JP2004024199A

JP2004024199A - Protein having mannose isomerase activity and polynucleotide encoding the same

Info

Publication number: JP2004024199A
Application number: JP2002189709A
Authority: JP
Inventors: Takafumi Harumi; 春　見　隆　文; Sumiko Mori; 森　　　澄　子; Kiyoshi Hayashi; 林　　　　　清; Uichi Sato; 佐　藤　右　一; Satoshi Hanamura; 花　村　　　聡; Koji Nishizawa; 西　沢　耕　治
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Food Research Institute
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Food Research Institute
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-01-29

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a mannose isomerase having excellent activity. <P>SOLUTION: There is provided a protein derived from microorganisms of the genus Thermobifida and having mannose isomerase activity and a polynucleotide encoding the protein. Mannose isomerase can be produced at a low cost by the use of the polynucleotide. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、マンノースイソメラーゼ活性を有する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を用いたマンノース製造方法に関する。
【０００２】
背景技術
マンノースイソメラーゼは、Ｄ−フルクトースとＤ−マンノースとを相互に変換する活性を有するタンパク質である。
マンノースイソメラーゼを生産する菌株としてはこれまでに、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（特開２０００−３１６５７２号公報、国際公開第ＷＯ００／６６７１９号）、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属（特開平１１−７５８３６号公報）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属（特開平８−９９８６号公報）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（特許３００３００９号公報）、およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属（発酵研究所報告　２８，８９−９４，１９６５）などが知られている。これらの菌に関する前記文献には、得られたマンノースイソメラーゼやその粗酵素液等を使用して、フルクトースからマンノースを生産する方法は開示されているが、マンノースイソメラーゼ酵素のアミノ酸配列は開示されておらず、また該酵素をコードするポリヌクレオチドの解析も行われていない。
【０００３】
この他のマンノースイソメラーゼを生産する菌株としては、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）（国際公開第ＷＯ０１／２５４４３）およびエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）（国際公開第ＷＯ００／６５０７２）が知られている。これらの菌に関する前記文献では、マンノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドが単離されており、その配列も開示されている。
【０００４】
マンノースは、多糖（例えばマンナンなどのホモ多糖）として植物界に広く分布しているものであるが、最近では、鶏へのサルモネラ菌の感染を阻害することが知られている（Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　６８，１３５７，１９８９）。このため、鶏などの家禽または家畜への飼料添加物や、機能性食品素材として、マンノースの利用が検討されている。
【０００５】
現在までのところ、前記した文献に記載のマンノースイソメラーゼを利用したマンノース製造方法は、工業的レベルでの実用化には至っていない。これは、マンノースイソメラーゼ生産菌株における酵素の生産性が低いためであると推定される。
一般的に、菌株における生産性が低い酵素を工業的に用いるには、部分精製によって酵素比活性を高める必要がある。しかしながら、その操作に要する経費は少なくないため、最終製品のコストが増大することとなる。工業的な規模でのマンノースイソメラーゼを利用したマンノース生産には、マンノースイソメラーゼ生産菌の酵素生産性を向上させることが望まれる。
【０００６】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、土壌より採取され、工業的利用に適した特性を持つマンノースイソメラーゼを生産する特定の菌が、優れたマンノースイソメラーゼ活性を有する酵素を有することを見いだした。そしてこの酵素を単離し、その遺伝子を特定することにも本発明者らは成功した。このような情報に基づいて遺伝子工学的手法を用いることによって、ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤やＵＶ照射を使用した酵素高生産変異株を取得する方法よりも確実に、酵素の生産性を向上させることができた。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００７】
したがって、本発明は、マンノースイソメラーゼ活性を有する新規なタンパク質、該タンパク質をコードするポリヌクレオチド、該タンパク質の製造方法、および該タンパク質を用いたマンノース製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の一つの態様によるタンパク質は、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌由来であって、以下の（Ａ）および（Ｂ）の特性を有するものである：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００である。
【０００９】
本発明の別の態様によるタンパク質は、以下の（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の特性を有するものである：
（Ａ）　マンノースイソメラーゼ活性を有し、
（Ｂ）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した平均分子量が約４１０００であり、
（Ｃ）　Ｎ末端のアミノ酸配列が配列番号３で示される配列である。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によるタンパク質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）　前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質、
（ｃ）　前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質。
【００１１】
また本発明の好ましい態様によれば、これらのタンパク質はサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３（受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）株由来である。
【００１２】
本発明によれば、該タンパク質の遺伝子も提供される。ここでこの遺伝子は、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明によるポリヌクレオチドは、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）　配列番号２に示される塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有する塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明による発現ベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるものである。
本発明による宿主は、本発明による発現ベクターにより形質転換されたものである。
【００１５】
本発明による目的タンパク質の製造方法は、前記の形質転換された宿主を培養し、得られる培養物からマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる。
【００１６】
本発明によるマンノースの製造方法は、前記したタンパク質、および前記製造方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質、または本発明による酵素調製物を用いて、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換することを含んでなる。
【００１７】
本発明によれば、高活性なマンノースイソメラーゼを得ることができる。
また、本発明のマンノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドにヒスチジンタグ等を付加することによって、遺伝子組換体からの高純度なマンノースイソメラーゼの精製を容易にすることも期待できる。さらに、例えば、本発明による高純度なマンノースイソメラーゼを固定化担体等に固定化した調製物を使用することによって、バッチ法での酵素回収が容易となって再利用も可能となるので、マンノース生産の生産コストを低減することも期待される。
このように、本発明によれば、マンノースイソメラーゼを安価で大量に製造することができ、またそれにより得られるマンノースイソメラーゼを用いることによって、マンノースの大量かつ効率的な製造が可能となる。
【００１８】
【発明の具体的説明】
微生物の寄託
サーモビフィダ・エスピーＭＢＬ１０００３株（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．　ＭＢＬ１０００３）は、平成９（１９９７）年５月２日（原寄託日）付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−５４６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に寄託された。受託番号は、ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２である。なお、サーモビフィダ属は、近年サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）属の再分類化により付与された分類である。
【００１９】
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
前記したように、本発明の一つの態様によれば、本発明のタンパク質は、マンノースイソメラーゼ活性を有する。
【００２０】
本発明において、「マンノースイソメラーゼ活性を有する」とは、当業者によりマンノースイソメラーゼ活性が認められたと評価される場合をいい、例えば、後述する実施例の「マンノースイソメラーゼ活性の測定」の項と同様の条件において測定した場合にマンノースイソメラーゼ活性が認められたと評価される場合を意味するものとする。
【００２１】
本発明において、「マンノースイソメラーゼ活性」とは、Ｄ−フルクトースとＤ−マンノースを相互に変換する活性のことをいい、すなわち、Ｄ−フルクトースをＤ−マンノースに変換する活性と、Ｄ−マンノースをＤ−フルクトースに変換する活性との双方を示すことをいう。このとき例えば、Ｄ−マンノースをＤ−フルクトースに変換する活性が高い場合には、もう一方のＤ−フルクトースをＤ−マンノースに変換する活性も高いものと理解される。
【００２２】
また、「相互に変換する」とは、例えば水溶液中にマンノースがフルクトースに比べて過剰にある場合、またはフルクトースがマンノースに比べて過剰にある場合に、マンノースイソメラーゼが働くと、水溶液中のマンノースとフルクトースとが所定の平衡状態の量になるまでそれぞれを変換することをいう。そのような平衡状態は、例えば、溶液の温度が５０℃で、ｐＨが７である場合、液中のマンノース：フルクトースの濃度比が２５：７５となる状態である。
【００２３】
また本発明の一つの態様によるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により測定したその平均分子量が約４１０００である。ここで、この分子量は、慣用の方法を適用することにより当業者であれば容易に測定することができる。
【００２４】
本発明によるタンパク質は、典型的には、そのＮ末端のアミノ酸配列が配列番号３で示される配列である。
【００２５】
本発明によるタンパク質は、典型的には、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の放線菌由来のものであり、好ましくはサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）、より好ましくはサーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）由来のものである。またこれらは、その変異株であってもよい。
【００２６】
本発明によるタンパク質は、例えば、サーモビフィダ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ）属の菌の培養液からイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、および／またはゲルクロマトグラフィーを種々組み合わせて単離および精製を行うことによって得ることができる。具体的には、例えば、実施例の例１〜２に記載の方法に従って単離して得ることができる。
【００２７】
本発明によるタンパク質は、好ましくはその至適ｐＨが７〜１０の範囲であり、および／またはその至適温度が５０〜６０℃の範囲である。
【００２８】
前記したように、本発明の別の態様によれば、タンパク質は、下記からなる群より選択されるものである：
（ａ）　配列番号１に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、
（ｂ）　前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質、
（ｃ）　前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質と少なくとも６０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有する、タンパク質。
【００２９】
前記（ａ）のアミノ酸配列において、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよいアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個、最も好ましくは１個である。
【００３０】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記（ｂ）のタンパク質は、前記（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸残基が、保存的置換されたアミノ酸配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質である。
【００３１】
ここで「保存的置換」とは、タンパク質の活性を実質的に改変しないように、１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような保存的置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。
極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００３２】
本発明の別の好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質と、前記（ａ）のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質との間の相同性は、少なくとも６０％であり、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９８％である。
なお、本明細書において示したこの相同性の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、本発明によるタンパク質は、例えば下記のようにして得ることもできる。
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を含む生物を培養し、その培養液からマンノースイソメラーゼ活性を指標に、慣用の方法を適用して、該活性を有するタンパク質を単離して、精製する。得られた精製タンパク質のアミノ酸配列を既知の方法により解析して、これをコードするオリゴヌクレオチドの全部または一部を合成して、該生物のゲノムＤＮＡをテンペレートにＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い長鎖プローブを合成する。このプローブを用いてＰＣＲ、インバースＰＣＲ、またはＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　Ｅｎｄｓ）法等を用いてマンノースイソメラーゼ酵素の翻訳領域の塩基配列を解析する。このようにして得られたマンノースイソメラーゼ酵素の翻訳領域を、発現に用いる宿主内で機能する制御配列に連結して、発現ベクターを得る。この発現ベクターを用いて、該宿主を形質転換して、この形質転換体を培養することによって、マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を効率的に得ることができる。
【００３４】
マンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド本発明によるポリヌクレオチドは、前記したタンパク質をコードしてなるものである。
本発明によるポリヌクレオチドは、典型的には、前記したように、下記からなる群より選択されるものである：
（ｉ）　配列番号２に示される塩基配列を含んでなる、ポリヌクレオチド、
（ｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入もしくは付加された塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、
（ｉｉｉ）　前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドと少なくとも６０％の相同性を有する塩基配列を含んでなり、かつマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００３５】
前記（ｉ）の塩基配列において、欠失、置換、挿入もしくは付加されてもよい塩基の数は、好ましくは１〜１２０個、より好ましくは１〜２４個、さらに好ましくは１〜１２個、最も好ましくは１〜３個である。
【００３６】
本発明のより好ましい態様によれば、該ポリヌクレオチドと、前記（ｉ）の塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドとの間の相同性は、少なくとも６０％であり、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９８％である。
【００３７】
前記（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドのような改変型の配列を有するポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発法やＰＣＲ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，　ｖｏｌ．１０，　ｐｐ６４８７　（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，　１００，　ｐｐ４４８　（１９８３）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ２ｎｄ　Ｅｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）、ＰＣＲ　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ２００　（１９９１））等の既知の方法を適用することにより、当業者が容易に作成することができる。このようにして得られたポリヌクレオチドが、所望の活性を有するか否かは、当業者に周知の方法を適用して、タンパク質を発現させ、これに例えば後述する実施例に記載の方法を適用することによって容易に判定できる。
【００３８】
本発明によるポリヌクレオチドは、例えば下記のようにして得ることができる。マンノースイソメラーゼ酵素生産菌の染色体ＤＮＡをテンプレートとして用いて、配列番号１に示されるマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列の一部または全部に対応する塩基配列を合成し、これによって得られたプライマーを使用してＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施する。得られたＰＣＲ増幅断片からの情報を解析することによって本発明によるポリヌクレオチドを得ることができる。このとき、マンノースイソメラーゼ生産菌としては特に限定されないが、好ましくはサーモビフィダ属の菌、より好ましくはサーモビフィダ・エスピー、最も好ましくはサーモビフィダ・エスピーＭＢＬ１０００３株を用いることができる。本発明によるポリヌクレオチドを得る上では、ＰＣＲの反応条件の設定が重要となるが、具体的には、例えば後述する実施例の例４に記載の方法が挙げられる。
また、本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列を利用し、慣用の方法を適用して化学的に合成することによって得てもよい。
【００３９】
発現ベクターおよび宿主
