KR101722836B1

KR101722836B1 - 암 발병의 예측, 조기 진단 및 치료제로써의 nkx6.3의 용도

Info

Publication number: KR101722836B1
Application number: KR1020150069359A
Authority: KR
Inventors: 박원상; 윤정환; 최원석
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2017-04-18
Also published as: JP6312861B2; KR20150133152A; JP2017523129A

Abstract

본 발명은 암 발병 예측, 조기 진단 및 치료제로써의 NKX6.3의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 NKX6.3의 단백질 발현양, mRNA 발현양, DNA 카피 수를 통하여 암 발생을 예측하고 조기에 진단하며, NKX6.3 단백질 또는 유전자를 투여하여 암을 예방하고 치료하기 위한 NKX6.3의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NKX6.3은 암세포에서 활성 또는 발현이 억제되어 있어 암을 조기에 진단할 수 있는 진단용 조성물로 활용할 수 있을 뿐만 아니라, NKX6.3의 발현을 유도하여 암세포의 생존과 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하는 기능을 발휘하는 바 항암 치료용 조성물로도 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

암 발병의 예측, 조기 진단 및 치료제로써의 NKX6.3의 용도{Use of NKX6.3 for onset prediction, early diagnosis and treatment of cancer}

본 발명은 암 발병의 예측, 조기 진단 및 치료제로써의 NKX6.3의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 NKX6.3의 단백질 발현양, mRNA 발현양, DNA 카피 수를 통하여 암을 조기에 진단하고, NKX6.3 단백질 또는 유전자를 투여하여 암을 치료하기 위한 NKX6.3의 용도에 관한 것이다.

위 상피는 관 형태의 분기된 위선(gastric glands)을 형성하며 위선은 다양한 세포를 포함한 복잡한 구조를 가지고 있다. 일반적으로 위 상피세포는 매우 빠른 세포 회전율을 가지는 세포로 매 3~5일에 상피의 재생을 유도하지만 빠른 회전율에도 불구하고 세포사멸을 통해 위선의 상피세포는 항상성을 유지한다. 만능 줄기세포는 위선의 목 또는 협부에 위치하고 있으며, 줄기세포는 유사분열 후 위선의 상 또는 하부로 이동하고 다양한 유형의 세포로 분화된다. 최근 연구 결과에 따르면 위 점막의 염증은 주로 헬리코박터 파이로리 균에 감염되어 발생하고 위축성 위염, 장 상피로의 화생(장형화생)이나 이형성의 여러 단계를 거쳐 위암 발병에 관여하는 것으로 알려지고 있다. 이중 장형화생은 위 점막상피세포가 장 점막상피세포로 분화되는 것으로 위암의 전암 병변으로 알려지고 있다. 비록 위암을 정복하기 위해 많은 연구들이 진행되었고 진행되고 있으나, 위암 발생 및 진행에 대한 정확한 분자적 기전은 아직 잘 모르는 실정이며, 위암은 세계적으로 가장 높은 발명률과 사망률을 나타내는 악성 종양 중 하나에 해당한다.

많은 호메오도메인(homeodomain) 전사인자들이 세포의 분화 및 발달 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 이러한 호메오박스 유전자 중에 NKX 패밀리 멤버들은 중추 신경계, 위장관 및 췌장에서 세포의 운명을 결정하는 등 발달 및 분화 과정에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서, NKX 유전자의 서브 패밀리인 NKX6의 세번째 멤버인 NKX6.3은 마우스 실험에서 위 말단부의 상피세포 중 하부/베이스 영역에서 주로 발현된다. 인체에서 NKX6.3은 염색체 8p11.21에 위치하며 266개의 아미노산 단백질을 인코딩하는데, NKX6.3은 위 단위(gastric unit)의 유사분열 후 상하로 이동하면서 분화하는 이동성 세포에서 발현되고, 위암에서 NKX6.3 유전자가 존재하는 염색체 8p11 부위의 이형 접합성 소실이 빈번하게 관찰되는바, 본 발명자들은 NKX6.3 유전자의 불활성화가 위 점막 상피세포의 비정상적인 분화와 항상성의 불균형을 초래할 수 있고, 그 결과 만적성인 위염과 암 발병의 원인이 될 수 있을 것이라고 예상하였다.

