 및/또는 진단제일 수 있다. 본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체는 치료제와 진단제를 각각 또는 동시에 전달할 수 있다. 예컨대, 리포좀 내 친수성 공간에 진단제를, 외부의 지질 이중막에 지용성 약물이나 음전하 물질을 결합시킬 수 있다.
상기 치료제는 화학요법제일 수 있다. 화학요법제는 임의의 질환에 대한 약리 효과를 나타내는 유기 화합물을 의미한다. 화학요법제는 대개 혈류를 통해 비선택적으로 세포에 전달되는 특성을 갖는데, 약물의 부작용을 감소시키기 위해 세포 또는 조직에 선택적인 치료가 요구되는 경우에는 본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체를 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 화학요법제의 대표적인 예로 항암 화학요법제를 들 수 있다. 상기 항암 화학요법제의 예로는, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 또는 빈크리스틴(vincristine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 CXCR4 인지형 나노복합체는 약물 전달에 의한 치료 외에 근적외선 조사에 의한 암의 광열요법(photothermal therapy)에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물이 π-π 결합을 통해 그래핀(graphene), 산화 그래핀(graphene oxide) 및 환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 중에서 선택된 그래핀 소재 나노시트에 결합된 형태의 제형을 가진 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체를 포함하는 암의 광열요법(photothermal therapy)에 사용하기 위한 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, CXCR4 인지형 나노복합체가 IR-808을 소수성 물질로 사용하고, 그래핀 소재 나노시트에 결합되는 경우, 근적외선 조사 시 현저하게 증강된 암 세포의 사멸이 관찰된다.
한편, 상기 진단제는 표적세포를 탐지해내어 인식가능하게 할 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 생체를 투과할 수 있는 근적외선 계열의 형광물질, 예컨대, 시아닌, 알로피코시아닌 (allophycocyanin), 플루오레신(fluorescein), 테트라메틸로드아민(tetramethylrhodamine), 보디피(BODIPY) 또는 알렉사(Alexa) 등; Calcium-47, Carbon-11, Carbon-14, Chromium-51, Cobalt-57, Cobalt-58, Erbium-169, Fluorine-18, Gallium-67, Gallium-68, Hydrogen-3, Indium-111, Iodine-123, Iodine-131, Technetium-99m와 같은 방사선의약품; 또는 MRI 조영제 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 진단 대상에서 분리한 조직 또는 세포에 투여하여 화학식 1의 화합물 및/또는 진단제가 신호를 감지하여 영상을 수득하는데 이용될 수 있다. 이러한 신호를 감지하기 위해서는 자기공명영상장치 또는 광학영상장치를 이용할 수 있다.
상기 자기공명영상장치는 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 자기 또는 전파는 골에 방해를 받지 않기 때문에 단단한 골 주위 또는 뇌나 골수의 종양에 대하여 종단, 횡단, 임의의 각도에서 선명한 입체적인 단층상을 얻을 수 있다. 특히 상기 자기공명영상장치는 T2 스핀-스핀 이완 자기공명영상장치인 것이 바람직하다.
본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 의약 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 다른 바람직한 양태는 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예를 들면 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다.
또한, 상기 멸균 주사용 제제는 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(예를 들면 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<
실시예
1>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
0)
의 합성
[반응식 3]
사이클램과 다이-털트-부틸 다이카보네이트를 1:3 (m/m) 비율로 섞고 촉매인 트리에틸아민을 이용하여 다이클로로메탄 용매로 12시간 동안 상온에서 반응 시킨 후, 그 반응 생성물과 알파,알파‘-다이브로모-p-자이렌(α,α'-dibromo-p-xylene)을 촉매인 포타슘 카보네이트을 이용하여 아세톤나이트릴 용매로 48시간동안 반응시켰다. 카보네이트를 촉매로 하여 생성물을 다시 2번 화합물과 아세톤나이트릴 용매 하에 12시간동안 반응시킨 후 마지막 생성물을 트리플로로아세트산과 다이클로로메탄을 1:1 (v/v)로 섞은 용액으로 4시간동안 반응시킨후 필터하여 생성물을 얻었다(AMD-0).
생성된 AMD-0, NHS-PEG2000-DSPE와 DIPEA를 1:1:4 (m/m)의 몰 비율로 다이메틸포름아마이드를 용매로 하여 12시간 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF를 이용하여 확인하였다(도 1 참조).
<
실시예
2>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
1)
의 합성
[반응식 4]
카보네이트를 촉매로 하여 실시예 1에서 합성한 AMD-0과 중간물질인 3번 화합물을 1:1 (m/m)의 몰 비율로 아세톤나이트릴 용매로 24시간 동안 상온에서 반응 후 마지막 생성물을 트리플로로아세트산과 다이클로로메탄을 1:1 (v/v)로 섞은 용액으로 4시간 동안 반응시킨 후 필터하여 생성물을 얻었다(AMD-1).