本発明によれば、前記したポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが提供される。本発明による発現ベクターは、宿主細胞内において複製可能で、かつ、本発明のマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を発現可能な状態で、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるものである。
本発明による発現ベクターの構築の手順および方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４０】
本発明において使用できる発現ベクターとしては、宿主染色体ＤＮＡに組込まれるものや、自己複製可能な自律的複製配列を有するベクターを宿主細胞内でプラスミド状態で存在させるものが挙げられる。例えば、ｐＵＣ系（ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳ＋等）、およびｐＢＲ３２２等のプラスミドが挙げられる。宿主細胞内に存在するポリヌクレオチドのコピー数は、１コピーでも複数であっても良い。
【００４１】
本発明による発現ベクターは、これを宿主に導入して本発明のタンパク質を発現させるために、本発明のポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換体を選択するための遺伝子マーカー等をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
発現を制御するＤＮＡ配列としては、宿主で機能する制御配列であれば特に制限はなく、例えばプロモーター、ターミネーター、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等が含まれる。
制御配列への連結は、例えば、常法に従い、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（目的遺伝子）の翻訳領域をプロモーターの下流に順方向に挿入することによって行うことができる。この場合、目的遺伝子を他のタンパク質の翻訳領域をコードする外来遺伝子と連結させて融合タンパク質として発現させることもできる。
【００４３】
遺伝子マーカーとしては、形質転換体の選択手法に応じて適宜選択できる。例えば、薬剤耐性をコードする遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、デストマイシン、ベノミル、オリゴマイシン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ビアラフォス、ブラストサイジンＳ、フレオマイシン、フォスフィノスリシン、アンピシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン等の薬剤に対する遺伝子が挙げられる。栄養要求性を相補する遺伝子としては、例えば、ａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤ、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３等の遺伝子が挙げられる。
【００４４】
これらのＤＮＡ配列および遺伝子マーカーは、本発明による発現ベクター中にそれぞれが機能し得る形で連結される。
【００４５】
本発明によれば、前記発現ベクターにより形質転換された宿主が提供される。本発明において使用する宿主−ベクター系はマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを正しく転写および翻訳することができるものであれば特に限定されず、例えば宿主として大腸菌、放線菌、糸状菌等の微生物を用いる系が挙げられる。好ましくは大腸菌を用いる系が挙げられる。
本発明の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、遺伝子工学の分野で慣用されている方法に従って実施することができる。そのような方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リチウム法または塩化カルシウム法等が挙げられ、宿主にとって効率の良い手法が選択される。
【００４６】
形質転換体（形質転換された宿主）の培養は、常法に従って、培地、培養条件等を適宜選択することにより行うことができ、典型的には、形質転換体の培地および培養条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。
【００４７】
タンパク質の製造方法
本発明によれば、前記したように、前記の形質転換された宿主を培養し、得られる宿主を含む培養物からマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含んでなる目的タンパク質の製造方法が提供される。
培養物から目的タンパク質の取得は、当該技術分野において慣用されている方法にしたがって行うことができ、例えば、培養物からの抽出（磨砕処理、加圧破砕等）、回収（ろ過、遠心分離等）、および／または精製（塩析法、溶媒沈殿法等）等の手段を適宜組みあわせて行うことができる。また、これらの過程において、必要に応じてフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ベンズアミジンまたはロイペプチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
【００４８】
マンノースイソメラーゼ酵素調製物
本発明によればまた、マンノースイソメラーゼ酵素調製物が提供される。このマンノースイソメラーゼ酵素調製物は、前記したマンノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質を少なくとも１種含んでなるものであり、必要に応じて、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、防腐剤等をさらに含んでなるものである。
このマンノースイソメラーゼ酵素調製物の形態は、特に制限はなく、粉末状であっても液体状であってもよい。例えば、粉剤、粒剤、顆粒剤、非粉塵化顆粒、液体製剤等の形態をとっていてもよい。また、マンノースイソメラーゼ酵素調製物は、本発明によるタンパク質を市販の陽イオンまたは陰イオン交換樹脂または吸着樹脂に固定化した固定化酵素の形態であってもよい。
【００４９】
マンノースの製造方法
本発明によれば、前記したように、前記したタンパク質、および前記製造方法により生産されたタンパク質からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質を用いて、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換することを含んでなる、マンノースの製造方法が提供される。
【００５０】
該方法において、フルクトース含有液に該タンパク質を用いて、タンパク質をフルクトースに作用させる場合の反応条件は、適宜選択することができる。例えば、反応液温は、一般的には２５〜７０℃であり、好ましくは３０〜６０℃である。また、反応ｐＨは、一般的にはｐＨ５〜１１であり、好ましくは６〜１０である。反応時間は、使用する酵素量や基質濃度に依存するため、それらに応じて適宜設定することができるが、３〜４８時間の間に設定するのが好ましい。
該方法において、フルクトース含有液は、フルクトースを１０％（Ｗ／Ｖ）以上含んでなることが望ましく、通常は、反応に用いたフルクトースの約２５％（Ｗ／Ｗ）がマンノースに異性化される。
【００５１】
本発明の好ましい態様によれば、この製造方法は、フルクトース含有液中のフルクトースをマンノースに変換させて得られるマンノース含有液から、マンノースを分離し、必要に応じて精製することをさらに含んでなる。
【００５２】
酵素反応により得られたマンノース含有液からのマンノースの分離回収は、慣用の方法を適用することにより実施可能である。例えば、濾過や遠心分離等により不純物を取り除いた後、イオン交換樹脂や活性炭カラム等によるクロマトグラフィーによってマンノースを精製することができる。効率的な精製を行うために、クロマトグラフィー装置として好ましくは擬似移動層クロマトグラフィー装置を用いてもよい。イオン交換樹脂は、好ましくは強酸性陽イオン交換樹脂を当業者で慣用の方法によりＣａ型として使用することができる。
【００５３】
さらに、得られたマンノースに対しては、慣用の方法、例えば減圧濃縮や膜濃縮等によって濃縮し、アルコールや水系での晶析を行うことができる。得られた結晶を遠心分離や濾過等で回収することにより、高純度のマンノース結晶を得ることができる。
【００５４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５５】
マンノースイソメラーゼ活性の測定
マンノースイソメラーゼ活性の測定は、以下に示す方法に従って行った。
基質液（０．２Ｍマンノース−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液）１ｍｌと酵素液１ｍｌを５０℃で３０分間反応させ、ここに０．５Ｍ過塩素酸２ｍｌを加えて酵素を失活させた後、遠心分離（３，０００ｒ．ｐ．ｍ．、１０分間）して反応液上清を得た。得られた該上清中の生成フルクトース量を、システイン−カルバゾール硫酸法（「生物化学実験法１−還元糖の定量法」、第７０〜７２頁、福井作蔵著、学会出版センター）に従って測定し、これにより、マンノースイソメラーゼ活性を決定した。
【００５６】
なおここで、被検タンパク質とマンノースを一定時間インキュベーションした後に生成されるフルクトースを測定した場合に、１分間に１μＭのフルクトースを生成する酵素量は１単位（１Ｕ）と定義する。
【００５７】
例１：　３０Ｌジャーによるマンノースイソメラーゼ生産菌の培養
サーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−７６３２）を、下記構成成分からなる寒天培地ａを用いて調製したスラント上において、５０℃、７２時間培養した。
寒天培地ａの構成成分：
グルコース０．５％（Ｗ／Ｖ）、マンノース１．０％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．４％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプトン０．１％（Ｗ／Ｖ）、リン酸水素２カリウム０．２％（Ｗ／Ｖ）、硝酸アンモニウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（Ｗ／Ｖ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）０．５％（Ｗ／Ｖ）、炭酸ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、および寒天２．０％（Ｗ／Ｖ）。
【００５８】
培養された菌体１エーゼを、前記の寒天培地ａから寒天を除いた液体培地ａ３０ｍｌを入れた２５０ｍｌ容バッフルつき三角フラスコに植菌し、これを、５０℃、４８時間で振とう培養した。
得られた培養液を、下記構成成分からなる液体培地ｂを３００ｍｌ入れた１Ｌ容三角フラスコ中に２％（Ｖ／Ｖ）添加し、これを５０℃で４８時間培養した。
液体培地ｂの構成成分：
マンノース１．０％（Ｗ／Ｖ）、グルコース０．５％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．４％（Ｗ／Ｖ）、ポリペプトン０．１％（Ｗ／Ｖ）、硝酸アンモニウム０．５％（Ｗ／Ｖ）、リン酸水素２カリウム０．２％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ポテトデキストロースブロス１．０％（Ｗ／Ｖ）、カルボキシメチルセルロース０．５％（Ｗ／Ｖ）、および炭酸ナトリウム０．５％（Ｗ／Ｖ）。
【００５９】
得られた培養液をさらに、前記液体培地ｂを１５Ｌ入れた３０Ｌ容培養槽中に２％（Ｖ／Ｖ）添加し、これを５０℃で４８時間培養した。
得られた培養液を遠心分離（９０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間）して菌体を回収した。
該菌体は凍結乾燥法によって乾燥し、凍結乾燥菌体３００ｇが得られた。
【００６０】
例２：　マンノースイソメラーゼの単離および精製
例２−１：菌体からのマンノースイソメラーゼ抽出
例１で得られた凍結乾燥菌体３００ｇを、菌体重量の１０倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した後、超音波処理によって菌体を破砕した。この超音波処理液を遠心分離して沈澱を除き、得られた上澄み液を０．４５μｍメンブランフィルターにて濾過し、さらに分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて液量が１／１０になるまで濃縮した。
この濃縮液を粗酵素液としてさらなる精製処理に用いた。
【００６１】
例２−２：陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ）による精製
得られた粗酵素液３００ｍｌを、８０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌと混合し、ｐＨ７．０に調整した。陰イオン交換カラムＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（アマシャムファルマシア社製、１０ｃｍ×１５ｃｍ）に、調整した前記粗酵素液（８００ｍｌ）を供し、樹脂に粗酵素液中のタンパク質を吸着させた。
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のＮａＣｌ濃度を段階的に０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍと増加させた溶離液を順次用いて、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度が０．３Ｍである場合において、その溶出ピークで検出された。このピークを回収し、分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて濃縮し脱塩した。
【００６２】
例２−３：疎水クロマトグラフィー（カラム：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＩＳＯ）による精製
例２−２で得られたＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ溶出画分３００ｍｌに、最終濃度が１Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、疎水クロマトカラムＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＩＳＯ（アマシャムファルマシア社製、３０ｍｍ×１５ｃｍ）に全量を供して、前記液中のタンパク質を吸着させた。次いで、１Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を溶離液として流して、カラムから非吸着タンパク質を除いた。
吸着タンパク質は脱イオン水を流すことにより溶出させた。マンノースイソメラーゼ活性は、脱イオン水溶出画分に検出された。
【００６３】
例２−４：疎水クロマトグラフィー（カラム：Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ＰＨＥ）による精製
例２−３で得られた脱イオン水溶出画分３００ｍｌに、最終濃度が１Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、疎水クロマトカラムＲＥＳＯＵＲＣＥ　ＰＨＥ（アマシャムファルマシア社製、３０ｍｍ×１５ｃｍ）に全量を供して、液中のタンパク質を吸着させた。溶離液において、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中の硫酸アンモニウム濃度を連続的に減少させることによって、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性を有する画分は、溶出液中の硫酸アンモニウム濃度が０．１５Ｍ〜０Ｍであるときに溶出された。溶出液は分画分子量１万のＵＦ膜（ミリポア社製、Ｂｉｏｍａｘ）にて濃縮して脱塩を行い、４４．５ｍｇのタンパク質を得た。タンパク質濃度は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質とした検量線から、Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓｅｙ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）によって求めた。
【００６４】
例２−５：陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：ＤＥＡＥ−ＣＯＳＭＯｇｅｌ）による精製
例２−４で得られた濃縮液１ｍｌを、陰イオン交換クロマトカラムＣＯＳＭＯＧＥＬ−ＤＥＡＥ（ナカライテスク，８ｍｍ×０．７５ｃｍ）に供して、液中のタンパク質を吸着させた。溶離液において、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中のＮａＣｌ濃度を連続的に増加させることによって、吸着タンパク質を溶出させた。
マンノースイソメラーゼ活性を有する画分は、溶出液中のＮａＣｌ濃度が０．１５Ｍ付近であるときに溶出された。
【００６５】
例２−６：ゲルクロマトグラフィー（カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ）による精製
例２−５で得られた溶出液０．７ｍｌを、ゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０）に供し、該液中のタンパク質を吸着させた。０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液を溶離液とし、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎで該ゲルカラムに流した。溶出されたマンノースイソメラーゼ活性画分について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、目的タンパク質を特定した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ラピダス・ミニスラブ電気泳動槽　ＡＥ−６５３０Ｍ／ＡＥ−６５３０Ｐ（ＡＴＴＯ社製）を用いて実施し、１０％アクリルアミドゲルおよび泳動用バッファーは前記の製品取扱説明書を参照して調製した。なお、分子量スタンダードは、１０ｋＤａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｄｄｅｒ（商品名：ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ^Ｒ、ＬＩＦＥ　ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いた。
得られたマンノースイソメラーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル上で単一バンドにまで精製され、４１０００の平均分子量を示していた。
【００６６】
例３：　マンノースイソメラーゼのＮ末端と消化断片のアミノ酸配列解析
例２で精製されたマンノースイソメラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のバンドをＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にブロッティングし、ペプチドシークエンサー（１００５Ａ、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　Ｃｏ．）にかけてＮ末端アミノ酸２９配列（配列番号３）を解析した。配列は以下に示したとおりであった。
ＴＬＷＴＡＲＡＡＨＲＡＷＬＤＡＥＡＲＲＬＶＤＦＡＡＡＡＤＨ（配列番号３）
【００６７】
また、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２５２，１１０２−１１０６，１９７７）にしたがってゲル上でＥｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｇｌｕ−Ｃにより消化した断片も同様の方法でブロッティングし、ペプチドシークエンサーにかけてアミノ酸１６配列（配列番号４）を解析した。配列は以下に示したとおりであった。
ＳＷＤＡＡＷＨＡＤＥＰＹＲＧＡＮ　（配列番号４）
【００６８】
例４：　マンノースイソメラーゼ遺伝子のクローニング
例４−１：マンノースイソメラーゼの部分塩基配列の決定
本発明によるマンノースイソメラーゼは、放線菌由来でありＧＣ含量が高い（７０％以上）ため、通常のＰＣＲ法では増幅された遺伝子断片を得ることができなかった。そこで、プライマーのデザイン、温度条件、ポリメラーゼ等のような細部にわたって条件の検討を行った。以下に、部分塩基配列の決定に用いた条件を示した。
【００６９】
マンノースイソメラーゼのＮ末端および消化断片のアミノ酸配列からコドン縮重の少ない領域を選び出し、フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号５）とリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）（配列番号６）をデザインして、化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−　ＩＧＣＩＭＧＩＧＣＩＧＣＩＣＡＹＭＧＩＧＣＮＴＧＧ　−３’（配列番号５）
リハ゛ースフ゜ライマー　：５’−　ＣＩＣＫＲＴＡＩＧＧＹＴＣＲＴＣＩＧＣＲＴＧＣＣＡ　−３’（配列番号６）
【００７０】
例１の寒天培地ａから寒天を除いた液体培地ａ　３０ｍｌで、サーモビフィダ・エスピー（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｓｐ．）ＭＢＬ１０００３株を、５０℃で４８時間培養し、放線菌ゲノム抽出法（Ｈｕｎｔｅｒらの方法、Ｉ．Ｓ．　Ｈｕｎｔｅｒ（１９８５），　Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ．　Ｉｎ　Ｇｌｏｖｅｒ　Ｄ．Ｍ．（ｅｄ）　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｖｏｌ．１．Ａ，　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ．　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，　ＤＣ，　ｐｐ１９−４４）によってゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号５および配列番号６に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、４５３ｂｐのマンノースイソメラーゼ遺伝子断片を得た。該ＰＣＲの条件は表１に示されるとおりであった。
【００７１】
【表１】