이에 본 발명자들은 NKX6.3 유전자가 위암의 발병에 연관되는지 확인하고자, 55개의 위암 샘플을 이용하여 NKX6.3 유전자의 유전학적, 후생학적 및 발현 분석을 진행하고, AGS와 MNK1 위암 세포주를 이용하여 기능 분석을 실시하였다. 그 결과 NKX6.3의 발현이 정상 위 점막 조직에 비하여 위암 조직에서 현저히 감소하였고, NKX6.3이 위 점막상피세포의 분화, 세포증식 및 세포사멸을 조절하는 종양 억제 유전자로 작용한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

미국 공개특허 US2004/0048377

본 발명의 목적은 NKX6.3(NK6 homeobox3)단백질 또는 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 있는 NKX6.3 단백질의 발현양, NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수를 확인하여 암 발생 예측, 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암제 후보물질을 세포에 처리하여 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 NKX6.3(NK6 homeobox3)단백질 또는 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NKX6.3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 유방암(breast cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 뇌암(brain cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 폐암(소세포 및/또는 비-소세포)(lung cancer (small and/or non-small cell)), 흑색종(melanoma), 난소암(ovarian cancer), 생식세포암(ovary (germ cell) cancer), 전립선암(prostate cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 음경암(penile cancer), 피부암(skin cancer), 연조직 육종(soft-tissue sarcoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinomas), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 갑상선암(thyroid cancer) 및 자궁암(uterine cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 암일 수 있다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 있는 NKX6.3 단백질의 발현양, NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수를 확인하여 암 발생 예측, 암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암 발생 예측을 위한 생물학적 시료는 비암성(前암성) 조직이고, 상기 암 진단 또는 예후 분석을 위한 생물학적 시료는 암 조직일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비암성(전암성) 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질의 발현양이 감소하거나; NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양이 감소하거나; 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수가 감소하는 경우; 암 발생 위험이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 특히 위 (stomach)에서 상기 비암성(전암성) 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질, Sox2 단백질 및 Muc5ac 단백질의 발현이 소실되고, Cdx2 및 Muc2의 발현이 증가되는 경우 장형화생이 진행되고 있어 암 발생이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질의 발현양이 감소하거나; NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양이 감소하거나; 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수가 감소하는 경우; 암으로 진단하거나 암의 악성도가 높은 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명은 항암제 후보물질을 세포에 처리하여 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보물질이 NKX6.3 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 NKX6.3 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 웨스턴 블라팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 NKX6.3은 암세포에서 활성 또는 발현이 억제되어 있어 암을 조기에 진단할 수 있는 진단용 조성물로 활용할 수 있을 뿐만 아니라, NKX6.3의 발현을 유도하여 암세포의 생존을 억제하고 세포사멸을 유도하는 기능을 발휘하는 바 항암 치료용 조성물로도 유용하게 사용될 수 있으며 위 점막세포로의 분화를 유도하여 전암 병변인 장형 화생을 억제하는 효과가 있다.

