KR101757269B1

KR101757269B1 - 자가유래 apc를 이용한 조절 t 세포의 생체외 증식 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101757269B1
Application number: KR1020150062802A
Authority: KR
Inventors: 박정규; 김정식; 임동균
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2017-07-12
Also published as: KR20150126568A

Abstract

본 발명은 자가유래 APC를 이용한 조절 T 세포의 생체외 증식 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 영장류 CD4⁺ Treg 및 CD4^-PBMC를 각각 준비하는 단계; 및 (b) 상기 CD4⁺ Treg를 상기 CD4^-PBMC, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL2(interleukin2) 및 TGF-b(beta)로 자극하여 CD4⁺ Treg를 증식시키는 단계;를 포함하는 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)의 생체외 증식 방법, 장기이식 거부 반응 억제용 조성물 및 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 방법은 조절 T 세포를 대량 증식시키고 상기 증폭된 조절 T 세포는 탁월한 면역 억제 효과를 나타내므로, 동종 또는 이종간의 장기의 이식 시 수용체(recipient)에서 발생하는 다양한 면역거부 반응을 극복하는 데 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

자가유래 APC를 이용한 조절 T 세포의 생체외 증식 방법 및 이의 용도{Method for Ex-vivo Expansion of Regulatory T cells Using Autologous Antigen-Presenting Cell and Uses Thereof}

본 발명은 자가유래 APC를 이용한 조절 T 세포의 생체외 증식 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

면역체계는 해로운 외부물질인 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포, 다른 사람 혹은 동물의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질에 반응하여 이를 제거하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응으로 인해 야기되는 자가 면역 질환(autoimmune disease)이 발생하게 된다. 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 자가면역 이상의 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.

자가면역 치료를 위해 다수의 화학적 및 생물학적 면역치료 방법이 개발되었다. 전형적 치료방법은 스테로이드 같은 화학제 또는 항-면역 세포항체를 이용하여 신체의 면역반응을 전체적으로 약화시키는 것이다. 이러한 종래 자가 면역질환 치료는 신체의 전반적 면역시스템을 약화시키는 것으로, 외부의 침입에 대응할 수 있는 신체의 면역기능을 전반적으로 떨어뜨려 다른 질환에 걸리게 하는 부작용을 초래하였다.

한편, 조절 T 세포는 인체 내에서 자기세포에 반응하는 T 세포의 무작위적인 반응을 조절하고 제어하는 역할을 함으로써 자가면역질환을 제어하고 예방한다. 조절 T 세포는 크게 흉선에서 선택되고 발달하여 생기는 nTreg (natural T reg) 과 말초혈관에서 특이 항원을 만나서 생겨나는 iTreg (inducible Treg)으로 나뉘어져 있다. 이중 nTreg은 세포의 안정성과 효과 지속성이 뛰어나 세포치료제로 각광받고 있다. nTreg은 자가면역질환이나 이식반응후 발생하는 면역거부반응의 제어를 목적으로 연구되고 있다. 하지만 생체내에 존재하는 nTreg의 양은 매우 제한적이어서 세포치료제로 이용하기에는 제약이 있다. 이를 극복하기 위해 자신의 몸에서 조절 T 세포만을 분리하여 생체외에서 다량으로 배양 증식하여 치료 목적으로 자신에게 넣어주는 시도들이 진행되고 있다. 이처럼 nTreg을 생체외부에서 증식하는 방법은 크게 2가지가 있다. nTreg 또한 다양한 종류의 항원특이성을 가진 비균질성(heterogeneous) 세포의 집단이다. 이런 nTreg을 항원에 상관없이 모두 증식시키는 방법과 특정 항원에 특이적인 nTreg만을 증식시키는 방법이 있다. nTreg을 항원에 상관없이 증식하는 방법을 폴리클로날(polyclonal) Treg 증식(expansion)이라고 하고, 항원특이적인 Treg을 증식하는 방법을 항원-특이(antigen-specific) Treg 증식(expansion)이라고 한다. 물론 nTreg 은 각종 자가면역질환등에 효과가 있으나 치료 효과면에서는 항원-특이 Treg이 더 적은 양으로 효과를 낼 수 있다.

또한, FoxP3⁺CD25⁺CD4⁺T 세포로 정의된 천연 조절 T 세포 (nTreg)는, 자기-내성 및 면역 항상성을 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 생체외 증식된 Treg의 적응성 전달(Adoptive transfer)은 자가 면역 및 알레르기와 같은 면역학적 조절장애(dysregulations)를 조절하고, 설치류의 실험 모델에서의 이식 거부 반응을 방지하기 위하여 집중적으로 연구된 바 있다. 그러나, 최근의 설치류 연구는 비-인간 영장류(non-human primates, NHPs) 및 인간에서보다 Treg-기반 관용 유도를 예측하는 것이 힘든 것으로 알려져 있다. NHPs과 인간 간의 Treg의 표현형 및 기능적 유사성 때문에, NHPs는 Treg-기반 치료에 있어 기초 연구와 인간 의학 사이의 번역적 연결에 대한 대리적 전-임상 자원으로 간주되었다.

