KR101728906B1 - A mutant enzyme for production of cephalosporin antibiotics - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세파계 항생제 원료물질인 7-ACA를 생산하기 위한 변이효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점 돌연변이를 통해 세팔로스포린 C에 대한 활성이 증가한 변이 세팔로스포린 C 아실라제 및 이를 이용한 7-ACA 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 변이 CPC 아실라제는 야생형 CPC 아실라제보다 CPC 기질에 대한 활성을 5배 내지 26배 증가시켜주므로, CPC에서 직접적으로 1단계 만에 7-ACA를 제조하는데 효과적이다.The present invention relates to a mutant enzyme for producing 7-ACA which is a raw material of a cephalometric antibiotic, and more particularly, to a mutant cephalosporin C acylase having increased activity against cephalosporin C through a point mutation, and 7 -ACA. ≪ / RTI > The mutant CPC acylase of the present invention increases the activity against the CPC substrate by 5 to 26 times that of the wild-type CPC acylase, so it is effective to produce 7-ACA directly in one step in CPC.

Description

세파계 항생제 원료물질(7-ACA)을 생산하기 위한 변이효소{A mutant enzyme for production of cephalosporin antibiotics}A mutant enzyme for production of cephalosporin antibiotics (7-ACA)

본 발명은 세파계 항생제 원료물질인 7-ACA를 생산하기 위한 변이효소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점 돌연변이를 통해 세팔로스포린 C에 대한 활성이 증가한 변이 세팔로스포린 C 아실라제 및 이를 이용한 7-ACA 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a mutant enzyme for producing 7-ACA which is a raw material of a cephalometric antibiotic, and more particularly, to a mutant cephalosporin C acylase having increased activity against cephalosporin C through a point mutation, and 7 -ACA. ≪ / RTI >

세팔로스포린 C(Cephalosporin C, 이하 "CPC"라고 약칭함)는 베타-락탐(-lactam)계 항생물질로서 사상균 곰팡이인 아크레모니움 크리소제눔(Acremonium chrysogenum)과 같은 일부 미생물에 의해서 생산되며, 그람음성 세균에 대해 세포벽 합성저해를 통해 항생활성을 나타내지만, 그 정도가 매우 미약하기 때문에 주로 반합성 세팔로스포린계 항생제(semi-synthetic cephalosporin antibiotics, 이하 "세파계 항생제"라고 약칭함)의 원료물질을 제조하는데 이용되고 있다. 특히, CPC로부터 아미노아디포일 곁가지(D--aminoadipoyl side chain)가 제거된 7-아미노세팔로스포란산(7-aminocephalosporanic acid, "7-ACA"이하 라고 약칭함)이 전세계 항생제 시장의 40% 이상을 점유하는 대부분의 세파계 항생제의 원료물질로 사용되고 있다.Cephalosporin C (hereinafter abbreviated as "CPC") is a beta-lactam antibiotic substance, which is a fungus fungus Acremonium chrysogenum ), and exhibit antibiotic activity through inhibition of cell wall synthesis against Gram-negative bacteria. However, since the degree of the antibiotic activity is very low, it is mainly used for semi-synthetic cephalosporin antibiotics (hereinafter referred to as "Quot; cephalosporin antibiotic "). ≪ / RTI > In particular, 7 - aminocephalosporanic acid (hereinafter abbreviated as "7 - ACA"), in which the D - amino adipoyl side chain has been removed from CPC, Of the total amount of antibiotics.

CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 종래의 공법으로서는 화학공법과 효소공법이 있다. 화학공법은 반응조건이 복잡하고, 환경 처리 비용이 많이 들기 때문에 현재 대부분의 기업은 환경친화적인 효소공법으로 7-ACA를 생산하고 있다. Conventional methods for producing 7-ACA from CPC include chemical engineering and enzyme engineering. Because chemical processes have complex reaction conditions and high environmental costs, most companies now produce 7-ACA with environmentally friendly enzymatic processes.

현재 기업들이 상업적으로 사용하고 있는 효소공법은 2단계로 구성되어 있다. 제1단계에서는 D-아미노산 산화효소(D-amino acid oxidase, 이하 "DAO"라고 약칭함)의 효소반응에 의해 CPC를 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산(Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid, 이하 "Gl-7-ACA"라고 약칭함)으로 전환시키고, 제2단계에서는 Gl-7-ACA 아실라제 효소반응에 의해 Gl-7-ACA를 7-ACA로 전환시킨다 (도 1 참조). Currently, the enzymes used by commercial companies are composed of two stages. In the first step, CPC is reacted with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (DAC) by an enzyme reaction of D-amino acid oxidase (hereinafter abbreviated as DAO) In the second step, Gl-7-ACA is converted to 7-ACA by the Gl-7-ACA acylase enzyme reaction (see FIG. 1).

그러나 2단계 효소공법은 생산 수율이 낮다. 그 이유는 제1단계 효소반응에서 생성된 과산화수소가 기질(CPC), 반응생성물(Gl-7-ACA) 및 DAO를 공격하기 때문이다. 따라서 CPC로부터 직접 7-ACA를 제조할 수 있는 세팔로스포린 C 아실라제(Cephalosporin C acylase,'CPC 아실라제'로 약칭)를 이용한 1단계 효소공법이 필요하다.However, the 2-step enzyme process has a low yield. This is because the hydrogen peroxide produced in the first stage enzyme reaction attacks the substrate (CPC), the reaction product (Gl-7-ACA) and the DAO. Therefore, a first-step enzyme method using cephalosporin C acylase (abbreviated as 'CPC acylase') capable of producing 7-ACA directly from CPC is required.

CPC 아실라제는 자연계에 존재하지 않기 때문에, 자연계에 존재하는 여러 Gl-7-ACA 아실라제(글루타릴 아미다제(GA)라고도 함)를 개량하여 제조한다. Gl-7-ACA 아실라제는 CPC에 대한 활성이 매우 약하기 때문에, 그 활성을 증가시켜야 한다.Since CPC acylase is not present in nature, it is prepared by improving several Gl-7-ACA acylases (also referred to as glutaryl amidase (GA)) present in nature. Gl-7-ACA acylase is very weak in activity against CPC, so its activity should be increased.

2단계 효소공법에 사용되는 Gl-7-ACA 아실라제는 여러 토양 미생물에서 발견되는데, Sonawane는 아래 [표 1]과 같이 Gl-7-ACA를 5개의 그룹으로 분류하고 있다(Sonawane, Crit. Rev. Biotech. 26: 95-120, 2006). 같은 그룹내에 속할 경우, 단백질 크기, 아미노산 서열, 기질특이성, 반응특성 등이 매우 유사하지만, 다른 그룹끼리는 매우 상이하다.The Gl-7-ACA acylase used in the second step enzyme method is found in several soil microorganisms, and Sonawane classifies Gl-7-ACA into five groups as shown in Table 1 below (Sonawane, Crit. Rev Biotech. 26: 95-120, 2006). When belonging to the same group, the protein size, amino acid sequence, substrate specificity, and reaction characteristics are very similar, but different groups are very different.

Gl-7-ACA 아실라제의 분류Classification of Gl-7-ACA acylase 그룹group 대표 균주/효소Representative strain / enzyme 참고문헌references Group IGroup I Pseudomonas sp. A14 Pseudomonas sp. A14 Aramori 등, J. Ferment . Bioeng . 72: 232-243, 1991Aramori et al . , J. Ferment . Bioeng . 72: 232-243, 1991 Group II-AGroup II-A Bacillus lacteroporus J1 Bacillus lacteroporus J1 Aramori 등, J. Bacteriol . 173: 7848-7855, 1991Aramori et al., J. Bacteriol . 173: 7848-7855, 1991 Group II-BGroup II-B Pseudomonas sp. GK16 Pseudomonas sp. GK16 Matsuda 등, J. Bacteriol . 163: 1222-1228, 1985Matsuda et al . , J. Bacteriol . 163: 1222-1228, 1985 Group II-CGroup II-C Pseudomonas sp. SE83 AcyI Pseudomonas sp. SE83 AcyI Matsuda 등, J. Bacteriol . 169: 5815-5820, 1987Matsuda et al . , J. Bacteriol . 169: 5815-5820, 1987 Group IIIGroup III Pseudomonas sp. N176 Pseudomonas sp. N176 Aramori 등, J. Ferment . Bioeng . 72: 232-243, 1991Aramori et al . , J. Ferment . Bioeng . 72: 232-243, 1991 Pseudomonas sp. SE83 AcyII Pseudomonas sp. SE83 AcyII Matsuda 등, J. Bacteriol . 169: 5815-5820, 1987Matsuda et al . , J. Bacteriol . 169: 5815-5820, 1987

Group III에 속하는 Gl-7-ACA 아실라제들은 반응산물인 7-ACA 및 무기염류에 의해 쉽게 활성이 저해되고, 효소의 반응 안정성이 낮은 단점이 있는데, Group III의 Gl-7-ACA 아실라제를 개량할 경우, 상기 단점을 그대로 갖게 된다. 그러나 Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제들은 Group III 효소들의 단점이 없다. 따라서 Group II-B의 Gl-7-ACA 아실라제를 개량하여, 7-ACA 생산을 위한 1단계 효소공법에 적용 가능한 변이 효소의 개발이 필요한 실정이다.
Gl-7-ACA acylases belonging to Group III are easily degraded by 7-ACA and inorganic salts, which are reaction products, and have low disadvantage of low enzyme stability. Gl-7-ACA acylase of Group III The above disadvantages are retained. However, the Gl-7-ACA acylases of Group II-B do not have the drawbacks of Group III enzymes. Therefore, it is necessary to develop a mutant enzyme which can be applied to the first step enzyme process for the production of 7-ACA by improving the Gl-7-ACA acylase of Group II-B.

이에 본 발명자들은 Group II-B에 속하는 슈도모나스 속 GK16 계열 Gl-7-ACA 아실라제로부터 CPC에 대한 활성이 증대된 변이 CPC 아실라제를 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors have discovered a mutant CPC acylase having increased activity against CPC from GD16-family GK16-family GI-7-ACA acylase belonging to Group II-B and completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 야생형 CPC(Cephalosporin C) 아실라제에서, F58ß 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 변이 CPC 아실라제를 제공하는 것이다.Therefore, an object of the present invention is to provide a method for the production of F58ß amino acid valine (hereinafter referred to as " F58ß amino acid ") in a wild type CPC (Cephalosporin C) acylase consisting of an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a beta subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: Valine) substituted CPC acylase.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a gene encoding the mutant CPC acylase.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector containing the gene.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with said expression vector.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a microorganism transformed by the expression vector.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 포함하는 7-ACA 제조용 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition for preparing 7-ACA comprising the mutant CPC acylase.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 이용한 7-ACA 제조방법을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a method for producing 7-ACA using the mutant CPC acylase.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 야생형 CPC(Cephalosporin C) 아실라제에서, F58ß 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 변이 CPC 아실라제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a wild-type Cephalosporin C acylase comprising an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: The mutant CPC acylase wherein the amino acid is substituted with valine is provided.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자를 제공한다.Another object of the present invention is to provide a gene encoding said mutant CPC acylase.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.Another object of the present invention is to provide a recombinant expression vector comprising said gene.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포를 제공한다.Another object of the present invention is to provide a host cell transformed with said expression vector.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a microorganism transformed by said expression vector.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 포함하는 7-ACA 제조용 조성물을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a composition for producing 7-ACA comprising the mutant CPC acylase.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 CPC 아실라제를 이용한 7-ACA 제조방법을 제공한다.
Another object of the present invention is to provide a method for producing 7-ACA using the mutant CPC acylase.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 야생형 CPC(Cephalosporin C) 아실라제에서 F58 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 변이 CPC 아실라제를 제공한다.The present invention relates to a mutant F58 amino acid in a wild type CPC (Cephalosporin C) acylase consisting of an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: Gt; CPC < / RTI > acylase.

상기 변이 CPC 아실라제는 Y153ßT, F177ßL 및 Y153ßT+ F177ßL로 이루어진 군에서 선택되는 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 'Y153ßT+ F177ßL'는 Y153ßT 및 F177ßL 돌연변이를 모두 갖는 것을 의미한다. 또한, 상기 돌연변이를 표시하는 단어의 의미를 Y153ßT로 예시하여 설명하자면, 베타-서브유닛(서열번호 4)의 153번째에 위치한 아미노산 티로신(Tyrosine, Y)이 트레오닌(Threonine, T)으로 치환된 것을 의미한다.
The mutant CPC acylase may further comprise a mutation selected from the group consisting of Y153ßT, F177ßL and Y153ßT + F177ßL. 'Y153ßT + F177ßL' means having both Y153ßT and F177ßL mutations. The meaning of the word indicating the mutation is exemplified by Y153ßT. It is assumed that the amino acid tyrosine (Y) located at the 153rd position of the beta-subunit (SEQ ID NO: 4) is substituted with threonine it means.

본 발명의 상기 변이 CPC 아실라제는 CPC 기질에 대한 활성이 야생형 CPC 아실라제보다 더 높다. 본 발명에 있어서 "CPC 기질에 대한 활성 증가"란, CPC 기질에 대한 비활성 (specific activity)의 증가 또는 반응산물에 의한 효소활성 저해 (end-product inhibition) 현상의 감소를 의미한다.The mutant CPC acylase of the present invention has higher activity on the CPC substrate than the wild-type CPC acylase. In the present invention, "increase in activity against CPC substrate" means an increase in specific activity against CPC substrate or a decrease in end-product inhibition by reaction product.