도 1은 위암 세포주와 위암 조직에서의 NKX6.3의 발현을 나타낸 것으로 A) AGS, MKN1, MKN28 및 MKN45 위암 세포주는 NKX6.3 단백질 발현을 나타내지 않으나, NKX6.3을 일시적으로 트랜스팩션한 AGS 세포주 또는 안정적으로 트랜스펙션한 AGS^NKX6.3 및 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서는 NKX6.3 단백질 발현이 확인되었고, B) 대부분의 위암 조직에서는 NKX6.3 단백질의 발현이 소실되거나 감소하였으며 C) 위암 조직과 각 예에 상응하는 비-암성 위 점막 조직에서 NKX6.3 유전자 프로모터 부위의 메틸화 및 비메틸화된 DNA 모두 관찰되었다.(U, upper stomach; M, middle stomach, L, lower stomach; N, normal; T, gastric cancer; M, methylated PCR product; U, unmethylated PCR product)
도 2는 비-암성 위 점막과 위암 조직에서 NKX6.3 DNA 카피 수와 NKX6.3 mRNA 발현 양상 변화를 관찰한 것으로 A) 55개의 위암 및 이에 대응하는 위 점막 조직에서 NKX6.3 DNA 수치를 SYBR green을 이용한 real time-QPCR로 분석한 후 GAPDH로 정상화하였고, B) NKX6.3 mRNA 발현을 SYBR green을 이용한 QRT-PCR로 분석한 후 GAPDH로 정상화 하였으며, C & D) 35 개의 정상 위 점막 조직 및 위암조직 샘플에서 NKX6.3 DNA 카피 수와 mRNA 발현과의 양적 상관관계를 확인한 결과이다(P<0.0001).
도 3은 위 점막 조직의 위축성 위염과 장형화생에서 NKX6.3의 발현을 관찰한 것으로 A) 55개의 위 점막 조직에서 mRNA 발현양 변화의 real-time RT-PCR 분석, B) 단핵세포 침투, 위축성 위염, 장형화생에서 NKX6.3 mRNA 발현의 산점도 분석, C) 위 점막 조직과 위축성 위염 또는 장형화생을 구분하기 위한 NKX6.3을 이용한 ROC 커브 분석 D) 단핵세포 침투, 위축성 위염, 장형화생에서 Cdx2 mRNA 발현의 산점도 분석 E) 위 점막 조직과 위축성 위염 또는 장형화생을 구분하기 위한 Cdx2를 이용한 ROC 커브 분석 결과이다.
도 4는 NKX6.3 이 위 분화 마커 Sox2 와 장 분화 마커 Cdx2 의 발현 조절자임을 확인한 것으로, A) NKX6.3 은 Sox2 유전자의 경우 3 ~ 4 kb 프로모터 부위 결합하여 전사인자로 작용하고. B) NKX6.3 은 Cdx2 유전자의 5 kb 프로모터 부위에서 전사인자로서의 결합능이 증가하였으며, C) NKX6.3 은 시간 의존성으로 Sox2 유전자의 발현을 유도하였고, D) Cdx2 유전자의 발현을 억제하였음을 확인한 결과이다.
도 5는 인체 위 점막조직에서 정상의 위선 (gastric gland)는 NKX6.3, Sox2 그리고 Muc5ac를 발현하고 있으나, 장형화생이 있는 위선은 이들의 발현이 소실되어 있고 장 분화 마커인 Cdx2 와 Muc2 를 발현하고 있어 상기 세포주 연구 결과를 인체 위 점막조직에서 검증하였다
도 6은 세포 생존 및 세포 사멸에 미치는 NKX6.3의 영향을 확인한 것으로, A) AGS^mock, MKN1^mock, AGS^NKX6 ^.3, MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 세포 생존을 MTT assay로 확인하였고, B) AGS^mock, MKN1^mock, AGS^NKX6 ^.3, MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 세포 증식 억제능을 BrdU incorporation assay로 확인하였고, C) AGS^NKX6 ^.3, MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 콜로니 형성 억제능을 확인하였으며, D)AGS^NKX6 ^.3, MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 세포주기 진행 억제능을 확인하였다.
도 7은 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 NKX6.3의 세포자멸사 유도능을 annexin V-binding assay로 확인하였다.

본 발명자들은 세포분화 과정에 이상이 생기면 암이 발생할 수 있다는 점에 착안하여 위암 조직에서 NKX6.3의 단백질 발현을 조사해 보았는데, 본 발명자들이 예상한 바와 같이 위암 조직에서는 NKX6.3의 발현이 소실되거나 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

즉, AGS, MKN1, MKN28 및 MKN45와 같은 위암 세포주에서 NKX6.3의 발현이 확인되지 않았고, 비암성 점막조직에서 NKX6.3 이 발현된 35개의 위암 조직 중 33개의 조직(94.3%)에서도 NKX6.3의 발현이 정상 조직에 비해 현저히 감소되거나 소실되는 것으로 확인되었다(도 1A 및 도 1B 참조).

