KR101727974B1 - 세라마이드를 포함하는 천연리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 1종 이상의 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질, 및 포집물질로서 세라마이드 및 히아루론산을 함유하는 천연리포좀 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

세라마이드를 포함하는 천연리포좀, 그 제조방법, 및 이를 포함하는 화장료 조성물{Natural liposome comprising ceramide, process for the preparation thereof, and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 세라마이드를 포함하는 천연리포좀, 그 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로, 바깥쪽으로부터 표피, 진피, 피하지방층의 3개의 부분으로 구성되어 있다.

이들 중 표피는 외부로부터의 여러 가지 자극(건조함, 자외선, 기타 물리화학적인 자극)에 대하여 장벽으로서 역할을 한다. 특히, 표피의 각질층은 표피의 가장 바깥쪽에 존재하여 자외선, 세균, 유해물질을 차단하는 역할을 한다. 이러한 각질층은 지질(lipid)이 풍부한 형태로 형성되어 있다.

표피가 장벽 역할을 수행하는데 있어서 각질 세포간지질이 중요한 역할을 하는데, 지질은 주로 세라마이드(50%), 콜레스테롤(25%), 지방산(10%)으로 이루어져 있다. 이중 세라마이드는 가장 중요한 지질로서 상기 세 가지의 주요 지질 중 어느 하나의 농도가 감소하거나 증가하게 되면 수분증발을 차단하고 수분을 유지하는 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. 유전적 요인 또는 노화에 의해 세라마이드의 생산이 감소되면 각질층의 보호장벽기능이 감소되고, 여러 가지 피부과적 증상, 예컨대, 아토피 피부염 및 건선 증상 등이 나타난다고 보고되어 있다(Fulmer amp; Kramer, J. Invest. Derm. , 86:598-602(1986); Tupker R. A. et al., ActaDerm. Venereol.Stockh , 70:1-5(1990)).

한편 피부는 유해물질 또는 유해작용에 대한 보호막으로서의 기능도 하지만 한편으로는 효능물질에 대한 장벽으로서 작용하기도 한다. 그러므로 효능물질을 선택적으로 피부에 침투시키기 위해서는 특수한 피부 흡수 전달 시스템이 필요하며 이를 위하여 가장 많이 연구되고 있는 것 중 하나가 리포좀(liposome)이다.

리포좀은 인지질을 수용액에 현탁할 때 생기는 소포로서 지질 이중충으로 구성된 막에 의해 외막과 격리되어 있으며 막 내에 콜레스테롤 당지질 등의 지질이나 막 단백질을 이입시킬 수 있다.

리포좀은 수용성 또는 유용성 물질을 포집할 수 있어 이들 원료의 운반을 도와주는 역할을 한다. 예를 들면 민감하고 피부에 흡수되기 어려운 원료들을 리포좀에 포집시켜 운반하면 이들 원료성분이 깨지지 않고 그대로 피부에 흡수될 수 있다.

기존의 여러 경피전달 시스템(transdermal delivery system)들 중에서 리포좀(liposome)은 생체막의 주요성분인 인지질로 구성되어 생체 친화적이며 수용성 또는 지용성 성분 모두를 리포좀의 지질 이중층으로 구성된 내부로 포집할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 리포좀은 이러한 장점에도 불구하고 제형이 불안정하고, 포집효율이 매우 낮다는 등의 문제를 안고 있다. 또한 리포좀의 원료로 사용되는 콜레스테롤은 리포좀의 지질막 형성이 견고해지면서 포집물질의 피부 투과율이 낮아지고 활성물질의 방출이 어렵다는 문제점이 있었다. 뿐만 아니라 리포좀 제조에 사용되는 용매, 방부제 등이 피부 자극을 유발하는 경우도 발생하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 다양한 종류의 리포좀이 연구되어 오고 있다.

한국등록특허 제603814호에는 레시틴과 세라마이드를 포함하는 리포좀 조성물이 개시되어 있다. 그러나 세라마이드와 히아루론산을 포함하는 천연리포좀은 개시되어 있지 않다.

한국등록특허 제603814호

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하여 피부 자극 등의 문제를 일으키지 않으면서도 체내에 흡수가 용이한 새로운 천연리포좀 및 이를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 1종 이상의 천연 유화제, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질, 및 포집물질로서 세라마이드 및 히아루론산을 함유하는 천연리포좀을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 천연리포좀을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 1종 이상의 천연 유화제를 용매와 혼합한 다음 50~80℃에서 초음파 처리하는 제1단계, 상기 제1단계의 생성물에 세라마이드 및 히아루론산을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계, 상기 제2단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 제3단계를 포함하는 천연리포좀의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 천연리포좀을 포함하는 피부 흡수 촉진제, 천연리포좀을 포함하는 아토피 피부염 치료제를 제공한다.

