KR101757852B1 - 미백 활성을 갖는 홍경천 초임계 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 홍경천 초임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물 및 상기 홍경천 초임계 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 홍경천 초임계 추출물은 피부 미백 및 주름개선 효과와 낮은 세포독성을 나타내어 피부미용제품의 조성물로 이용이 가능하다.

Description

미백 활성을 갖는 홍경천 초임계 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Manufacturing method of Rhodiola sacra supercritical fluid extracts having whitening activits and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 미백 활성을 가지는 홍경천 초임계 추출물의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 내인성 노화화 외인성 노화로 나눌 수 있는데 내인성 노화는 주로 유전적인 원인에 근거하며 외인성 노화는 주로 자외선에 의해 발생된다. 자외선은 표피와 진피를 통과하여 진피에서 콜라겐과 엘라스틴의 구조를 분해하고 활성산소를 생성한다. 표피의 기저층에 위치한 피부세포를 보호하기 위해 멜라닌 세포는 멜라닌을 생성하는데 상기 멜라닌은 자외선을 흡수하여 자외선에 의해 세포들이 손상되지 않도록 보호하는 역할을 한다.

멜라닌의 생성은 멜라닌세포 내에서 티로신(tyrosine)이 티로시나제(tyrosinase)의 작용에 의해 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환되며, 이후 효소의 작용 및 자발적인 산화 반응에 의하여 이루어진다. 그러나 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부 병변이 유발되고, 반대로 자외선 등에 의해 과도하게 멜라닌이 합성되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 피부흑화, 기미, 주근깨를 형성하고 더 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.

멜라닌의 생성과정을 억제하기 위하여, 종래에는 아스콜빈산(ascorbic acid), 코직산(kojic acid), 알부틴(arbutin), 하이드로퀴논(hydroquinone), 및 천연식물의 추출물 등이 미백원료로 사용되어 왔다. 그러나, 대표적 미백원료인 코직산(kojic acid)이나 알부틴(arbutin)의 경우 좋은 미백효과에도 불구하고, 제품 안전성이 낮다는 문제가 있다.

최근에는 민간요법으로 오랫동안 사용되어오던 천연식물 추출물을 이용한 미백원료에 대한 연구에 관심이 쏟아지고 있다.

홍경천(Rhodiola sacra)은 유럽과 아시아의 고산지대에 널리 분포되어 서식하는 식물로서, 신경계통의 자극, 우울증의 감소, 작업능력의 향상, 피로회복, 고산병의 예방 등에 유효한 전통약물로 동유럽과 아시아에 오래전부터 사용되어 왔다. 최근 홍경천의 추출물이 미백에 활성을 나타낸다는 보고가 있다. 한국등록특허 제0445404호에는 홍경천(Rhodiola sachalinensis A. Bor.) 추출물을 포함하는 미백조성물에 관한 특징이 개시되어 있어 있으나, 홍경천을 에탄올, 페트롤륨에테르, 클로로포름, 아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 추출하는 방법을 통해 추출물을 얻고 있어 추출방법이 복잡하다는 문제가 있으며, 한국공개특허 제1999-0051310호에서는 물 또는 에탄올 또는 물/에탄올로 추출한 홍경천(Rhodiola sachalinensis A. Bor.) 추출물을 함유하는 수렴 화장료 조성물에 관한 특징이 개시되어 있으나 상기와 같은 효과 불구하고 홍경천은 세포 독성으로 인하여 민감한 피부에 피부자극을 발생시킬 수 있어 그 활용도가 제한되고 되고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 홍경천 초임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백활성 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 홍경천 초임계 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 홍경천의 초임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백활성 또는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 홍경천의 초임계 추출물은 홍경천을 초임계 추출 방법으로 추출한 추출물이다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 홍경천은 홍경천, 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해한 홍경천 효소 분해물 및 초음파 처리된 홍경천 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 세포벽 분해효소는 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 셀룰라아제(cellulase), 자일란나아제(xylanase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase) 및 아라비나아제(arabinase) 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합효소일 수 있다.

본 발명에 따른 홍경천의 초임계 추출물은 하기 단계를 포함하여 수행함으로써 제조될 수 있다.

(1) 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하는 단계; 및

(2) 상기 가수분해된 홍경천을 초임계 추출하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (1) 단계를 수행하기 전, 홍경천을 마쇄하는 단계; 및 마쇄된 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 (1) 단계는 25 내지 40 ℃의 온도에서 2 내지 24 시간 동안 수행되는 것일 수 있다.