이러한 NKX6.3 발현 감소가 NKX6.3 유전자의 체세포 내에서의 후성적 변화에 의해 야기되는지 확인해 보고자, 위암 조직에서 NKX6.3 유전자에 돌연변이를 확인해 보았다. 그러나, 위암 조직에서 특이할 만한 NKX6.3 유전자의 체세포 돌연변이는 확인되지 않았다(데이터 미도시).

이에, 본 발명자들은 NKX6.3 유전자 프로모터 부위의 메틸화 변화에 의해 위암 조직에서 NKX6.3 발현 양상이 달라지는지 확인해 보고자 메틸화 여부를 분석해 보았으나, 위암 조직과 정상 점막 조직에서 NKX6.3 유전자의 메틸화는 큰 차이는 없는 것으로 확인되어(도 1 C 참조), 위암의 발생 과정에서 NXK6.3의 체세포 돌연변이나 프로모터 과메틸화는 위암의 발생에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 결론을 내렸다.

이후 본 발명자들은 위암에서 NKX6.3 발현이 감소되는 기전을 추가로 확인하고자 DNA 카피 수와 mRNA 전사 수준을 real-time QPCR 및 real-time RT-PCR로 분석해 보았는데, 비-암성 위 점막 조직에 비해 위암 조직에서 각각 DNA 카피 수와 mRNA 전사 발현이 55개의 샘플 중 18(32.7%) 및 34(61.8%)개의 샘플에서 감소되는 것으로 나타났다(도 2A 및 도 2B 참조). 한편, 본 발명자들은 NKX6.3 DNA 카피 수와 mRNA 전사체 발현과의 관계를 비교하였는데, 비-암성 점막 조직과 위암 조직에서 모두 DNA 카피 수와 mRNA 전사체 사이에 유의한 상관관계를 나타내는 것을 알 수 있었다(P<0.0001)(도 2D 참조). 상기와 같은 결과로부터 본 발명자들은 위암에서 감소된 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수와 mRNA 전사 수준이 NKX6.3 단백질의 발현 감소에 주요 원인인 것으로 판단하였다.

NKX6.3은 신규한 전사인자로 위 점막 상피세포의 분화 과정에 작용하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 세포분화 과정의 이상 중 하나인 장형화생이 위암의 전암 병변이며 장형화생을 억제하면 암을 예방할 수 있다는 점에 착안하여 위축성 위염과 장형화생 병변을 나타내는 조직에서 NKX6.3의 발현양 변화를 조사하였는데, 위축성 위염과 장형화생 병변을 나타내는 조직에서 모두 NKX6.3의 발현이 현저히 감소되어 있었고, Cdx2의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3 참조).

이와 더불어 NKX6.3 이 세포분화에 관련된 단백 발현에 미치는 영향을 추가적으로 조사하였는데, NKX6.3 은 위 점막세포로의 분화를 유도하는 Sox2 유전자와 장 점막세포로의 분화를 유도하는 Cdx2 유전자의 발현을 조절하여 장형화생을 억제함을 확인할 수 있었다.

즉, NKX6.3 은 Sox2 와 Cdx2 유전자들의 프로모터 부위에 결합하는 전사인자로서 위 분화 마커인 Sox2 의 발현을 유도하는 반면, 장 분화 마커인 Cdx2의 발현을 억제하였다 (도 4 참조).

또한, 인체 위 점막조직에서 정상의 위선 (gastric gland)은 NKX6.3, Sox2 그리고 Muc5ac를 발현하고 있으나 장형화생이 있는 위선은 이들의 발현이 소실되고 장 분화 마커인 Cdx2 와 Muc2 가 발현하고 있었다 (도 5 참조).

이 외에도, 본 발명자들은 NKX6.3이 위암 세포의 성장과 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 확인해 보고자 NKX6.3을 안정적으로 발현하는 AGS^NKX6 ^.3및 MNK1^NKX6 ^.3 세포주를 제작하여 세포 생존을 관찰하였는데, NKX6.3의 발현은 이들 위암 세포주들의 생존, 세포 증식 및 콜로니 형성을 시간 의존적으로 억제하는 것을 알 수 있었다(도 6A, 5B, 5C & 5D 참조). 또한, AGS^NKX6 ^.3, MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 시간 의존적으로 이들 위암 세포주의 세포사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다(도 7 참조). 이들 결과로 부터 본 발명자들은 NKX6.3이 위암 세포의 정상적인 분화를 유도하고 세포증식을 억제하며 세포사멸을 조절하는 종양 억제자로써 기능함을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 NKX6.3 단백질 또는 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공할 수 있다.