본 발명에 따르면, 효율적으로 피부에 흡수될 수 있으며 아토피 피부 완화에 유용한 천연리포좀을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 태양에 따른 세라마이드 천연리포좀의 제조방법을 나타낸다.
도 2a, 도 2b, 도 2c는 각각 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀의 1만배 배율의 SEM 사진이고, 도 2d, 도 2e, 도 2f는 각각 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀의 5만배 배율의 SEM 사진이다.
도 3a~도 3c는 각각 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀의 입도 분포 그래프를 나타낸다.
도 4a~도 4c는 각각 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀의 제타전위 그래프를 나타낸다.
도 5은 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀의 처리농도별 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 6a~도 6d는 각각 증류수, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice 피부 절편의 공초점주사레이저현미경 사진이다.
도 7a~도 7d는 각각 증류수, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 등 피부의 디지털카메라 사진이다.
도 8a~도 8d는 각각 증류수, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 등 피부를 확대한 주사전자현미경(SEM) 사진이다.
도 9a는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 증류수, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 피부염 유발 사진이다.
도 9b는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 등 피부의 피부염 유발부위 피부두께를 측정한 그래프이다.
도 9c는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 피부 조직 내 IgE 함량을 측정한 그래프이다.
도 9d는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 비장 수치를 측정한 그래프이다.
도 9e는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 피부염 정도에 대한 광학현미경 관찰 결과이다.
도 9f는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 비만세포에 대한 광학현미경 관찰 결과이다.
도 9g는 각각 아토피 유발 인자 무처리, 아토피 유발 인자 처리, 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀 처리에 따른 Hairless mice의 호산구에 대한 광학현미경 관찰 결과이다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 세라마이드 천연리포좀을 보다 상세하게 설명한다.

그러나 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

1. 유화제

유화제는 인지질과 지방산으로 이루어져 있다.

인지질로는 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol), 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인지질이 사용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산(stearic acid), 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산이 사용될 수 있다. 지방산은 1 내지 10 중량% 포함될 수 있다.

기타 유화제로서 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate), 소르비탄올리베이트(Sobitanolivate - 올리브유래)가 사용될 수 있다.

유화제로는 2 이상의 유화제가 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 제1 유화제로서 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 리소포스파티딜콜렌(lysophosphatidylcholine), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid - 콩유래)의 조성물이, 제2 유화제로서 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine - 콩 유래)이 사용될 수 있다. 이 경우 제1 유화제 성분은 1 내지 5 중량%, 제2 유화제 성분은 0.5 내지 2 중량% 포함될 수 있다.

또한 제1 유화제, 제2 유화제 외에 제3 유화제로서 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate) 및 소르비탄올리베이트(sorbitanolivate - 올리브유래)의 조성물이 추가로 사용될 수 있다.이 경우 제1 유화제 성분은 1 내지 5 중량%, 제2 유화제 성분은 0.5 내지 2 중량%, 제3 유화제 성분은 0.5 내지 2 중량% 포함될 수 있다.

또한 이들과 함께 천연 지방산이 사용될 수 있다. 바람직하게는 달맞이꽃 오일이 천연 지방산으로 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연 지방산은 1 내지 10 중량% 포함될 수 있다.

2. 포집물질

리포좀의 인지질층 내부에 포집될 수 있는 포집물질로는 하아루론산(히아루론산 1% solution), 세라마이드(효모유래세라마이드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 물질이 사용될 수 있다. 하아루론산(히아루론산 1% solution)은 1 내지 10 중량%, 세라마이드(효모유래세라마이드)는 0.1 내지 1 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

히아루론산은 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민으로 된 이루어진 고분자 화합물로서 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 히아루론산은 수산화기가 많기 때문에 친수성 물질로서 피부에 보습 작용을 한다.

세라마이드는 친수성기와 친유성기를 동시에 가지고 있어서 피부 속 수분 증발을 억제한다. 또한 세라마이드는 이물질의 침투를 저지하는 피부 장벽으로서 작용하여 염증의 조절이나 상처 회복에도 중요한 기능을 수행한다.

3. 용매

용매로는 증류수, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 에탄올이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 증류수, 글리세린이, 더 바람직하게는 증류수가 사용될 수 있다. 용매의 함량은 유화제, 포집가능물질 및 방부제의 함량의 잔량이다.