상기 (2) 단계는 이산화탄소를 추출용매로 120 내지 300 bar에서 추출되는 것일 수 있다.

상기 (2) 단계는 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 150 분간 수행하여 추출되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 홍경천 초임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물은 미백활성, 노화방지 및 주름 개선 효과가 우수하면서 세포독성 및 피부 자극이 적어 인체에 안전하게 사용될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 피부 색소 침착과 주름을 개선하면서 피부 자극이 낮아 인체에 안전하게 사용될 수 있는 물질을 검색하기 위하여 여러 식물 추출들을 대상으로 연구한 결과 홍경천을 초임계 추출방법으로 추출한 추출물이 피부 미백, 주름 개선의 효과가 우수하면서 세포독성은 낮아 피부자극이 크게 감소된 것을 확인하고 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 홍경천 초임계 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 홍경천 초임계 추출물은 홍경천을 초임계 유체를 이용하여 초임계 방법으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따른 홍경천 초임계 추출물은 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해한 다음 초임계 방법으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따른 홍경천 초임계 추출물은 초음파 처리한 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해한 다음 초임계 방법으로 추출한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 홍경천 초임계 추출물은 하기 방법을 통해 제조될 수 있다.

(1) 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하는 단계; 및

(2) 상기 가수분해된 홍경천을 초임계 추출하는 단계.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 홍경천은 절단기로 세절하거나 분쇄기로 분쇄하여 이용하는 것이 추출 수율의 향상에 바람직하다.

구체적으로, 먼저 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하여 홍경천 효소 분해물을 제조한다. 상기 세포벽 분해효소는 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 셀룰라아제(cellulase), 자일란나아제(xylanase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase) 및 아라비나아제(arabinase) 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합효소일 수 있으며, 홍경천 100 중량부에 대하여 세포벽 분해효소가 0.1 내지 10 중량부로 첨가될 수 있다. 상기 세포벽 분해효소의 함량이 상기 범위 미만이면 효소처리에 의한 효과가 미미할 수 있어, 티로시나제 활성 저해율이 저하된 추출물이 제조될 수 있으며, 상기 범위를 초과하면 홍경천이 과도하게 가수분해되어 홍경천에 함유된 티로시나제 저해 활성을 가지는 성분이 파괴될 수 있으므로 미백 기능성이 오히려 저하된 추출물이 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 구체적으로 상기 효소가 각각 10 내지 3,000 unit/홍경천 100g으로 함유될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 상기 (1) 단계는 홍경천의 가수분해가 용이하도록 세포벽 분해효소를 활성화시키기 위하여 pH 및 온도가 조절되는 것이 바람직하다. 상기 pH는 식품에 이용가능한 통상의 pH 조절제를 이용하여 조절될 수 있으며, 상기 pH 조절제로는 특별히 제한은 없고, 상기 조절되는 pH의 최적범위는 첨가되는 효소의 종류에 따라 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 구연산을 이용하여 4.5 내지 6의 pH 범위에서 가수분해를 수행할 수 있으며, 온도를 30 내지 50℃로 조절하여 수행될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 가수분해 반응이 종료되면, 상기 효소를 실활시키는 것이 바람직하다. 효소를 실활시키는 방법은 특별히 제한은 없으며, 통상의 효소 실활방법을 이용할 수 있다. 예를 들면 80 내지 120 ℃에서 5 내지 15분간 열처리하는 것일 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 (2) 단계는 초임계 이산화탄소를 추출용매로 사용하여 유속을 5 내지 20 ml/min의 속도로 투입하여 추출하는 것일 수 있는데, 30 내지 50 ℃에서 40분 내지 150분간 추출하는 것일 수 있는데, 더욱 바람직하게는 120 내지 300 bar의 압력으로 추출하는 것일 수 있다.