【００７２】
得られた遺伝子断片を、ＴＯＰＯＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み込み、このベクターをエレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０株に取り込ませた。この株を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で培養を行なった。
生育したコロニーのうち白色あるいは薄青色を選び出し、定法にてプラスミドを単離した。
さらに、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　ＢｉｇＤｙｅ　ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（パーキンエルマー社製）を用いて、ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３１０　Ｇｎｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ，　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．）にてＤＮＡ塩基配列を解読した。
【００７３】
得られた塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られた２つのアミノ酸配列と一致し、マンノースイソメラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。得られたマンノースイソメラーゼ遺伝子断片のＤＮＡ塩基配列は、以下に示されるとおりであった。
ＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＧＧＴＴＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＴＧＡＣＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＧＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＧＣＧＧＣＡＣＧＧＴＣＧＣＣＧＡＣＴＣＧＣＧＣＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＧＴＴＣＧＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣＣＧＴＧＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＧＡＡＣＴＣＣＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＣＣＧＣＧ　（配列番号７）
【００７４】
例４−２：マンノースイソメラーゼの５’および３’側未知領域の塩基配列の決定
例４−１と同様に、マンノースイソメラーゼはＧＣ含量が高いため、通常のＰＣＲ条件では目的物を得ることができなかった。そこで、前記と同様にプライマーのデザイン、温度条件、ポリメラーゼ等のような細部にわたって条件の検討を行った。以下に５’および３’側未知領域の塩基配列の決定に用いた条件を示した。
【００７５】
５’および３’側未知領域の塩基配列の解析を目的としてＴＡＩＬ−ＰＣＲ法（ｔｈｅｒｍａｌ　ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ　ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ−ＰＣＲ）（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　，８（３），４５７−４６３，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２５，６７４−６８１，１９９５）を実施するために、例４−１で得られたマンノースイソメラーゼ遺伝子の遺伝子断片４５３ｂｐの塩基配列（配列番号７）より、以下の６個のプライマー（ｌｏｎｇ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ：配列番号８〜１３）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー１：５’−　ＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴ　−３’（配列番号８）
フォワート゛フ゜ライマー２：５’−　ＧＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＣ　−３’（配列番号９）
フォワート゛フ゜ライマー３：５’−　ＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴ　−３’（配列番号１０）
リハ゛ースフ゜ライマー１　：５’−　ＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＣＴ　−３’（配列番号１１）
リハ゛ースフ゜ライマー２　：５’−　ＣＧＧＣＣＡＣＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＣＡＧＧＴ　−３’（配列番号１２）
リハ゛ースフ゜ライマー３　：５’−　ＧＧＧＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＡＡＧＴ　−３’（配列番号１３）
【００７６】
また、未知領域に特異的に結合する３個の混合プライマー（ｓｈｏｒｔ　ａｒｂｉｔｒａｒｙ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ）を化学合成した。
混合プライマー１：５’−　ＴＣＴＮＴＧＮＡＷＣＴＮＣＡＣＷ　−３’（配列番号１４）
混合プライマー２：５’−　ＮＧＴＣＧＡＳＷＧＡＮＡＷＧＡＡ　−３’（配列番号１５）
混合プライマー３：５’−　ＧＴＮＣＧＡＳＷＣＡＮＡＷＧＴＴ　−３’（配列番号１６）
【００７７】
次に、５’側未知領域の塩基配列を解析するため、例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、リバースプライマー１（配列番号１１）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとし、リバースプライマー２（配列番号１２）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとし、リバースプライマー３（配列番号１３）と混合プライマー１（配列番号１４）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−１）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（２２７ｂｐ：配列番号１７）を解読した。
【００７８】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られたＮ末端側アミノ酸配列（配列番号３）が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の５’上流部分であることが判明した。以下に、得られた５’上流部分の塩基配列を示した。
ＧＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＴＡＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＴＣＮＣＡＣＣＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＧＧＣＧＴＴＴＣＡＣＡＣＧＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＧＧＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＴＧＧ　（配列番号１７）
【００７９】
次に、３’側未知領域の塩基配列を解析するため、例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマー１（配列番号８）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー２（配列番号９）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー３（配列番号１０）と混合プライマー２（配列番号１５）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−２）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（５８６ｂｐ：配列番号１８）を解読した。
【００８０】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、例３で得られた消化断片のアミノ酸配列（配列番号４）の一部が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の３’下流部分であることが判明した。以下に、得られた３’下流部分の塩基配列を示した。
ＧＣＣＧＣＧＴＧＧＣＡＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＡＣＣＧＣＧＧＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＣＧＴＧＣＧＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＣＧＣＣＣＣＧＣＧＡＣＴＧＧＣＧＡＣＴＣＣＣＣＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＴＣＧＴＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＧＣＧＣＣＣＡＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴＧＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＡＣＧＣＧＧＣＴＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＧＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＧＣＴＣＣＣＧＧＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡ　（配列番号１８）
【００８１】
配列番号１８の塩基配列には終止コドンが含まれていなかった。そこで、さらに３’側未知領域の塩基配列を解析するためＴＡＩＬ−ＰＣＲを続けた。
まず、配列番号１８の塩基配列からフォワードプライマー４（配列番号１９）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー４：５’−　ＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣ　−３’（配列番号１９）
【００８２】
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、フォワードプライマー１（配列番号８）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。続いて、１回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとして、フォワードプライマー２（配列番号９）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲを行った。さらに、２回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ産物をテンプレートとしてフォワードプライマー４（配列番号１９）と混合プライマー３（配列番号１６）を用いて３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ（条件：３回目のＴＡＩＬ−ＰＣＲ−２）を行い、増幅したＤＮＡ断片の塩基配列（３５４ｂｐ：配列番号２０）を解読した。
【００８３】
この塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先のＴＡＩＬ−ＰＣＲで得られた塩基配列（配列番号１８）にコードされるアミノ酸配列の一部（配列番号１における３３１〜３５７番目のアミノ酸）および終止コドン（ＴＧＡ）が存在していた。このことから、マンノースイソメラーゼ遺伝子の３’下流部分であることが判明した。以下に、終止コドンを含む３’下流部分の塩基配列を示した。
ＧＴＡＣＴＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＣＣＣＧＡＣＧＴＴＴＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＧＣＧＡＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧＧＣＧＣＴＣＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＣＧＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＣＧＡＧＧＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＣＴＧＴＧＧＴＣＣＧＮＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＣＴＣＧＧＣＣＣＧ　（配列番号２０）
【００８４】
なお、ここでおこなったＴＡＩＬ−ＰＣＲの条件（Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　，８（３），４５７−４６３，１９９５，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２５，６７４−６８１，１９９５の方法を改変した）は、表２に示したとおりであった。
【００８５】
【表２】