생성된 AMD-1, NHS-PEG2000-DSPE와 DIPEA를 1:1:4 (m/m)의 몰 비율로 다이메틸포름아마이드를 용매로 하여 12시간 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 2 참조).
<
실시예
3>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
3)
의 합성
[반응식 5]
카보네이트를 촉매로 하여 사이클램과 중간물질인 3번 화합물을 4:1 (m/m)의 몰 비율로 아세톤나이트릴 용매로 24시간동안 상온에서 반응 후 마지막 생성물을 트리플로로아세트산과 다이클로로메탄을 1:1 (v/v)로 섞은 용액으로 4시간동안 반응시킨 후 필터하여 생성물을 얻었다(AMD-3).
생성된 AMD-3, NHS-PEG2000-DSPE와 DIPEA를 1:1:4 (m/m)의 몰 비율로 다이메틸포름아마이드를 용매로 하여 12시간 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 이 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 3 참조).
<
실시예
4>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
6)
의 합성
[반응식 6]
카보네이트를 촉매로 하여 실시예 1에서 합성한 AMD-0과 중간물질인 3번 화합물을 1:6 (m/m)의 몰 비율로 아세톤나이트릴 용매로 24시간동안 상온에서 반응 후 마지막 생성물을 트리플로로아세트산과 다이클로로메탄을 1:1 (v/v)로 섞은 용액으로 4시간동안 반응시킨후 필터하여 생성물을 얻었다(AMD-6).
생성된 AMD-6, NHS-PEG2000-DSPE와 DIPEA를 1:1:4 (m/m)의 몰 비율로 다이메틸포름아마이드를 용매로 하여 12시간 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 4 참조).
<
실시예
5>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
24)
의 합성
[반응식 7]
카보네이트를 촉매로 하여 실시예 4에서 합성한 AMD-6과 중간물질인 3번 화합물을 1:6 (m/m)의 몰 비율로 아세톤나이트릴 용매로 24시간동안 상온에서 반응 후 마지막 생성물을 트리플로로아세트산과 다이클로로메탄을 1:1 (v/v)로 섞은 용액으로 4시간동안 반응시킨 후 필터하여 생성물을 얻었다(AMD-6).
생성된 AMD-6, NHS-PEG2000-DSPE와 DIPEA를 1:1:4 (m/m)의 비율로 다이메틸포름아마이드를 용매로 하여 12시간 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 5 참조).
<
실시예
6>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
PLA
-
PEG
2000
-AMD-
6)의
합성
[반응식 8]
실시예 4에서 합성한 AMD-6과 NHS-PEG2000-PLA을 1:1 (m/m)의 몰 비율로 촉매인 DIPEA를 이용하여 다이메틸포름아마이드 용매를 이용하여 12시간동안 상온에서 반응시킨 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 6 참조).
<
실시예
7>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(IR-808-
PEG
2000
-AMD-0)의 합성
[반응식 9]
실시예 4에서 합성한 AMD-6과 NHS-PEG2000-NHFmoc을 1:1 (m/m)의 비율로 촉매인 DIPEA를 이용하여 다이메틸포름아마이드 용매를 이용하여 12시간동안 상온에서 반응시키고, 생성물과 Boc2을 촉매인 트리에틸아민을 이용하여 다이클로로메탄 용매를 이용하여 12시간동안 상온에서 반응시켜 AMD-6의 아민기를 모두 Boc으로 치환하였다. 그 후 피페리딘과 다이메틸포름아마이드 1:1 (v/v)로 섞은 용매에 생성물을 넣고 6시간동안 반응시켜 Fmoc를 제거한 뒤, IR-808 (문헌 [Xu Tan et al., Biomaterials, 2012; 33:pp. 2203~2239])을 반응의 촉매인 EDC, HOBt, DIPEA를 이용하여 다이메틸포름아마이드 용매를 이용하여 12시간 동안 반응시키고, 마지막으로 그 생성물을 TFA와 다이클로로메탄응 1:1 (v/v)로 섞은 용매에서 4시간동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 여과막을 이용하여 증류수와 메탄올로 반응하지 못한 물질들을 여과시켰다. 그 후 감압장치를 이용하여 용매를 제거한 후 건조하여 생성물을 얻었다. 반응 여부는 박막층 크로마토그래피법 및 MALDI-TOF (AD SCIEX, MALDI TOF-TOF 5800 System, USA)를 이용하여 확인하였다(도 7 참조).