대부분의 Gl-7-ACA 아실라제 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열은 알파-서브유닛, 스페이서 펩티드(Spacer Peptide) 및 베타-서브유닛의 순으로 구성된다. 본 발명에서 사용한 기본 유전자(ga 유전자)는 전사 및 번역과정을 거치면 약 77 kDa 크기의 불활성 단일사슬로 이루어진 폴리펩티드를 생성한다. 그 후, 스페이서 펩티드가 떨어져 나가면서, 약 18 kDa 크기의 알파-서브유닛(서열번호 3) 및 58kDa 크기의 베타-서브유닛(서열번호 4)로 구성된 이량체 형태를 갖게 된다. The amino acid sequences translated from most of the Gl-7-ACA acylase genes consist of alpha-subunits, spacer peptides and beta-subunits in that order. The basic gene (ga gene) used in the present invention produces a polypeptide consisting of an inactive single chain of about 77 kDa through transcription and translation. Thereafter, the spacer peptide is disrupted leaving a dimer form consisting of an alpha-subunit (SEQ ID NO: 3) of about 18 kDa and a beta-subunit (SEQ ID NO: 4) of 58 kDa in size.

상기 ga 유전자로부터 제조된 야생형 CPC 아실라제를 점 돌연변이(Point Mutation) 및 유전자 조작 기술로 CPC 기질에 대한 활성이 증대된 변이 CPC 아실라제를 제조하였다.The wild-type CPC acylase prepared from the ga gene was subjected to point mutation and genetic engineering techniques to prepare a mutant CPC acylase having an increased activity against the CPC substrate.

야생형 CPC 아실라제에 점 돌연변이를 일으킬 위치를 선발하기 위해, 3차 구조 모델링 및 가상 돌연변이 결과를 바탕으로 이미 알려져 있는 후보 변이 잔기들을 검토하여, 4개의 잔기(F31ß, F58ß, Y153ß, F177ß)를 선정하였다. F31ß는 베타-서브유닛의 아미노산 서열에서 31번째에 위치한 페닐알라닌(Phenylalanine, Phe, F)를 의미한다.Based on the results of the tertiary structure modeling and the virtual mutation, candidate mutation residues were selected to select four residues (F31ß, F58ß, Y153ß, and F177ß) in order to select locations to cause point mutations in wild-type CPC acylase Respectively. F31ß refers to phenylalanine (Phe, F) located at the 31st position in the amino acid sequence of the beta-subunit.

상기 선별한 4개의 잔기에 포화 돌연변이를 수행한 결과, F31ß, Y153ß, F177ß 잔기 3중의 포화 돌연변이에서는 CPC에 대한 활성이 증가하지 못했으나, F58에서는 발린으로 치환된 돌연변이체(F58V, 변이 효소로도 표현)만이 활성이 증가하였다(실시예 2-2 참조). 야생형 CPC 아실라제의 활성을 1로 봤을 때, 상기 S17 변이효소의 활성은 야생형의 5.3배에 달했다(실시예 4 참조).As a result of performing the saturation mutation on the selected four residues, the activity against CPC was not increased in the F31ß, Y153ß, and F177ß residue 3 saturation mutants, but the F58 mutant (F58V, mutant enzyme Expression) increased the activity (see Example 2-2). When the activity of the wild-type CPC acylase was considered as 1, the activity of the S17 mutant enzyme reached 5.3 times of the wild type (see Example 4).

F58ßV 돌연변이체의 CPC에 대한 활성을 증대시키기 위해, F58ßV 돌연변이체를 대상으로 F31ß, Y153ß, F177ß 잔기들에 대해 각각 포화 돌연변이(2중 돌연변이)를 실시한 결과, F31 포화 돌연변이에서는 활성이 증가하지 못했으나, F58ßV/F177ßL('A5 변이효소') 및 F58ßV/Y153ßT('B2 변이효소') 변이체에서는 활성이 야생형에 비하여 9.8배, 14.5배나 증가하였다(실시예 2-3 및 실시예 4 참조). 이 결과에서 Y153ßT, F177ßL 돌연변이는 야생형에서는 효과가 없지만, F58ßV 돌연변이체에서는 CPC 기질에 대한 활성을 높인다는 것을 알 수 있다. F58ßV/Y153ßT/F177ßL(3중 돌연변이) 변이체('R1 변이효소')는 야생형보다 CPC 기질에 대해 16.8 배 높은 활성을 보인다(실시예 4 참조).
In order to increase the activity of F58ßV mutant on CPC, a saturation mutation (double mutation) was performed on the F31ß, Y153ß, and F177ß residues in the F58ßV mutant, respectively, and the activity did not increase in the F31 saturation mutant , F58ßV / F177ßL ('A5 mutant enzyme') and F58ßV / Y153ßT ('B2 mutant enzyme') mutants increased 9.8-fold and 14.5-fold compared to the wild type (see Examples 2-3 and Example 4). These results indicate that the Y153ßT and F177ßL mutations are ineffective in the wild type but increase the activity on the CPC substrate in the F58ßV mutant. The F58ßV / Y153ßT / F177ßL (triple mutant) mutant ('R1 mutant enzyme') shows 16.8-fold higher activity on the CPC substrate than the wild type (see Example 4).

S17, A5, B2 및 R1 변이체는 I45ß 또는 V382ß 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다. 더 바람직하게는 R1 변이체가 I45ß 또는 V382ß에서의 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.The S17, A5, B2 and R1 variants may further comprise a mutation in which the I45ß or V382ß amino acid is replaced by another amino acid. More preferably the R1 variant may further comprise a mutation at I45ß or V382ß.

상기 추가로 포함되는 돌연변이는 I45ß가 메티오닌(Methionine), 발린(Valine), 알라닌(Alanine), 시스테인(Cysteine) 및 류신(Leucine)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되고, V382ß가 류신(Leucine) 또는 이소류신(Isoleucine)으로 치환되는 것을 특징으로 한다.The further included mutation is characterized in that I45ß is replaced by an amino acid selected from the group consisting of Methionine, Valine, Alanine, Cysteine and Leucine, V382ß is Leucine, Or isoleucine (isoleucine).

더 바람직하게는 상기 변이 CPC 아실라제는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제를 제공한다.
More preferably, the mutant CPC acylase comprises an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 .

실시예 2-4에서 제조한 F58ßV/Y153ßT/F177ßL(R1 변이효소) 변이체의 활성을 증가시키기 위해, 무작위 돌연변이를 실시해 보았다. 상기 3중 변이체 유전자 DNA를 주형으로 에러 유발성 중합효소 연쇄반응(Error-prone PCR)으로 무작위 점 돌연변이를 유발한 결과, I45ßM/F58ßV/Y153ßT/F177ßL('M23 변이효소') 및 F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI('M27 변이효소')의 4중 변이체의 CPC에 대한 활성이 R1 변이효소보다 높은 것을 발견하였다(실시예 3-1). 활성 정도를 야생형과 비교해본 결과, 야생형보다 M23은 18.8배, M27은 20.3 배 높았다(실시예 4 참조). To increase the activity of the F58ßV / Y153ßT / F177ßL (R1 mutant enzyme) mutant prepared in Example 2-4, a random mutation was performed. As a result of random-point mutagenesis using error-prone PCR using the triple mutant DNA as a template, I45ßM / F58ßV / Y153ßT / F177ßL ('M23 mutant enzyme') and F58ßV / Y153ßT / It was found that the activity of the quaternary mutants of F177ßL / V382ßI ('M27 mutant enzyme') against CPC was higher than that of the R1 mutant enzyme (Example 3-1). As a result of comparing the activity with the wild type, the M23 was 18.8 times higher than the wild type and the M27 was 20.3 times higher (see Example 4).

실시예 3-1의 결과에서, I45ß, V382ß 잔기 변이가 CPC 아실라제 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있다. 이에 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체에 대해 I45ß 및 V382ß 잔기의 이중 포화 돌연변이(5종 돌연변이) 라이브러리를 제조하여 M27 변이효소보다 활성이 증가한 변이체를 스크리닝 한 결과, 5개의 5중 변이체(I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßA/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI, I45ßC/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßM/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßL/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI)를 선발하였다(실시예 3-2 참조).From the results of Example 3-1, it can be seen that the I45ß, V382ß residue mutation increases CPC acylase activity. As a result, a mutant of the I45ß and V382ß residues in the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant was prepared by screening mutants having a higher activity than the M27 mutant enzyme. As a result, five five mutants (I45ßV / F58ßV F157ßL / V382ßL, I45ßC / F177ßL / V382ßL, I45ßM / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßL, I45ßL / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / (See Example 3-2).

상기 효소 중, PM2(I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL) 변이 효소가 활성이 제일 높았다. 상기 PM2 변이 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 것을 특징으로 한다. Of these enzymes, PM2 (I45ßV / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßL) mutant enzymes showed the highest activity. The PM2 mutant enzyme is characterized by comprising an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.

상기 실시예 3-2의 결과에서 I45ß 잔기에서는 아이소류신이 메티오닌, 발린, 알라닌, 시스테인 또는 류신으로 치환되고, V382ß 잔기에서는 발린이 류신 또는 이소류신으로 치환되는 것을 특징으로 한다.In the result of Example 3-2, isoleucine is substituted with methionine, valine, alanine, cysteine or leucine in the I45ß residue, and valine is substituted with leucine or isoleucine in the V382ß residue.

실시예 3은 CPC 아실라제의 활성을 높여주는 새로운 잔기(I45ß 및 V382ß)를 알려준다는 점에서 큰 의의가 있다. 실시예 2 내지 3의 변이체 선발 과정의 모식도를 도 2에 표시하였다.
Example 3 is of great significance in that it discloses new residues (I45ß and V382ß) that increase the activity of CPC acylase. A schematic diagram of the mutant selection process of Examples 2 to 3 is shown in Fig.

본 발명의 상기 변이 CPC 아실라제들을 암호화하는 유전자를 제공한다. 더 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시될 수 있다.The gene encoding the mutant CPC acylases of the present invention is provided. More preferably, the gene may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

변이 CPC 아실라제를 제조하기 위한 기본 유전자는 Group II-B에 속하는 슈도모나스 속 GK16 계열 유래의 글루타릴 아미다제(GA) 유전자(이하 'ga 유전자'로 약칭)이다. 이 때, 단백질 합성 효율을 증대시키기 위하여 각 아미노산을 암호화하는 코돈은 대장균에서 자주 사용되는 코돈 위주로 염기서열을 정하였다. 이와 같은 방법으로 합성된 ga 의 염기서열은 서열번호 1(2,079개 염기), 아미노산 서열은 서열번호 2(692개 아미노산)로 표시된다.The basic gene for producing the mutant CPC acylase is a glutaryl amidase (GA) gene (hereinafter abbreviated as 'ga gene') derived from Pseudomonas sp. GK16 family belonging to Group II-B. At this time, in order to increase protein synthesis efficiency, the codons encoding each amino acid were determined by codon-based sequences frequently used in E. coli. The nucleotide sequence of ga synthesized in this way is shown in SEQ ID NO: 1 (2,079 bases) and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2 (692 amino acids).

상기 ga 유전자에는 알파 유닛 및 베타 유닛 외에도 스페이서 펩티드를 암호화 하는 염기서열이 포함되어 있는데, 이는 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자 역시 같다. 본 발명의 변이 효소는 야생형의 베타-서브유닛에서만 돌연변이를 일으킨 것이므로, 변이 효소 및 야생형 효소는 같은 아미노산 서열의 알파-서브유닛과 스페이서 펩티드를 갖는다. The ga gene includes a base sequence encoding a spacer peptide in addition to an alpha unit and a beta unit, and the gene encoding the mutant CPC acylase of the present invention is also the same. Since the mutant enzyme of the present invention mutated only in the wild-type beta-subunit, the mutant enzyme and wild-type enzyme have the same alpha-subunit and spacer peptide of the same amino acid sequence.

그 예로, 가장 높은 활성이 나왔던 변이체 PM2를 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 5에 표시하였다.
As an example, the nucleotide sequence of the gene encoding the mutant PM2 in which the highest activity was obtained is shown in SEQ ID NO: 5.

본 발명은 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. The present invention provides a recombinant expression vector comprising a gene encoding the mutant CPC acylase of the present invention.

본 명세서에서 '발현벡터'란 상기 티올라아제의 변이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 클로닝된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따라 클로닝된 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. '작동가능하게 연결(operably linked)' 된다는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 조절 서열에 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현 조절 서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴크레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리포좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.As used herein, the term "expression vector" means a plasmid, virus or other medium into which a polynucleotide encoding the mutated protein of thiolase has been cloned. The polynucleotide sequence cloned according to the present invention may be operably linked to an appropriate expression control sequence, wherein the operably linked gene sequence and expression control sequence comprise a selection marker and a replication origin May be contained within one expression vector. &Quot; Operably linked " means that the polynucleotide sequence is linked in such a way as to enable gene expression in the expression control sequence. The expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked to a particular host cell. Such regulatory sequences include one or more selected from the group consisting of a promoter for transcription, an optional operator sequence for regulating transcription, a sequence encoding a suitable mRNA liposomal binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation .

상기 발현 벡터의 모벡터로 사용되는 벡터는 특별한 제한이 없으며, 이 발명이 속하는 기술분야에서 숙주세포로 사용되는 미생물에서의 발현을 위하여 통상적으로 사용되는 모든 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체 등이 사용 가능하다. 예컨대, 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.There is no particular limitation on the vector used as the parent vector of the expression vector, and any plasmid, virus or other medium commonly used for expression in a microorganism used as a host cell in the technical field of the present invention can be used . For example, plasmids derived from Escherichia coli (pBR322, pBR325, pUC118 and pUC119, pET-22b (+)), plasmids derived from Bacillus subtilis (pUB110 and pTP5) and yeast-derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50) , The virus may be an animal virus such as retrovirus, adenovirus or vaccinia virus, or an insect virus such as baculovirus, but is not limited thereto.