적응성 Treg 세포 면역요법을 연구하기 위한 임상 시험은 폴리클로날(polyclonal) 또는 항원-특이적 방법으로 이러한 드문 세포 집단의 효율적인 인 비트로 증식을 필요로 한다. CD4⁺T 세포의 CD25^highCD127^low/neg 집단은 FoxP3를 강하게 발현하고, Treg의 농축을 위한 표면 마커로서 사용된다. 설치류 및 인간의 Treg의 분리, 농축 및 생체외 증식을 위한 여러 접근법이 널리 연구되었다. GMP 등급의 동종(allo)-항원 특이 Treg의 많은 양을 얻기 위한 기술의 최근 발전은 장기 또는 동종-췌도 이식의 동종-반응성을 조절하는 데 촉망받고 있다. 항원-특이 Treg는 세포 기반 효능과 안전성 우려 면에서 폴리클로날 증식된 Treg보다 더욱 바람직한 것으로 보인다. 그러나, 인간에서 관련 타겟 항원에 대한 깊은 이해의 부족으로 인해, 현재의 기술로는 자가면역 질환을 치료하기 위한 자가항원-특이 Treg의 식별이 여전히 용이하지 않다. 흥미롭게도, GVHD(graft-versus-host disease)에 있어, 자가항원-특이 Treg 치료는 폴리클로날 Treg 집단에 비해 적당한 효능을 보였다. 따라서, 만성 GVHD을 예방하기 위한 최신 임상 시험이 생체외 증폭된 폴리클로날 Treg을 다시 환자에게 주입함으로써 시작되었다.

NHPs의 확장과 관련하여, 일부 연구에서는 NHPs로부터 CD4⁺CD25^highTreg 증식을 확인하였다. 원숭이의 말초 혈액으로부터 농축된 Treg는 항-CD3/CD28-코팅 비드 및 고용량 rhIL-2 및/또는 라파마이신 및/또는 인공 항원-제시 세포(APC)의 조합 처리로 증식되었다. 실용적인 관점에서, 일관성 있는 방법으로 대량의 기능적 NHP Treg를 확보하도록 하는 혈액의 제한적인 공급 및 원숭이-특이 프로토콜의 부족때문에, NHP를 이용하여 치료 임상 실험을 위해 많은 양의 증식된 Treg을 확보하는 것은 기술적인 도전으로 남아있다.

따라서, 임상 시험을 위한 조절성 기능이 남아있는 원숭이 Treg의 대용량 생산 문제를 고려할 때 시험관 내에서 최소한의 자극으로 재현가능한 증식율을 수득할 수 있는 Treg 증식 프로토콜을 세분화하는 것이 여전히 필요하다.

본 발명자들은 면역억제 반응에 대한 대용량의 Treg을 확보하기 위하여 재현성 및 일관성이 있는 Treg의 증식 방법을 예의 연구하였고, 원숭이로부터 PBMC-유래 조절 T 세포(Treg)를 분리하고 자가유래 APC를 이용하여 생체외 증식시킨 결과, Foxp3 발현 및 면역억제 기능을 유지하면서 탁월하게 증식될 뿐만 아니라 상기 증식된 Treg의 활성화 상태, 이동성 및 일부 기능-관련 마커들의 발현을 확인함으로써, NHP Treg에 최적화된 신규한 폴리클로날 Treg 증식 프로토콜을 제공하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)의 생체외 증식 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 증식된 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)를 포함하는 동종 및 이종 세포와 동종 및 이종 장기이식 거부 반응 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 증식된 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 영장류 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)의 생체외 증식 방법을 제공한다:

(a) 영장류 CD4⁺ Treg 및 CD4^-PBMC를 각각 준비하는 단계; 및

(b) 상기 CD4⁺ Treg를 상기 CD4^-PBMC, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL2(interleukin2) 및 TGF-b(beta)로 자극하여 CD4⁺ Treg를 증식시키는 단계.

본 발명에서 사용되는 용어 "면역조절 T 세포(Regulatory T cell)"는 T 세포의 일종으로, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있는 세포이며, Treg 또는 조절 T 세포로 표시하며 일반적으로 CD4⁺CD25^highCD127^- 표지를 갖는다. 이러한 면역조절 T 세포는 크게 자연성(natural) Treg와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있다. 말초 자연성 T 세포는 특정 환경 하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성 Treg 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-b를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts 등이 여기에 해당한다.

바람직하게는, 본 발명의 면역조절 T 세포는 CD4⁺CD25^highCD127^-및CD4⁺CD25^highCD127^-CD95⁺CD27⁺CD47⁺CTLA4⁺FoxP3⁺ 표지를 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 면역조절 T 세포는 그 종류를 제한하는 것은 아니나, 자가, 동종 또는 이종 유래된 면역조절 T 세포일 수 있으며, 가장 바람직하게는 자가유래이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 5 내지 10일 간격으로 1회 내지 10회 반복적으로 실시하고, 보다 바람직하게는 7일 간격으로 2회 내지 5회 반복적으로 실시하며, 가장 바람직하게는 7일 간격으로 2회 반복적으로 실시한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 CD4⁺ Treg 및 CD4^-PBMC는 혈액 또는 제대혈로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)로부터 유래된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈액 또는 제대혈은 영장류에 대해 자가유래 또는 동종이계(allogeneic), 또는 상기 영장류에 대해 이종발생성(xenogeneic)이며, 보다 바람직하게는 영장류에 대해 자가유래이다.