바람직하게, 상기 NKX6.3 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 NKX6.3 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 NKX6.3과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 NKX6.3의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 NKX6.3의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 NKX6.3의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 NKX6.3의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른 단백질과 융합으로 만들어진 융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한 상기 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법이며 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드를 사용하여 NKX6.3 유전자가 삽입된 도 12의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터인 pcDNA3.1-NKX6.3을 제조하였다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질주입방법을 사용할 수 있다.

또한 상기 NKX6.3을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 종양세포를 치료하기 위한 유효량으로 표적 암 또는 종양세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암 또는 종양의 경우에는 본 발명의 약학적 조성물을 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항암 조성물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

또한, 본 발명은 암 예방, 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 있는 NKX6.3 단백질의 발현양, NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수를 확인하여 암을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 "예방"은 암의 전암성 병변에서의 암 발생 예방을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예방은 암의 발생을 근본적으로 억제할 가능성을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "예후"는 질병의 진행 가능성 과정, 특히, 질병의 차도, 질병의 재생, 종양 재발, 전이 및 죽음 가능성 측면에서의 예측을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 예후는 암 환자의 질병이 완치될 가능성을 의미한다. 한편, 본 발명에 있어서 암의 악성도가 높다는 것은 암의 침습 및 전이 가능성이 높고 재발의 위험이 높은 상태를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 면역분석(immunoassay) 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 상술한 본 발명의 암 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 암을 진단하는 데 이용될 수 있다. 이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 프로토콜에 따라 실시될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Sprin Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 세포 시료 분해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, -갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시 예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 본 발명의 마커에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅳ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, NKX6.3 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅴ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, -갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed. Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널의 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 변형 예에 따르면, 항체 대신에 본 발명의 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998) 에 상세하게 개시되어 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 저발현되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 현저히 약하게 나오는 경우에는 암으로 진단할 수 있다.

또한, 본 발명은 NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수를 확인하여 암을 진단할 수 있다.

mRNA 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수는 PCR 증폭과정을 통하여 확인할 수 있으며, 마이크로 어레이를 통해 확인할 수 있다.

명세서에 기재된 용어 "증폭"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-매개 증폭(transcription-mediated amplification; TMA, WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication, WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences, 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction(CP-PCR), 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR), 미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification(NASBA), 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명에서 진단에 사용되는 프로브 또는 프라이머는 NKX6.3 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다. 본 명세서에서 용어 "상보적(complementary)"은 어떤 특정한 혼성화(hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 용어 상보적은 용어 완전 상보적 (perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "프로브"는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고 디옥시리보 뉴클레오타이드이다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단 (예컨대, 플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법 (Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생물학적 시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직하게는 위(stomach) 조직세포에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

한편, 본 발명의 NKX6.3은 암세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 촉진시키는 활성이 있으므로, 본 발명은 상기 유전자를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은 항암제 후보물질을 세포에 처리하여 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 후보물질이 NKX6.3 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 NKX6.3 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현 수준이 증가한다는 의미는 NKX6.3 유전자의 발현이 증가되거나 또는 NKX6.3 단백질의 분해가 억제되어 NKX6.3 단백질의 농도가 증가되는 것을 말한다. 상기 NKX6.3 유전자 발현은 NKX6.3 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다.

또한, NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 웨스턴 블라팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행할 수 있다.

또한 본 발명의 NKX6.3을 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 NKX6.3의 발현정도를 측정할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50 내지 500에 이르는 검정 용적을 필요로 하며, 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

1-1. 위암 샘플 수득

총 55개의 동결된 위암 조직과 암 주위 비암성 점막 조직을 보건복지 가족부가 지원하는 한국 국립 바이오뱅크 분원인 전남대학교 화순 병원으로부터 수득하였다. 고지에 입각한 동의는 헬싱키 선언에 따라 제공되었고, 이에 따라 모든 환자로부터 서면 동의서를 얻었으며, 모든 실험은 가톨릭대학교 의과대학의 기관감사위원회로부터 승인을 받아 진행되었다(MC15SISI0015). 실험에 참여한 환자 중 가족성 암을 나타내는 환자는 확인되지 않았다.