<
실시예
8>
실시예
1의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물(
DSPE
-PEG
2000
-AMD-0) 및 형광 지질을 함유하는
리포좀
제조
실시예 1에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 중성 지질인 L-a-포스파티딜콜린(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 ‘PC’라 함), 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma, USA)과 형광 지질인 N-(7-니트로벤즈-2-옥시-1,3-디아졸-4-일)-1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에타올아민(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 ‘NBD-PE’라 함)을 각각 0.18 : 4 : 2 : 0.025 mmole씩 취하여 1ml의 클로로포름에 녹인 후 파이렉스 10ml-유리 격막 바이알에 넣어 혼합한 후 질소 환경에서 모든 클로로포름이 증발될 때까지 낮은 속도로 회전 증발시켜 지질 박막 필름으로 제조하였다. 지질 다층형 소구체 (multilamella vesicle)를 제조하기 위하여 이 박막 필름에 인산완충용액 1ml을 첨가하고 바이알을 37℃로 하여 밀봉 후 3분간 교반(voltexing)하였다. 균일한 크기를 만들기 위해 이를 입자 균질화 제조기(extruder, Northern Lipid Inc., Canada)를 사용하여 0.22mm 폴리카보네이트 막을 3번 통과시켜 제조하였다. 수득된 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-0) 함유 리포좀은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
9>
실시예
2의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-1) 및 형광 지질을 함유하는
리포좀
제조
실시예 2에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-1) 함유 리포좀을 제조하였다.
<
실시예
10>
실시예
3의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-3) 및 형광 지질을 함유하는
리포좀
제조
실시예 3에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-3) 함유 리포좀을 제조하였다.
<
실시예
11>
실시예
4의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-6) 및 형광 지질을 함유하는
리포좀
제조
실시예 4에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-6) 함유 리포좀을 제조하였다.
<
실시예
12>
실시예
5의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-24) 및 형광 지질을 함유하는
리포좀
제조
실시예 5에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-24) 함유 리포좀을 제조하였다.
<
실시예
13>
실시예
1의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-0) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 1에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, mPEG2000-PLA와 형광물질이 결합된 항암제인 형광 파클리탁셀(Oregon Green® 488 Taxol)을 각각 5, 100, 1 mg씩 취하여 둥근바닥플라스크(round bottom flask)에 넣은 후, 4ml의 디클로로메테인(Dichloromethane)을 넣고 회전식 감압증류기에 장착한 후 40~60℃ 수욕조에서 균일한 용액이 될 때까지 고분자를 완전히 녹였다. 진공펌프를 이용하여 감압하면서 모든 디클로로메테인이 증발될 때까지 회전 증발시켜 박막 필름으로 제조하였다. 진공을 해제한 후 생성된 박막필름에 미리 40~60℃ 가열해 놓은 3차 증류수 4mL을 가하여 고분자가 완전히 용해되어 나노입자가 생성될 때까지 플라스크를 회전시켰다. 증류수에 고분자가 완전히 녹은 것을 확인하고 실온으로 냉각한 후 0.22 mm membrane filter로 무균 여과하였다. 수득된 CXCR4 결합성 지질 유도체 (DSPE-PEG2000-AMD-0) 함유 고분자 나노입자는 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
14>
실시예
2의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-1) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 2에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-1) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
실시예
15>
실시예
3의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-3) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 3에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-3) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
실시예
16>
실시예
4의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-6) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 4에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-6) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
실시예
17>
실시예
5의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-24) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 5에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-24) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
실시예
18>
실시예
1의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-0) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 1에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
19>
실시예
2의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-1) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 2에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
20>
실시예
3의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2
000
-AMD-3) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 3에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
21>
실시예
4의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-6) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 4에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
22>
실시예
5의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-24) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 5에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
23>
실시예
6의
CXCR4
결합성
사이클램
고분자 유도체 화합물 (
PLA
-PEG
2000
-AMD-6) 및 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 6에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 사용한 것을 제외하고, 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(PLA-PEG2000-AMD-6) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
실시예
24>
실시예
7의
CXCR4
결합성
사이클램
근적외선
형광물질
유도체 화합물 (IR-808-
PEG
2000
-AMD-6) 및
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
실시예 7에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물, 환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 2 : 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실시예
25>
실시예
4의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-6) 및
파클리탁셀을
함유하는
리포좀
제조
실시예 4에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, 중성 지질인 L-a-포스파티딜콜린(Avanti Polar Lipid Inc., USA, 이하 ‘PC’라 함), 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma, USA)과 항암제인 파클리탁셀을 각각 0.18 : 4 : 2 : 0.02 mmole씩 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체 (DSPE-PEG2000-AMD-6) 함유 리포좀을 제조하였다.