상기 재조합 발현벡터는 바람직하게는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함할 수 있다.The recombinant expression vector may preferably include a gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

서열번호 5가 암호화하는 변이 CPC 아실라제는 변이 효소 PM2로서, 서열번호 5로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pBC-PM2 플라스미드를 제조하였다(실시예 4 참조).
The mutant CPC acylase encoded by SEQ ID NO: 5 produced the recombinant expression vector pBC-PM2 plasmid containing the gene represented by SEQ ID NO: 5 as the mutant enzyme PM2 (see Example 4).

또한, 본 발명은 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 미생물을 제공한다. The present invention also provides a host cell and a microorganism transformed by the expression vector.

상기 숙수세포는 통상적으로 사용되는 모든 종류의 단세포 유기체, 예컨대 각종 박테리아 (예컨대, Clostridia 속, 대장균, 등) 등의 원핵세포 미생물 및 효모 등의 진핵세포 미생물을 모두 의미하는 것으로, 예컨대, 클로스트리디아 (Clostridia) 속 미생물 (예컨대, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, 또는 Clostridium saccharobutylicum), 대장균 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The aqueduct cell means all eukaryotic microorganisms such as prokaryotic microorganisms such as all kinds of single cell organisms commonly used, such as various bacteria (for example, Clostridia genus, E. coli, etc.) and yeast. For example, (Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, or Clostridium saccharobutylicum), Escherichia coli, and the like, but is not limited thereto.

상기 형질전환은 본 발명의 변이 CPC 아실라제 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현벡터를 숙주 세포로 도입하기 위하여 통상적으로 사용되는 모든 수단에 의하여 수행될 수 있다. 예컨대, 상기 발현벡터는 이에 제한되지는 않지만, 염화칼슘(CaCl2) 및 열쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation), PEG(polyethylenglycol)에 의한 침전법 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다.Such transfection can be carried out by any means conventionally used to introduce an expression vector comprising a variant CPC acylase encoding polynucleotide sequence of the present invention into a host cell. For example, the expression vector can be, but is not limited to, calcium chloride (CaCl2) and heat shock methods, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, , Electroporation, precipitation with polyethylenglycol (PEG), or the like.

상기 미생물은 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 pBC-PM2 플라스미드에 의해 형질전환 된 Escherichia coli MC1061/pBC-PM2(기탁번호: KCTC12344BP)일 수 있다.
The microorganism may be Escherichia coli MC1061 / pBC-PM2 (accession number: KCTC12344BP) transformed with the recombinant expression vector pBC-PM2 plasmid containing the gene represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.

본 발명은 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 포함하는 7-ACA 제조용 조성물을 제공한다.The present invention provides a composition for preparing 7-ACA comprising a mutant CPC acylase of the present invention.

본 발명의 변이 CPC 아실라제 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여 변이 CPC 아실라제를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 알파-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포와 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 베타-서브유닛 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 각각 적당한 배지와 조건에서 배양하여 각각의 변이 CPC 아실라제 서브유닛 단백질을 제조한 후 시험관 내에서 (in vitro) 두 서브유닛 단백질을 혼합하여 변이 CPC 아실라제를 제조할 수도 있다.The mutant CPC acylase can be prepared by culturing the host cell transformed with the recombinant expression vector in which the mutant CPC acylase coding gene of the present invention or the gene having the equivalent function is inserted into a suitable medium and conditions. In addition, the host cell transformed with the recombinant expression vector into which the gene encoding the alpha-subunit of the mutant CPC acylase of the present invention or the gene having the equivalent function is inserted and the beta-subunit of the mutant CPC acylase of the present invention A host cell transformed with a recombinant expression vector into which an encoding gene or a gene having an equivalent function is inserted is cultured in a suitable medium and conditions to prepare each mutant CPC acylase subunit protein, vitro) may be mixed to prepare a mutant CPC acylase.

상기와 같이 제조된 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 목적산물 제조를 위해서 그대로 사용하거나 또는 정제하여 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 CPC 아실라제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 또한, 히스티딘 펩티드와 니켈 컬럼 성분과의 결합력 또는 섬유소 결합부위 (cellulose binding domain, CBD), 섬유소와의 결합력 등과 같은 특정 결합력 성질을 이용한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography) 방법에 의해 변이 CPC 아실라제를 정제하는 것도 가능하다.The mutant CPC acylase of the present invention produced as described above can be used as it is or purified for its intended use. The mutant CPC acylase enzyme can be separated and purified by using the property of the CPC acylase that has been previously found and using the method of protein separation by various chromatographic methods as it is or slightly modified according to the purpose of the experiment. In addition, the mutant CPC acylase can be obtained by an affinity chromatography method using specific binding force properties such as binding force of the histidine peptide with the nickel column component or cellulose binding domain (CBD) It is also possible to refine.

또한, 본 발명의 변이 CPC 아실라제를 유리 상태가 아닌 고정화시킨 상태로 사용하는 것이 가능하다. 변이 CPC 아실라제의 고정화는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조가 가능한데, 담체로서는 섬유소, 전분, 덱스트란, 아가로즈(agarose) 등의 천연 폴리머; 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide), 폴리아크릴레이트 (polyacrylate), 폴리메타크릴레이트 (polymethacylate), 유퍼짓 C (Eupergit C) 등의 합성 폴리머; 또는 실리카 (silica), 벤토나이트 (bentonite), 금속과 같은 미네랄 등이 사용 가능하다. 또한, 이들 담체에 공유결합, 이온결합, 소수성결합, 물리적 흡착, 마이크로인캡슐레이션(microencapsulation) 등에 의해 변이 CPC 아실라제를 결합시키는 것이 가능하다. 아울러, 이들 담체-효소 결합체가 글루타르알데히드 (glutaraldehyde), 시아노겐 브로마이드 (cyanogen bromide) 등의 작용에 의해 공유결합을 형성함으로써 변이 CPC 아실라제를 고정화시키는 것도 가능하다. 또한, 더욱 바람직한 방법으로는 변이 CPC 아실라제를 따로 정제할 필요가 없이 변이 CPC 아실라제를 함유한 미생물 세포를 그대로 고정화하여 사용하는 것도 가능하다. 이와 같은 전세포 고정화 (whole cell immobilization)시 미생물에 함유된 변이 CPC 아실라제의 반응성을 높이기 위하여 세포에 구멍을 내거나 표면발현 등의 기술을 적용할 수도 있다.In addition, it is possible to use the modified CPC acylase of the present invention in a state in which it is immobilized rather than in a free state. The immobilized CPC acylase can be prepared by a conventional method known in the art. Examples of the carrier include natural polymers such as cellulose, starch, dextran and agarose; Synthetic polymers such as polyacrylamide, polyacrylate, polymethacylate, and Eupergit C; Or minerals such as silica, bentonite and metal can be used. It is also possible to bind the mutant CPC acylase to these carriers by covalent bonding, ionic bonding, hydrophobic bonding, physical adsorption, microencapsulation or the like. It is also possible that these carrier-enzyme conjugates form covalent bonds by the action of glutaraldehyde, cyanogen bromide or the like to immobilize mutant CPC acylase. Further, as a more preferable method, it is not necessary to purify mutant CPC acylase separately, and microorganism cells containing mutant CPC acylase can be immobilized as they are. In such whole cell immobilization, it is possible to apply techniques such as pore formation or surface expression to increase the reactivity of the mutant CPC acylase contained in the microorganism.

본 발명의 변이 CPC 아실라제를 포함하는 7-ACA 제조용 조성물은 변이 CPC 아실라제, 상기 변이 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함한다.
The composition for producing 7-ACA comprising the mutant CPC acylase of the present invention comprises a mutant CPC acylase, a polynucleotide encoding the mutant enzyme, an expression vector comprising the polynucleotide, and a transformant transformed with the expression vector And at least one selected from the group consisting of

본 발명은 또한 상기 변이 CPC 아실라제를 이용하여 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염로부터 하기 화학식 2의 화합물 또는 그의 염을 제조하는 방법을 제공한다. The present invention also provides a method for preparing a compound of the formula (2) or a salt thereof from a compound of the formula (1) or a salt thereof using the mutant CPC acylase.

하기 화학식 중, R은 아세톡시 (-OCOCH3), 하이드록시 (-OH), 수소 (-H)이다. 바람직하게는 하기 화학식의 R은 아세톡시 (-OCOCH3)이고, 하기 화학식의 바람직한 화합물의 염 형태는 알칼리 금속 염 (예: 나트륨염, 칼륨염, 리튬염 등)이다. 또한, 바람직하게는 화학식 1의 화합물은 CPC 기질화합물이고, 화학식 2의 화합물은 7-ACA 화합물이다.In the following formulas, R is acetoxy (-OCOCH3), hydroxy (-OH), or hydrogen (-H). Preferably, R in the following formula is acetoxy (-OCOCH3) and the salt forms of the preferred compounds of the formula are alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts, lithium salts and the like. Also preferably, the compound of formula 1 is a CPC substrate compound and the compound of formula 2 is a 7-ACA compound.

<화학식 1>&Lt; Formula 1 >

Figure 112013005690446-pat00001
Figure 112013005690446-pat00001

<화학식 2>(2)

Figure 112013005690446-pat00002
Figure 112013005690446-pat00002

당업자는 상기 제조방법에 의해 제조된 변이 CPC 아실라제 생산균주의 배양물 또는 변이 CPC 아실라제 함유 조성물의 형태로, 또는 분리된 효소를 유리 상태 또는 고정화시킨 상태로 상기 화합물 1과 접촉하여 상기 화합물 2를 제조할 수 있다. 본 발명의 변이 CPC 아실라제와 상기 화합물 1과의 접촉은 바람직하게는 수용 액(물 또는 완충용액) 상에서 이루어진다. 바람직한 화합물 1의 농도는 1~500 mM 범위 내에서, 바람직한 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 첨가량은 0.1~100 U/㎖ 범위 내에서, 바람직한 반응혼합액의 pH는 pH 7~10 범위 내에서, 바람직한 반응시간은 0.1~24시간 범위 내에서, 바람직한 반응온도는 4~40℃ 범위 내에서 선택될 수 있다. 이와 같은 효소반응을 통해서 생성된 화합물 2는 통상의 방법에 의해 반응액으로부터 분리, 정제될 수 있다.Those skilled in the art will understand that the culture of the mutant CPC acylase producing strain produced by the above method or the mutant CPC acylase-containing composition, or in the form of a free or immobilized enzyme in contact with the compound 1, Can be produced. The mutant CPC acylase of the present invention and the compound 1 are preferably contacted with each other in an aqueous solution (water or buffer solution). The preferred concentration of compound 1 is in the range of 1 to 500 mM, the preferred amount of the modified CPC acylase of the present invention is in the range of 0.1 to 100 U / ml, the pH of the reaction mixture is preferably in the range of pH 7 to 10, The reaction time may be selected within the range of 0.1 to 24 hours, and the preferable reaction temperature may be selected within the range of 4 to 40 ° C. The compound 2 produced through such an enzymatic reaction can be separated and purified from the reaction solution by a conventional method.

또한, 생체 내 (in vivo)에서 본 발명의 변이 CPC 아실라제와 상기 화합물 1의 접촉을 통해 상기화합물 2를 제조할 수 있다. 상기 화합물 1의 생합성 능력을 가지고 있는 아크레모니움 크리소제놈 같은 균주에 본 발명의 변이 CPC 아실라제 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유도체가 삽입된 재조합 발현벡터를 도입하고, 상기 형질전환체를 적당한 배지와 조건에서 배양하게 되면 형질전환체 내에서 생합성된 화합물 1과 본 발명의 변이 CPC 아실라제의 자연스러운 접촉을 통하여 화합물 2가 제조될 수 있다.
In addition, the compound 2 can be prepared in vivo by contacting the mutant CPC acylase of the present invention with the compound 1 described above. A recombinant expression vector into which a mutant CPC acylase coding gene of the present invention or a derivative having an equivalent sequence is inserted is introduced into a strain such as an acromemonium chrysotrophile having the biosynthesis ability of the compound 1, Is cultured in an appropriate medium and conditions, compound 2 can be prepared through natural contact of the biosynthesized compound 1 in the transformant with the mutant CPC acylase of the present invention.

본 발명의 변이 CPC 아실라제는 야생형 CPC 아실라제보다 CPC 기질에 대한 활성을 5배 내지 26배 증가시켜주므로, CPC에서 직접적으로 1단계 만에 7-ACA를 제조하는데 효과적이다.
The mutant CPC acylase of the present invention increases the activity against the CPC substrate by 5 to 26 times that of the wild-type CPC acylase, so it is effective to produce 7-ACA directly in one step in CPC.

도 1은 CPC로부터 7-ACA를 제조하기 위한 1단계 효소공정법과 2단계 효소공정법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 변이 CPC 아실라제의 제조과정을 도식화한 것이다.1 is a schematic representation of a first stage enzyme process and a second stage enzyme process for producing 7-ACA from CPC.
FIG. 2 is a diagram illustrating a process for producing a mutant CPC acylase according to the present invention.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1> &Lt; Example 1 >

CPC 아실라제(Cephalosporin C Acylase)의 제조 및 활성 측정Preparation and activity measurement of CPC acylase (Cephalosporin C Acylase)

<1-1> pBC-GA 플라스미드의 제조<1-1> Preparation of pBC-GA plasmid

변이 CPC 아실라제 개발을 위한 기본 유전자로서 슈도모나스 속 GK16 계열 균주(Matsuda et. al. , J. Bacteriol. 163: 1222-1228, 1985) 유래의 글루타릴 아미다제(Glutaryl amidase, GA) 유전자('ga 유전자'로 약칭)를 사용하였다. (Glutaryl amidase, GA) gene (derived from Pseudomonas sp. GK16 strain (Matsuda et al. , J. Bacteriol. 163: 1222-1228, 1985) as a basic gene for development of mutant CPC acylase . ga gene ') was used.

pBC-GA 플라스미드는 서열번호 1의 ga 구조유전자 DNA 단편이 pBC KS(+) 벡터 (Stratagene사, USA)의 XbaI과 NotI 제한효소 인식부위에 삽입되어 제조된 것이다. The pBC-GA plasmid was prepared by inserting the ga structural gene DNA fragment of SEQ ID NO: 1 into the Xba I and Not I restriction enzyme recognition sites of the pBC KS (+) vector (Stratagene, USA).