상기 영장류는 원숭이, 침팬지, 고릴라, 오랑우탄 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원숭이, 침팬지, 고릴라 및 오랑우탄으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있며, 가장 바람직하게는 원숭이이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 CD4^-PBMC는 자가유래, 동종유래, 이종유래 또는 이들의 조합을 포함하며, 방사능 조사 처리한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 CD4^-PBMC는 CD4⁺Treg에 대하여 1 내지 20의 비율; IL-2은 100 내지 2,000 units/ml의 범위; 및 TGF-b는1 내지 10 ng/ml의 범위로 처리되며, 보다 바람직하게는 CD4⁺Treg: CD4^-PBMC=1:10의 비율; IL-2은 1,000 units/ml; 및 TGF-b는 5 ng/ml로 처리된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 증폭된 CD4⁺Treg는 FoxP3, CD69, CD95, CD25, CCR7, CCR5, FASL, CD27, PD-1, CD47 및 CTLA4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현 수준을 향상시키고; CD4⁺CD25^-CD127^-이펙터(effector) T 세포의 증식을 억제시킨다.

즉, 본 발명의 방법은 다음 단계를 포함하는 영장류 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)의 생체외 증식 방법을 제공한다:

(a) 영장류 혈액 또는 다른 조직으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 PBMC에 항-CD4 항체를 이용하여 CD4⁺T 세포 및 CD4^-PBMC 세포로 분획하는 단계;

(c') 상기 PBMC-유래 CD4⁺T 세포에 항-CD25 항체 및 항-CD127 항체를 이용하여 CD4⁺CD25^highCD127^- 및 CD4⁺CD25^high Treg를 분획하는 단계;

(c") 상기 CD4^-PBMC에 방사능 조사 처리하는 단계;

(d) 상기 (c') 단계의 CD4⁺ Treg를 하기 조합으로 자극하여 증식시키는 단계;

CD4⁺ Treg에 대하여 1 내지 20 범위의 비율인 상기 (c') 단계의 CD4^-PBMC, 100 내지 2,000 units/ml 범위의 IL-2, 1 내지 10 ng/ml 범위의 TGF-b, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL2(interleukin2); 및

(e) 상기 (d) 단계를 5 내지 10일 간격으로 5 내지 10일 간격으로 1회 내지 10회 반복적으로 실시하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 방법에 따라 증식된 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)를 포함하는 동종 및 이종 세포와 동종 및 이종 장기이식 거부 반응 억제용을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 조성물은 조직 또는 장기 이식 거부 반응에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 이식 수용체에 의한 조직 이식편의 거부반응을 억제 또는 반전시키거나, 이식 수용체에 이식된 조직의 기능을 생존 연장 또는 보존시키거나, 또는 이식 수용체에서 손상된 이식 조직의 기능을 회복시킨다.

성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 또는 장기에 대한 수용체의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에서 발현되는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다.

바람직하게는, 본 발명의 이식 수용체는 영장류이며, 더욱 바람직하게는 고등 영장류, 가장 바람직하게는 인간 또는 원숭이이다. 또한, 수용체는 조직 이식이 필요한 또 다른 포유류, 특히 상업적 중요성이 있는 포유류, 또는 애완 동물 또는 기타 가치 있는 동물, 예컨대 멸종될 위기에 있는 종일 수 있다. 따라서, 수용체의 비제한적인 예로는 양, 말, 소, 염소, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 게르빌루스쥐, 래트 및 마우스가 있다.

바람직하게는, 본 발명의 조직은 상기 영장류에 대해 동종이계(allogeneic)이거나, 또는 상기 영장류에 대해 이종발생성(xenogeneic)인 공여체조직이다.

상기 공여체 조직은 통상적인 수단으로 지원자나 기타 살아있는 공여체, 또는 사체 공여체로부터 유래할 수 있다. 공여체는 수용체를 사용하여 실행가능하도록 조직적합성인 것이 바람직하다. 따라서, 수용체는 자가 및 동종이계공여체 조직이 바람직하다. 그러나, 공여체 조직을 비인간 영장류(예컨대, 침팬지 또는 비비) 또는 기타 비교적 적합성이 있는 동물(예컨대, 돼지)과 같은 이종으로부터 얻을 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 방법에 따라 증식된 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "자가면역 질환"은 자기관용의 유도 또는 계속적 유지에 문제가 발생하여, 자기항원에 대한 면역반응이 일어나고, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염증성 질환"은 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-a(tumor necrosis factor-a), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitricoxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