이산화탄소는 초임계 상태에서 유기 용매에 가까운 성질을 가지는데 온도 및 압력이 높아질수록 일반적인 비극성 성질뿐만 아니라 극성의 성질이 향상되어 양쪽성 성질을 나타내게 되어 추출능이 향상된다. 본 발명에 따르면, 초임계 추출 조건에서 추출압이 100 bar에서는 추출능이 낮은 문제가 있었으며, 350 bar이상이면 추출능이 향상될 수 있으나 미백 활성 또는 주름 개선에 관여하지 않는 성분도 함께 추출되어 추출물 중의 미백 활성 또는 주름 개선 등의 기능성 물질의 함량 비율이 낮아지는 것을 확인하였다. 이에 추출압이 120 bar 또는 300 bar, 바람직하게는 150 내지 250 bar인 것이 미백 활성 및 주름 개선 효과를 극대화할 수 있는 범위인 것으로 추정하였다. 본 발명에 의하면 상기 미백활성 물질은 티로시나제 생성 억제 활성을 나타내는 물질일 수 있으며, 주름 개선 물질은 콜라겐 합성을 촉진시키는 물질일 수 있다.

또한 추출시간이 상기 범위를 미만이면 추출되는 미백 활성 성분 또는 주름 개선 성분의 함량이 낮아 바람직하지 않으며, 추출시간이 상기 범위를 초과하면 추출수율은 향상되나 미백 활성 또는 주름 개선에 관여하지 않는 성분이 함께 추출되는 문제가 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 (1) 단계를 수행하기 전, 홍경천을 마쇄하는 단계; 및 마쇄된 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리하는 단계;를 더 포함하여 수행함으로써 추출수율을 향상시키고, 주름 개선 효과가 더욱 증진된 추출물을 얻을 수 있다.

구체적으로, 상기 가수분해 전에 홍경천을 초음파 처리를 하게 되면, 홍경천 내의 섬유소등 단단한 결합조직(rigid structural matrix)을 해리시켜 생리활성 성분이 쉽게 유리될 수 있도록 하여, 추출수율이 향상되는 결과를 얻었다. 또한, 초음파 처리된 추출물은 초음파 처리되지 않은 추출물에 비하여 특히, 콜라겐 합성 촉진 효과가 크게 증진되는 결과를 얻었다.

본 발명에 의하면, 상기 초음파 처리는 15-25 kHz, 500-800 watt 및 20 amplitude의 조건으로 20 내지 35 ℃에서 2 내지 20 분간 초음파를 조사하는 것일 수 있다. 초음파 초사시간이 상기 범위 미만이 추출수율의 향상을 기대하기 어렵고콜라겐 합성 촉진 효과를 추가로 얻기 어려웠다. 초음파 조사시간이 증가할수록 콜라겐 합성 촉진 효과도 함께 증가하는 경향을 나타내었으나, 20 분을 초과하면 콜라겐 합성 촉진 효과가 초음파를 조사하지 않는 경우보다 저하되는 것을 확인하였다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예

실시예 1

홍경천을 분쇄한 다음 250 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 홍경천 초임계 추출물을 제조하였다.

실시예 2

가. 홍경천을 분쇄한 다음 물에 현탁하고, 구연산을 첨가하여 pH를 5.8이 되도록 조절하였다. pH가 조절된 홍경천 분쇄물 100 g에 대하여 셀룰라아제, 베타-글루카나아제, 헤미셀룰라아제, 아라비나아제 및 자일란나아제를 포함하는 복합효소인 비스코자임 L(Viscozyme L) 1 g을 첨가하여 40 ℃의 온도에서 200 rpm의 속도로 교반하여 균질화시키면서 효소분해 반응을 수행하였다. 반응 종료 후, 100 ℃에서 10분 동안 가열하여 효소를 실활시킨 뒤, 용매를 제거하여 홍경천 효소분해물을 제조하였다.

나. 상기 홍경천 효소분해물을 150 bar 및 40 ℃에서 초임계 이산화탄소의 유속을 10 ml/min의 속도로 투입하여 2시간 동안 추출하여 홍경천 초임계 추출물을 제조하였다.

실시예 3

본 발명에 사용되는 초음파 추출방법은 초음파 추출기(SEEC-SONIC Ⅱ, UL-Tech. com. Uiwang, Korea)를 사용하여 20 kHz, 750 watt 및 20 amplitude 조건에서 초음파를 발생시켜 추출하였으며, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.

홍경천을 분쇄한 뒤 물에 현탁하여 5 분간 초음파를 조사한 뒤, 용매를 제거하고, 실시예 1의 방법으로 초임계 추출하여 홍경천 초임계 추출물을 제조하였다.