4. 방부제

방부제로는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물, 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연추출물이 사용될 수 있다. 천연추출물이라는 점에서 통상적으로 사용되는 방부제인 벤조산, 파라옥시벤조산에스테르, 메틸클로로이소티아졸리논의 혼합물, 페녹시에탄올 등과는 구별된다. 방부제는 일반적으로 1 내지 5 중량% 포함될 수 있다.

5. 리포좀의 제조

본 발명에 따른 리포좀은 초음파를 이용하여 제조될 수 있다.

[초음파 이용 방법]

1종 이상의 유화제를 증류수 일부와 혼합한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor)를 이용하여 50~80℃에서 초음파 파쇄한다. 초음파 파쇄는 혼합물을 균질화하기 위한 작업이다. 유화제가 균질화되면 포집물질을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합한다. 유화제와 포집물질이 완전히 균질화되면 40~60℃로 가온된 나머지 증류수와 천연추출물(방부제)을 넣고 초음파 파쇄를 통하여 혼합하여 리포좀 형태의 입자를 형성한다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 천연리포좀을 제조한다. 그 제조공정을 도 1에 도시하였다.

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본 발명에 의한 리포좀은 피부투과율을 높일 수 있어 흡수율을 개선할 수 있어 유효성분이 피부에 효과적으로 작용할 수 있도록 한다. 따라서 본 발명에 의한 리포좀은 화장료 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스, 메이컵베이스, 파운데이션, 염모제, 샴푸, 린스, 보디세정제, 치약, 마스크시트 및 구강청정액 형태의 화장료 조성물에 사용될 수 있다.

<실시예 1>

하기 표 1의 조성에 따라 리포좀을 제조하였다.

	원료	실시예 1 (단위: 중량 %)
유화제	유화제 1	2.5
	유화제 2	1
	유화제 3	1
지방산	달맞이꽃오일	5
방부제		1
용매	D. I. WATER	78.5
포집물질	히아루론산	10
	세라마이드	1

유화제 1: 유화제1 전체 100중량%를 기준으로, 포스파티딜콜린 67 중량%, 리소포스파티딜콜린 8 중량%, 포스파티딜에탄올아민 8 중량%, 팔미트산 3 중량%, 스테아르산 1 중량%, 올레산 3 중량%, 리놀레산 7중량%, 리놀렌산 3 중량%

유화제 2: 하이드로지네이티드포스파티딜콜린(hydrogenated phophatidylcholine - 콩유래)

유화제3: 유화제 3 전체 100중량%를 기준으로, 세테아릴올리베이트(Cetearylolivate) 50 중량% 및 소르비탄올리베이트(Sobitanolivate - 올리브유래) 50 중량%

방부제: 초피나무열매추출물:할미꽃추출물:어스니어추출물이 1:1:1의 중량비로 포함됨

* HA: 히아루론산(1% 용액)

* CER: 세라마이드(효모유래세라마이드)

구체적인 제조과정은 다음과 같다.

먼저 상기 표 1에 기재된 바와 같이 세라마이드 1중량%, 히아루론산 10 중량%, 달맞이꽃오일 5중량%를 혼합한 후 초음파 파쇄기(Ultrasonic Liquid Processor, QSONICA, USA)를 이용하여 세라마이드가 균질화 될 때까지 파쇄하여 유상을 제조하였다. 유화제 1, 2, 3을 각각 2.5중량%, 1 중량%, 1중량%의 비율로 증류수 1/3과 혼합한 후 65℃에서 초음파 파쇄하였다. 상기 유화제가 균질화되면 먼저 제조한 유상을 첨가한 후 초음파 파쇄하여 혼합하였다. 유화제와 세라마이드, 히아루론산, 달맞이꽃오일이 완전히 균질화되면 50℃로 가온된 나머지 증류수(2/3)와 천연추출물인 방부제 1중량%를 천천히 혼합하면서 초음파 파쇄하여 리포좀 형태의 입자를 형성하였다. 이후 온도를 서서히 낮추면서 최종적으로 5분간 초음파 파쇄를 하여 상기 입자를 보다 작고 균일하게 만들어 최종적으로 세라마이드 천연리포좀을 제조하였다. 제조공정을 도 1에 도시하였다.

<비교예 1>

세라마이드, 히아루론산, 유화제3, 달맞이꽃 오일을 모두 실시예 1과 동일한 양을 사용하고 증류수를 잔량 사용하여 혼합하고 65℃까지 가열한 후 6000rpm, 5분간으로 유화시킨 것으로, 리포좀화하지 않은 유화 혼합물을 제조하였다.