상기 자가면역 질환의 예는 알로페시아그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군,자가면역아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac spruedermatitis),만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판감소성자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스다발성근통, 다발성 근염과피부근염, 일차성무감마글로불린혈증, 일차성담증성간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성루푸스, 홍반성루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제,현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington'sPharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

예컨대, 제 1 형 당뇨병에 적용되는 경우, 복강투여가 가장 바람직하며, 이는 투여된 면역 조절 T 세포가 희석되지 않고 효과적으로 타겟으로 이동할 수 있기 때문이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 0.5~100mg/day/체중kg이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 방법으로 증식된 CD4⁺ 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell, Treg)를 포함하므로, 상술한 본 발명의 방법 및 면역반응 억제용 조성물과 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법은 조절 T 세포를 대량 증식시키고 상기 증폭된 조절 T 세포는 탁월한 면역 억제 효과를 나타내므로, 동종 또는 이종간의 장기의 이식 시 수용체(recipient)에서 발생하는 다양한 면역거부 반응을 극복하는 데 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 CD4⁺CD127^-T 세포의 CD25^high 집단의 항체에 따른 차이를 보여준다.
도 2는 각 조건에 따른 증식 효율을 보여준다.
도 3은 Treg의 대량 증식에 기여하는 CD4^-PBMCs의 아집단(subpopulations) 분석 결과를 보여준다.
도 4는 2-주 증식 프로토콜에 따라 증식된 Treg의 특성을 보여준다.
도 5는 증식된 Treg의 CD4⁺T 이펙터 세포 억제 효과를 보여준다.
도 6은 증식된 nTreg의 표현형 분석 결과를 보여준다.
도 7은 Treg 증식의 최적화 조건 및 방법을 도식적으로 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법 및 재료

동물

원숭이의 nTreg를 분리하기 위해, 3-4 연령의 12 마리 레서스 원숭이(rhesus monkey, Macacamulatta)로부터 EDTA 또는 헤파린-처리 혈액 샘플을 수집하였다. 동물 관리에 대한 모든 절차는, 실험동물 자원 연구소에 의해 제작되고 국립 보건원(NIH Publication No. 86-23, revised 2011)에 의해 공개된 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 설명서에 명시된 지침을 준수하였고, 서울 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인받았다.

Treg의 분리 및 증식

CD4⁺CD25^highCD127^-Treg 증식의 개략적인 과정은 도 7에 나타내었다. 채혈된 혈액으로부터 피콜-페이크™(1.077 g/dl; GE Healthcare Life Science,Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)를 분리하였다. 제조사(MiltenyiBiotec)의 지침에 따라 NHP CD4⁺ T-cell 분리 키트(MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA) 및 autoMACs®을 이용하여 이를 AutoMACS cell isolation system을 이용하여 CD4⁺T 세포와 CD4⁺T-depleted 세포(CD4^-T 세포)로 분리하였다.

CD4⁺T 세포는 하기의 콘쥬게이션된 mAbs로 염색하였다: CD4-FITC(OKT4; BD Bioscience, San Jose, CA, USA), CD25-PE (CD25-4E3;eBioscience, San Diego, CA, USA) 및 CD127-PEcy7 (R34.34,eBioscience). 또한, 항-CD25-PE (BC96, BD Bioscience)를 CD4⁺CD25^highCD127^-T 세포의 유세포 분석 테스트하는데 사용하였다.

CD4^-PBMC의 일부는 자극제 세포로서 후속의 TREG 증식을 위해 이용하였고, 나머지는 7일 후의 다음 2 라운드 증식을 위하여 냉동 보관하였다.

FoxP3를 약 90% 발현하고 매우 높게 CD25를 발현하는 CD4⁺T 세포(CD25^high 로 지칭)를 분리하기 위하여 FACSAria^TMIII Cell Sorter (BD Bioscience)를 이용하여 CD4⁺T 세포 내에서 약 상위1-3%의 CD25^highCD127^- CD4⁺Treg를 수집하였다. 동시에, CD4⁺CD25^-CD127⁺T 세포를 따로 수집하여 후속의 CFSE(carboxy fluorescein succinimidyl ester)-기반 T 세포 억제 어세이를 위하여 냉동 보관하였다. 유세포 분석 방법으로부터 95-99% 순도의 Treg 집단을 획득하였다. 웰당 CD4⁺CD25^highCD127^-Treg 1x10⁴세포와방사선 조사된(irradiated) 자가유래 CD4^- PBMCs(APC, antigen-presenting cell) 1x10⁵세포를 항-CD3 항체 (FN18, 5 ㎍/ml; BD Bioscience)가 코팅된 96 웰 플레이트(Nest^®, CA, USA)에서 배양하여 자극시켰다.