【００８６】
例４−３：マンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列の決定
ＴＡＩＬ−ＰＣＲにより明らかになった上流、下流の塩基配列より、以下に示すフォワードプライマー（配列番号２１）、リバースプライマー（配列番号２２）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−ＣＣＴＣＣＡＣＧＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＴＣ　−３’（配列番号２１）
リハ゛ースフ゜ライマー　：５’−ＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧ　−３’（配列番号２２）
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、配列番号２１、配列番号２２の二つのプライマーを用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅し、その塩基配列を解読して、最終的にマンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列（配列番号２３）を決定した。
【００８７】
なお、ここでおこなったＰＣＲの条件は、表３に示したとおりであった。
【００８８】
【表３】

【００８９】
例５：　マンノースイソメラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
例５−１：発現ベクターの構築と形質転換
マンノースイソメラーゼのＤＮＡ全長の両端にＮｃｏＩとＸｈｏＩサイトを付加するために、マンノースイソメラーゼ遺伝子の全塩基配列を基に以下に示したフォワードプライマー（配列番号２４）、リバースプライマー（配列番号２５）を化学合成した。
フォワート゛フ゜ライマー：５’−　ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧ　−３’（配列番号２４）
リハ゛ースフ゜ライマー：５’−　ＣＴＣＧＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＡＧＧ　−３’（配列番号２５）
【００９０】
例４−１で抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、配列番号２４、配列番号２５の二つのプライマーを用いてＰＣＲを行った。
なお、ここでおこなったＰＣＲの条件は、表４に示したとおりであった。
【００９１】
【表４】