<비교예 2>

비교예 2의 리포좀으로는 Cerasome(lucasmyer 판매)을 사용하였다. Cerasome은 물(23.5 중량%), 글리세린(45 중량%), 옥틸도데칸올(20 중량%), 하이드로제네이티드 레시틴(6 중량%), 세라마이드(5 중량%), 1,2-헥산디올(0.25 중량%),카프릴릴글라이콜(0.25 중량%)을 구성성분으로 포함한다.

시험예 1: 리포좀 입자의 형태 분석

전자주사현미경(Scanning Electron microscope S-1700, hitachi)을 이용하여 상기 실시예 1의 리포좀, 비교예 1의 혼합물, 실시예 2의 리포좀 입자의 형태와 크기를 분석하였다. 측정은, 제조된 시료를 동결 건조한 다음 이를 얇게 펴서 PdPt 혼합 촉매로 1회 코팅한 후 이루어졌다.

세라마이드를 포집한 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀, 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀을 전자주사현미경(SEM)으로 확인한 다음 SEM 사진을 찍어 그 결과를 각각 도 2a, 도 2b, 도 2c에 나타내었다(1만배 배율). 또한 이들에 대하여 5만배 배율을 적용한 SEM 사진을 각각 도 2d(실시예 1의 세라마이드 천연리포좀),도 2e(비교예 1의 혼합물), 도 2f(비교예 2의 리포좀)에 나타내었다.

도시된 바와 같이 실시예 1에 따른 세라마이드 천연리포좀은, 1만배, 5만배 배율로 확대하여 확인한 결과(각각 도 2a, 도 2d), 백색의 구형의 형태를 가지는 것으로 나타났다.

비교예 1에 따른 혼합물은 도 2b, 2e에 도시된 바와 같이 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀에 비해 입자가 크고, 울퉁불퉁한 구형의 형태를 나타내었다. 비교예 2에 따른 리포좀은 도 2c, 2f에 도시된 바와 같이 입자가 일정하지 않으며, 구형 또는 직사각형의 형태를 나타내었다.

시험예 2: 리포좀 입자의 크기 분석

레이저 입도분석기(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 입자의 크기를 측정하였다.

평균입자크기를 하기 표 2에 나타내었고, 입자크기의 분포도를 도 3에 나타내었다.

	평균입자크기(nm)
실시예 1	124.4
비교예 1	776.9
비교예 2	130.2

상기 표 2에서 보듯이 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀의 평균입자크기는 124.4nm로 나타났다. 도 3a에 도시된 바와 같이 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 안정적인 입자 분포를 갖는 것으로 나타났다. 반면, 세라마이드와 원료를 유화공정으로 제조한 비교예 1의 혼합물은 평균입자크기가 776.9nm로, 상대적으로 입자가 더 크고, 입자크기의 분포도도 더 넓게 나타났다(도 3b). 비교예 2의 리포좀은 평균입자크기가 130.2nm로 측정되었으며, 입자분포도는 비교적 균일한 것으로 나타났다(도 3c).

시험예 3:제타전위 분석

ELS-Z(Electrophoretic Light Scattering Spectrophotometer ELS-8000, Otsuka)를 이용하여 리포좀입자의 제타전위를 측정하였다.

제타전위를 하기 표 3에 나타내었고, 제타전위 그래프를 도 4에 나타내었다.

	제타전위(mV)
실시예 1	-61.74
비교예 1	-52.31
비교예 2	-35.52

상기 표 3에서 보듯이 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 -61.74mV의 제타전위 값을 나타냈다. 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 음이온성 전하지질을 포함하고 있어 제타전위의 절대값이 크고, 이에 따라 간접적으로 분산성이 우수하다는 것을 알 수 있다. 비교예 1은 -52.73mV, 비교예 2는 -35.52mV의 제타전위값을 나타냈으며 상대적으로 입자가 가지는 전하량이 적은 것으로 확인되었다.

시험예 4: 포집율 측정

완성된 리포좀 현탁액의 일정량을 취하고 1.2㎛ syringe filter를 이용하여 리포좀 내 포집되지 않은 물질을 제거하였다. 그런 다음 에탄올을 이용하여 리포좀 막을 파괴시켰다. 기능성 물질이 포집되기 전, 후의 세라마이드 흡광도를 측정하고 아래 식으로 환산하여 기능성 물질의 포집율을 나타내었다.

[기능성 물질]

포집율(%) = 필터를 통과한 세라마이드의 흡광도/처음 넣어준 세라마이드의 흡광도 * 100

포집율을 하기 표 4에 나타내었다.