실시예 4

홍경천을 분쇄한 뒤, 물에 현탁하여 실시예 3의 조건으로 5 분간 초음파를 조사한 뒤, 구연산을 첨가하여 pH를 5.8이 되도록 조절하였다. pH가 조절된 홍경천 분쇄물 100 g에 대하여 비스코자임 L(Viscozyme L) 1 g을 첨가하여 40 ℃의 온도에서 200 rpm의 속도로 교반하여 균질화시키면서 효소분해 반응을 수행하였다. 반응 종료 후, 100 ℃에서 10분 동안 가열하여 효소를 실활시킨 뒤, 용매를 제거하여 홍경천 효소분해물을 제조하였다.

상기 제조된 홍경천 효소분해물을 실시예 1의 방법으로 초임계 추출하여 홍경천 초임계 추출물을 제조하였다.

비교예 1

홍경천을 분쇄한 뒤, 물을 첨가하여 2 시간 동안 100 ℃로 가열 환류시키는 방법으로 홍경천 열수추출 추출물을 제조하였다.

비교예 2.

홍경천을 분쇄한 뒤, 50 % 에탄올 수용액을 첨가하여 2시간 동안 40 ℃로 가열 환류시키는 방법으로 홍경천 알콜 추출물을 제조하였다.

시험예 1. 과산화수소 유도 세포 독성 억제 효과 검증
과산화수소는 세포 내에서 히드록실라디칼(Hydroxyl radical)을 생성하여 지질과산화를 유발함으로써 세포막의 손상과 세포독성을 일으킨다. 실시예 1~4 및 비교예 1~2에 따른 추출물이 과산화수소에 의한 세포독성 작용을 억제시킬 수 있는지 확인하였다.
실험은 HaCaT 세포를 이용하여 MTT 분석법으로 측정하였다. 대수증식기에 있는 HaCaT 세포를 웰(well) 당 8000개로 96웰 플레이트에 접종하여 DMEM 배지 200 ㎕에서 24 시간 동안 배양하였다. 실시예 1~4 및 비교예 1~2의 추출물들을 각각 최종농도 50 ㎍/㎖로 배지에 첨가한 다음 4 시간 동안 반응시키고, 세포들은 PBS로 세척하였다. 과산화수소를 최종농도 1 mM로 포함하는 배지에 상기 세척된 세포들을 2 시간 동안 배양하여 산화적 스트레스를 유도하였고, 상기 세포들을 PBS로 세척하였다. 세척한 세포들은 0.5 ㎎/㎖의 MTT를 포함한 배지에서 다시 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 이때, 황색의 MTT는 살아있는 세포 내 미토콘드리아의 작용 하에 환원되어, 물에 용해되지 않는 자색의 포마잔(Formazan)으로 변화한다. MTT는 세포에 붙어있기 때문에, 디메틸설폭사이드(DMSO) 용액 200 ㎕로 상기 배양액을 용해하여, 세포를 파괴하고 MTT를 유리시켰다. 포마잔의 양은 살아있는 세포수에 정비례하므로, ELISA 판독기로 측정하였을 경우 나타나는 포마잔의 흡광도를 측정하여 세포독성을 계산하였다.
또한, 과산화수소 처리를 하였으나 상기 추출물을 첨가하지 않은 HaCaT 세포를 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실시하였다. 상기에서 용해시킨 시료들 각각을 ELISA 판독기의 540 ㎚로 흡광도를 측정한 뒤, 각 용액의 세포 독성을 하기 식 1로 환산하여 표 1에 나타내었다.
[식 1]

구분	세포독성(%)
대조군	62.4
비교예1	35.3
비교예2	33.1
실시예1	26.7
실시예2	22.4
실시예3	27.1
실시예4	23.6

표 1을 참고로 하면,실시예 1 내지 4의 홍경천 초임계 추출물이 대조군 및 비교예 1, 2 보다 세포 독성이 낮은 것을 확인할 수 있다. 특히, 세포벽 분해효소로 분해한 홍경천 추출물(실시예 2, 4)가 세포독성이 더 낮았으며, 초음파 조사를 하는 경우에는 세포독성이 다소 증가하는 경향을 나타냈으나 유의적이지는 않았다.
시험예 2. 티로시나제 활성 억제 검증
Vanni 등(Vanni A, Gastaldi D, Giunata G et al., Annali Di Chimica, 1990; 80:35-60)의 방법에 따라 L-티로신 용액(시그마 사 제조) 40 ㎕를 96웰에 넣고, 여기에 각각 0 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖의 농도별로 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 추출물을 첨가하였다. 상기 혼합 용액에 50 ㎍/㎖ 티로시나제(시그마 사 제조) 20 ㎕를 각각 첨가한 뒤, 37 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 상기 L-티로신 용액(시그마 사 제조)에 실시예 대신에 티로시나제 활성 억제 기능이 있다고 알려진 알부틴을 대조군으로 하여 상기 방법과 동일하게 실시하였다. 상기 혼합 용액들의 흡광도를 490 ㎚에서 측정한 뒤, 각 용액의 티로시나제 활성 억제율(%)을 하기 식 2로 환산하여 하기 표 2에 나타내었다.
[식 2]