재조합 인간 IL-2 (rhIL-2, 500 units/ml; Chiron, Emeryville, CA, USA), 재조합 인간 TGF-b1 (rhTGF-b1, 5ng/ml;PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 자극제인 항-CD28 항체 (CD28.2, 5 ㎍/ml; e-Bioscience)를 이용하여 처음 3 일동안 배양하였다. 3일 및 5일째에, 배지의 2/3을 rhIL-2 (1,000 units/ml) 및 rhTGF-b1 (5ng/ml)를 함유한 새로운 배지로 교체하였다. 수집 7일 후, 세포들을 재-자극하였고, 상술한 것과 동일한 프로토콜로 추가 7일 동안 배양하였다. 냉동 보관된 CD4^-PBMCs를 해동, 세척 및 방사선 조사하여 2차 증식 동안 APCs를 공급하였다. 필요한 경우 추가적으로 PBMCs를 새로운 채혈로부터 분리하고 autoMACs® cell isolator를 이용하여 CD4^- PBMCs를 획득하였다. 최종적으로, 증식된 Treg를 수집하여 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의하여 정제하였다.

10% FBS(fetal bovine serum), 2-머캅토에탄올, L-글루타민, 및 비-필수배지(MEM)가 보충된 X-VIVO 15 배지(BioWhitaker, Walkersville, MD, USA)로 세포들을 37℃, 5% CO_2. 조건에서 배양하였다.

유세포 분석(Flow cytometric analysis)

증식된 Treg 세포 내 FoxP3 염색을 제조사(eBioscience)의 지침에 따라 실시하였다. 항-CD4-FITC, 항-CD25-PERCP, 및 항-FoxP3-PE (PCH101; eBioscience) 항체들을 염색에 이용하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 7AAD (BD Bioscience) 염색을 이용하여 비-가시적 세포들을 제외하였다. 또한, CD14⁺ 단핵구, CD16⁺NK 세포, CD20⁺B 세포 또는 CD8⁺T 세포들의 분리를 위하여 항-CD8-PERCPcy5.5 (RPA-T8), 항-CD14-APCcy7 (M5E2), 항-CD20-PE (L27), 및 항-CD16-APC (3G8) 항체들을 이용하였다. 모든 항체는 BD Bioscience 사 제품이었다. CD69 (FN50, eBioscience), CD95(DX2, eBioscience), CCR7(3D12, eBioscience), CCR5(3A9; BD Bioscience), FASL(NOK-1, eBioscience), CD27(LT27, AbDSerotec, NC, USA), PD-1 (J105, eBioscience) 및 CD47(BCH12.1, BD Bioscience) 항체로 Treg 염색하여 세포 표면 표현형 분석을 실시하였다. 제조사(BD Bioscience)의 지침에 따라 CTLA4 (BNI3; BD Bioscience), IL-17 (eBio64CAP17, eBioscience), IFN-r (4S.B3,eBioscience) 및 IL-10 (JES3-9D7,eBioscience)의 세포 내 염색을 실시하였다. 염색된 세포들을 FACS CANTOII 또는 FacsAriaIIIflow cytometers(BD Biosciences)로 분석하였다. 상기 데이터들을 Flowjo cytometry analysis software (Tree Star, Ashland, OR, USA) 또는BD CellQuest Software (BD Bioscience)로 분석하였다.

CFSE-기반 Treg 억제 기능(suppressive function)

냉동 보관된 CD4⁺CD25^-CD127⁺T 세포를 제조사(eBioscience)의 지침에 따라 5?molar CFSE로 5분, 37℃에서 표지시켰다. autoMACs sorting system을 이용하여 음성적인 선별 후 냉동보관했던 자극제(Stimulator)인 CD4^-PBMCs를 3,000 cGy로 방사선 조사하였다. 자극시키는 항-CD3 항체(0.5 ㎍/ml)가 코팅된 96-웰 플레이트에 1ⅹ10⁵CFSE-표지 CD4⁺T 세포를 2x 10⁵자극제 CD4^-PBMCs와 함께 배양하였다. 이어서, 증식된 Treg를 CD4⁺T 세포에 대하여 다양한 비율(0:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16)로 웰에 첨가하였다. 상기 세포들은 37℃, 5 일 동안 X-vivo15 배지로 인큐베이션하였다. FACS CantoII로 증식율을 분석하였다. 억제율은 다음과 같이 계산하였다: %억제율=[(단독 배양으로 증식된 CD4⁺T 세포의 퍼센트 - Treg와 공동 배양하여 증식된 CD4⁺T 세포의 퍼센트)/ 단독 배양으로 증식된 CD4⁺T 세포의 퍼센트] X 100.

데이터 표시 및 통계

모든 분석은 통계학적 소프트웨어 GRAPHPAD PRISM5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA/ Mann-Whittney test with two-tailed P-value)를 이용하여 실시하였다. 상기 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. p 값을 하기와 같이 정의하였다: * 유의성 수준, p<0.05, ** 유의성 수준, p<0.01, 및 *** 유의성 수준, p<0.001.