	세라마이드포집율(%)
실시예 1	95.1
비교예 2	88.45

실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 95.1%의 높은 포집율을 나타내었다. 반면 비교예 2의 리포좀은 포집율이 88.45%로 실시예 1보다는 낮은 것으로 확인되었다. 비교예 1은 리포좀화 하지 않은 원료이므로 포집율을 측정하지 않았다.

시험예 5: 가변형성 측정

제조된 리포좀의 가변형성 평가를 위해 mini extruder를 사용하여 세라마이드 천연리포좀이 인공 투과장벽을 통과하는 정도를 측정하였다. 구체적으로, 실시예 1과 비교예 2의 리포좀 현탁액에 0.2MPa의 압력을 1분간 가했을 때 폴리카보네이트 막(0.08㎛ 크기의 기공 보유)을 통과하여 나온 리포좀 현탁액의 양과 membrane을 통과한 리포좀 입자의 크기를 측정하였다. 가변형성은 아래식으로 환산하였다.

가변형성지수(Deformability Index) = J_flux × (rv/rp)²

J_flux = 1분 동안 extrusion된 셀포좀의 양

rv = extrusion 후의 셀포좀 입자크기

rp = filter membrane의 pore size

가변형성지수를 하기 표 5에 나타내었다.

	가변형성지수(Deformability index)
실시예 1	31.99
비교예 2	8.12

가변형성지수는 리포좀 입자가 각질층을 쉽게 통과할 수 있는지 확인하는 실험방법이다. 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 가변형성지수가 31.99이므로 입자가 탄성을 가짐으로써 각질층을 쉽게 통과할 수 있을 것으로 판단된다. 반면, 비교예 2의 리포좀은 가변형성지수가 8.12로 실시예 1에 비해 낮은 것으로 확인되었다. 비교예 1은 리포좀화 하지 않은 원료이므로 가변형성지수를 측정하지 않았다.

시험예 6: 세포독성 확인

48 well에 Fibroblast 세포 1 × 10⁴개를 분주하고, 24시간 뒤에 새 배지로 교체한 후 0.1 내지 5% 농도의 세라마이드 천연리포좀 원료를 24시간 동안 처리하였다. 이후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyltetra zolium bromide (0.1 mg/ml)을 각 well에 처리하여 3시간 배양한 후 형성된 insoluble formazan을 0.04N HCl/Isoprophanol에 녹이고 ELISA reader를 통해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세라마이드 천연리포좀(실시예 1), 세라마이드 혼합물(비교예 1), 종래기술의 세라마이드 리포좀(비교예 2)의 세포독성을 비교하여 리포좀의 안전성을 확인하였다(도 5). 비교예 1의 세라마이드 혼합물과 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀을 처리한 세포는 5% 농도까지 95% 이상의 생존율을 유지하였다. 반면 비교예 2의 종래기술의 세라마이드 리포좀을 처리한 세포는 1% 처리농도까지 100%의 생존율을 유지하다가 5% 처리농도에서는 72% 수준으로 감소하였다. 즉, 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 비교예 2의 종래기술의 리포좀에 비해 세포독성이 적어 안전성이 우수한 것으로 나타났다.

시험예 7: 공초점주사현미경을 이용한 피부 흡수 능력 평가

플루오레세인(Fluorescein)을 함께 혼합한 세라마이드와 세라마이드 천연리포좀을 Hos:HR-1(Hairless mice)의 등피부에 30분간 흡수시킨 후 피부조직을 회수하였다. 회수한 피부를 10% 포르말린에 24시간 동안 침지시킨 후, 다시 30% 수크로스에서 12시간 동안 침지하였다. 고정된 피부조직의 단면을 절단하여 공초점주사현미경(CLSM)으로 관찰하였다.

세라마이드가 흡수된 피부조직을 공초점주사현미경으로 확인한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6a는 플루오레세인과 증류수를 혼합하여 처리한 피부에 대한 피부조직사진을, 도 6b는 실시예 1에 따라 플루오레세인과 세라마이드를 혼합하여 담지한 리포좀을 처리한 피부에 대한 피부조직사진을, 도 6c는 비교예 1에 따라 플루오레세인과 세라마이드를 혼합하여 처리한 피부에 대한 피부조직사진을, 도 6d는 비교예 2에 따라 플루오레세인과 종래기술의 세라마이드 리포좀을 혼합한 피부에 대한 피부조직사진을 나타내었다.