상기 구조유전자에 제한효소 인식부위 및 리보좀 결합부위 등을 도입하기 위하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. PCR 반응액의 조성은 10 ng의 합성 ga DNA, 각 50 pmol의 GA-F 프라이머 (서열번호: 12)와 GA-R 프라이머 (서열번호: 13), Taq 완충용액 (5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl2), 0.2 mM dNTP 혼합액, 2.5 단위 ExTaq 중합효소 (Takara사, Japan)로 구성되어 있고, 최종 부피는 100㎕ 로 조정하였다. 또한, PCR은 펠티어 열 순환기 (Peltier Thermal Cycler PTC-200; MJ Research사, USA)를 사용하였으며, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 5분 동안 전-변성 (pre-denaturation)시켰고 변성 (denaturation)을 95℃에서 1분, 어닐링 (annealing)을 58℃에서 30초 및 중합 (polymerization)을 72℃에서 90초 동안 수행하는 반응을 25회 반복한 후 72℃에서 10분 동안 후-중합 (post-polymerization)시켰다. 상기 PCR을 통해 얻은 약 2.1 kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen사, Germany)로 정제하여 이를 삽입 DNA로 사용하였다. 또한, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제 (Roche사, Germany)를 이용하여 16에서 12~16시간 동안 접합 (ligation)시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법 (electrophoration)에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ug/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 형질전환체들을 선별하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 삽입 DNA의 염기서열을 결정함으로써 서열번호: 1의 염기서열을 갖는 ga 구조유전자를 포함하는 pBC-GA 플라스미드를 제조하였다.Polymerase chain reaction (PCR) was performed to introduce restriction enzyme recognition sites and ribosome binding sites into the structural gene. The composition of the PCR reaction solution contained 10 ng of synthetic ga DNA, 50 pmol of each of GA-F primer (SEQ ID NO: 12) and GA-R primer (SEQ ID NO: 13), Taq buffer (5 mM KCl, 5 mM Tris -HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 ), 0.2 mM dNTP mixture and 2.5 units of ExTaq polymerase (Takara, Japan), and the final volume was adjusted to 100 μl. The reaction mixture was pre-denatured at 95 ° C for 5 minutes and denaturation was carried out using a Peltier thermocycler PTC-200 (MJ Research, USA) At 95 ° C for 1 minute, annealing at 58 ° C for 30 seconds, and polymerization at 72 ° C for 90 seconds was repeated 25 times, followed by post-polymerization at 72 ° C for 10 minutes, polymerization. A PCR product of about 2.1 kb in size was digested with restriction enzymes XbaI and NotI and purified with a purification kit (QIAEX Gel Extraction Kit; Qiagen, Germany). Further, a DNA fragment in which pBC KS (+) vector DNA was digested with restriction enzymes XbaI and NotI and dephosphorylated with CIP was used as a vector DNA. The above-mentioned inserted DNA and vector DNA were ligated using T4 DNA ligase (Roche, Germany) at 16 for 12 to 16 hours, and then ligated by electrophoresis using the above-mentioned conjugation solution. Transformation of E. coli MC1061 strain was performed. The strain was plated on an LB agar medium containing chloramphenicol antibiotics at a concentration of 25 ug / mL and cultured overnight at 30 ° C. to select transformants. The pBC-GA plasmid containing the ga structural gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 was prepared by isolating the plasmid from the transformant and determining the nucleotide sequence of the inserted DNA.

pBC-GA 플라스미드 함유 재조합 대장균에 의한 CPC 아실라제의 생산성을 측정하기 위해서 CPC 아실라제 조효소액을 하기와 같이 제조하였다. 상기 대장균 형질전환체 각각을 25 ug/mL 클로람페니콜이 함유된 3 mL의 LB 배지 (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl)에 접종한 후 30℃, 200 rpm 조건으로 16시간 동안 진탕배양하였다. 그 후에 배양액 50 uL를 25 ug/mL 클로람페니콜이 함유된 50 mL의 새로운 LB 배지에 접종한 후 25℃, 200 rpm 조건으로 48시간 동안 진탕배양하였다. 이 플라스크 배양액을 원심분리 (4℃, 8,000 rpm, 10분)하여 균체를 회수한 후 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액으로 2회 세척하였다. 이 균체를 5 mL의 동일 완충용액에 현탁한 후 4℃에서 초음파 분쇄기로 10분 동안 파쇄하고 4℃, 15,000 rpm 조건으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취함으로써 변이 CPC 아실라제 조효소액을 제조하였다.
To measure the productivity of CPC acylase by pBC-GA plasmid-containing recombinant E. coli, a CPC acylase enzyme solution was prepared as follows. Each of the E. coli transformants was inoculated into 3 mL of LB medium (1% Bacto-tryptone, 0.5% Yeast Extract, 0.5% NaCl) containing 25 ug / mL chloramphenicol, And shake cultured. Then, 50 μL of the culture was inoculated into 50 mL of fresh LB medium containing 25 μg / mL of chloramphenicol, followed by shaking culture at 25 ° C. and 200 rpm for 48 hours. Cells were recovered by centrifugation (4 ° C, 8,000 rpm, 10 minutes) and washed twice with 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) buffer solution. The cells were suspended in 5 mL of the same buffer, and then disrupted with an ultrasonic grinder at 4 ° C for 10 minutes. The mutant CPC acylase crude enzyme solution was prepared by centrifuging at 4 ° C and 15,000 rpm for 20 minutes to remove the supernatant .

<1-2> CPC 아실라제의 활성 측정<1-2> Measurement of activity of CPC acylase

상기 실시예 <1-1>에서 합성한 CPC 아실라제의 활성 정도를 측정하기 위해, Park 등의 방법 (Park 등, Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 559-564, 1995)을 변형하여 다음과 같이 실시하였다.(Park et al. , Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol . 23: 559-564, 1995) to measure the activity of CPC acylase synthesized in Example <1-1> And the results were as follows.

CPC 기질 (순도 90%; Hayao사, 중국)을 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 20 mg/mL 농도로 녹인 후 1 N NaOH로 pH를 8.0으로 조절하여 기질용액을 제조하였다. 이 CPC 기질용액 20 uL에 효소액 20 uL를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 50 mM NaOH-20% 빙아세트산 (glacial acetic acid; 1:2) 용액을 200 uL을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 그 후에 원심분리를 수행하여 회수한 상등액 200 uL에 메탄올에 용해시킨 0.5% (w/v) PDAB(p-dimethylaminobenzaldehyde; Sigma, 미국) 40 uL를 첨가하여 10분간 반응시킨 후, 415 파장에서 흡광도를 측정하고 표준물질의 정량곡선과 비교하여 정량하였다. 이때, 1 단위 (unit)는 분당 CPC로부터 1 umole의 7-ACA를 생성할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 한편, CPC 기질에 대한 비활성은 효소액 중의 단백질 양을 브래드포드의 방법 (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976)에 따라 측정한 후에 1 mg 단백질에 해당하는 활성 단위로 표시하였다.The substrate solution was prepared by dissolving the CPC substrate (purity 90%; Hayao Co., China) in 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) buffer solution at a concentration of 20 mg / mL and adjusting the pH to 8.0 with 1 N NaOH. 20 μL of the enzyme solution was added to 20 μL of the CPC substrate solution, reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then 200 μL of 50 mM NaOH-20% glacial acetic acid (1: 2) solution was added to stop the reaction. Then, 40 μL of 0.5% (w / v) p-dimethylaminobenzaldehyde (Sigma, USA) dissolved in methanol was added to 200 μL of the supernatant recovered by centrifugation and incubated for 10 minutes. The absorbance at 415 wavelength And compared with the quantitative curve of the reference material. At this time, one unit was defined as the amount of enzyme capable of producing 1 umole of 7-ACA from CPC per minute. On the other hand, the inactivation of the CPC substrate is measured by measuring the amount of protein in the enzyme solution according to the method of Bradford (Bradford, M., Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976) Respectively.

상기의 방법으로 조효소액을 제조하여 CPC 아실라제 활성을 측정한 결과, 재조합 E. coli MC1061(pBC-GA) 균주에 의한 CPC 아실라제의 생산성은 약 40 단위/L이었다.
The productivity of CPC acylase by the recombinant E. coli MC1061 (pBC-GA) strain was about 40 units / L.

<실시예 2>&Lt; Example 2 >

포화 돌연변이에 의한 변이 Variation due to saturation mutation CPCCPC 아실라제의Acylase 제조 Produce

<2-1> 공지의 구조정보에 근거한 GA 변이 잔기의 선별&Lt; 2-1 > Selection of GA mutation residues based on known structural information

CPC 기질에 대한 활성이 매우 미약한 상기 실시예 1의 CPC 아실라제(야생형)를 개량하기 위해, 공지의 3차 구조 모델링과 가장 돌연변이 정보를 바탕으로 GA 활성부위의 돌연변이를 수행하였다.In order to improve the CPC acylase (wild type) of Example 1 in which the activity against the CPC substrate is very weak, the mutation of the GA active site was performed based on the known tertiary structure modeling and the most mutation information.

이를 위해, Fritz-Wolf 등(Fritz-Wolf et . al . , Protein Sci . 11: 92-103, 2002)이 제안한 8개의 GA 활성부위 아미노산 잔기들 (Y149ß, L24ß, Y33ß, Q50ß, R57ß, V70ß, Y153ß, F177ß)을 우선적으로 검토하였고 또한 김 등이 제안한 슈도모나스 속 CAD 유래 Gl-7-ACA 아실라제의 활성부위 변이 잔기도 같이 검토하였다 (Kim et. al. , J. Biol. Chem. 276: 48376-48381, 2001). 그 결과, 야생형 GA의 활성부위 변이 잔기로서 4개의 잔기(F31ß, F58ß, Y153ß, F177ß)를 선정하였다.
For this, Fritz-Wolf et al. (Fritz-Wolfmeat . get . ,Protein Sci . (Y149ß, L24ß, Y33ß, Q50ß, R57ß, V70ß, Y153ß, and F177ß) of the eight GA active site proposed by the present inventors were preferentially examined, and the amino acid residues of the Pseudomonas sp. -7-ACA acylase was also investigated (Kim et al.,J. Biol. Chem. 276: 48376-48381, 2001). As a result, four residues (F31ß, F58ß, Y153ß, and F177ß) were selected as residues of the active site mutation of the wild-type GA.

<2-2> F58ß <2-2> F58ß 변이체의Mutant 제조 Produce

CPC 아실라제 활성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 제조하기 위하여 GA 활성부위 잔기인 F31ß, F58ß, Y153ß, F177ß 잔기에 대해서 각각 20종류의 아미노산으로 치환하는 포화 돌연변이(saturation mutagenesis)를 수행하여 4중의 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리 제조과정은 하기와 같다. In order to prepare mutant CPC acylase with increased CPC acylase activity, saturation mutagenesis was performed by substituting 20 kinds of amino acids for F31ß, F58ß, Y153ß, and F177ß residues of GA active site residues, respectively, to obtain 4 mutations &Lt; / RTI &gt; The specific mutant library preparation process is as follows.

구체적으로, F31ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리를 제조하기 위하여, pBC-GA 플라스미드를 주형으로 하고 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 F31b-R 프라이머 (서열번호: 15)를 사용하는 PCR을 수행하여 0.7 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, 또한 pBC-GA 플라스미드를 주형으로 하고 F31b-F 프라이머 (서열번호: 14)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 10)를 사용하는 PCR을 수행하여 1.5 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 0.7 kb의 PCR 산물과 1.5kb의 PCR 산물을 혼합하여 프라이머를 첨가하지 않고 상기의 방법으로 PCR을 수행하여 두 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.1 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 이로부터 얻은 2.1 kb의 PCR 산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호: 8)와 T7 프라이머 (서열번호: 9)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.1 kb 크기의 1중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다.Specifically, in order to prepare the F31ß residue saturation mutagenesis library, PCR was performed using the pBC-GA plasmid as a template and the M13-R primer (SEQ ID NO: 11) and the F31b-R primer (SEQ ID NO: 15) kb PCR product was recovered and PCR was performed using the pBC-GA plasmid as a template and the F31b-F primer (SEQ ID NO: 14) and the M13-F primer (SEQ ID NO: 10) The PCR product was recovered. The 0.7 kb PCR product and the 1.5 kb PCR product were mixed and PCR was performed in the same manner as described above without adding the primer, thereby recovering a PCR product of about 2.1 kb in size. The resulting 2.1 kb PCR product was used as a template and PCR was performed using T3 primer (SEQ ID NO: 8) and T7 primer (SEQ ID NO: 9) to amplify a single mutant DNA fragment of about 2.1 kb in size.

상기 PCR을 통해 얻은 변이 유전자 즉, 2.1 kb의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였고, pBC KS(+) 벡터 DNA를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하고 CIP로 탈인산화시킨 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ug/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치 배양함으로써 F31ß 잔기 포화 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.The mutant gene obtained by the above PCR, that is, the 2.1 kb PCR product was digested with restriction enzymes Xba I and Not I, purified using a purification kit (QIAEX Gel Extraction Kit) and used as an inserted DNA. The pBC KS (+) vector DNA Was digested with restriction enzymes Xba I and Not I and the DNA fragment was dephosphorylated with CIP as a vector DNA. The above-mentioned inserted DNA and vector DNA were ligated with T4 DNA ligase at 16 ° C for 16 hours, and E. coli strain MC1061 was transformed by electroporation using the above-mentioned conjugate. The strain was plated on an LB agar medium containing chloramphenicol antibiotics at a concentration of 25 ug / mL and incubated overnight at 30 캜 for overnight incubation to prepare an F31ß residue saturation mutant library.