【００９２】
増幅された遺伝子断片を、ＴＯＰＯＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてクローニングした。クローニングは前記キットの取扱説明書に記載の条件にしたがって実施し、プラスミドを単離した。
クローニングしたプラスミドとｐＥＴ３０ａ（＋）ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで分解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ）（ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．）を用いてｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行って発現用プラスミドを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、ベクターとインサートのモル比を１対４とし、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈはベクター＋インサートと同容量とし、これらの混合物を１６℃で１６時間反応させた。
得られたプラスミド（ｐＥＴ−３０ａ（＋）ＭＩ）を用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１Ｇｏｌｄ）を形質転換した。
【００９３】
例５−２：マンノースイソメラーゼの大腸菌での発現
構築したベクターを導入して形質転換した大腸菌を、カナマイシンを含むＬＢ培地にて３７℃で培養し、ＯＤ_６００が０．５に達したところで０．１ｍＭ　ＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）で発現を誘導して、さらに２０℃で２１時間振とう培養した。
遠心分離によって菌体を回収して２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、懸濁液を冷却しながら菌体を超音波破砕し、さらに遠心分離して上澄み液を得た。
【００９４】
上澄み液中のマンノースイソメラーゼ活性を測定したところ、培養によって得られた菌体（湿重量）１ｇあたりの酵素活性は７５５０Ｕであった。
同様の操作で測定した、野生株の菌体（湿重量）１ｇあたりの酵素活性は約１０Ｕであり、形質転換した大腸菌での酵素活性は約７５０倍に増加していた。
【００９５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプラスミドｐＥＴ−３０ａ（＋）ＭＩを示した図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
Field of the invention
The present invention relates to a novel protein having mannose isomerase activity, a polynucleotide encoding the protein, a method for producing the protein, and a method for producing mannose using the protein.
[0002]
Background art
Mannose isomerase is a protein having an activity of mutually converting D-fructose and D-mannose.
As a strain producing mannose isomerase, Agrobacterium (AgrobacteriumGenus (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-316572, International Publication No. WO 00/66719), Thermomonospora (Thermomonospora) (Japanese Unexamined Patent Publication No. 11-75836), Acinetobacter (Acinetobacter) (Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-9986), Pseudomonas (Pseudomonas) (Patent No. 3003009) and Streptomyces (Streptomyces) Genera (Fermentation Research Institute reports # 28, 89-94, 1965) and the like. The above literature on these bacteria discloses a method for producing mannose from fructose using the obtained mannose isomerase and a crude enzyme solution thereof, but does not disclose the amino acid sequence of the mannose isomerase enzyme. No analysis of the polynucleotide encoding the enzyme has been performed.
[0003]
Other strains producing mannose isomerase include Agrobacterium radiobacter (Agrobacterium radiobacter(WO 01/25443) and Escherichia coli (Escherichia coli) (WO 00/65072) are known. In the above-mentioned literature relating to these bacteria, a polynucleotide encoding mannose isomerase has been isolated, and its sequence is also disclosed.
[0004]
Mannose is widely distributed in the plant kingdom as a polysaccharide (eg, a homopolysaccharide such as mannan), but has recently been known to inhibit infection of chickens with Salmonella (Poultry Science, # 68, 1357, 1989). For this reason, utilization of mannose as a feed additive to poultry such as chickens or livestock and a functional food material is being studied.
[0005]
To date, the method for producing mannose using mannose isomerase described in the above-mentioned literature has not yet been put to practical use on an industrial level. This is presumed to be due to the low productivity of the enzyme in the mannose isomerase producing strain.
Generally, in order to industrially use an enzyme having low productivity in a strain, it is necessary to increase the specific activity of the enzyme by partial purification. However, the cost required for the operation is not small, so that the cost of the final product increases. For mannose production using mannose isomerase on an industrial scale, it is desired to improve the enzyme productivity of mannose isomerase-producing bacteria.
[0006]
Summary of the Invention
The present inventors have now found that a specific bacterium which produces mannose isomerase having properties suitable for industrial use, which is collected from soil, has an enzyme having excellent mannose isomerase activity. We have also succeeded in isolating this enzyme and specifying its gene. By using genetic engineering techniques based on such information, it is possible to improve enzyme productivity more reliably than by using a mutagenizing agent such as nitrosoguanidine (NTG) or a method of obtaining a mutant with high enzyme production using UV irradiation. Could be improved. The present invention is based on such findings.
[0007]
Therefore, an object of the present invention is to provide a novel protein having mannose isomerase activity, a polynucleotide encoding the protein, a method for producing the protein, and a method for producing mannose using the protein.
[0008]
The protein according to one embodiment of the present invention is a thermobifida (Thermobifida) Of the genus, having the following properties (A) and (B):
(A) has mannose isomerase activity,
(B) The average molecular weight measured by ΔSDS-PAGE is about 41,000.
[0009]
A protein according to another aspect of the invention has the following properties (A), (B) and (C):
(A) has mannose isomerase activity,
(B) the average molecular weight measured by ΔSDS-PAGE is about 41000,
(C) The amino acid sequence at the N-terminal is the sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[0010]
A protein according to yet another aspect of the present invention is selected from the group consisting of:
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which (a) one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence (a), and which has a mannose isomerase activity;
(C) A protein comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the protein comprising the amino acid sequence of (a), and having mannose isomerase activity.
[0011]
According to a preferred embodiment of the present invention, these proteins are thermobifida sp.Thermobifida{Sp. ) Derived from MBL10003 (Accession No. FERM @ BP-7632) strain.
[0012]
According to the present invention, a gene for the protein is also provided. Here, the gene is a polynucleotide encoding the protein.
[0013]
The polynucleotide according to the present invention is selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(Ii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence of (i), and encodes a protein having mannose isomerase activity;
(Iii) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 60% homology with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (i) and encoding a protein having mannose isomerase activity.
[0014]
An expression vector according to the present invention comprises a polynucleotide according to the present invention.
The host according to the present invention has been transformed with the expression vector according to the present invention.
[0015]
The method for producing a target protein according to the present invention comprises culturing the transformed host and collecting a protein having mannose isomerase activity from the resulting culture.
[0016]
The method for producing mannose according to the present invention comprises using the protein described above, at least one protein selected from the group consisting of proteins produced by the above-described production method, or an enzyme preparation according to the present invention, in a fructose-containing liquid. Converting fructose to mannose.
[0017]
According to the present invention, highly active mannose isomerase can be obtained.
In addition, by adding a histidine tag or the like to the polynucleotide encoding the mannose isomerase of the present invention, it can be expected that the purification of high-purity mannose isomerase from the recombinant can be facilitated. Furthermore, for example, by using a preparation in which high-purity mannose isomerase according to the present invention is immobilized on an immobilization carrier or the like, the enzyme can be easily recovered in a batch method and reused, so that mannose production can be performed. It is also expected to reduce production costs.
As described above, according to the present invention, mannose isomerase can be produced in large quantities at low cost, and the use of the obtained mannose isomerase enables large-scale and efficient production of mannose.
[0018]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Microbial deposit
Thermobifida SP MBL10003 shares (Thermobifida{Sp. MBL10003) was established on May 2, 1997 (Hara Deposit Date) by the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (センター 305-5466), 1-1 1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan No. 6) was deposited. The accession number is FERM @ BP-7632. The genus Thermobifida has recently been known as Thermomonospora (Thermomonospora) Classification given by genus reclassification.
[0019]
Protein having mannose isomerase activity
As described above, according to one aspect of the present invention, the protein of the present invention has mannose isomerase activity.
[0020]
In the present invention, "having mannose isomerase activity" refers to the case where it is evaluated that mannose isomerase activity has been recognized by those skilled in the art, and for example, the same as the section of "Measurement of mannose isomerase activity" in Examples described later. It means the case where it is evaluated that the mannose isomerase activity was recognized when measured under the conditions.
[0021]
In the present invention, "mannose isomerase activity" refers to an activity of converting D-fructose and D-mannose to each other, that is, an activity of converting D-fructose to D-mannose, and an activity of converting D-mannose to D-mannose. -To exhibit both the activity of converting to fructose. At this time, for example, when the activity of converting D-mannose to D-fructose is high, it is understood that the activity of converting the other D-fructose to D-mannose is also high.
[0022]
In addition, `` conversion to each other '' means, for example, when mannose is present in an aqueous solution in excess of fructose, or when fructose is present in excess in relation to mannose, when mannose isomerase acts, mannose in aqueous solution is converted to mannose in aqueous solution. It means that each is converted until fructose reaches a predetermined equilibrium amount. Such an equilibrium state is a state where, for example, when the temperature of the solution is 50 ° C. and the pH is 7, the concentration ratio of mannose: fructose in the solution is 25:75.
[0023]
The protein according to one embodiment of the present invention has an average molecular weight of about 41,000 as measured by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis). Here, this molecular weight can be easily measured by those skilled in the art by applying a conventional method.
[0024]
The protein according to the present invention typically has a N-terminal amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
[0025]
The proteins according to the invention are typically thermobifida (Thermobifida) Of the genus Actinomycetes, preferably Thermobifida sp.Thermobifida{Sp. ), And more preferably Thermobifida SP (Thermobifida{Sp. ) Derived from MBL10003 strain (FERM @ BP-7632). They may also be mutants thereof.
[0026]
The protein according to the present invention includes, for example, Thermobifida (Thermobifida) A genus of a genus of the genus can be obtained by performing isolation and purification by various combinations of ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and / or gel chromatography. Specifically, for example, it can be isolated and obtained according to the methods described in Examples 1 and 2 of the Examples.
[0027]
The protein according to the invention preferably has an optimum pH in the range from 7 to 10 and / or an optimum temperature in the range from 50 to 60 ° C.
[0028]
As mentioned above, according to another aspect of the invention, the protein is selected from the group consisting of:
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which (a) one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence (a), and which has a mannose isomerase activity;
(C) A protein comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the protein comprising the amino acid sequence of (a), and having mannose isomerase activity.
[0029]
In the amino acid sequence (a), the number of amino acid residues which may be deleted, substituted, inserted or added is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 8, and still more preferably 1 to 4. , Most preferably one.
[0030]
According to another preferred embodiment of the present invention, the protein (b) comprises an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are conservatively substituted in the amino acid sequence (a); And a protein having mannose isomerase activity.
[0031]
As used herein, the term "conservative substitution" refers to replacing one or more amino acid residues with another chemically similar amino acid residue so as not to substantially alter the activity of the protein. For example, a case where a certain hydrophobic residue is replaced with another hydrophobic residue, a case where a certain polar residue is replaced with another polar residue having the same charge, and the like can be mentioned. Functionally similar amino acids that can make such conservative substitutions are known in the art for each amino acid. As specific examples, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like.
Examples of polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine. Examples of (basic) amino acids having a positive charge include arginine, histidine, lysine and the like. Examples of negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
[0032]
According to another preferred embodiment of the present invention, the homology between the protein according to the present invention and the protein comprising the amino acid sequence of (a) is at least 60%, more preferably at least 70%, More preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, particularly preferably at least 98%.
Note that any of the numerical values of homology shown in the present specification may be numerical values calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, default values (initial settings) in FASTA, BLAST, etc. By using the parameters, it can be easily calculated.
[0033]
According to another aspect of the present invention, the protein according to the present invention can also be obtained, for example, as described below.
An organism containing the protein having the mannose isomerase activity is cultured, and the protein having the activity is isolated and purified from the culture solution by using the mannose isomerase activity as an indicator and applying a conventional method. The amino acid sequence of the obtained purified protein is analyzed by a known method, all or a part of an oligonucleotide encoding the same is synthesized, and genomic DNA of the organism is used as a template to perform PCR (Polymerase Chain Reaction). Synthesize a long probe. Using this probe, the base sequence of the translation region of the mannose isomerase enzyme is analyzed by PCR, inverse PCR, or RACE (Rapid Amplification of cDNA <RTIgt; Ends) </ RTI> method or the like. The translation region of the thus obtained mannose isomerase enzyme is ligated to a control sequence that functions in a host used for expression to obtain an expression vector. By transforming the host with this expression vector and culturing the transformant, a protein having mannose isomerase activity can be efficiently obtained.
[0034]
Polynucleotide encoding a protein having mannose isomerase activityThe polynucleotide according to the present invention encodes the protein described above.
A polynucleotide according to the present invention is typically one selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(Ii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, inserted or added in the base sequence of (i), and encodes a protein having mannose isomerase activity;
(Iii) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 60% homology with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (i) and encoding a protein having mannose isomerase activity.
[0035]
In the base sequence (i), the number of bases which may be deleted, substituted, inserted or added is preferably 1 to 120, more preferably 1 to 24, still more preferably 1 to 12, most preferably Preferably it is 1-3.
[0036]
According to a more preferred embodiment of the present invention, the homology between the polynucleotide and the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (i) is at least 60%, more preferably at least 70%, Preferably it is at least 80%, even more preferably at least 90%, particularly preferably at least 98%.
[0037]
Polynucleotides having a modified sequence such as the polynucleotide (iii) can be obtained by site-directed mutagenesis or PCR (Nucleic Acid Res., Vol. 10, pp 6487 (1982), Methods in Enzymology, 100). , Pp 448 (1983), Molecular Cloning 2nd Edt., Cold Spring Labor Laboratory Press (1989), PCR A Practical Approach IRL Press pp200. Can be. Whether or not the thus obtained polynucleotide has a desired activity is determined by applying a method well known to those skilled in the art to express a protein, to which a method described in Examples below is applied. Can be easily determined.
[0038]
The polynucleotide according to the present invention can be obtained, for example, as follows. Using a chromosomal DNA of a mannose isomerase enzyme-producing bacterium as a template, a base sequence corresponding to a part or all of the amino acid sequence of the protein having mannose isomerase activity shown in SEQ ID NO: 1 is synthesized, and the primer obtained thereby is used as a primer. Perform PCR (Polymerase \ Chain \ Reaction) using The polynucleotide according to the present invention can be obtained by analyzing information from the obtained PCR amplified fragment. At this time, the mannose isomerase producing bacterium is not particularly limited, but preferably a bacterium belonging to the genus Thermobifida, more preferably Thermobifida sp., And most preferably Thermobifida sp. MBL10003 strain. For obtaining the polynucleotide according to the present invention, it is important to set the PCR reaction conditions, and specifically, for example, the method described in Example 4 of Examples described later can be mentioned.