도시된 바와 같이 정제수와 비교예 1의 혼합물로 처리하였을 때, 형광물질이 피부 내부로 흡수되지 않고 표면에 남아있음을 확인할 수 있었다(도 6a, 도 6c 참조). 실시예 1의 리포좀을 처리한 피부조직은 피부 표면의 아래쪽까지 형광물질이 흡수된 것으로 나타났다(도 6b 참조). 비교예 2의 리포좀을 처리한 피부 조직에서도 표면 아래쪽까지 형광물질이 관찰되었으나 형광발색정도가 실시예 1의 리포좀을 처리한 경우 보다 작은 것을 확인하였다(도 6d 참조).

시험예 8: 아토피 피부염 예방 및 완화 시험

5주령된 수컷 hairless mice(22-24g)를 1주일간 적응시킨 후 이를 동물실험에 사용하였다. 시험기간 중 사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며, 사육실의 온도(22±2℃), 상대습도(55±5%)와 명암은 12시간 주기를 유지하였다. 1-chloro-2,4-dinitrobenzene(DNCB)를 2.5%의 농도가 되도록 아세톤에 용해하여 아토피 유발 시약을 제조하였다. 아무것도 처리하지 않은 정상군을 제외한 모든 군에 3일 동안 상기 아토피 유발 시약을 도포하였다. 피부에 각질이 일어난 후 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀, 비교예 1의 세라마이드 혼합물, 비교예 2의 종래기술의 세라마이드 리포좀으로 3일 동안 처리한 다음 등피부의 변화를 관찰하여 디지털카메라로 촬영하였고, 등 피부 표면을 500배로 확대하여 주사전자현미경으로 촬영하였다.

세라마이드 리포좀을 처리한 등피부의 변화를 디지털카메라로 확인한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7a는 증류수로 처리한 mice의 피부사진을, 도 7b는 실시예 1에 따른 세라마이드 리포좀으로 처리한 mice의 피부사진을, 도 7c는 비교예 1에 따른 세라마이드 혼합물로 처리한 mice의 피부사진을, 도 7d는 비교예 2에 따른 세라마이드 리포좀으로 처리한 mice의 피부사진을 나타내었다. 도시된 바와 같이 정제수와 비교예 1의 혼합물, 비교예 2의 리포좀으로 처리한 등피부 표면에는 각질이 남아있는 것이 확인되었다(도 7a, 7c, 7d 참조). 반면 실시예 1에 따른 세라마이드 리포좀으로 처리한 등피부는 각질이 제거되었다(도 7b 참조).

세라마이드 리포좀을 처리한 등피부를 500배로 확대하여 촬영한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 7과 마찬가지로 정제수와 비교예 1, 비교예 2를 처리한 피부 표면은 각질에 의해 굴곡이 심하고 갈라진 모습이 관찰되었다(도 8a, 8c, 8d 참조). 반면 실시예 1의 세라마이드 리포좀을 처리한 피부 표면은 비교적 매끄러운 굴곡을 보였다(도 8b 참조).

시험예 9: 아토피 피부염 유발 및 면역학적 관찰

5주령된 수컷 hairless mice(22-24g)를 1주일간 적응시킨 후 이를 동물실험에 사용하였다. 시험기간 중 사료와 물은 자유로이 섭취시켰으며, 사육실의 온도(22±2℃), 상대습도(55±5%)와 명암은 12시간 주기를 유지하였다. DNCB를 1%와 0.5%의 농도가 되도록 아세톤에 용해하여 아토피 유발 시약을 제조하였다. 실험동물은 총 21마리를 사용하였으며 7군으로 나누어 각 3마리씩 cage에 배정하였다. 아무것도 처리하지 않은 Normal군(DNCB(-))을 제외하고는 모두 DNCB를 처리하여 아토피를 유발하였으며, 비교예 1의 세라마이드 혼합물, 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀, 비교예 2의 세라마이드 리포좀을 각각 100ul씩 처리하였고, 아토피 피부염 유발은 하기 표 6과 같은 실험과정을 따라 시행하였다.

1st week	2nd week	3th week	4th week	5th week
100㎕ 1% DNCB solution(daily)	50㎕ 0.5% DNCB solution(daily) 100㎕ sample 처리(daily)

<아토피 피부염 증상 관찰 및 피부 두께 측정>

아토피 피부염 증상 관찰 및 피부 두께 측정을 위하여 마우스 피부의 외형적 변화(홍반, 인설, 가피)를 digital camera(Canon IXUS 100 IS)를 이용하여 촬영하였으며, 피부 두께 측정을 위하여 마우스의 피부를 적출하여 digimaticcaliper장비(Mitutoyo)를 이용하여 두께를 측정하였다.

피부염이 유발된 마우스의 외형적 사진을 도 9a에 나타내었다. 정상군(무처리군)은 1주차와 6주차에서 큰 차이를 보이지 않은 반면 DNCB를 처리한 나머지 군에서는 아토피 유발을 확인할 수 있었다.