<
실시예
26>
실시예
4의
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-PEG
2000
-AMD-6) 및
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
실시예 4에서 합성한 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물, mPEG2000-PLA와 항암제인 파클리탁셀(paclitaxel, Sigma, USA)을 각각 5, 100, 1 mg씩 사용한 것을 제외하고, 실시예 13과 동일한 방법을 사용하여 CXCR4 결합성 지질 유도체(DSPE-PEG2000-AMD-6) 함유 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
비교예
1>
형광물질(NBD-PE)을
함유하는
리포좀
제조
mPEG2000, 중성지질인 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤과 형광 지질인 N-(7-니트로벤즈-2-옥시-1,3-디아졸-4-일)-1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포에타올아민을 각각 0.18 : 4 : 2 : 0.025 mmole씩 사용한 것을 제외하고, 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 리포좀을 제조하였다.
<
비교예
2> 형광-
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
mPEG2000-PLA와 형광물질이 결합된 항암제인 형광 파클리탁셀을 각각 100, 1 mg씩 사용한 것을 제외하고는, 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
비교예
3>
형광물질(Cy5.5)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
환원된 그래핀 나노시트, DSPE-PEG5000-Cy5.5를 1 : 0.1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
비교예
4>
파클리탁셀을
함유하는
리포좀
제조
mPEG2000, 중성지질인 L-a-포스파티딜콜린, 콜레스테롤과 항암제인 파클리탁셀(paclitaxel, Sigma, USA)을 각각 0.18 : 4 : 2 : 0.02 mmole씩 사용한 것을 제외하고, 실시예 8과 같은 방법을 사용하여 파클리탁셀을 함유하는 리포좀을 제조하였다.
<
비교예
5>
파클리탁셀을
함유하는 고분자 나노입자 제조
mPEG2000-PLA와 항암제인 파클리탁셀을 각각 100, 1 mg씩 사용한 것을 제외하고는, 실시예 13과 같은 방법을 사용하여 파클리탁셀을 함유하는 고분자 나노입자를 제조하였다.
<
비교예
6>
근적외선
형광물질(IR-808)을
함유하는
그래핀
나노시트
제조
환원된 그래핀 나노시트, IR-808을 2 : 1 (w/w)으로 섞은 후 잘 교반시켜 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<
실험예
1>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
리포좀의
KB 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
CXCR4를 과발현하는 것으로 알려진 비인두 표피암 세포주 KB 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰당 1×105 개씩 분주하였다. 각 플레이트의 세포가 60~70 % 정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 1과 실시예 8~12를 각각 웰에 처리한 후 37℃의 CO2 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 비교예 1과 실시예 8~12에서 사용된 리포좀들은 모두 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 것으로서 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR (BD Bioscience, USA)를 사용하고 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하였고 이를 도 8에 나타내었다.
도 8에서, 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 1의 리포좀은 6.1 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 87.8 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 89.2 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.6 %, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.4 %, DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.5 %를 나타내어 비교예 1의 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가 되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능은 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
2>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자의 KB 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 2과 형광물질 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 실시예 13~17의 고분자 나노입자들을 KB 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하였고 이를 도 9에 나타내었다.
도 9에서, 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 2를 처리한 군은 2.56 %의 세포를 고분자 나노입자가 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0)을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.3%, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.3%, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.8%, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.9%, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.4%를 나타내어 비교예 2의 고분자 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
3>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
그래핀
나노시트의 KB 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 3과 형광물질 Cy5.5-PEG5000-DSPE가 π-π 결합으로 결합한 실시예 18~22의 그래핀 나노시트들을 KB 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 10에 나타내었다.
도 10에서, 세포에 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 3은 34.8 %의 세포를 그래핀 나노시트가 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 74.1 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 74.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 71.9 %, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 79.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 82.2 %를 나타내어 비교예 3의 그래핀 나노시트 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
4>
CXCR4
결합성
사이클램
고분자 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자의 KB 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 2와 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 실시예 23을 KB 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 세포에 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로, 피크가 이동하지 않았고(도 11A), 비교예 2의 고분자 나노입자는 23.5 %의 세포를 고분자 나노입자가 인지하여 결합한 반면(도 11B), DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.5%를 나타내어(도 11C) 비교예 2의 고분자 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
<
실험예
5>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
리포좀의
SCC7 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 1과 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 실시예 8~12 리포좀을 CXCR4를 과발현하는 것으로 알려진 SCC7 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 12에 나타내었다.
도 12에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 1은 15.1 %의 세포를 리포좀이 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.9 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.6 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.5%, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 93.5 %, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 92.1 %를 나타내어 비교예 1의 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
6>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자의
SCC7
세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 2과 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 실시예 13~17의 고분자 나노입자들을 SCC7 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 13에 나타내었다.