Further, the polynucleotide according to the present invention may be obtained by utilizing the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and chemically synthesizing by applying a conventional method.
[0039]
Expression vector and host
According to the present invention, there is provided an expression vector comprising the above-described polynucleotide. The expression vector according to the present invention comprises the polynucleotide of the present invention in a state capable of replicating in a host cell and expressing the protein having the mannose isomerase activity of the present invention.
The procedure and method for constructing the expression vector according to the present invention may be those commonly used in the field of genetic engineering.
[0040]
Expression vectors that can be used in the present invention include those that are integrated into the host chromosomal DNA and those that cause a vector having an autonomously replicating sequence capable of self-replication to exist in a host cell in the form of a plasmid. For example, plasmids such as pUC (pUC18 or pUC118, etc.), pBluescript (pBluescriptII @ KS +, etc.), and pBR322 and the like can be mentioned. The copy number of the polynucleotide present in the host cell may be one copy or plural.
[0041]
The expression vector according to the present invention is, in addition to the polynucleotide of the present invention, a DNA sequence for controlling its expression and a gene for selecting a transformant, in order to introduce the vector into the host to express the protein of the present invention. It may further include a marker or the like.
[0042]
The DNA sequence that controls expression is not particularly limited as long as it is a control sequence that functions in a host, and includes, for example, a promoter, a terminator, a DNA sequence encoding a signal peptide, and the like.
Linkage to the control sequence can be performed, for example, by inserting a translation region of a polynucleotide (target gene) encoding the target protein in the forward direction downstream of the promoter according to a conventional method. In this case, the target gene can be linked to a foreign gene encoding a translation region of another protein and expressed as a fusion protein.
[0043]
The gene marker can be appropriately selected according to a method for selecting a transformant. For example, a gene encoding drug resistance or a gene complementing auxotrophy can be used. Examples of drug resistance genes include genes for drugs such as destomycin, benomyl, oligomycin, hygromycin, G418, bleomycin, bialaphos, blasticidin S, phleomycin, phosphinothricin, ampicillin, streptomycin, and kanamycin. . Examples of genes that complement auxotrophy include,amdS,pyrG,argB,trpC,niaD,TRP1,LEU2,URA3And the like.
[0044]
These DNA sequences and gene markers are operably linked in an expression vector according to the present invention.
[0045]
According to the present invention, there is provided a host transformed with the expression vector. The host-vector system used in the present invention is not particularly limited as long as it can correctly transcribe and translate a polynucleotide encoding a protein having mannose isomerase activity. Examples of the host include Escherichia coli, actinomycetes, and filamentous fungi. And a system using the microorganism. Preferably, a system using Escherichia coli is used.
Transformation of a host cell with the expression vector of the present invention can be performed according to a method commonly used in the field of genetic engineering. Examples of such a method include an electroporation method, a polyethylene glycol method, an Agrobacterium method, a lithium method, a calcium chloride method, and the like, and an efficient method for a host is selected.
[0046]
The transformant (transformed host) can be cultured by appropriately selecting a medium, culture conditions, and the like according to a conventional method. Typically, the culture medium and culture conditions of the transformant are the May be essentially equivalent to that of the microorganism to be treated.
[0047]
Method for producing protein
According to the present invention, as described above, a method for producing a target protein comprising culturing the transformed host and collecting a protein having mannose isomerase activity from a culture containing the obtained host. Provided.
The target protein can be obtained from the culture according to a method commonly used in the art, for example, extraction (grinding treatment, pressure crushing, etc.) and recovery (filtration, centrifugation, etc.) from the culture. ) And / or purification (salting out method, solvent precipitation method, etc.), etc., can be appropriately combined. In these processes, a protease inhibitor such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), benzamidine or leupeptin can be added as necessary.
[0048]
Mannose isomerase enzyme preparation
The present invention also provides a mannose isomerase enzyme preparation. The enzyme preparation of mannose isomerase comprises at least one protein having the above-mentioned mannose isomerase activity. If necessary, excipients (eg, lactose, sodium chloride, sorbitol, etc.), preservatives, etc. Is further included.
The form of the mannose isomerase enzyme preparation is not particularly limited, and may be a powder or a liquid. For example, they may be in the form of powders, granules, granules, non-dusted granules, liquid preparations and the like. The mannose isomerase enzyme preparation may be in the form of an immobilized enzyme in which the protein according to the present invention is immobilized on a commercially available cation or anion exchange resin or adsorption resin.
[0049]
Mannose manufacturing method
According to the present invention, as described above, the fructose in the fructose-containing liquid is converted into mannose using at least one protein selected from the group consisting of the protein described above and the protein produced by the production method. Provided is a method for producing mannose.
[0050]
In the method, the reaction conditions when the protein is allowed to act on fructose using the protein in a fructose-containing solution can be appropriately selected. For example, the reaction solution temperature is generally 25 to 70 ° C, preferably 30 to 60 ° C. The reaction pH is generally pH 5 to 11, preferably 6 to 10. The reaction time depends on the amount of the enzyme used and the concentration of the substrate, and can be appropriately set according to them. However, it is preferable to set the reaction time between 3 and 48 hours.
In this method, the fructose-containing liquid desirably contains fructose at 10% (W / V) or more, and usually, about 25% (W / W) of fructose used in the reaction is isomerized to mannose. .
[0051]
According to a preferred embodiment of the present invention, the production method further comprises separating mannose from the mannose-containing solution obtained by converting fructose in the fructose-containing solution to mannose, and purifying as necessary. .
[0052]
Separation and recovery of mannose from the mannose-containing liquid obtained by the enzymatic reaction can be performed by applying a conventional method. For example, after removing impurities by filtration, centrifugation, or the like, mannose can be purified by chromatography using an ion exchange resin, an activated carbon column, or the like. For efficient purification, a simulated moving bed chromatography apparatus may be preferably used as the chromatography apparatus. As the ion exchange resin, preferably, a strongly acidic cation exchange resin can be used as a Ca type by a method commonly used by those skilled in the art.
[0053]
Further, the obtained mannose can be concentrated by a conventional method, for example, concentration under reduced pressure or membrane concentration, and can be crystallized in an alcohol or aqueous system. By collecting the obtained crystals by centrifugation or filtration, high-purity mannose crystals can be obtained.
[0054]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but these do not limit the present invention.
[0055]
Measurement of mannose isomerase activity
The measurement of mannose isomerase activity was performed according to the method shown below.
1 ml of a substrate solution (0.2 M mannose-0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) solution) and 1 ml of the enzyme solution were reacted at 50 ° C. for 30 minutes, and 2 ml of 0.5 M perchloric acid was added thereto to add the enzyme. After inactivation, the mixture was centrifuged (3,000 rpm, 10 minutes) to obtain a reaction solution supernatant. The amount of fructose produced in the obtained supernatant was measured according to the cysteine-carbazole sulfate method (“Biochemical Experiment Method 1—Quantitative Determination of Reducing Sugars”, pp. 70-72, by Sakuzo Fukui, Gakkai Shuppan Center). Thus, the mannose isomerase activity was determined.
[0056]
Here, when the fructose generated after incubation of the test protein and mannose for a certain period of time is measured, the amount of the enzyme that produces 1 μM fructose per minute is defined as one unit (1 U).
[0057]
Example 1: Cultivation of mannose isomerase producing bacteria in a 30 L jar
Thermobifida SP (Thermobifida{Sp. ) The MBL10003 strain (FERM @ BP-7632) was cultured at 50 ° C for 72 hours on a slant prepared using an agar medium a comprising the following components.
Components of agar medium a:
Glucose 0.5% (W / V), mannose 1.0% (W / V), yeast extract (manufactured by Difco) 0.4% (W / V), polypeptone 0.1% (W / V), Dipotassium hydrogen phosphate 0.2% (W / V), ammonium nitrate 0.5% (W / V), magnesium sulfate heptahydrate 0.05% (W / V), carboxymethyl cellulose (CMC) 0.5 % (W / V), sodium carbonate 0.5% (W / V), and agar 2.0% (W / V).
[0058]
The cultured 1 cell bacterium was inoculated into a 250-ml baffled Erlenmeyer flask containing 30 ml of a liquid medium a obtained by removing the agar from the agar medium a, and cultured with shaking at 50 ° C. for 48 hours.
The obtained culture solution was added to a 1 L Erlenmeyer flask containing 300 ml of a liquid medium b composed of the following components, and added thereto at 2% (V / V), and this was cultured at 50 ° C for 48 hours.
Constituents of liquid medium b:
Mannose 1.0% (W / V), glucose 0.5% (W / V), yeast extract 0.4% (W / V), polypeptone 0.1% (W / V), ammonium nitrate 0.5% (W / V), dipotassium hydrogen phosphate 0.2% (W / V), magnesium sulfate 0.05% (W / V), potato dextrose broth 1.0% (W / V), carboxymethyl cellulose 0.1% 5% (W / V) and 0.5% sodium carbonate (W / V).
[0059]
The obtained culture solution was further added to a 30-L culture tank containing 15 L of the liquid medium b, and cultured at 50 ° C. for 48 hours.
The obtained culture was centrifuged (9000 rpm, 30 minutes) to collect the cells.
The cells were dried by a freeze-drying method to obtain 300 g of freeze-dried cells.
[0060]
Example 2: Isolation and purification of mannose isomerase
Example 2-1 Mannose isomerase extraction from cells
After 300 g of the freeze-dried cells obtained in Example 1 were suspended in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) 10 times the cell weight, the cells were disrupted by sonication. This sonicated solution was centrifuged to remove the precipitate, and the resulting supernatant was filtered through a 0.45 μm membrane filter, and further subjected to a UF membrane (Millipore, Biomax) with a molecular weight cut off of 10,000. Was concentrated to 1/10.
This concentrated solution was used as a crude enzyme solution for further purification treatment.
[0061]
Example 2-2: anion exchange chromatography (column: DEAE-Sepharose FF ) Purification
300 ml of the obtained crude enzyme solution was mixed with 500 ml of 80 mM phosphate buffer (pH 7.0) to adjust the pH to 7.0. The prepared crude enzyme solution (800 ml) was supplied to an anion exchange column DEAE-Sepharose @FF (manufactured by Amersham Pharmacia, 10 cm × 15 cm), and the protein in the crude enzyme solution was adsorbed to the resin.
The adsorbed protein was eluted using an eluent in which the NaCl concentration in a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) was gradually increased to 0.1 M, 0.2 M, and 0.3 M in order.
Mannose isomerase activity was detected at the elution peak when the NaCl concentration was 0.3M. This peak was collected, concentrated and desalted with a UF membrane (Biomax, manufactured by Millipore) having a molecular weight cut off of 10,000.
[0062]
Example 2-3: hydrophobic chromatography (column: Resource ISO ) Purification
Ammonium sulfate was added to 300 ml of the DEAE-Sepharose @ FF eluted fraction obtained in Example 2-2 to a final concentration of 1 M, and the whole amount was supplied to a hydrophobic chromatography column RESOURCE @ ISO (Amersham Pharmacia, 30 mm × 15 cm). Thus, the protein in the liquid was adsorbed. Next, 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 M ammonium sulfate was flowed as an eluent to remove non-adsorbed proteins from the column.
The adsorbed protein was eluted by flowing deionized water. Mannose isomerase activity was detected in the deionized water eluted fraction.
[0063]
Example 2-4: Hydrophobic chromatography (column: Resource PHE ) Purification
Ammonium sulfate was added to 300 ml of the deionized water eluted fraction obtained in Example 2-3 so as to have a final concentration of 1 M, and the whole amount was supplied to a hydrophobic chromatography column RESOURCE @ PHE (Amersham Pharmacia, 30 mm × 15 cm). The protein in the liquid was adsorbed. In the eluate, the adsorbed protein was eluted by continuously reducing the concentration of ammonium sulfate in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
The fraction having mannose isomerase activity was eluted when the concentration of ammonium sulfate in the eluate was 0.15M to 0M. The eluate was concentrated and desalted by a UF membrane (Biomax, manufactured by Millipore) having a molecular weight cut off of 10,000 to obtain 44.5 mg of protein. The protein concentration was determined from a calibration curve using bovine serum albumin (BSA) as a standard substance using Protein @ assay (Bio @ Rad).
[0064]
Example 2-5: Anion exchange chromatography (column: DEAE-COSMOgel ) Purification
1 ml of the concentrate obtained in Example 2-4 was applied to an anion exchange chromatography column COSMOGEL-DEAE (Nacalai Tesque, 8 mm × 0.75 cm) to adsorb proteins in the liquid. In the eluate, the adsorbed protein was eluted by continuously increasing the concentration of NaCl in a 20 mM phosphate buffer (pH 6.0).
The fraction having mannose isomerase activity was eluted when the NaCl concentration in the eluate was around 0.15M.
[0065]
Example 2-6: Gel chromatography (column: Superdex200HR ) Purification
0.7 ml of the eluate obtained in Example 2-5 was subjected to gel filtration (Superdex200HR10 / 30) to adsorb proteins in the liquid. Using a 50 mM phosphate buffer containing 0.15 M NaCl as an eluent, the solution was applied to the gel column at a flow rate of 0.25 ml / min. The eluted mannose isomerase active fraction was subjected to SDS-PAGE to identify the target protein.
SDS-PAGE was carried out using a Rapidas minislab electrophoresis tank @ AE-6530M / AE-6530P (manufactured by ATTO), and a 10% acrylamide gel and an electrophoresis buffer were prepared with reference to the above-mentioned instruction manual. . The molecular weight standard is 10 kDa Protein Ladder (trade name: GIBCO BRL)^RLIFE TECHNOLOGIES).
The resulting mannose isomerase was purified to a single band on a SDS-PAGE gel and showed an average molecular weight of 41,000.
[0066]
Example 3: Amino acid sequence analysis of N-terminal and digested fragments of mannose isomerase
The band on the SDS-PAGE gel of the mannose isomerase purified in Example 2 was blotted on a PVDF membrane (manufactured by BIO-RAD) and applied to a peptide sequencer (1005A, Hewlett @ Packard @ Co.) To obtain an N-terminal amino acid 29 sequence (SEQ ID NO: 3). ) Was analyzed. The sequence was as shown below.
TLWTARAAARAWDAEARRLVDFAAAADH (SEQ ID NO: 3)
[0067]
A fragment digested with Endoproteinase Glu-C on a gel according to the method of Cleveland (J. Biol. Chem., 252, 1102-1106, 1977) was also blotted in the same manner and subjected to a peptide sequencer for amino acid 16 sequence (sequence). No. 4) was analyzed. The sequence was as shown below.
SWDAAWHADEPYRGAN (SEQ ID NO: 4)
[0068]
Example 4: Cloning of mannose isomerase gene
Example 4-1: Determination of partial base sequence of mannose isomerase
Since the mannose isomerase according to the present invention is derived from actinomycetes and has a high GC content (70% or more), an amplified gene fragment could not be obtained by ordinary PCR. Therefore, the conditions were examined in detail such as primer design, temperature conditions, polymerase and the like. The conditions used for the determination of the partial base sequence are shown below.
[0069]
A region with low codon degeneracy was selected from the N-terminal of mannose isomerase and the amino acid sequence of the digested fragment, and a forward primer (sequence number 5) and a reverse primer (reverse case) (sequence number 6) were designed. Synthesized.
Forward primer: 5 '-{IGCIMIGIGCIGCICAYMGIGCNTGG} -3' (SEQ ID NO: 5)
Reversible primer: 5 '-{CICKRTAIGGYTCRTCICRTGGCCA} -3' (SEQ ID NO: 6)
[0070]
In a liquid medium a 30 ml obtained by removing agar from the agar medium a of Example 1, Thermobifida SP (Thermobifida{Sp. ) The MBL10003 strain was cultured at 50 ° C for 48 hours, and the actinomycetes genome extraction method (Hunter et al., IS. Hunter (1985), Gene Cloning in Streptomyces. In Glover DM. (Ed) DNA cloning, Gen. DNA was extracted by Vol. 1.A, \ practical \ approach. \ IRL Press, \ Washington, DC, \ pp19-44). PCR was performed using the genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NOS: 5 and 6 to obtain a 453 bp mannose isomerase gene fragment. The conditions of the PCR were as shown in Table 1.
[0071]
[Table 1]