대조군으로 사용된 DNCB 처리군과 증류수를 처리한 실험군은 1주차에서 6주차로 갈수록 아토피 피부 개선의 효과 없이 계속 아토피가 유발되었다.

비교예 1의 세라마이드를 처리한 경우 4주차까지 아토피 완화 증상을 보이지 않았지만 5주차에서 증상의 완화를 확인할 수 있었다.

비교예 2의 세라마이드 리포좀을 처리한 경우 3주차에 가장 뚜렷한 아토피 증상을 확인할 수 있었으며, 4주차부터 완화 증상을 보였지만 5주차까지도 미세한 인설, 가피 현상을 보였다.

실시예 1의 세라마이드 천연리포좀을 처리한 경우 전반적으로 아토피 유발 증상이 미세하게 나타났고, 5주차의 경우 DNCB 무처리군과 비슷한 피부상태를 보여 아토피 증상이 완화된 것을 확인할 수 있었다.

5주차까지 실험이 끝난 뒤 마우스의 등피부를 적출하고 피부염이 유발된 부위의 피부두께를 측정한 결과를 도 9b에 나타내었다. 각 군의 마우스에 동일한 부위의 피부두께를 mm 단위로 측정하였고, 그 결과 아토피가 유발된 피부염에서는 경피의 수분손실도의 증가로 피부의 가피, 인설, 태선화 같은 경피의 각질층이 일어나 피부 두께가 증가함을 확인할 수 있었다. DNCB 무처리군은 0.51mm로 피부 두께가 가장 얇았으며, DNCB를 처리한 군에서 0.93mm로 가장 두꺼워졌다. 비교예 1의 세라마이드 혼합물 및 비교예 2의 종래기술의 세라마이드 리포좀은 각각 0.71, 0.90mm를 나타내었으며, 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 0.66mm로 다른 군과 비교하였을 때 DNCB 무처리군과 가장 유사한 두께를 나타내었다.

<Immuniglobulin E(IgE) 농도 측정 및 비장수치>

세라마이드 천연리포좀의 면역학적 평가를 위하여 실험 최종일에 마우스를 12시간 이상 절식시킨 후 에테르로 가볍게 마취시켰으며, 개복 후 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취한 후, 약 15분간 실온에 방치시키고 10,000rpm, 4℃에서 30분간 원심분리 하여 혈청을 분리하였다. 이후 마우스를 희생시켜 비장을 적출하고 그 무게를 측정하였다.

먼저, 혈청을 이용하여 세포 면역반응의 감소를 확인하기 위해 imminoglobulinE(IgE) 농도를 분석하였다. 실험은 mouse IgE ELISA Kit(Bethyl사)로 정량하였다.

피부 조직 내 IgE 함량을 측정하여 염증반응 유발 정도를 측정한 결과를 도 9c에 나타내었다.

DNCB 무처리군의 경우 Ige 함량이 0.67ng/ml로, DNCB처리군의 경우 28.15ng/ml로 나타났다. DNCB 무처리군과 비교하였을 때 DNCB처리군에서 IgE 함량이 유의적으로 높아짐으로써 염증반응이 일어난 것으로 보인다. 비교예 1의 세라마이드 혼합물 처리군의 경우 Ige 함량이 35.61ng/ml로 DNCB군보다 더 높은 수치를 나타내 염증 완화 효과가 없는 것을 알 수 있었고, 비교예 2인 종래기술의 세라마이드 리포좀을 처리한 경우 24.70ng/ml로 염증 반응 수치가 다소 낮아진 것을 확인할 수 있었다.

반면 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀은 DNCB군, 비교예 1, 비교예 2와 비교하였을 때 가장 적은 IgE 함량을 나타내어, 염증이 가장 적게 유발된 것을 확인할 수 있었다.

비장수치는 마우스의 비장무게(mg)를 실험 종료일 마우스의 몸무게(g)로 나눔으로써 얻을 수 있었다(도 9d 참조).

아토피를 유발시키지 않은 DNCB 무처리군은 비장수치가 2.78mg/g, DNCB 처리군은 5.26mg/g으로 나타났다. 비교예 1인 세라마이드 혼합물과 비교예 2인 종래기술의 세라마이드 리포좀을 처리한 군에서는 4.28mg/g, 4.09mg/g로 나타났다. 실시예 1인 세라마이드 천연리포좀의 경우 2.96mg/g으로 가장 낮은 수치를 나타내었다. 이 결과를 통해 세라마이드 천연리포좀이 비장 내의 T 림프구의 증가를 현저하게 억제한 것으로 볼 수 있다.