1-2. 세포 배양 및 NKX6 .3의 트랜스펙션

AGS, MKN1, MKN28 및 MNK45 위암 세포주는 열로 불활성화된 10% FBS를 첨가한 RPMI-1640 배지를 이용하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다. 전체 NKX6.3-cDNA를 pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 발현 벡터에 클로닝 한 후, 총 5 mg의 발현 플라스미드를 60mm 디쉬에 배양한 AGS와 MKN1 세포주에 Lipofectamine Plus transfection reagent (Invitrogen)을 이용하여 제조자의 방식에 따라 일시적으로 트랜스펙션하였다.

또한 사람 NKX6.3을 안정적으로 발현하는 AGS 와 MKN1 세포주인 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주를 제작하였고, 안정적인 NKX6.3 단백 발현을 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

1-3. 통계 분석

세포 생존에 대한 NKX6.3의 효과를 분석하기 위하여 Student's t-test를 사용하였다. 데이타는 최소 세 번의 독립적인 실험을 거친 후, 평균표준편차로 나타내었다. 선형 회귀 상관 및 Chi-스퀘어 테스트를 NKX6.3의 DNA 카피 수 변화에 따른 mRNA 및 단백질 발현과의 상관관계를 분석하기 위해 사용하였다. p<0.05인 경우 통계적으로 유의미한 것으로 해석하였다.

< 실시예 2>

위암 세포주와 위암 조직에서의 NKX6 .3 단백질 발현양 감소

NKX6.3 단백질의 발현을 상기 35명의 환자로부터 채취한 위암 조직에서 웨스턴 블라팅 방법으로 조사하였고, 각 예에 상응하는 비암성-위장 점막 조직에서의 NKX6.3의 발현양도 함께 조사하였다. AGS, MKN1, MKN28, MNK45와 같은 위암 세포주에서도 NKX6.3의 발현양을 조사해 보았다. 웨스턴 블라팅을 위하여 세포를 용해시키고, 20% 폴리아크릴아미드 겔에 전기 영동한 후, Hybond-PVDF 멤브리인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 트랜스퍼하고, 항-NKX6.3 단일클론 항체 (Abcam, Cambridge, UK)로 반응시켰다. 단백질 밴드는 ECM 웨스턴 블라팅 검출 시약(Bid-Rad)으로 검출하였다.

그 결과, AGS, MNK1, MKN28 및 MKN45 위암 세포주에서는 NKX6.3 단백질의 발현이 관찰되지 않아, 이들 위암 세포주에서는 NKX6.3이 완전히 불활성화되어 있음을 확인할 수 있었다(도 1A 참조). 위의 상부 [분문(cardia)], 중부 [기저부(fundus), 코퍼스(corpus)], 및 하부 [공동(antrum)과 유문부(pylorus)]를 포함하는 비-암성 위 점막 조직 중 35개의 샘플에서 NKX6.3 단백질의 발현이 확인되었고, 이들의 위암 조직 중 33개(94.3%)에서는 그 발현이 소실되거나 감소된 것으로 확인되었다(도 1B 참조).

< 실시예 3>

위암 조직에서 NKX6 .3의 돌연변이 분석

상기 실시예 2의 NKX6.3의 감소된 발현이 유전자의 돌연변이와 연관되어 있는지 확인해 보고자 서열 분석을 실시하였다. 이를 위하여 각 종양 세포 및 이에 대응하는 비-암성 위 점막 세포로부터 게놈 DNA를 NKX6.3 유전자의 전체 코딩 영역을 커버하는 6 세트의 프라이머로 증폭하였다. NKX6.3의 돌연변이 검출을 위한 구체적인 프라이머는 GenBank accession No. NC_000008.11의 게놈 서열에 따라 디자인 하였으며, 구체적인 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

각각의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 절차는 표준 조건 하에서 실시하였다. 이를 간략하게 설명하면, 반응 혼합물을 12 분 동안 94℃에서 변성시킨 후, 40 초 동안 94℃에서 변성, 40 초간 56 ~ 60℃에서 어닐링하고 40 초 동안 72℃에서 연장하는 단계를 35 사이클 동안 반응시켰다. 72℃에서 최종 연장 단계는 5 분 동안 수행하였다. PCR 산물의 서열분석은 제조자의 프로토콜에 따라 사이클 시퀀싱 키트 (퍼킨 엘머, 포스터 시티, CA, USA)를 사용하여 수행하였다.