[0072]
The obtained gene fragment wasA TA cloning kit (manufactured by Invitrogen) was used to incorporate the vector into the TA cloning vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen), and this vector was subjected to electroporation.E. FIG. coliた Incorporated in TOP10 strain. This strain was spread on an LB agar medium containing the antibiotic ampicillin, and cultured at 37 ° C.
A white or light blue color was selected from the grown colonies, and the plasmid was isolated by a standard method.
Furthermore, a DNA sequencer (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, DNA Base was read by Genetically Analyzed Biosystems) was used using an ABI Prism Big Dye terminator cycle sequencing Ready Reaction kit (manufactured by PerkinElmer).
[0073]
When the obtained base sequence was translated into amino acids, it was found to be a part of the mannose isomerase gene, consistent with the two amino acid sequences obtained in Example 3. The DNA base sequence of the obtained mannose isomerase gene fragment was as shown below.
CTGGACGCCGAGGCGCGCCGCCTGGTGGACTTTGCCGCTGCTGCCGACCACCCCGAGCACGGTTTCGCCTGGCTTGACGGGAGCGGCGCACCGCTCCCCGAGCAGGGAGTGCACACCTGGATCACCTGCCGGTTCACCCACGTGGCCGCACTCGCCCACCTGGAAGGGATTCCCGGGGCGAGCGCACTCGCCGACCACGGGCTGCGGGCCCTGGCGGGGCCGCTGCGCGACCCGGAGCACGACGGCTGGTTCACCGCTCTGGACTCCCGCGGCACGGTCGCCGACTCGCGCAAAGAGGCCTACCAGCACGCGTTCGTGCTCCTCGCAGCGGCA GCGCTACCGTGGCCGGACGGCCCGGCGCGCGGGAACTCCTCGACGCCGCCGCGGCAGTGATCGAACAGCGGTTCTGGGAGGAAGAGACAGGCCGCTGCCGGGAGAGCTGGGATGCCGCG (SEQ ID NO: 7)
[0074]
Example 4-2: Determination of base sequence of unknown region at 5 'and 3' side of mannose isomerase
As in Example 4-1, mannose isomerase has a high GC content, so that the desired product could not be obtained under ordinary PCR conditions. Therefore, conditions were examined in detail like the primer design, temperature conditions, polymerase and the like as described above. The conditions used for determining the base sequences of the unknown regions on the 5 'and 3' sides are shown below.
[0075]
TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced-PCR) (Plant J., 8 (3), 457-463, 1995, Genomics, 25, 674-681) for the purpose of analyzing the base sequences of the 5 ′ and 3 ′ unknown regions. , 1995), the following six primers (long @ specific \ primer: SEQ ID NOs: 8 to 13) were obtained from the base sequence (SEQ ID NO: 7) of the gene fragment 453 bp of the mannose isomerase gene obtained in Example 4-1. ) Was chemically synthesized.
Forward primer 1: 5 '-{CCGCCTGGTGGGACTTTGCCGCTCGCT} -3' (SEQ ID NO: 8)
Forward Primer 2: 5 '-{GGACTTTGCCGCTGCTGCCGACCAC} -3' (SEQ ID NO: 9)
Forward primer 3: 5'-AGGCCGCTGCCGGGAGAGCTGGGAT-3 '(SEQ ID NO: 10)
Recycle primer 1: 5 '-{GCTGCGAGGAGCACGAACGCTGCTCT-3' (SEQ ID NO: 11)
Reverse primer 2: 5 '-{CGGCCACGTGGGTGAACCGGCAGGGT-3' (SEQ ID NO: 12)
Reversible primer 3: 5 '-{GGGTGGTCGGCAGCAGCGGCAAAAGT} -3' (SEQ ID NO: 13)
[0076]
In addition, three mixed primers (short / arbitrary / degenerate / primer) that specifically bind to the unknown region were chemically synthesized.
Mixed primer 1: 5 '-{TCTNTGNAWCTNCACW} -3' (SEQ ID NO: 14)
Mixed primer 2: 5 '-{NGTCGASWGANAWGAA} -3' (SEQ ID NO: 15)
Mixed primer 3: 5 '-{GTNCGASWCANAWGTT} -3' (SEQ ID NO: 16)
[0077]
Next, in order to analyze the base sequence of the 5′-side unknown region, the genomic DNA extracted in Example 4-1 was used as a template, and the reverse primer 1 (SEQ ID NO: 11) and the mixed primer 1 (SEQ ID NO: 14) were used. The second TAIL-PCR was performed. Subsequently, a second TAIL-PCR was performed using the first TAIL-PCR product as a template and reverse primer 2 (SEQ ID NO: 12) and mixed primer 1 (SEQ ID NO: 14). Further, using the second TAIL-PCR product as a template, the third TAIL-PCR (conditions: the third TAIL-PCR-1) using reverse primer 3 (SEQ ID NO: 13) and mixed primer 1 (SEQ ID NO: 14) ), And the base sequence (227 bp: SEQ ID NO: 17) of the amplified DNA fragment was decoded.
[0078]
When this base sequence was translated into amino acids, the N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) obtained in Example 3 was present. This proved to be 5 'upstream of the mannose isomerase gene. The base sequence of the obtained 5 'upstream portion is shown below.
GTGCGGCCCCTCCGGCGCGGTGAACCAGGTGGAGGCCCGGTAAGCCCGGCGGGTATCCTCCACGCGGCGCCGTGCGCGTATGCCGTTCNCACCGCACCGACGGCACGGAGGGAGGGACGGCGTTTCACACGTCCGCATCTGACCGAGGGGAACGCCACCGATGACCTTGTGGACCGCGCGAGCTGCACACCGGGCCTGGCTGGACGCCGAGGCGCGCCGCCTGGTGG (SEQ ID NO: 17)
[0079]
Next, in order to analyze the base sequence of the 3′-side unknown region, using the genomic DNA extracted in Example 4-1 as a template, a forward primer 1 (SEQ ID NO: 8) and a mixed primer 2 (SEQ ID NO: 15) The second TAIL-PCR was performed. Subsequently, a second TAIL-PCR was performed using the first-time TAIL-PCR product as a template and a forward primer 2 (SEQ ID NO: 9) and a mixed primer 2 (SEQ ID NO: 15). Further, using the second TAIL-PCR product as a template, a third TAIL-PCR (condition: third TAIL-PCR-2) using forward primer 3 (SEQ ID NO: 10) and mixed primer 2 (SEQ ID NO: 15) ), And the base sequence (586 bp: SEQ ID NO: 18) of the amplified DNA fragment was decoded.
[0080]
When this base sequence was translated into amino acids, a part of the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the digested fragment obtained in Example 3 was present. This proved to be a 3 'downstream portion of the mannose isomerase gene. The base sequence of the obtained 3 'downstream portion is shown below.
GCCGCGTGGCACGCCGACGAACCCTACCGCGGCGCTAACAGCAACATGCACCTGGTAGAAGCGTTCCTCGCGGCGTTCGACGCCACCGGGGACCGGGTGTGGGCGGAGCGTGCGCTGCGGATCGCCCACTTCTTCGTCCACGAGGTGGCCGCGCCCCGCGACTGGCGACTCCCCGAGCATTTCACCCCCGACTGGCAGGTCGTGGCCGACTACAACACCGACGACCGCGCCCACCCGTTCCGCCCCTACGGGGTCACCGTCGGCCACGTCCTGGAATGGGCCCGGCTCCTGGTGCACGTGGAGGCGGCGCTGCCTGACCCGCCGTCGTGGCTG TCGCCGACGCGGAGGCGATGTTCGCCGCCGCCGTGGCACGCGGCTGGTCGGTGGACGGAACGGAAGGCTTCGTCTACACCCTCGACTACGACGACACTCCGGTGGTGCGCTCCCGGATGCACTGGGTGGTGGCCGAGGCGGTCCTCCGTGCGGCGGTAATGGGGCAGCGTACTGGCGACGAGCGCTACGAGCACTGGTACCGGACGTGGTGGGACCATGCCGCCACGTATTTCGTGGACACCGTGCAGGGCA (SEQ ID NO: 18)
[0081]
The base sequence of SEQ ID NO: 18 did not contain a stop codon. Therefore, TAIL-PCR was continued to further analyze the base sequence of the 3'-side unknown region.
First, forward primer 4 (SEQ ID NO: 19) was chemically synthesized from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
Forward primer 4: 5 '-{CTCCGTGCGGCGGTAATGGGGCAGC-3 "(SEQ ID NO: 19)
[0082]
Using the genomic DNA extracted in Example 4-1 as a template, the first TAIL-PCR was performed using forward primer 1 (SEQ ID NO: 8) and mixed primer 3 (SEQ ID NO: 16). Subsequently, a second TAIL-PCR was carried out using the first-time TAIL-PCR product as a template and a forward primer 2 (SEQ ID NO: 9) and a mixed primer 3 (SEQ ID NO: 16). Further, the third TAIL-PCR (conditions: the third TAIL-PCR-2) using the forward primer 4 (SEQ ID NO: 19) and the mixed primer 3 (SEQ ID NO: 16) using the second TAIL-PCR product as a template And the base sequence (354 bp: SEQ ID NO: 20) of the amplified DNA fragment was decoded.
[0083]
When this nucleotide sequence was translated into amino acids, a part of the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 18) obtained by the above TAIL-PCR (amino acids 331 to 357 in SEQ ID NO: 1) and a stop codon (TGA) was present. This proved to be a 3 'downstream portion of the mannose isomerase gene. The base sequence of the 3 'downstream portion including the stop codon is shown below.
GTACTGGCGACGAGCGCTACGAGCACTGGTACCGGACGTGGTGGGACCATGCCGCCACGTATTTCGTGGACACCGTGCAGGGCAGTTGGCACCACGAGCTCGACCCGACGCTCGCTCCCCCGCCCGGCGGCACGTGGAGCGGCAAACCCGACGTTTACCACGCCTACCAGGCGACCCGGCTGCCGCTGCTGCCGCTGGCGCCCAGCCTGGCGGGGGCGCTCGCCACGGTGGGCTGACCGCCAGGGGAAGAGCCGCGCGCCCGGCCGGGGCAGGCCGGGAATGGTACGAGGTGGGCGGACCGCACCTGCCCGGGTCTGTGGTCCGNCGCCCGGG AGGGCAGCGGGCTCGGCCCG (SEQ ID NO: 20)
[0084]
The conditions of the TAIL-PCR performed here (Plan {J.}, 8 (3), 457-463, 1995, Genomics, 25, 674-681, 1995) were modified as shown in Table 2. Met.
[0085]
[Table 2]