<조직학적 평가>

피부 조직에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 피부조직을 검사하였다. 피부를 10% 포르말린에 고정한 후 파라핀에 포매하여 4㎛ 두께로 박절하여 hematoxylin-eosin으로 염색하였다. 피부염의 정도는 상피의 과각화증, 부각화증, 과증식, 염증세포의 침윤 및 진피층의 염증 침윤 정도를 확인하였다(도 9e 참조). 조직을 염색하여 관찰한 결과, DNCB 무처리군 보다 DNCB 처리군의 피부가 두껍게 확장된 피부손상을 나타냈으며, 각질화와 백혈구의 침윤도 관찰되었다. 반면 실시예 1의 세라마이드 천연리포좀을 처리한 피부는 상피두께도 얇게 나타났으며, 부종과 백혈구 침윤도 적게 관찰되었다(도 9e 참조).

한편 toluidine blue 염색을 통해 비만세포를 염색하고(도 9f 참조), 호산구 확인을 위해 congo red 염색을 한 후 광학현미경으로 관찰하였다(도 9g 참조). 비만세포와 호산구의 경우, DNCB 무처리군에 비해 DNCB 처리군의 피부에서 세포수가 증가하는 것을 확인하였다(도 9f, 9g). 비교예 1의 세라마이드 혼합물 처리군과 비교예 2인 종래기술 세라마이드 리포좀 처리군에서는 비만세포와 호산구의 세포수가 감소하지 않았으나 실시예 1인 세라마이드 천연리포좀을 처리한 피부에서는 세포수가 DNCB 수준으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 9f, 도 9g)

Claims (15)

1종 이상의 천연 유화제, 천연 지방산, 용매 및 천연 방부제를 함유하는 리포좀 구성 물질, 및
포집물질로서 세라마이드 및 히아루론산
을 포함하는 천연리포좀으로서,
상기 천연 유화제를 2 내지 9 중량%,
상기 천연 지방산을 1 내지 10 중량%,
상기 천연 방부제를 1 내지 5 중량%,
상기 히아루론산을 1 내지 10 중량%
상기 세라마이드를 0.1 내지 1 중량%
상기 용매를 잔량 포함하며,
상기 천연 유화제를 상기 용매와 혼합한 다음 50~80℃에서 초음파 처리하는 제1단계, 상기 제1단계의 생성물에 세라마이드, 천연 지방산 및 히아루론산을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계를 포함하는 방법에 의하여 형성되며,
상기 천연 유화제는 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 하이드로지네이티드포스파티딜콜린, 포스파티딜산, 포스파티딜 세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시롤, 및 이들의 수소첨가 생성물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인지질; 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 및 리놀렌산(콩유래)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 지방산; 또는 상기 인지질과 상기 지방산을 포함하고,
상기 용매는 증류수, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린, 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유래 용매이고,
상기 천연 지방산은 달맞이꽃 오일을 포함하고,
상기 천연 방부제는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물 및 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연유래추출물인 천연리포좀.

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제1항에 있어서,
소르비탄올리베이트 및 세테아릴올리베이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 유화제를 추가로 포함하는 천연리포좀.

제1항에 있어서,
상기 용매는 증류수인 천연리포좀.

제1항에 있어서,
상기 천연 방부제는 초피나무열매추출물, 할미꽃추출물 및 어스니어추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연유래추출물인 천연리포좀.

삭제

제1항에 있어서,
피부 흡수 촉진용 천연리포좀.

제1항에 있어서,
아토피 피부염 예방 및 완화용 천연리포좀.

제1항의 천연리포좀을 함유하는 화장료 조성물.

1종 이상의 천연 유화제를 용매와 혼합한 다음 50~80℃에서 초음파 처리하는 제1단계,
상기 제1단계의 생성물에 세라마이드, 달맞이꽃 오일 및 히아루론산을 첨가한 후 초음파 처리하여 혼합하는 제2단계,
상기 제2단계의 생성물에 40~60℃로 가온된 용매와 천연 방부제를 첨가하고 초음파 처리하여 리포좀을 형성하는 제3단계
를 포함하는 제1항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 천연리포좀의 제조방법.

제12항에 있어서,
상기 제3단계 이후에 온도를 서서히 낮추면서 초음파 처리하는 제4단계
를 추가로 포함하는 천연리포좀의 제조방법.

제1항의 천연리포좀을 포함하는 피부 흡수 촉진제.

제1항의 천연리포좀을 포함하는 아토피 피부염 치료제.

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