실시예 1. NHP CD4 ⁺ CD25 ^hi CD127 ^- Treg 농축(enrichment): 항-CD25 항체 선별 및 세포 분리전략

CD4⁺CD25⁺세포는 건강한 레서스 원숭이의 말초혈액 내에 CD4⁺T 세포의 약 10±1%로 존재한다. 인간 nTreg과 유사한, 표면에 있는 CD25 발현 수준은 레서스 원숭이의 CD4⁺T 세포 내 FoxP3 발현과 직접적으로 상관 관계가 있었다. 반면, CD127 표면 발현은 CD4⁺T 세포 내 FoxP3 발현과 상반된 상관 관계가 있었다. 따라서, 본 발명자들은 본 연구에서 NHP FoxP3-발현 조절 T 세포를 분리 및 농축시키기 위하여 대리 마커(surrogate marker)인 CD25 및 CD127를 이용하였다. 또한, CD4⁺T 세포의 CD25^highCD124^-T 세포 집단의 1-3%의 FoxP3-발현 수준은 90% 이상이었고, 후속의 생체외 증식을 위하여 임의로 수집하였다.

본 발명자들은 FACSAriaIII를 이용하여 CD4⁺CD127^-T 세포의 CD25^high 집단을 분리하기 위하여 CD25 (clone BC96 및 clone CD25-4E3)에 특이적인 상이한 2 종의 모노클로날 항체를 이용하였다. 흥미롭게도, 항-CD25 항체의 유형은 CD25^highCD127^-CD4⁺T 세포의 회수율에 결정적으로 영향을 미쳤다. 도 1A에 나타낸 바와 같이, FACSAriaIII을 사용한 분리 과정 동안, CD25 BC96 클론으로부터 얻어진 항-CD25 항체로 염색된 CD25의 CD25^high 집단은 1 시간 내에 임의 지정된 역치로부터 점차 사라졌다. 두 항체 모두가 CD25^low/neg집단과 CD25^high 집단을 구별할 수 있었으나, CD25-4E3이 BC96보다 더욱 확실한 CD25^middle 집단으로부터의 CD25^high 집단 분리를 제공하였다(도 1B). 또한, CD25를 BC96로 염색한 경우, CD25^high 집단의 안정성은 상온에서 크게 감소되었으나 광(light)에서는 아니었다. 이는 CD25 강도의 점진적인 상실은 항체에 결합된 형광 다이의 광-표백(photo-bleaching) 때문은 아니다. 반면, 실험 인큐베이션 시간 동안 CD25-4E3로 염색된 CD4⁺T 세포 내 CD25^high의 강도는 온도(냉 또는 상온) 및 광 강도 상관없이 일정하였다(도 1C). 그 결과, 20ml로부터 회수된 CD4⁺CD25^highCD127^-T 세포의 최종적인 양은 CD25-4E3을 이용한 경우 BC96에 비해 4.3배가 높았다(도 1D). 따라서, 이후의 모든 실험에서 CD25^high 집단을 염색하고 분리하는데 CD25-4E3 항체를 이용하였다. FACS-분리 후 최종 순도는 약 98% - 99%에 이르렀다(도 1E).

실시예 2. 생체외 NHP Treg 증식 프로토콜의 최적화: rhIL-2, rhTGF-b 및 자가유래항원제시세포(antigen-presenting cells)

본 발명자들은 항-CD3 항체 및 자유-형성(free-formed) 항-CD28 항체가 결합된 플레이트에 rhIL-2 (500 units/ml) 및 TGF-b(2.5 ng/ml) 보충 및 TCR 자극을 포함하는 3-주 증식 프로토콜을 기본적으로 설계하였다. 또한, 방사선 조사된 CD4^-PBMC를 APC로서 이 프로토콜에 보충하였다. 혈액으로부터 새롭게 분리된 Treg의 많은 양을 제공하는 데 기술적인 문제점 때문에, 본 발명자들은 먼저 상술한 조건으로 1 주일 동안 CD4⁺CD25^highCD127^-Treg를 1차-증식시켰다. 증식된Treg의 충분한 양을 제공한 후, 추가적으로 2 주 동안 rhIL-2 (500 및 1,000 units/ml)와 TGF-b(0, 2.5, 및 5 ng/ml)의 상이한 농도 및 Treg 대 APCs의 다양한 비율(1:0, 1:2, 1:4 및 1:10)을 포함하는 배양 조건의 다양한 조합으로 2차 및 3차 증식을 실시하였다. 2차 증식 후, 증식율(다양한 2차 및 3차 증식율) 및 세포 내 FoxP3 발현 수준을 비교하였다. 도 2A에 나타낸 바와 같이, rhIL-2 500 units/ml일 때 보다 1,000 units/ml의 농도일 때 더욱 Treg를 증식시켰다. 두 그룹간의 FoxP3 발현 수준은 크게 상이하지 않았다. 0 ng/ml 내지 5 ng/ml 범위의 농도로 테스트 한 결과 TGF-b 농도는 Treg의 증식 효율에 영향을 미치지 않았으나, 보다 높은 농도에서 더욱 높은 FoxP3 발현 수준을 나타냈다(도 1C). 흥미롭게도, 증식율은 주로 APC인 CD4^-PBMC의 보충적인 추가에 영향을 받았다. CD4^-PBMCs 대 Treg의 높은 비율은 FoxP3 발현 수준을 유지하면서 Treg의 높은 증식율을 야기하였다(도 1A 및 1B). 종합적으로, 본 발명자들은 1,000 units/ml의 rhIL-2, 5 ng/ml의 TGF-b 및 1:10 비율의 Treg 대 CD4-PBMC의 조합이 원숭이 Treg의 FoxP3 발현 수준을 유지하는 생체외 증식을 위한 최적의 조건임을 확인하였다.