도 13에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 2의 고분자 나노입자는 5.29 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 79.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.3%, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 87.2%, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 84.5%, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 79.8% 를 나타내어 비교예 2의 고분자 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
7>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
그래핀
나노시트의
SCC7
세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 3과 Cy5.5-PEG5000-DSPE가 π-π 결합으로 결합되어 있는 실시예 18~22의 그래핀 나노시트를 SCC7 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 14에 나타내었다.
도 14에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 4의 그래핀 나노시트는 40.6 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 92.0 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 97.9 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 95.1 %, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 95.9 %, DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 90.7 %를 나타내어 비교예 3의 그래핀 나노시트 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
8>
CXCR4
결합성
사이클램
근적외선
형광물질
유도체 화합물을 포함하는
그래핀
나노시트의
SCC7
세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 6과 근적외선 형광물질 IR-808이 π-π 결합으로 결합되어 있는 실시예 24의 그래핀 나노시트를 SCC7 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 15에 나타내었다.
도 15에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고(도 15A), 비교예 6의 그래핀 나노시트는 17.8 %의 세포를 인지하여 결합한 반면(도 15B), IR-808-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 94.8 %를 나타내어(도 15C), 비교예 6의 그래핀 나노시트 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었음을 알 수 있다.
<
실험예
9>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
리포좀의
A549 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 1과 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 실시예 8~12의 리포좀을 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 A549 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 16에 나타내었다.
도 16A의 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 1의 리포좀은 12.8 %의 세포를 인지하여 결합한 반면(도 16B), DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 89.2 %(도 16C), DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 94.9 %(도 16D), DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 97.9 %(도 16E), DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.4 %(도 16F), DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 99.4 %를 나타내어(도 16G) 비교예 1의 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가 되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
10>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자의 A549 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 2과 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 실시예 13~17의 고분자 나노입자를 A549 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 17에 나타내었다.
도 17에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 2의 고분자 나노입자는 21.2 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 94.2%, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 91.5%, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 95.2%, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 95.9%, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.6%를 나타내어 비교예 2의 고분자 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
11>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
그래핀
나노시트의 A549 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 3과 형광물질 Cy5.5-PEG5000-DSPE가 π-π 결합으로 결합되어 있는 실시예 18~22의 그래핀 나노시트를 A549 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 18에 나타내었다.
도 18에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 4의 그래핀 나노시트는 34.8 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.2 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.8 %, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 96.5 %를 나타내어 비교예 3의 그래핀 나노시트 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
12>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
리포좀
의 H1299 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 1과 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 실시예 8~12의 리포좀을 CXCR4를 과발현하며 파클리탁셀 내성을 갖는 세포로 알려진 H1299 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 19에 나타내었다.
도 19에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고, 비교예 1의 리포좀은 19.3 %의 세포를 인지하여 결합한 반면, DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 72.2 %, DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 68.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 79.3 %, DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 73.4 %, DSPE-PEG2000-AMD-24을 포함하는 리포좀 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 72.4 %를 나타내어 비교예 1의 리포좀 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
13>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자의 H1299 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 2과 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 실시예 13~17의 고분자 나노입자를 H1299 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 20에 나타내었다.
도 20에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고(도 20A), 비교예 2의 고분자 나노입자는 22.8 %의 세포를 인지하여 결합한 반면(도 20B), DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 86.6 %(도 20C), DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 92.5 %(도 20D), DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 91.3 %(도 20E), DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.7 %(도 20F), DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 고분자 나노입자 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 98.5 %를 나타내어(도 20G), 비교예 2의 고분자 나노입자 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
14>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물을 포함하는
그래핀
나노시트의 H1299 세포 표면
CXCR4
인지능
측정 :
FACS
비교예 3과 형광물질 Cy5.5-PEG5000-DSPE가 π-π 결합으로 결합되어 있는 실시예 18~22의 그래핀 나노시트를 H1299 세포주에 처리하여 상기 실험예 1과 같은 방법을 사용하여 형광 강도 피크의 이동에 의한 세포 표면의 인테그린 CXCR4 인지능을 분석하고 이를 도 21에 나타내었다.
도 21에서, 세포에서 아무 처리 하지 않은 미처리군은 대조군으로 피크가 이동하지 않았고(도 21A), 비교예 4의 그래핀 나노시트는 15.8 %의 세포를 인지하여 결합한 반면(도 21B), DSPE-PEG2000-AMD-0을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 86.7 %(도 21C), DSPE-PEG2000-AMD-1을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 95.7 %(도 21D), DSPE-PEG2000-AMD-3을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 91.2 %(도 21E), DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 94.3 %(도 21F), DSPE-PEG2000-AMD-24를 포함하는 그래핀 나노시트 처리군의 경우 형광으로 표지된 세포의 비율이 94.2 %를 나타내어(도 21G), 비교예 3의 그래핀 나노시트 처리군에 비하여 세포 표면의 CXCR4 인지능이 현저히 증가되었으며, 실시예 1~5의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물의 CXCR4 인지능이 비슷한 것을 알 수 있다.