상기와 동일한 방법으로 F58ß, Y153ß, F177ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리를 각각 제조하였다. 이때, F58ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리 제조를 위해서는 F58b-F 프라이머 (서열번호: 16)와 F58b-R 프라이머 (서열번호: 17)를 사용하였고, Y153ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리 제조를 위해서는 Y153b-F 프라이머 (서열번호: 18)와 Y153b-R 프라이머 (서열번호: 19)를 사용하였고, F177ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리 제조를 위해서는 F177b-F 프라이머 (서열번호: 20)와 F177b-R 프라이머 (서열번호: 21)를 사용하였다. F58ß, Y153ß, and F177ß residue saturation mutagenesis libraries were prepared in the same manner as above. The F58b-F primer (SEQ ID NO: 16) and the F58b-R primer (SEQ ID NO: 17) were used for the preparation of the F58ß residue-saturation mutant library and the Y153b-F primer F177b-F primer (SEQ ID NO: 20) and F177b-R primer (SEQ ID NO: 21) were used for the preparation of the F177ß residue-saturated mutation library .

상기 포화 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 반응성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 하기와 같은 방법으로 스크리닝하였다.The mutant CPC acylase with increased reactivity to the CPC substrate from the saturation mutant library was screened as follows.

돌연변이가 유발된 변이 CPC 아실라제 유전자를 함유한 E. coli MC1061 형질전환체를 클로람페니콜 항생제가 함유된 LB 액체배지가 200 uL씩 분주된 96-웰 플레이트에 접종한 후, 30℃, 180 rpm 조건으로 60~70시간 동안 진탕배양하였다. 그 후 상기 웰 플레이트에서 100 uL씩의 배양액을 취하여 이를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 상기 배양액을 100 uL의 세포 분해용액 (0.67 mg/mL 리소자임 (lysozyme), 1.3 mM EDTA, 0.13% Triton X-100을 포함한 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액)과 혼합하여 30에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후에 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) 완충용액에 용해시킨 2.5%(w/v) CPC 기질을 첨가하고 28℃에서 14~16시간 동안 CPC 기질의 가수분해 반응을 수행하였다. CPC 기질의 가수분해를 수행한 후에 반응액을 4,200 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상등액 50 uL를 새로운 96-웰 플레이트로 옮겼다. 여기에 반응 정지액 (acetic acid: 250 mM NaOH, 2:1) 160 uL를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후 발색시약 (메탄올에 용해된 0.5% (w/v) PDAB 용액) 40 uL를 첨가하고 실온에서 10분간 방치하였다. 그 후에 96-웰 플레이트 판독기를 사용하여 415nm 에서 흡광도를 측정함으로써 CPC 기질에 대한 활성이 증가된 변이체를 스크리닝하였다. E. coli MC1061 transformants containing the mutated CPC acylase gene were inoculated in a 96-well plate in which 200 μL of the LB liquid medium containing the chloramphenicol antibiotic was dispensed, And shake cultured for 60 to 70 hours. Then, 100 uL of culture solution was taken from the well plate and transferred to a new 96-well plate. The culture was mixed with 100 uL of cell lysate solution (0.67 mg / mL lysozyme, 1.3 mM EDTA, 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) buffer containing 0.13% Triton X-100) . After that, a 2.5% (w / v) CPC substrate dissolved in 0.1 M potassium phosphate (pH 8.0) buffer was added and hydrolysis of the CPC substrate was carried out at 28 ° C for 14-16 hours. After performing hydrolysis of the CPC substrate, the reaction solution was centrifuged at 4,200 rpm for 20 minutes, and 50 uL of the supernatant was transferred to a new 96-well plate. After the addition of 160 uL of acetic acid (250 mM NaOH, 2: 1), the enzyme reaction was stopped and 40 uL of a coloring reagent (0.5% (w / v) PDAB solution in methanol) And allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Subsequently, mutants with increased activity on the CPC substrate were screened by measuring the absorbance at 415 nm using a 96-well plate reader.

상기와 같은 방법으로 F31ß, F58ß, Y153ß, F177ß 잔기 4중의 포화 돌연변이 라이브러리를 스크리닝 한 결과, F31ß, Y153ß, F177ß 잔기 3중의 포화 돌연변이 라이브러리에서는 야생형 GA 대비 CPC 아실라제 활성 증가 변이체를 선발하지 못했다. 그러나 F58 잔기 포화 돌연변이 라이브러리에서 CPC 아실라제 활성이 증가한 변이체 1종 (S17)을 선발하였다. 이 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 S17 변이효소는 F58ß 잔기가 발린으로 치환되어 있음을 확인하였다. S17 변이효소의 아미노산 서열은 서열번호 28에 표시하였다.As a result of screening the saturated mutation library of F31ß, F58ß, Y153ß, and F177ß residues 4 in the same manner as above, the mutant library of saturated mutants in F31ß, Y153ß, and F177ß residues 3 did not select mutants with increased CPC acylase activity relative to wild-type GA. However, one variant (S17) with increased CPC acylase activity in the F58 residue - saturation mutant library was selected. Through the sequencing of the gene encoding this mutant, it was confirmed that the S17 mutant enzyme was substituted with valine for the F58ß residue. The amino acid sequence of the S17 mutant enzyme is shown in SEQ ID NO: 28.

<2-3> F31ß/F58ß, F58ß/<2-3> F31ß / F58ß, F58ß / Y153Y153 ß, F58ß/F177ß 2중 ß, F58ß / F177ß 2 변이체의Mutant 제조  Produce

상기 F58ßV 변이체의 CPC 아실라제 활성을 부가적으로 증대시키기 위해서 F58ßV 변이체 유전자를 대상으로 실시예 <1-3>의 방법과 동일하게 F31ß, Y153ß, F177ß 잔기에 대한 포화 돌연변이 라이브러리를 제조하였다.In order to further increase the CPC acylase activity of the F58ßV mutant, a saturated mutation library for the F31ß, Y153ß, and F177ß residues was prepared in the same manner as in Example <1-3> for the F58ßV mutant gene.

그 후, 실시예 <2-2>의 방법과 동일하게 3중의 포화 돌연변이 라이브러리를 스크리닝 한 결과, F31 잔기 포화 돌연변이 라이브러리에서는 F58ßV 변이체 대비 CPC 아실라제 활성 증가 변이체를 선발하지 못했다. 그러나 Y153ß 잔기 및 F177ß 잔기 포화 돌연변이 라이브러리에서 CPC 아실라제 활성이 증가한 변이체를 각각 1종 (B2 및 A5)씩 선발하였다. 이 변이체들을 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 B2 변이효소는 Y153ß 잔기가 스레오닌으로 치환되었고, A5 변이효소는 F177ß 잔기가 루이신으로 치환되어 있음을 확인하였다. 즉, B2 변이효소는 F58ßV/Y153ßT 2중 변이체이고, A5는 F58ßV/F177ßL 2중 변이체이다.Thereafter, a triple saturated mutation library was screened in the same manner as in Example <2-2>. As a result, the F31 residue-saturation mutant library did not select mutants with increased CPC acylase activity as compared to F58ßV variants. However, mutants with increased CPC acylase activity in the Y153ß residue and the F177ß residue-saturation mutant library were selected, one by one (B2 and A5), respectively. Through the sequencing of the genes encoding these mutants, it was confirmed that the Y153ß residue was replaced with threonine in the B2 mutant enzyme and the F177ß residue was replaced with the lysine in the A5 mutant enzyme. That is, the B2 mutant enzyme is an F58ßV / Y153ßT 2 mutant, and A5 is an F58ßV / F177ßL 2 mutant.

<2-4> F58ß/<2-4> F58ß / Y153Y153 ß/F177ß 3중 ß / F177ß 3 변이체의Mutant 제조  Produce

상기 실시예 <2-3>에서 F58ßV 변이체에 Y153ßT 또는 F177ßL의 도입이 CPC 아실라제 활성 증가에 기여함을 확인하였다. 이에 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체를 제조하여 공지의 구조정보에 근거한 변이 CPC 아실라제 개발을 완성하고자 하였다.In Example <2-3>, it was confirmed that the introduction of Y153ßT or F177ßL into the F58ßV mutant contributes to the increase of CPC acylase activity. Thus, the present inventors produced F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutants to complete development of mutant CPC acylase based on known structural information.

구체적으로, F58ßV/Y153ßT 2중 변이체에 F177ßL 변이를 도입함으로써 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체를 제조하였다. 이때, F177bL-F 프라이머 (서열번호: 22)와 F177bL-R 프라이머 (서열번호: 23)를 사용하여 실시예 <2-2>의 방법과 동일하게 3중 변이 유전자를 함유한 형질전환체를 제조하였다. 이 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하여 염기서열을 결정함으로써 변이가 제대로 도입되었는지를 확인하였다. 이로부터 제조된 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이효소 효소를 암호화하는 변이 CPC 아실라제 유전자를 R1으로 명명하였다.
Specifically, the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant was prepared by introducing the F177ßL mutation into the F58ßV / Y153ßT mutant. At this time, using the F177bL-F primer (SEQ ID NO: 22) and the F177bL-R primer (SEQ ID NO: 23), a transformant containing a triple mutation gene was prepared in the same manner as in the method of Example <2-2> Respectively. The plasmid was isolated from the transformant and the nucleotide sequence was determined to confirm whether the mutation was properly introduced. The mutant CPC acylase gene encoding the F58ßV / Y153ßT / F177ßL triple mutant enzyme produced thereby was named R1.

<실험예 3><Experimental Example 3>

무작위 돌연변이에 의한 변이 CPC 아실라제의 제조Production of mutant CPC acylase by random mutation

<3-1> <3-1> I45I45 ß/F58ß/ß / F58ß / Y153Y153 ß/F177ß 및 F58ß/ß / F177ß and F58ß / Y153Y153 ß/F177ß/ß / F177ß / V382V382 ß 4중 ß Four 변이transition 체의 제조Manufacture of sieves

상기 실시예 <2-4>의 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체의 CPC 아실라제 활성을 부가적으로 증대시키기 위해서 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 DNA를 주형 DNA로 사용하여 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 무작위 위치에서 점 돌연변이를 유발시킨 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리의 제조과정은 하기에 설명한 바와 같다. In order to additionally increase the CPC acylase activity of the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant of Example <2-4>, the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant DNA was used as a template DNA to generate an error-inducing polymerase chain The mutation library was generated by performing the reaction to induce a point mutation at a random position. The procedure for preparing the specific mutant library is as described below.

에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 위한 PCR 반응액의 조성은 주형 DNA로서 5 ng의 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 DNA, 각 50 pmol의 T3 프라이머 (서열번호: 8)와 T7 프라이머 (서열번호: 9), 5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3.5 mM MgCl2, 0.025 mM MnCl2, 각 0.2 mM의 dATP와 dGTP, 각 1 mM의 dCTP와 dTTP, 5 단위의 rTaq 중합효소 (Takara사, Japan)로 구성되어 있고, 최종 부피는 100 uL로 조정하였다. PCR은 펠티어 열 순환기를 사용하였고, 반응조건은 반응 혼합액을 95℃에서 3분 동안 전-변성시키고 변성을 95℃에서 1분, 어닐링을 58℃에서 30초 및 중합을 72℃에서 90초 동안 수행하는 반응을 20회 반복한 후 72℃에서 10분 동안 후-중합시켰다. 상기 조건의 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 변이 유전자, 즉, 2.1 kb 크기의 PCR 산물을 제한효소 XbaI과 NotI로 절단한 후 정제 키트 (QIAEX Gel Extraction Kit)로 정제하여 삽입 DNA로 사용하였고, pBC-GA 플라스미드를 제한효소 XbaI과 NotI로 절단하여 회수한 3.4 kb 크기의 DNA 단편을 벡터 DNA로 사용하였다. 상기의 삽입 DNA와 벡터 DNA를 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 16시간 동안 접합시킨 후 상기 접합액을 이용하여 전기천공법에 의한 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하였다. 상기 균주를 25 ug/mL 농도의 클로람페니콜 항생제를 함유한 LB 한천배지에 도말하여 30℃에서 하룻밤 정치배양함으로써 무작위 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. The composition of the PCR reaction solution for the error-inducible polymerase chain reaction was as follows: 5 ng of F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant DNA, 50 pmol each of T3 primer (SEQ ID NO: 8) and T7 primer (SEQ ID NO: 9), 5 mM KCl, 5 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3.5 mM MgCl 2 , 0.025 mM MnCl 2 , 0.2 mM each of dATP and dGTP, 1 mM each of dCTP and dTTP, 5 units of rTaq polymerase Takara, Japan) and the final volume was adjusted to 100 uL. The PCR was carried out using a Peltier thermocycler. The reaction conditions were as follows: the reaction mixture was pre-denatured at 95 DEG C for 3 minutes, denaturation at 95 DEG C for 1 minute, annealing at 58 DEG C for 30 seconds and polymerization at 72 DEG C for 90 seconds The reaction was repeated 20 times and then post-polymerized at 72 ° C for 10 minutes. The mutant gene obtained through the error-prone PCR reaction of the above conditions, that is, the 2.1 kb PCR product, was digested with restriction enzymes Xba I and Not I, purified with a purification kit (QIAEX Gel Extraction Kit) , And a 3.4 kb DNA fragment recovered by digesting pBC-GA plasmid with restriction enzymes Xba I and Not I was used as vector DNA. The above-mentioned inserted DNA and vector DNA were ligated with T4 DNA ligase at 16 ° C for 16 hours, and E. coli strain MC1061 was transformed by electroporation using the above-mentioned conjugate. The strain was plated on an LB agar medium containing chloramphenicol antibiotics at a concentration of 25 ug / mL and cultured overnight at 30 캜 for a random mutagenesis library.