실시예 3. NHP Treg 증식을 증강시키는 주요 집단으로서의 단핵구

다음으로, Treg의 대량 증식에 기여하는 CD4^-PBMCs의 아집단(subpopulations)을 확인하기 위하여, FACSAriaIII를 이용하여 CD8⁺T, NK (CD16⁺), 단핵구 (CD14⁺) 및 B (CD20⁺) 세포들을 CD4^-PBMCs로부터 분리하였다. 새로 분리된 CD4⁺CD25^highCD127^-Treg를 상술한 프로토콜과 동일하게 1 주일 동안 1차 증식을 실시하였다. 분리된 각 아집단들을 CD4^-PBMCs와 교체하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 단핵구가 Treg 증식을 증강시키는 데 있어 주요 역할을 한다는 것을 발견하였다. 또한, 단핵구 존재하에서 FoxP3 발현 수준을 유지하였다. 그러나, CD8+T, B 및 NK 세포들은 낮은 수준에서 상기 증식에 영향을 미쳤다.

실시예 4. NHP CD4 ⁺ Treg 증식을 위한 2-주 증식 프로토콜 확립

최종적으로, 본 발명자들은 2차 자극하는 2-주 NHP Treg 증식 프로토콜을 설계하였다(도 4A). 실험 방법 및 재료에 상술한 바와 같이, 분리된 CD4⁺CD25^hiCD127^-T 세포들을, 3 일 동안 항-CD3 항체 및 자유-형성(free-formed) 항-CD28 항체가 결합된 플레이트에서의 자극하에서 rhIL-2 (500 units/ml) 및 rhTGF-b (5ng/ml) 존재 시, 방사선 조사된 CD4^-PBMCs(Treg:APC=1:10)과 배양하였다. 3일 및 5일째에, 배지의 2/3을 rhIL-2 (1,000 units/ml) 및 rhTGF-b (5 ng/ml)를 함유한 새로운 배지로 교체하였다. 배양 7일 후, 수집된 Treg에 1차 증식과 동일한 방법으로 반복하여 2차 증식을 실시하였다. 도 4B에 나타낸 결과와, 같이, 2-주 증식 기간 동안 9 개체의 원숭이의 12 번의 실시로부터 획득한 전체 증식율은 약 3,000 내지 5,500 배에 이른다. 1차 증식 기간에 비해 2차 증식 기간 동안 증식율은 크게 지연되었다. 평균 Foxp3 발현 수준은 약 92%였다(도 4c). 증식된 Treg은 7AAD⁺살아있는 세포의 99.9 %의 CD4⁺Treg로 구성된다. 무시할 만큼의 양의 살아있는 CD8⁺T, 단핵구, NK 또는or B 세포 세포들이 최종 증식 후에 발견되었다(도 4D). 참고로, 전체 증식율이 추가적인 3차 증식으로 최대 12,500 배가 되었다고 하더라도, 단독 3차 증식 동안 증식율은 평균 2.35 배가 지연되었다. 이러한 결점과 함께, 기술적인 면에서 원숭이의 수집 가능한 혈액 양의 제한으로 인해 3차 증식 기간 동안 CD4^-PBMCs의 충분한 양을 거의 획득할 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 최종적으로 2차 자극하는 14-일 NHP Treg 증식 프로토콜을 정립하였다.

실시예 5. 증식된 Treg의 강한 면역억제 활성 확인

증식된 Treg의 면역 억제 기능을 확인하기 위하여, CFSE-기반 T 세포 증식/억제 어세이를 실시하였다. CFSE-표지 자가유래 응답자(responder) CD4⁺CD25^-CD127⁺T 세포(effector T cell)들을, Treg(CD4⁺CD25^highCD127^-)에 대하여 1:1 내지 1:32 비율로 조합하여, 5일 동안 방사선 조사된 자가유래 CD4^-PBMCs(CD4⁺T-depleted APC)와 함께 항-CD3 항체(0.5 ㎍/ml)가 결합된 플레이트에서 자극하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 증식된 Treg는 응답자 CD4⁺T 세포 증식에 대한 강한 면역억제 기능을 농도의존적으로 나타냈다. 자가유래 CD4⁺T 이펙터 세포를 억제하는 기능적 능력의 개별 차이는 존재하였다.

즉, 0:1(조절T세포 안넣음: CD4+CD25-T)에서는 3일간 55%의 CD4+CD25-T 세포의 증식이 이루어지고, 1:1 (조절 T 세포: CD4+CD25-T세포)에서는 3일간 18.3%의 CD4+CD25-T 세포의 증식이 이루어졌으며, 이는 조절 T세포가 CD4+CD25-effector T 세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낸다는 것이다.