<
실험예
15>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-
6)을
포함하는
리포좀의
KB 세포 표면
CXCR4
인지능
관찰 : 형광현미경 이미지 분석
KB 세포주를 실험 전날 12웰 플레이트에 웰당 1×105 개씩 분주하고, 각 플레이트의 세포가 60~70 % 정도 균일하게 성장했을 때, 비교예 1과 형광 지질인 NBD-PE를 구성성분으로 함유하는 실시예 11의 리포좀을 각각 웰에 처리한 후 37℃의 CO2 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 수집한 후 인산완충용액으로 2번 세척하였다. 형광현미경(Leica, DM I1, Germany)을 사용하여 세포 표면의 CXCR4 인지능을 분석하였고 도 22에 나타내었다.
도 22에서, 세포에서 아무 처리하지 않은 미처리군은 대조군으로 형광이 관찰되지 않았고(도 22A, D), 비교예 1의 형광 리포좀을 처리한 세포군(도 22B, E)에 비해 DSPE-PEG2000-AMD-6이 포함된 실시예 11를 처리군의 경우 형광이 강하게 발현되었음을 알 수 있다(도 22C, F).
<
실험예
16>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는
리포좀의
항암 효능 평가 :
MTT
분석
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 포함하는 파클릭탁셀 리포좀의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다. KB 세포주에 비교예 4의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀과 실시예 25의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)을 포함하는 파클릭탁셀 리포좀을 파클릭탁셀의 농도별로 각각 처리하고 세포 내로 전달된 항암제에 의한 암 세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.
구체적으로, 세포를 웰 당 3×104 세포가 되도록 48 웰에 분주하고 48시간 배양한 후 비교예 4와 실시예 25를 각각 웰 플래이트에 첨가하여 37℃의 CO2 세포배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액(Sigma, USA)을 배지의 10%가 되도록 가하고, 2시간 더 배양한 다음 상층액을 제거하고 DMSO를 첨가한 후에 엘라이져 리더(ELISA reader, Sunrise-Basic TECAN, MAnnedorf, Switzerland)를 이용하여 570nm에서 그 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다.
도 23은 상기의 파클리탁셀이 봉입된 리포좀 제형들의 항암 효능을 평가한 결과로 비교예 4의 파클리탁셀 리포좀보다 실시예 25의 DSPE-PEG2000-AMD-6이 포함된 리포좀 조성이 더 증강된 암 세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 23의 항암 효능 결과로부터 실시예 25의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀의 경우 CXCR4를 과발현하는 KB 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 파클리탁셀을 암 세포내로 전달함으로써 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
<
실험예
17>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는 고분자 나노입자의 항암 효능 평가 :
MTT
분석
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 포함하는 파클릭탁셀 고분자 나노입자의 표적세포 내 항암제 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여 SCC7 세포에 비교예 5의 파클리탁셀이 봉입된 고분자 나노입자와 실시예 26의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물 (DSPE-PEG2000-AMD-6)을 포함하는 파클릭탁셀 고분자 나노입자를 파클릭탁셀의 농도별로 각각 처리하고 상기 실험예 16과 같은 방법을 사용하여 MTT 실험으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 비교예 5의 파클리탁셀 고분자 나노입자보다 실시예 26의 DSPE-PEG2000-AMD-6이 포함된 고분자 나노입자 조성이 더 증강된 암 세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 24의 항암 효능 결과로부터 실시예 26의 DSPE-PEG2000-AMD6을 포함하는 고분자 나노입자의 경우 CXCR4를 과발현하는 KB 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 파클리탁셀을 암 세포내로 전달함으로써 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
<
실험예
18>
CXCR4
결합성
사이클램
근적외선
형광물질
유도체 화합물 (IR-808-PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는
그래핀
나노시트의
광열
항암 효능 평가 :
MTT
분석
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 유도체 화합물을 포함하는 그래핀 나노시트의 광열 항암 효능을 평가하기 위하여 SCC7 세포주에 비교예 6의 그래핀 나노시트와 실시예 24의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물(IR-808-PEG2000-AMD-6)을 포함하는 그래핀 나노시트를 각각 처리하고 세포 내로 전달된 그래핀 나노시트에 근적외선을 조사하여 광열에 의한 암 세포의 생존율을 평가하였다. 항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다.