[0086]
Example 4-3: Determination of the entire nucleotide sequence of the mannose isomerase gene
From the upstream and downstream nucleotide sequences revealed by TAIL-PCR, the following forward primer (SEQ ID NO: 21) and reverse primer (SEQ ID NO: 22) were chemically synthesized.
Forward primer: 5'-CCTCCCACGCGGCGCCGTGCGCGTATGCCGTTC-3 '(SEQ ID NO: 21)
Recycle primer: 5'-CCATTCCCGGCCTGCCCCGGCCGGGGCGCGCGGG-3 '(SEQ ID NO: 22)
Using the genomic DNA extracted in Example 4-1 as a template, a DNA fragment was amplified by PCR using two primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, the base sequence was decoded, and finally the mannose isomerase gene The entire nucleotide sequence (SEQ ID NO: 23) was determined.
[0087]
The conditions of the PCR performed here were as shown in Table 3.
[0088]
[Table 3]

[0089]
Example 5: Expression of the mannose isomerase gene in E. coli
Example 5-1: Expression vector construction and transformation
In order to add NcoI and XhoI sites to both ends of the full length of mannose isomerase DNA, the following forward primer (SEQ ID NO: 24) and reverse primer (SEQ ID NO: 25) shown below were chemically synthesized based on the entire base sequence of the mannose isomerase gene. did.
Forward primer: 5 '-{CCATGGCCTTGTGGACCGCCGCGAGCTGCACCACCG} -3' (SEQ ID NO: 24)
Reversible primer: 5 '-{CTCGAGCAGCCCACCGTGGCGAGGCCCCCCGCCAGGG-3' (SEQ ID NO: 25)
[0090]
PCR was performed using the genomic DNA extracted in Example 4-1 as a template and two primers of SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25.
The conditions of the PCR performed here were as shown in Table 4.
[0091]
[Table 4]

[0092]
The amplified gene fragment is transferred to TOPOCloning was performed using a TA @ cloning kit (manufactured by Invitrogen). Cloning was performed according to the conditions described in the instruction manual of the kit, and the plasmid was isolated.
The cloned plasmid and pET30a (+) plasmid (Novagen) were used as restriction enzymes.NcoI andXhoI, and a ligation reaction was performed using Ligation high (DNA ligation kit) (TOYOBO Co. Ltd.) to prepare an expression plasmid. In the Ligation reaction, the molar ratio of the vector to the insert was 1: 4, Ligation @ high was the same volume as the vector + insert, and the mixture was reacted at 16 ° C. for 16 hours.
Using the obtained plasmid (pET-30a (+) MI), E. coli (E. FIG. coli(BL21Gold) was transformed.
[0093]
Example 5-2: Expression of mannose isomerase in E. coli
Escherichia coli transformed by introducing the constructed vector was cultured at 37 ° C. in LB medium containing kanamycin, and OD₆₀₀Reached 0.5, the expression was induced with 0.1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside), and the cells were further cultured at 20 ° C. for 21 hours with shaking.
The cells were collected by centrifugation, suspended in 20 mM phosphate buffer (pH 7), and the cells were sonicated while cooling the suspension, followed by centrifugation to obtain a supernatant.
[0094]
When the mannose isomerase activity in the supernatant was measured, the enzyme activity per 1 g of the cells (wet weight) obtained by the culturing was 7550 U.
The enzyme activity per 1 g of the wild-type bacterial cell (wet weight) measured by the same operation was about 10 U, and the enzyme activity in the transformed Escherichia coli was increased about 750 times.
[0095]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a plasmid pET-30a (+) MI of the present invention.

Claims

A protein derived from a bacterium of the genus Thermobifida and having the following properties (A) and (B):
(A) having a mannose isomerase activity,
(B) The average molecular weight measured by SDS-PAGE is about 41,000.

A protein having the following properties (A), (B) and (C):
(A) having a mannose isomerase activity,
(B) the average molecular weight measured by SDS-PAGE is about 41000,
(C) The amino acid sequence at the N-terminus is the sequence represented by SEQ ID NO: 3.

The protein according to claim 2, which is derived from a bacterium belonging to the genus Thermobifida .

The protein according to any one of claims 1 to 3, which is derived from Thermobifida sp. MBL10003 (Accession No. FERM BP-7632) strain.

A protein selected from the group consisting of:
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
(B) a protein comprising the amino acid sequence of (a), wherein the protein comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added, and has mannose isomerase activity;
(C) A protein comprising an amino acid sequence having at least 60% homology with the protein comprising the amino acid sequence of (a), and having mannose isomerase activity.

The protein according to claim 5, wherein the homology in (c) is at least 80%.

A polynucleotide encoding the protein according to any one of claims 1 to 6.

A polynucleotide selected from the group consisting of:
(I) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2,
(Ii) a polynucleotide comprising a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted, inserted or added in the base sequence (i), and encodes a protein having mannose isomerase activity;
(Iii) A polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 60% homology with the polynucleotide comprising the nucleotide sequence of (i), and encoding a protein having mannose isomerase activity.

9. The polynucleotide of claim 8, wherein the homology in (iii) is at least 80%.

An expression vector comprising the polynucleotide according to any one of claims 7 to 9.

A host transformed with the expression vector according to claim 10.

A method for producing a target protein, comprising culturing the host according to claim 11, and collecting a protein having mannose isomerase activity from the resulting culture.

A mannose isomerase enzyme preparation comprising a protein according to any one of claims 1 to 6 and at least one protein selected from the group consisting of proteins produced by the method according to claim 12. .

A protein according to any one of claims 1 to 6, and at least one protein selected from the group consisting of proteins produced by the method according to claim 12, or an enzyme according to claim 13. A method for producing mannose, comprising converting fructose in a fructose-containing solution to mannose using the preparation.