구분	실시예 1	실시예 2	실시예3	실시예 4	비교예1	알부틴
5 ㎍/ml	21.13	23.82	21.15	23.47	13.26	4.81
25 ㎍/ml	41.95	48.15	42.12	48.25	37.15	23.15
50 ㎍/ml	61.02	67.15	60.96	67.91	51.78	48.63
100 ㎍/ml	67.99	73.12	68.46	73.46	59.13	60.28

표 2에 나타낸 바와 같이, 홍경천 초임계 추출물은 홍경천 열수추출물에 비하여 티로시나제 활성 억제 효과가 우수한 것을 확인하였으며, 초임계 추출시 홍경천을 그대로 이용한 실시예 1 및 3 보다는 세포벽 분해효소로 분해한 실시예 2 및 4에서 티로시나제 활성 억제 효과가 더 우수한 것을 확인하였다. 한편, 초음파 조사는 티로시나제 활성 억제 효과에 영향을 미치지 않거나, 유의적이지 않은 것으로 확인되었다.
시험예 3. 콜라겐 합성 촉진 효과
실시예 1 내지 4의 홍경천 초임계 추출물 및 비교예 1의 홍경천 열수 추출물을 인간 유래 섬유아세포의 배양액에 첨가하여 세포수준에서 콜라겐 합성효과를 확인하였다. 합성된 콜라겐의 측정은 PICP EIA kit(Procollagen Type Ⅰ C-Peptide Enzyme ImmunoAssay KIT)를 이용하여 정량하였다.
실시예 1 내지 4 및 비교예의 추출물을 최종 농도가 0.05 %가 되도록 인간 유래의 섬유아세포(human fibroblast 세포)의 배양배지에 첨가하여 1 일간 배양한 후, 배양액을 취하여 PICP EIA Kit로 각 농도에서 콜라겐 합성 정도를 분광광도계를 이용하여 450 ㎚에서 측정하였다. 대조군으로 무첨가된 배지를 이용하였으며, 비교군으로 콜라겐 합성 촉진 물질로 잘 알려진 비타민 C를 최종농도 0.005 %가 되도록 첨가하여 콜라겐 합성 정도를 측정하였다.

구분	증가율(%)
대조군(무첨가)	100
실시예 1	129.12
실시예 2	131.52
실시예 3	134.15
실시예 4	135.89
비교예 1	111.84
비타민 C	137.12

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 초임계 추출 전에 초음파를 조사한 실시예 3 및 4은 각각 실시예 1 및 2 보다 콜라겐 합성 정도가 증가한 경향을 나타내었다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. (A) 마쇄된 홍경천을 물에 현탁하여 초음파 처리하는 단계;
   (B) 홍경천을 세포벽 분해효소로 가수분해하는 단계; 및
   (C) 상기 가수분해된 홍경천을 초임계 추출하는 단계;를 포함하는 피부 미백 또는 주름 개선용 홍경천 초임계 추출물의 제조방법으로서,
   상기 (B) 단계는 상기 홍경천 100 중량부에 대하여 상기 세포벽 분해효소 0.1 내지 10 중량부를 첨가하여 수행되고,
   상기 (C) 단계는 초임계 이산화탄소를 추출용매로 사용하여 유속을 5-20 mL/분의 속도로 투입함으로써 30-50 ℃에서 120-300 bar의 압력으로 40-150 분 동안 수행되며,
   상기 세포벽 분해효소는 베타-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 셀룰라아제(cellulase), 자일란나아제(xylanase), 펙티나아제(pectinase), 글루코시다아제(glucosidase) 및 아라비나아제(arabinase) 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합효소인 것을 특징으로 하는 피부 미백 또는 주름 개선용 홍경천 초임계 추출물의 제조방법.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제