세포를 웰 당 3×104 세포가 되도록 48 웰에 분주하고 48시간 배양한 후 비교예 6과 실시예 24을 각각 웰 플레이트에 첨가하여 37℃의 CO2 세포배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 한번 갈아 준 후, 근적외선을 1.5W의 세기로 세포에 조사한 뒤, 2시간 후에 MTT 실험을 수행하였고, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 비교예 6의 그래핀 나노시트보다 실시예 24의 IR-808-PEG2000-AMD-6이 포함된 그래핀 나노시트가 더 증강된 광열에 의한 암 세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 도 25의 광열에 의한 항암 효능 결과로부터 실시예 24의 IR-808-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트의 경우 CXCR4를 과발현하는 SCC7 세포주에 보다 효과적으로 결합하여 더 많은 그래핀 나노시트를 암 세포내로 전달함으로써 더 증강된 광열에 의한 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
<
실험예
19>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는
리포좀의
종양동물모델에서의
전달능
평가 : 광학 이미지 (the eXplore
Optix
System)
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 포함하면서, 형광지질을 함유하는 고분자 나노입자의 표적세포 내 전달 효율을 평가하기 위해, KB 세포주를 누드 마우스에 피하 접종하여 종양 모델을 만들고, 종양 모델이 생성된 후 비교예 1의 형광지질을 함유하는 리포좀과 실시예 11의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)을 포함하는 리포좀을 각각 처리하고 2시간 후 암 세포 내로 전달된 형광 물질의 형광 강도를 정량적으로 측정한 뒤 장기들을 적출하여 리포좀의 생체 분포를 확인하였다.
도 26A의 이미지에서 실시예 11의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀의 경우 비교예 2의 리포좀에 비해 종양에 더 축적된 것을 확인하였다. 도 26B는 형광 강도를 정량화시킨 것으로 실시예 11의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀의 경우 비교예 2의 리포좀에 비해 약 2 배 정도의 고분자 나노입자가 더 종양으로 전달되었음을 확인하였다. 도 26C의 이미지에서도 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 리포좀이 종양에 더 많이 전달된 것을 확인하였으며 또한 리포좀이 다른 장기보다 종양으로만 특이적으로 이동하는 것을 확인하였다.
<
실험예
20>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는 고분자 나노입자의 종양동물모델에서의
전달능
평가 : 광학 이미지 (the
eXplore
Optix
System)
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 포함하고, 형광물질인 오레곤그린488-팍클리탁셀을 함유하는 고분자 나노입자의 표적세포 내 전달 효율을 평가하기 위해, 상기 실험예 19에 기재된 방법과 동일하게 종양 모델을 만들고, 비교예 2의 형광물질을 함유하는 고분자 나노입자와 실시예 16의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물(DSPE-PEG2000-AMD-6)을 포함하는 고분자 나노입자를 각각 처리하여 암 세포 내로 전달된 형광물질의 형광 강도를 정량적으로 측정하였다.
도 27A의 이미지에서 실시예 16의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자의 경우 비교예 2의 고분자 나노입자에 비해 종양에 더 축적된 것을 확인하였다. 도 27B는 형광 강도를 정량화 시킨 것으로 실시예 16의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자의 경우 비교예 2의 고분자 나노입자에 비해 약 2 배 정도의 고분자 나노입자가 더 종양으로 전달되었음을 확인하였다.
<
실험예
21>
CXCR4
결합성
사이클램
지질 유도체 화합물 (
DSPE
-
PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는 고분자 나노입자의 종양동물모델에서의
전달능
평가 (ex
vivo
) : 광학 이미지 (the
eXplore
Optix
System)
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 지질 유도체 화합물을 포함하는 고분자 나노입자를 종양동물모델에서의 종양 세포 내 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여, KB 세포주를 누드 마우스에 피하 접종하여 종양 모델을 만들고, 종양 모델이 생성된 후 비교예 2과 실시예 16의 형광 물질 오레곤그린488-팍클리탁셀을 구성성분으로 함유하는 고분자 나노입자를 각각 종양동물모델에 처리하였다. 처리한 뒤 2시간, 24시간 후에 장기들을 적출하여 고분자 나노입자의 생체 분포를 형광 강도를 정량적으로 측정하였다.
도 28A는 종양동물모델에 실시예 16의 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자와 비교예 2의 고분자 나노입자를 처리한 후 2시간 후에 생체 분포를 적출한 이미지로, 생체 분포에서는 모두 종양으로 많이 축적되는 결과를 보였지만, 24시간 후에 생체 분포 이미지에서는 DSPE-PEG2000-AMD-6을 포함하는 고분자 나노입자가 종양에 더 많이 전달된 것을 확인하였다(도 28B).