실시예 6. 증식된 CD4 ⁺ Treg의 표현형 프로파일 확인

본 발명에서 증식된 Treg의 활성화 상태, 이동성 및 일부 기능-관련 마커들의 발현을 확인하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이 표현형 분석에서, 본 연구에서 증식된 거의 모든 Treg는 활성 마커 CD25와 활성 및 기억세포 마커 CD95가 발현되었다. 상당한 양의 CD69, CCR7 및 PD-1가 발현되었다. 증식된 Treg에서 소량의 CCR5 및 CXCR3이 발현되었다. 인간 CD4⁺ CD25⁺ 세포의 증식 후, 기능적으로 거의 모든 세포들이 조절 및 비-조절 T 세포간을 구별하는 것으로 알려진 CD27 및 Treg의 중요한 기능적 마커인 세포 내 CTLA4이 발현되었다. 그러나, Treg는 무시할 만한 양의 CD95L 및 세포 내 IL-17 및 IL-1가 발현되었다. 적은 양의 IFN-γ-분비 세포(1.8%)가 Treg 증식 동안 발생되었다. 종합적으로, 본 연구에서 증식된 Treg는 CD25⁺CD95⁺CD27⁺CD47⁺ CTLA4⁺FoxP3⁺CD4⁺Treg로 확인되었다. 또한, 본 발명의 증식된 nTreg은 염증성 사이토카인 IL-17, IFN-r, IL-10이 발현되지 않았다.

실시예 7. 원숭이를 이용하는 전임상 실험에 대한 NHP Treg 증식 프로토콜

Treg를 분리 및 증식시키는 방법을 도 7에 요약하여 나타내었다. 일반적으로 약 2-8 ⅹ10⁷ PBMCs를 원숭이 말초혈액 20 ㎖으로부터 획득하였다. 유세포 분석기로 CD4⁺T 및 CD4^-PBMCs로 분리하였고, 약 1.5-3.5ⅹ10⁵의 CD4⁺CD25^highCD127^-Treg을 농축한 후 후속의 14-일 증식을 실시하였다. 나머지 CD4^-PBMCs를 2차 증식을 위하여 냉동 보관하였다. 1차 자극에 대한 Treg 증식율은 일반적으로 14-일 증식 기간 동안 3,000-5,500 배에 이른다. 약 4.5-17.5ⅹ10⁸의 증식된 Treg는 이론적으로는 원숭이 말초 혈액 20 ㎖으로부터 획득할 수 있다. 참고로, 본 프로토콜에서 nTreg의 전체 증식시, 2차 증식 전 APC로서 CD4-PBMC의 충분한 양을 확보하기 위해 동일한 원숭이로부터 말초 혈액을 수집하는 것이 필요하다.

즉, 본 발명에서는 자가 유래 APC를 이용하고 항-CD3, 항-CD28 항체, IL-2, TGF-beta의 조건을 최적화하여 기존의 방법보다 14일간 평균 3000-5500배로 증식 효율을 높일 수 있었다. 또한, 조절 T세포를 첨가함으로써 CD4+CD25-이펙터 T 세포의 증식 및 염증성 사이토카인이 억제되는 효과를 나타내었다.

Claims

다음 단계를 포함하는 영장류 CD4⁺CD25^highCD127^- 폴리크로날(polyclonal) 자연(natural) 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell)인 nTreg의 생체외 증식(Ex-vivo Expansion) 방법:
(a) 영장류 혈액으로부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 PBMC를, 항-CD4 항체를 이용하여 CD4⁺T 세포 및 CD4^-PBMC 세포로 분획하는 단계로서,
상기 CD4^-PBMC는 단핵구(monocyte)이며;
(c') 상기 (b) 단계의 PBMC-유래 CD4⁺T 세포를, 항-CD25 항체 및 항-CD127 항체를 이용하여 CD4⁺CD25^highCD127^-nTreg로 분획하는 단계;
(c") 상기 (b) 단계의 CD4^-PBMC-유래 단핵구에 방사능 조사 처리하는 단계;
(d) 상기 (c') 단계의 CD4⁺CD25^highCD127^-nTreg에 대하여 상기 (c") 단계의 CD4^-PBMC-유래 단핵구를 1 내지 20의 비율로 처리하고; IL-2, 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 TGF-b를 병용 처리하여 자극시킴으로써 증식시키는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계를 5 내지 10일 간격으로 1회 내지 10회 반복적으로 실시하는 단계로서,
상기 (d) 단계에서 증식된 CD4⁺CD25^highCD127^- nTreg는 FoxP3, CD69, CD95, CD25, CCR7, CCR5, FASL, CD27, PD-1, CD47 및 CTLA4로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 발현 수준이 향상되고; CD4⁺ 이펙터(effector) T 세포의 증식은 억제되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항의 방법에 따라 증식된 CD4⁺CD25^highCD127^-폴리크로날(polyclonal) 자연(natural) 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell)인 nTreg를 포함하는 동종 및 이종 장기이식 거부 반응 억제용 조성물.
제1항의 방법에 따라 증식된 CD4⁺CD25^highCD127^-폴리크로날(polyclonal) 자연(natural) 면역조절 T 세포(Regulatory T Cell)인 nTreg를 유효성분으로 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.