상기 무작위 돌연변이 라이브러리로부터 CPC 기질에 대한 활성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 실시예 <2-2>의 방법으로 스크리닝하였다. 그 결과, 약 25,000종의 변이체 중에서 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 대비 CPC 활성이 증가한 변이체 2중 (M23 및 M27)을 선발하였다. 이들 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정을 통하여 M23 변이효소는 I45ß 잔기가 메티오닌으로 치환되어 있었고, M27 변이효소는V382ß 잔기가 이소루이신으로 치환되어 있음을 확인하였다.
The mutant CPC acylase with increased activity against the CPC substrate from the random mutant library was screened by the method of Example <2-2>. As a result, mutants (M23 and M27) having increased CPC activity relative to F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutants were selected from about 25,000 variants. Through the sequencing of the genes encoding these mutants, the M23 mutant enzyme was found to have the I45ß residue replaced with methionine, and the M27 mutant enzyme was found to be substituted with isoleucine at the V382ß residue.

<3-2> I45ß/F58ß/ Y153ß/F177ß/ V382ß 5중 변이체의 제조 <3-2> Preparation of I45 ß / F58 ß / Y153 ß / ß F177 / V382 variant ß 5

상기 <3-1>의 결과에서 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체에 I45ßM 또는 V382ßI의 돌연변이가 도입된 경우에 CPC 아실라제 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 부가적인 CPC 아실라제 활성 증대를 위해서 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체에 I45ß 잔기 및 V382ß 잔기에 대한 이중 포화 돌연변이 라이브러리를 제조하였다. 구체적인 돌연변이 라이브러리 제조과정은 하기와 같다. As a result of the above <3-1>, CPC acylase activity was increased when a mutation of I45ßM or V382ßI was introduced into F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant. Therefore, a dual saturation mutant library for the I45ß residue and the V382ß residue was prepared in the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant for additional CPC acylase activity increase. The specific mutant library preparation process is as follows.

I45ß 잔기 및 V382ß 잔기 이중 포화 돌연변이 라이브러리를 제조하기 위하여, F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 DNA를 주형으로 하고 M13-R 프라이머 (서열번호: 11)와 I45b-R 프라이머 (서열번호: 25)를 사용하는 PCR을 수행하여 0.7 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, 또한 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 DNA를 주형으로 하고 I45b-F 프라이머 (서열번호: 24)와 V382b-R 프라이머 (서열번호: 27)를 사용하는 PCR을 수행하여 1.0 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였고, 또한 F58ßV/Y153ßT/F177ßL 3중 변이체 DNA를 주형으로 하고 V382b-F 프라이머 (서열번호: 26)와 M13-F 프라이머 (서열번호: 10)를 사용하는 PCR을 수행하여 0.5 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 상기 0.7 kb의 PCR 산물과 1.0 kb의 PCR 산물 및 0.5 kb 크기의 PCR 산물을 혼합하여 프라이머를 첨가하지 않고 PCR을 수행하여 세 PCR 산물이 하나로 연결된 약 2.1 kb 크기의 PCR 산물을 회수하였다. 이로부터 얻은 2.1 kb의 PCR 산물을 주형으로 하고 T3 프라이머 (서열번호: 8)와 T7 프라이머 (서열번호: 9)를 사용한 PCR을 수행하여 약 2.1 kb 크기의 5중 변이체 DNA 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻은 2.1 kb의 PCR 산물을 실시예 <2-2>의 방법과 동일하게 pBC KS(+) 벡터 DNA에 삽입하고 E. coli MC1061 균주의 형질전환을 수행하여 I45ß 잔기 및 V382ß 잔기 이중 포화 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다.(SEQ ID NO: 11) and I45b-R primer (SEQ ID NO: 25) were used as templates and the F58ßV / Y153ßT / F177ßL mutant DNA template as a template and the I45b-R primer (SEQ ID NO: 24) and V382b-R primer (SEQ ID NO: 27) using the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant DNA as a template, and recovering the 0.7 kb PCR product. (SEQ ID NO: 26) and M13-F primer (SEQ ID NO: 26), using the F58ßV / Y153ßT / F177ßL 3 mutant DNA as a template, as a template, 10) was used to recover 0.5 kb PCR product. The 0.7 kb PCR product, the 1.0 kb PCR product, and the 0.5 kb PCR product were mixed and PCR was performed without primers to recover a PCR product of about 2.1 kb in size. The 2.1 kb fragment was amplified by PCR using 2.1 kb of the obtained PCR product as a template and a T3 primer (SEQ ID NO: 8) and a T7 primer (SEQ ID NO: 9). The thus obtained 2.1 kb PCR product was inserted into pBC KS (+) vector DNA in the same manner as in Example <2-2>, and E. coli MC1061 was transformed to obtain I45ß residue and V382ß residue double-saturated mutant &Lt; / RTI &gt;

상기 이중 포화 돌연변이 라이브러리로부터 실시예 <2-2>의 방법으로 M27 변이효소 (F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI 4중 변이체) 대비 CPC 기질에 대한 활성이 증가된 변이 CPC 아실라제를 스크리닝하였다. 그 결과, M27 변이효소 대비 CPC 아실라제 활성이 증대된 5종의 5중 변이체 (I45ßV/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßA/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI, I45ßC/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßM/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßL, I45ßL/F58ßV/Y153ßT/F177ßL/V382ßI)를 선발하였다.
Mutant CPC acylase having an increased activity on the CPC substrate was screened from the above-mentioned dual saturation mutant library by the method of Example <2-2> in comparison with the M27 mutant enzyme (F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßI 4 mutant). As a result, it was confirmed that five kinds of five mutants (I45ßV / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßL, I45ßA / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßI, I45ßC / F178ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßL) having increased CPC acylase activity against the M27 mutant enzyme , I45ßM / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßL, I45ßL / F58ßV / Y153ßT / F177ßL / V382ßI) were selected.

<< 실시예Example 4> 4>

변이 CPC 아실라제의 활성 측정Activity measurement of mutant CPC acylase

상기 실시예 2 내지 실시예 3의 변이 CPC 아실라제의 활성 정도를 실시예 <1-2>와 같은 방법으로 측정한 결과, 아래 [표 2]과 같다. 5중 변이체는 5개 모두 비슷한 활성을 보였는데, PM2 변이체의 활성이 가장 높아서 PM2를 대표적으로 측정하였다. 야생형 효소의 수치를 1로 놓고, 변이 효소의 활성은 야생형 효소 활성의 배수로 표현하였다. The degree of activity of the mutant CPC acylases of Examples 2 to 3 was measured by the same method as in Example <1-2>, and the results are shown in Table 2 below. The five mutants showed similar activities, and the activity of PM2 variants was the highest, and PM2 was representative. The wild-type enzyme level was set to 1, and the activity of the mutant enzyme was expressed as a multiple of the wild-type enzyme activity.

변이 CPC 아실라제의 변이 잔기 및 CPC 아실라제 활성 정도 비교Comparison of mutant residues and CPC acylase activity of mutant CPC acylase 변이효소Mutant enzyme 변이 잔기Mutation residue CPC 기질에 상대 활성 (배)Relative activity on CPC substrate (times) GAGA 야생형Wild type 1.01.0 S17S17 F58VF58V 5.35.3 A5A5 F58V/F177LF58V / F177L 9.89.8 B2B2 F58V/Y153TF58V / Y153T 14.514.5 R1R1 F58V/Y153T/F177LF58V / Y153T / F177L 16.816.8 M23M23 I45M/F58V/Y153T/F177LI45M / F58V / Y153T / F177L 18.818.8 M27M27 F58V/Y153T/F177L/V382IF58V / Y153T / F177L / V382I 20.320.3 PM2PM2 I45V/F58V/Y153T/F177L/V382LI45V / F58V / Y153T / F177L / V382L 25.325.3

상기 변이 효소 중, PM2 변이 효소를 암호화하는 유전자(서열번호 5)를 포함하는 pBC-PM2 플라스미드로 형질전환된 E. coli MC1061 균주를 Escherichia coli MC1061/pBC-PM2라 명명하였고, 2012년 12월 30일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC12344BP).
Among the above-mentioned mutant enzymes, Escherichia coli MC1061 / pBC-PM2 was named E. coli MC1061 strain transformed with the pBC-PM2 plasmid containing the gene encoding the PM2 mutant enzyme (SEQ ID NO: 5) (Accession No .: KCTC12344BP). &Lt; / RTI &gt;

본 발명의 변이 CPC 아실라제는 야생형 CPC 아실라제보다 CPC 기질에 대한 활성을 5배 내지 26배 증가시켜주므로, CPC에서 직접적으로 1단계 만에 7-ACA를 제조할 수 있어, 산업상 이용가능성이 높다.Since the mutant CPC acylase of the present invention increases the activity against the CPC substrate by 5 to 26 times that of the wild-type CPC acylase, 7-ACA can be produced directly in CPC in only one step, high.