<
실험예
22>
CXCR4
결합성
사이클램
근적외선
형광물질
유도체 화합물 (IR-808-PEG
2000
-AMD-6)을 포함하는
그래핀
나노시트의
종양동물모델에서의
전달능
평가 (in
vivo
) : 광학 이미지 (the
eXplore
Optix
System)
본 발명의 CXCR4 결합성 사이클램 근적외선 형광물질 유도체 화합물을 포함하는 그래핀 나노시트를 종양동물모델에서의 종양 세포 내 전달 효율에 관한 평가를 하기 위하여, KB 세포주를 누드 마우스에 피하 접종하여 종양 모델을 만들고, 종양 모델이 생성된 후 비교예 6과 실시예 24의 IR-808과 IR-808-PEG2000-AMD-6를 π-π 결합으로 결합시킨 그래핀 나노시트를 종양동물모델에 처리하였다. 처리한 뒤 24시간 후에 장기들을 적출하여 그래핀 나노시트의 생체 분포를 형광 강도를 정량적으로 측정하였다.
도 29A의 이미지에서 실시예 24의 IR-808-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트의 경우 비교예 6의 그래핀 나노시트에 비해 종양에 더 축적된 것을 확인하였다. 도 29B는 형광 강도를 정량화 시킨 것으로 실시예 24의 IR-808-PEG2000-AMD-6을 포함하는 그래핀 나노시트의 경우 비교예 6의 그래핀 나노시트에 비해 약 2 배 정도의 고분자 나노입자가 더 종양으로 전달되었음을 확인하였다.
Claims (15)
- 하기 화학식 1a 내지 1g 중 어느 하나로 표현되는 화합물:
[화학식 1a]
[화학식 1b]
[화학식 1c]
[화학식 1d]
[화학식 1e]
[화학식 1f]
[화학식 1g]
상기 화학식 1a 내지 1g에 있어서, 화학식 2a 내지 2e는 하기와 같고, 화학식 1a 내지 1g의 카보닐과 화학식 2a 내지 2e의 NH 작용기 중 어느 하나가 아마이드 결합으로 연결된다:
[화학식 2a]
[화학식 2b]
[화학식 2c]
[화학식 2d]
[화학식 2e]
- 하기 화학식 1로 표현되는 화합물:
[화학식 1]
상기 식에서,
A는 그래핀과 π-π 결합성이 있고, 근적외선 파장에서 흡광도를 가지며, 헵타마틴 다이 IR-808(heptamethine dye IR-808), 헵타마틴 다이 IR-825(heptamethine dye IR-825), 인도시아닌 그린(Indocyanine Green, ICG), 클로린 e6(chlorin e6, Ce6), 미톡산트론(mitoxanthrone) 및 독소루비신(doxorubicin, DOX)으로 이루어진 군에서 선택되는 저분자 화합물을 나타내고,
L은 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리글리세롤, 폴록사머, 폴리톡실레이티드 탈로우 아민(polythoxylated tallow amine, POEA) 및 폴리에틸렌이민으로 이루어진 군에서 선택되는 스페이서이며,
B는 하기 화학식 2a 내지 2e 중 어느 하나에서 선택되고, 상기 L과 B는 화학식 2a 내지 2e의 NH 작용기 중 어느 하나가,
, 또는
중 어느 하나의 결합으로 서로 연결된다:
[화학식 2a]
[화학식 2b]
[화학식 2c]
[화학식 2d]
[화학식 2e]
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체.
- 제9항에 있어서,
표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체는 리포좀, 미셀 및 고분자 나노입자로 이루어진 군에서 선택된 제형을 가진 것인 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체.
- 제9항에 있어서,
표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체는 제1항의 화합물이 π-π 결합을 통해 그래핀(graphene), 산화 그래핀(graphene oxide) 및 환원형 산화 그래핀(reduced graphene oxide) 중에서 선택된 그래핀 소재 나노시트에 결합된 형태의 제형을 가진 것인 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체.
- 제9항에 따른 표적 세포의 CXCR4 인지형 나노복합체; 및
치료제 및 진단제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 약물을 포함하는 CXCR4 발현 암의 진단 또는 치료용 조성물.
- 제12항에 있어서,
치료제는 항암 화학요법제인 CXCR4 발현 암의 진단 또는 치료용 조성물.
- 제13항에 있어서,
항암 화학요법제는 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 독소루비신 (doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valubicin), 미톡산트론(mitoxantrone), 커큐민(curcumin), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 CXCR4 발현 암의 진단 또는 치료용 조성물.
- 제12항에 있어서,
진단제는 근적외선 계열의 형광물질, 방사성의약품 또는 조영제인 CXCR4 발현 암의 진단 또는 치료용 조성물.
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-
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