<110> AMICOGEN CO., LTD. <120> A mutant enzyme for production of cephalosporin antibiotics <130> NP12-0110 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2079 <212> DNA <213> Wild-type Gl-7-ACA acylase gene of Pseudomonas sp. GK16 <400> 1 atggaaccga ccagcacccc gcaggctccg atcgctgctt ataaaccgcg tagcaacgaa 60 atcctgtggg atggttatgg tgttccgcat atctatggtg ttgacgctcc gagcgctttt 120 tatggttatg gctgggctca ggctcgtagc catggtgata acatcctgcg tctgtatggt 180 gaagctcgtg gtaaaggcgc tgaatattgg ggtccggatt acgaacagac gaccgtttgg 240 ctgctgacca acggtgttcc ggaacgtgct cagcagtggt atgctcagca gagcccggat 300 tttcgtgcta acctggatgc ttttgctgct ggtatcaacg cttatgctca gcagaacccg 360 gatgatatca gcccggaagt tcgtcaggtt ctgccggtta gcggtgctga tgttgttgct 420 catgctcatc gtctgatgaa ctttctgtat gttgctagcc cgggtcgtac cctgggtgaa 480 ggtgatccgc cggatctggc tgatcagggt agcaacagct gggctgttgc tccgggtaaa 540 accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aaccctcatc tgagctggac caccgattat 600 tttacctatt atgaagctca tctggttacc ccggattttg aaatctatgg tgctacccag 660 atcggtctgc cggttatccg ttttgctttt aaccagcgta tgggtatcac caacaccgtt 720 aacggtatgg ttggtgctac caactatcgt ctgaccctgc aggatggtgg ttatctgtat 780 gatggtcagg ttcgtccgtt tgaacgtcgt caggctagct atcgtctgcg tcaggctgat 840 ggtaccaccg ttgataaacc gctggaaatc cgttccagcg ttcatggtcc ggtttttgaa 900 cgtgctgatg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggatcgtcc gggtatgctg 960 gaacagtatt ttgatatgat caccgctgat agctttgatg attatgaagc tgctctggct 1020 cgtatgcagg ttccgacctt taacatcgtt tatgctgatc gtgaaggtac catcaactat 1080 agctttaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttttg gcagggtctg 1140 gttccgggtg atagcagccg ttatctgtgg accgaaaccc atccgctgga tgatctgccg 1200 cgtgttacca acccgccggg tggttttgtt cagaacagca acgatccgcc gtggaccccg 1260 acctggccgg ttacctatac cccgaaagat tttccgagct atctggctcc gcagaccccg 1320 catagcctgc gtgctcagca gagcgttcgt ctgatgagcg aaaacgatga tctgaccctg 1380 gaacgtttta tggctctgca gctgagccat cgtgctgtta tggctgatcg taccctgccg 1440 gatctgatcc cggctgctct gatcgatccg gatccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500 ctggctgcgt gggatcgtga atttaccagc gatagccgtg ctgctctgct gtttgaagaa 1560 tgggctcgtc tgtttgctgg tcagaacttt gctggtcagg ctggctttgc taccccgtgg 1620 agcctggata aaccggttag caccccgtat ggtgttcgtg atccgaaagc tgctgttgat 1680 cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatatg gtgctatcga tcgtccgttt 1740 ggtgatgcta gccgtatgat cctgaacgat gttaacgttc cgggtgctgc tggttatggt 1800 aacctgggta gctttcgtgt ttttacctgg agcgatccgg atgaaaacgg tgtgcgtacc 1860 ccggttcatg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattta gcaccccggt tcgtgcttat 1920 ggtctgatga gctatggtaa cagccgtcag ccgggtacca cccattatag cgatcagatc 1980 gaacgtgtta gccgtgctga ttttcgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040 gctgttcagg aacgtacccc gtttaacttt aaaccgtga 2079 <210> 2 <211> 692 <212> PRT <213> Amino acid sequence coded by nucleotide of sequence No.1 <400> 2 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr 20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala 35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly 50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp 65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln 85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile 100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg 115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg 130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro 180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu 195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro 210 215 220 Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala 260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu 275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly 290 295 300 Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala 340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys 355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp 370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro 420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser 435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met 450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser 500 505 510 Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln 515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys 530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn 580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe 595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val His Gly 610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu 660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe 675 680 685 Asn Phe Lys Pro 690 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Alpha-subunit of wild-type Gl-7-ACA acylase(GA) protien from Pseudomonas sp. GK16 <400> 3 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly 20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg 35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys 50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln 85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn 100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln 115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu 130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 4 <211> 522 <212> PRT <213> Beta-subunit of wild-type Gl-7-ACA acylase(GA) protien from Pseudomonas sp. GK16 <400> 4 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 405 410 415 Ile Leu 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ggtatcaacg cttatgctca gcagaacccg 360 gatgatatca gcccggaagt tcgtcaggtt ctgccggtta gcggtgctga tgttgttgct 420 catgctcatc gtctgatgaa ctttctgtat gttgctagcc cgggtcgtac cctgggtgaa 480 ggtgatccgc cggatctggc tgatcagggt agcaacagct gggctgttgc tccgggtaaa 540 accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aaccctcatc tgagctggac caccgattat 600 tttacctatt atgaagctca tctggttacc ccggattttg aagtgtatgg tgctacccag 660 atcggtctgc cggttatccg tgttgctttt aaccagcgta tgggtatcac caacaccgtt 720 aacggtatgg ttggtgctac caactatcgt ctgaccctgc aggatggtgg ttatctgtat 780 gatggtcagg ttcgtccgtt tgaacgtcgt caggctagct atcgtctgcg tcaggctgat 840 ggtaccaccg ttgataaacc gctggaaatc cgttccagcg ttcatggtcc ggtttttgaa 900 cgtgctgatg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggatcgtcc gggtatgctg 960 gaacagactt ttgatatgat caccgctgat agctttgatg attatgaagc tgctctggct 1020 cgtatgcagg ttccgacctt gaacatcgtt tatgctgatc gtgaaggtac catcaactat 1080 agctttaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttttg gcagggtctg 1140 gttccgggtg atagcagccg ttatctgtgg accgaaaccc atccgctgga tgatctgccg 1200 cgtgttacca acccgccggg tggttttgtt cagaacagca acgatccgcc gtggaccccg 1260 acctggccgg ttacctatac cccgaaagat tttccgagct atctggctcc gcagaccccg 1320 catagcctgc gtgctcagca gagcgttcgt ctgatgagcg aaaacgatga tctgaccctg 1380 gaacgtttta tggctctgca gctgagccat cgtgctgtta tggctgatcg taccctgccg 1440 gatctgatcc cggctgctct gatcgatccg gatccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500 ctggctgcgt gggatcgtga atttaccagc gatagccgtg ctgctctgct gtttgaagaa 1560 tgggctcgtc tgtttgctgg tcagaacttt gctggtcagg ctggctttgc taccccgtgg 1620 agcctggata aaccggttag caccccgtat ggtctgcgtg atccgaaagc tgctgttgat 1680 cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatatg gtgctatcga tcgtccgttt 1740 ggtgatgcta gccgtatgat cctgaacgat gttaacgttc cgggtgctgc tggttatggt 1800 aacctgggta gctttcgtgt ttttacctgg agcgatccgg atgaaaacgg tgtgcgtacc 1860 ccggttcatg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattta gcaccccggt tcgtgcttat 1920 ggtctgatga gctatggtaa cagccgtcag ccgggtacca cccattatag cgatcagatc 1980 gaacgtgtta gccgtgctga ttttcgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040 gctgttcagg aacgtacccc gtttaacttt aaaccgtga 2079 <210> 6 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-subunit of mutatnt PM2 protein <400> 6 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg 1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly 20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg 35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys 50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu 65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln 85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn 100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln 115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu 130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 7 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of PM2 mutant <400> 7 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr 20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala 35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met 50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro 85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr 100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val 115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu 130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr 165 170 175 Leu Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe 180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln 195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His 210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu 275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met 290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala 340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr 355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp 370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met 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<213> Artificial Sequence <220> <223> GA-F primer <400> 12 attaagtcta gaaggagata tacatatgga accgaccagc ac 42 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA-R primer <400> 13 agtttagcgg ccgcaagctt atcacggttt aaagttaaac 40 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F31b-F primer <400> 14 gctggaccac cgattatnnk acctattatg aagctcatct g 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F31b-R primer <400> 15 cagatgagct tcataatagg tmnnataatc ggtggtccag c 41 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58b-F primer <400> 16 ctgccggtta tccgtnnkgc ttttaaccag cgtatgg 37 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58b-R primer <400> 17 ccatacgctg gttaaaagcm nnacggataa ccggcag 37 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y153b-F primer <400> 18 cgggtatgct ggaacagnnk tttgatatga tcaccgctg 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y153b-R 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cgtgatccga aagctgc 37 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V382b-R primer <400> 27 gcagctttcg gatcacgmnn accatacggg gtgctaa 37 <110> AMICOGEN CO., LTD. <120> A mutant enzyme for the production of cephalosporin antibiotics <130> NP12-0110 <160> 27 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 2079 <212> DNA <213> Wild-type Gl-7-ACA acylase gene of Pseudomonas sp. GK16 <400> 1 atggaaccga ccagcacccc gcaggctccg atcgctgctt ataaaccgcg tagcaacgaa 60 atcctgtggg atggttatgg tgttccgcat atctatggtg ttgacgctcc gagcgctttt 120 tatggttatg gctgggctca ggctcgtagc catggtgata acatcctgcg tctgtatggt 180 gaagctcgtg gtaaaggcgc tgaatattgg ggtccggatt acgaacagac gaccgtttgg 240 ctgctgacca acggtgttcc ggaacgtgct cagcagtggt atgctcagca gagcccggat 300 tttcgtgcta acctggatgc ttttgctgct ggtatcaacg cttatgctca gcagaacccg 360 gatgatatca gcccggaagt tcgtcaggtt ctgccggtta gcggtgctga tgttgttgct 420 catgctcatc gtctgatgaa ctttctgtat gttgctagcc cgggtcgtac cctgggtgaa 480 ggtgatccgc cggatctggc tgatcagggt agcaacagct gggctgttgc tccgggtaaa 540 accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aaccctcatc tgagctggac caccgattat 600 tttacctatt atgaagctca tctggttacc ccggattttg aaatctatgg tgctacccag 660 atcggtctgc cggttatccg ttttgctttt aaccagcgta tgggtatcac caacaccgtt 720 aacggtatgg ttggtgctac caactatcgt ctgaccctgc aggatggtgg ttatctgtat 780 gatggtcagg ttcgtccgtt tgaacgtcgt caggctagct atcgtctgcg tcaggctgat 840 ggtaccaccg ttgataaacc gctggaaatc cgttccagcg ttcatggtcc ggtttttgaa 900 cgtgctgatg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggatcgtcc gggtatgctg 960 gaacagtatt ttgatatgat caccgctgat agctttgatg attatgaagc tgctctggct 1020 cgtatgcagg ttccgacctt taacatcgtt tatgctgatc gtgaaggtac catcaactat 1080 agctttaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttttg gcagggtctg 1140 gttccgggtg atagcagccg ttatctgtgg accgaaaccc atccgctgga tgatctgccg 1200 cgtgttacca acccgccggg tggttttgtt cagaacagca acgatccgcc gtggaccccg 1260 acctggccgg ttacctatac cccgaaagat tttccgagct atctggctcc gcagaccccg 1320 catagcctgc gtgctcagca gagcgttcgt ctgatgagcg aaaacgatga tctgaccctg 1380 gaacgtttta tggctctgca gctgagccat cgtgctgtta tggctgatcg taccctgccg 1440 gatctgatcc cggctgctct gatcgatccg gatccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500 ctggctgcgt gggatcgtga atttaccagc gatagccgtg ctgctctgct gtttgaagaa 1560 tgggctcgtc tgtttgctgg tcagaacttt gctggtcagg ctggctttgc taccccgtgg 1620 agcctggata aaccggttag caccccgtat ggtgttcgtg atccgaaagc tgctgttgat 1680 cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatatg gtgctatcga tcgtccgttt 1740 ggtgatgcta gccgtatgat cctgaacgat gttaacgttc cgggtgctgc tggttatggt 1800 aacctgggta gctttcgtgt ttttacctgg agcgatccgg atgaaacgg tgtgcgtacc 1860 ccggttcatg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattta gcaccccggt tcgtgcttat 1920 ggtctgatga gctatggtaa cagccgtcag ccgggtacca cccattatag cgatcagatc 1980 gaacgtgtta gccgtgctga ttttcgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040 gctgttcagg aacgtacccc gtttaacttt aaaccgtga 2079 <210> 2 <211> 692 <212> PRT <213> Amino acid sequence coded by nucleotide of sequence No.1 <400> 2 Met Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro   1 5 10 15 Arg Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr              20 25 30 Gly Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala          35 40 45 Arg Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly      50 55 60 Lys Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp  65 70 75 80 Leu Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln                  85 90 95 Gln Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile             100 105 110 Asn Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg         115 120 125 Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg     130 135 140 Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu 145 150 155 160 Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val                 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro             180 185 190 His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu         195 200 205 Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro     210 215 220 Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val 225 230 235 240 Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly                 245 250 255 Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala             260 265 270 Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr Thr Val Asp Lys Pro Leu         275 280 285 Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly     290 295 300 Thr Ala Val Ala Val Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu                 325 330 335 Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala             340 345 350 Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys         355 360 365 Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln Gly Leu Val Pro Gly Asp     370 375 380 Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His Pro Leu Asp Asp Leu Pro 385 390 395 400 Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val Gln Asn Ser Asn Asp Pro                 405 410 415 Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr Thr Pro Lys Asp Phe Pro             420 425 430 Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser Leu Arg Ala Gln Gln Ser         435 440 445 Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu Thr Leu Glu Arg Phe Met     450 455 460 Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met Ala Asp Arg Thr Leu Pro 465 470 475 480 Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro Asp Pro Glu Val Gln Ala                 485 490 495 Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg Glu Phe Thr Ser Asp Ser             500 505 510 Arg Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala Arg Leu Phe Ala Gly Gln         515 520 525 Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr Pro Trp Ser Leu Asp Lys     530 535 540 Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp 545 550 555 560 Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys Arg Lys Tyr Gly Ala Ile                 565 570 575 Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met Ile Leu Asn Asp Val Asn             580 585 590 Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Ser Phe Arg Val Phe         595 600 605 Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val Arg Thr Pro Val Gly Gly     610 615 620 Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr 625 630 635 640 Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr                 645 650 655 Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Ser Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu             660 665 670 Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe         675 680 685 Asn Phe Lys Pro     690 <210> 3 <211> 158 <212> PRT <213> Alpha-subunit of wild-type Gl-7-ACA acylase (GA) protien from Pseudomonas sp. GK16 <400> 3 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg   1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly              20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg          35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys      50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu  65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln                  85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn             100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln         115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu     130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 4 <211> 522 <212> PRT <213> Beta-subunit of wild-type Gl-7-ACA acylase (GA) protien from Pseudomonas sp. GK16 <400> 4 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala   1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr              20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Ile Tyr Gly Ala          35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met      50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg  65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro                  85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr             100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val         115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Val Ala Gly Leu     130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr                 165 170 175 Phe Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe             180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln         195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His     210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr                 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser             260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu         275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met     290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg                 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala             340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr         355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Val Arg Asp     370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met                 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu             420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val         435 440 445 Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser     450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Ser Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala                 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val             500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro         515 520 <210> 5 <211> 2079 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of PM2 mutant <400> 5 atggaaccga ccagcacccc gcaggctccg atcgctgctt ataaaccgcg tagcaacgaa 60 atcctgtggg atggttatgg tgttccgcat atctatggtg ttgacgctcc gagcgctttt 120 tatggttatg gctgggctca ggctcgtagc catggtgata acatcctgcg tctgtatggt 180 gaagctcgtg gtaaaggcgc tgaatattgg ggtccggatt acgaacagac gaccgtttgg 240 ctgctgacca acggtgttcc ggaacgtgct cagcagtggt atgctcagca gagcccggat 300 tttcgtgcta acctggatgc ttttgctgct ggtatcaacg cttatgctca gcagaacccg 360 gatgatatca gcccggaagt tcgtcaggtt ctgccggtta gcggtgctga tgttgttgct 420 catgctcatc gtctgatgaa ctttctgtat gttgctagcc cgggtcgtac cctgggtgaa 480 ggtgatccgc cggatctggc tgatcagggt agcaacagct gggctgttgc tccgggtaaa 540 accgctaacg gtaacgctct gctgctgcag aaccctcatc tgagctggac caccgattat 600 tttacctatt atgaagctca tctggttacc ccggattttg aagtgtatgg tgctacccag 660 atcggtctgc cggttatccg tgttgctttt aaccagcgta tgggtatcac caacaccgtt 720 aacggtatgg ttggtgctac caactatcgt ctgaccctgc aggatggtgg ttatctgtat 780 gatggtcagg ttcgtccgtt tgaacgtcgt caggctagct atcgtctgcg tcaggctgat 840 ggtaccaccg ttgataaacc gctggaaatc cgttccagcg ttcatggtcc ggtttttgaa 900 cgtgctgatg gtaccgctgt tgctgttcgt gttgctggtc tggatcgtcc gggtatgctg 960 gaacagactt ttgatatgat caccgctgat agctttgatg attatgaagc tgctctggct 1020 cgtatgcagg ttccgacctt gaacatcgtt tatgctgatc gtgaaggtac catcaactat 1080 agctttaacg gtgttgctcc gaaacgtgct gaaggtgaca tcgctttttg gcagggtctg 1140 gttccgggtg atagcagccg ttatctgtgg accgaaaccc atccgctgga tgatctgccg 1200 cgtgttacca acccgccggg tggttttgtt cagaacagca acgatccgcc gtggaccccg 1260 acctggccgg ttacctatac cccgaaagat tttccgagct atctggctcc gcagaccccg 1320 catagcctgc gtgctcagca gagcgttcgt ctgatgagcg aaaacgatga tctgaccctg 1380 gaacgtttta tggctctgca gctgagccat cgtgctgtta tggctgatcg taccctgccg 1440 gatctgatcc cggctgctct gatcgatccg gatccggaag ttcaggctgc tgctcgtctg 1500 ctggctgcgt gggatcgtga atttaccagc gatagccgtg ctgctctgct gtttgaagaa 1560 tgggctcgtc tgtttgctgg tcagaacttt gctggtcagg ctggctttgc taccccgtgg 1620 agcctggata aaccggttag caccccgtat ggtctgcgtg atccgaaagc tgctgttgat 1680 cagctgcgta ccgctatcgc taacaccaaa cgtaaatatg gtgctatcga tcgtccgttt 1740 ggtgatgcta gccgtatgat cctgaacgat gttaacgttc cgggtgctgc tggttatggt 1800 aacctgggta gctttcgtgt ttttacctgg agcgatccgg atgaaacgg tgtgcgtacc 1860 ccggttcatg gtgaaacctg ggttgctatg atcgaattta gcaccccggt tcgtgcttat 1920 ggtctgatga gctatggtaa cagccgtcag ccgggtacca cccattatag cgatcagatc 1980 gaacgtgtta gccgtgctga ttttcgtgaa ctgctgctgc gtcgtgaaca ggttgaagct 2040 gctgttcagg aacgtacccc gtttaacttt aaaccgtga 2079 <210> 6 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> alpha-subunit of mutant PM2 protein <400> 6 Glu Pro Thr Ser Thr Pro Gln Ala Pro Ile Ala Ala Tyr Lys Pro Arg   1 5 10 15 Ser Asn Glu Ile Leu Trp Asp Gly Tyr Gly Val Pro His Ile Tyr Gly              20 25 30 Val Asp Ala Pro Ser Ala Phe Tyr Gly Tyr Gly Trp Ala Gln Ala Arg          35 40 45 Ser His Gly Asp Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Glu Ala Arg Gly Lys      50 55 60 Gly Ala Glu Tyr Trp Gly Pro Asp Tyr Glu Gln Thr Thr Val Trp Leu  65 70 75 80 Leu Thr Asn Gly Val Pro Glu Arg Ala Gln Gln Trp Tyr Ala Gln Gln                  85 90 95 Ser Pro Asp Phe Arg Ala Asn Leu Asp Ala Phe Ala Ala Gly Ile Asn             100 105 110 Ala Tyr Ala Gln Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg Gln         115 120 125 Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg Leu     130 135 140 Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly 145 150 155 <210> 7 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-subunit of PM2 mutant <400> 7 Ser Asn Ser Trp Ala Val Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala   1 5 10 15 Leu Leu Leu Gln Asn Pro His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr              20 25 30 Tyr Tyr Glu Ala His Leu Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala          35 40 45 Thr Gln Ile Gly Leu Pro Val Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Arg Met      50 55 60 Gly Ile Thr Asn Thr Val Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg  65 70 75 80 Leu Thr Leu Gln Asp Gly Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro                  85 90 95 Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Thr             100 105 110 Thr Val Asp Lys Pro Leu Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val         115 120 125 Phe Glu Arg Ala Asp Gly Thr Ala Val Ala Val Val Ala Gly Leu     130 135 140 Asp Arg Pro Gly Met Leu Glu Gln Thr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ser Phe Asp Asp Tyr Glu Ala Ala Leu Ala Arg Met Gln Val Pro Thr                 165 170 175 Leu Asn Ile Val Tyr Ala Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe             180 185 190 Asn Gly Val Ala Pro Lys Arg Ala Glu Gly Asp Ile Ala Phe Trp Gln         195 200 205 Gly Leu Val Pro Gly Asp Ser Ser Arg Tyr Leu Trp Thr Glu Thr His     210 215 220 Pro Leu Asp Asp Leu Pro Arg Val Thr Asn Pro Pro Gly Gly Phe Val 225 230 235 240 Gln Asn Ser Asn Asp Pro Pro Trp Thr Pro Thr Trp Pro Val Thr Tyr                 245 250 255 Thr Pro Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Leu Ala Pro Gln Thr Pro His Ser             260 265 270 Leu Arg Ala Gln Gln Ser Val Arg Leu Met Ser Glu Asn Asp Asp Leu         275 280 285 Thr Leu Glu Arg Phe Met Ala Leu Gln Leu Ser His Arg Ala Val Met     290 295 300 Ala Asp Arg Thr Leu Pro Asp Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ile Asp Pro 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Gln Ala Ala Ala Arg Leu Leu Ala Ala Trp Asp Arg                 325 330 335 Glu Phe Thr Ser Asp Ser Arg Ala Ala Leu Leu Phe Glu Glu Trp Ala             340 345 350 Arg Leu Phe Ala Gly Gln Asn Phe Ala Gly Gln Ala Gly Phe Ala Thr         355 360 365 Pro Trp Ser Leu Asp Lys Pro Val Ser Thr Pro Tyr Gly Leu Arg Asp     370 375 380 Pro Lys Ala Ala Val Asp Gln Leu Arg Thr Ala Ile Ala Asn Thr Lys 385 390 395 400 Arg Lys Tyr Gly Ala Ile Asp Arg Pro Phe Gly Asp Ala Ser Arg Met                 405 410 415 Ile Leu Asn Asp Val Asn Val Pro Gly Ala Ala Gly Tyr Gly Asn Leu             420 425 430 Gly Ser Phe Arg Val Phe Thr Trp Ser Asp Pro Asp Glu Asn Gly Val         435 440 445 Arg Thr Pro Val His Gly Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser     450 455 460 Thr Pro Val Arg Ala Tyr Gly Leu Met Ser Tyr Gly Asn Ser Ser Gln 465 470 475 480 Pro Gly Thr Thr His Tyr Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala                 485 490 495 Asp Phe Arg Glu Leu Leu Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val             500 505 510 Gln Glu Arg Thr Pro Phe Asn Phe Lys Pro         515 520 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3 primer <400> 8 aattaaccct cactaaaggg a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 primer <400> 9 taatacgact cactataggg 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-F primer <400> 10 cgccagggtt ttcccagtca cga 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13-R primer <400> 11 agcggataac aatttcacac agga 24 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA-F primer <400> 12 attaagtcta gaaggagata tacatatgga accgaccagc ac 42 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GA-R primer <400> 13 agtttagcgg ccgcaagctt atcacggttt aaagttaaac 40 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F31b-F primer <400> 14 gctggaccac cgattatnnk acctattatg aagctcatct g 41 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F31b-R primer <400> 15 cagatgagct tcataatagg tmnnataatc ggtggtccag c 41 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58b-F primer <400> 16 ctgccggtta tccgtnnkgc ttttaaccag cgtatgg 37 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F58b-R primer <400> 17 ccatacgctg gttaaaagcm nnacggataa ccggcag 37 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y153b-F primer <400> 18 cgggtatgct ggaacagnnk tttgatatga tcaccgctg 39 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y153b-R primer <400> 19 cagcggtgat catatcaaam nnctgttcca gcatacccg 39 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F177b-F primer <400> 20 gtatgcaggt tccgaccnnk aacatcgttt atgctgatcg 40 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F177b-R primer <400> 21 cgatcagcat aaacgatgtt mnnggtcgga acctgcatac 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F177bL-F primer <400> 22 gtatgcaggt tccgaccctg aacatcgttt atgctgatcg 40 <210> 23 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F177bL-R primer <400> 23 cgatcagcat aaacgatgtt cagggtcgga acctgcatac 40 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I45b-F primer <400> 24 ggttaccccg gattttgaan nktatggtgc tacccagatc g 41 <210> 25 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I45b-R primer <400> 25 cgatctgggt agcaccatam nnttcaaaat ccggggtaac c 41 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V382b-F primer <400> 26 ttagcacccc gtatggtnnk cgtgatccga aagctgc 37 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V382b-R primer <400> 27 gcagctttcg gatcacgmnn accatacggg gtgctaa 37

Claims (14)

서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 야생형 CPC(Cephalosporin C) 아실라제 서열 중에서, F58β 아미노산이 발린(Valine)으로 치환되고 Y153β 아미노산이 트레오닌(Threonine)으로 치환된 변이 CPC 아실라제.
Among the wild-type Cephalosporin C acylase sequences consisting of the alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, the F58? Amino acid is substituted with Valine Mutated CPC acylase in which the Y153? Amino acid is substituted with threonine.
제1항에 있어서, 상기 변이 CPC 아실라제는 F177βL 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
2. The mutant CPC acylase according to claim 1, wherein the mutant CPC acylase further comprises an F177? L mutation.
제2항에 있어서, 상기 변이 CPC 아실라제는 I45β가 메티오닌(Methionine), 발린(Valine), 알라닌(Alanine), 시스테인(Cysteine) 및 류신(Leucine)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되고, V382β가 류신(Leucine) 또는 이소류신(Isoleucine)으로 치환된 돌연변이를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
The mutant CPC acylase according to claim 2, wherein the mutant CPC acylase is a mutant CPC acylase wherein I45? Is substituted with an amino acid selected from the group consisting of Methionine, Valine, Alanine, Cysteine and Leucine, Wherein the mutant CPC acylase further comprises a mutant substituted with leucine or isoleucine.
삭제delete 제3항에 있어서, 상기 변이 CPC 아실라제는 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 알파-서브유닛과 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 베타-서브유닛으로 구성된 것을 특징으로 하는 변이 CPC 아실라제.
4. The mutant CPC acylase according to claim 3, wherein the mutant CPC acylase comprises an alpha-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 and a beta-subunit represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO:
제1항 내지 제3항 및 제5항 중에서 선택된 어느 한 항의 변이 CPC 아실라제를 암호화하는 유전자.
A gene encoding a mutant CPC acylase according to any one of claims 1 to 3 and 5.
제6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
7. The gene according to claim 6, wherein the gene is represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
제6항의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
A recombinant expression vector comprising the gene of claim 6.
삭제delete 제8항의 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
A host cell transformed by the expression vector of claim 8.
제8항의 발현벡터에 의해 형질전환된 미생물.
A microorganism transformed by the expression vector of claim 8.
제11항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호: KCTC12344BP로 기탁된 Escherichia coli MC1061/pBC-PM2인 것을 특징으로 하는 미생물.
12. The microorganism according to claim 11, wherein the microorganism is Escherichia coli MC1061 / pBC-PM2 deposited with Accession No. KCTC12344BP.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중에서 선택된 어느 한 항의 변이 CPC 아실라제를 포함하는 7-ACA(7-Aminocephalosporanic acid) 제조용 조성물.
A composition for the preparation of 7-ACA (7-Aminocephalosporanic acid) comprising a mutant CPC acylase according to any one of claims 1 to 3 and 5.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중에서 선택된 어느 한 항의 변이 CPC 아실라제를 하기 화학식 1의 화합물 또는 그 염과 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 제조하는 방법.
<화학식 1>
Figure 112016056865113-pat00003

<화학식 2>
Figure 112016056865113-pat00004

[상기 식에서, R은 아세톡시(-OCOCH3), 하이드록시(-OH), 및 수소(-H)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 작용기이다.]The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the mutation of the CPC acylase is reacted with a compound of the formula (1) or a salt thereof to prepare a compound of the formula (2).
&Lt; Formula 1 >
Figure 112016056865113-pat00003

(2)
Figure 112016056865113-pat00004

[Wherein, R is any one of functional groups selected from acetoxy (-OCOCH 3), the group consisting of hydroxy (-OH), and hydrogen (-H).]
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102194740B1 (en) * 2019-09-18 2020-12-23 아미코젠주식회사 Methods for preparing recombinant Acremonium chrysogenum producing deacetoxycephalosporin C with high concentration and Acremonium chrysogenum prepared thereby as bioprocess for 7-ADCA preparation
KR102405289B1 (en) 2021-12-24 2022-06-07 아미코젠주식회사 Polypeptide having cephalosporin c acylase activity and use thereof

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543201B (en) * 2016-02-23 2018-11-20 山西新宝源制药有限公司 A kind of Cephalosporin C acylase mutant
KR101808192B1 (en) * 2016-08-26 2018-01-18 아미코젠주식회사 Methods for preparing recombinant Acremonium chrysogenum producing 7-aminocephalosporanic acid with high concentration and Acremonium chrysogenum prepared thereby
WO2018165881A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 上海星维生物技术有限公司 Cephalosporin c acylase mutants and applications thereof
CN108220276B (en) * 2017-10-30 2021-05-14 南京朗恩生物科技有限公司 Cephalosporin C acylase mutant and application thereof in 7-aminocephalosporanic acid production
CN109913436B (en) * 2017-12-12 2023-05-23 石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司 Cephalosporin C acylase mutant containing one or several point mutations and preparation method thereof
KR101985911B1 (en) * 2017-12-28 2019-06-04 아미코젠주식회사 Mutants of penicillin G acylase from Achromobacter sp. CCM 4824, and uses thereof
CN111172142B (en) * 2020-02-14 2021-09-28 上海陶宇晟生物技术有限责任公司 Cephalosporin C acylase mutant with high thermal stability
CN112662655B (en) * 2020-12-29 2022-05-03 山东金城柯瑞化学有限公司 Cephalosporin C acylase mutant and preparation method and application thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100530299B1 (en) * 2003-08-11 2005-11-22 산도즈 게엠베하 Cephalosporin c acylase mutant and method for preparing 7-aca using same
CN1257269C (en) * 2003-11-17 2006-05-24 清华大学 Method for producing 7-amino cephalosporanic acid and its specific recombinase
CN101240285B (en) * 2008-03-19 2010-06-02 清华大学 Cephalosporin C acrylase and its vector and application

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Struct Biol., Vol. 131, No. 1, pp. 79-81 (2000.07.)*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102194740B1 (en) * 2019-09-18 2020-12-23 아미코젠주식회사 Methods for preparing recombinant Acremonium chrysogenum producing deacetoxycephalosporin C with high concentration and Acremonium chrysogenum prepared thereby as bioprocess for 7-ADCA preparation
WO2021054545A1 (en) * 2019-09-18 2021-03-25 아미코젠주식회사 Method for preparing recombinant acremonium chrysogenum strain producing high concentration of deacetoxycephalosproin c for preparation of 7-adca, and strain prepared by same method
KR102405289B1 (en) 2021-12-24 2022-06-07 아미코젠주식회사 Polypeptide having cephalosporin c acylase activity and use thereof

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