그 결과, 위암 세포에서 NKX6.3의 돌연변이는 확인되지 않았다. 신뢰성을 확보하기 위하여 PCR 및 서열 분석을 각각 2 차례 실시하였으나 결과는 동일한 것으로 나타났다.

< 실시예 4>

위암 조직에서 NKX6 .3의 메틸화 상태 분석

상기 실시예 2의 NKX6.3의 감소된 발현이 NXK6.3 유전자의 프로모터 영역의 메틸화에 의한 것인지 확인해 보고자 하였다. 이를 위하여 NKX6.3 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 상태는 DNA에 아황산 수소 나트륨 처리 후, 메틸화 특이적 PCR (MSP)에 의해서 측정하였다. 이황산 변형된 DNA 5㎕를 메틸화 또는 비메틸화된 NKX6.3을 분석하기 위한 NKX6.3 프라이머 2 세트를 사용하여 MSP 하였다. 이 때 사용한 프라이머는 상기 표 1에 표시하였다. PCR은 주형 DNA 5㎕, 각 프라이머 0.5μM, 각 dNTP 0.2μM, 1.5mM MgCl₂, 0.4 unit의 Ampli Taq gold polymerase(Perkin-Elmer), 3㎕ 10×버퍼를 이용하여 총 30㎕ 부피로 반응하였다. 반응 용액은 초기에 95℃에서 1 분 동안 변성시켰다. 증폭은 95℃에서 30 초, 59℃에서 30초, 72℃에서 30초간 40주기를 실시하고, 72℃에서 마지막으로 5 분간 추가 연장 반응하였다. PCR 산물은 2 % 아가로스 겔 상에 직접 적재하여 전기영동하고, EtBr 염색한 후 UV 조명에서 확인하였다.

그 결과, 모든 정상 조직과 위암 조직에서 모두 NKX6.3 유전자에 메틸화 및 비메틸화 된 부분을 보여주어(도 1C 참조), NKX6.3의 특정 메틸화가 위암 조직에서의 NKX6.3 발현에 영향을 미치지는 않는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

위암 조직에서 NKX6 .3의 DNA 카피 수 변화와 mRNA 발현 양상 변화 분석

위암 조직에서 NKX6.3의 발현양 감소가 NKX6.3의 DNA 카피 수 변화 및 mRNA 발현 양상 변화와 관계가 있는지 확인해 보고자 하였다. 이를 위하여, 위암 조직과 이에 상응하는 비-암성 위 점막 조직으로부터 게놈 DNA와 mRNA를 추출하여 정량한 후, Stratagene Mx 3000P QPCR system을 이용하여 real-time SYBR Green QPCR을 실시하였다. NKX6.3 DNA 카피 수를 확인하기 위한 특이적 프라이머는 Genbank accession No. NC_000008.11의 게놈 서열을 이용하여 디자인하였다. 모든 샘플은 GAPDH 특이적 프라이머로 PCR 증폭하여 정상화하였다. SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자 특이적 유전자-특이적 비-상동성 DNA 서열에 기초하여 디자인 하였고, 프라이머 서열은 상기 표 1에 기재한 바와 같다.

mRNA 발현을 확인하기 위하여 Roche Molecular System(Roche, Mannheim, Germany)에서 제조된 역전사 키트를 이용하여 제조자의 방식에 따라 cDNA를 합성하였다. QPCR을 위하여 50ng의 cDNA를 Fullvelocity SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 20 pmol/㎕의 순방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 Stratagene Mx 3000P QPCR system으로 증폭하였다.

그러나 낮은 Ct 값 때문에, real-time RT PCR은 45 주기 수행하였으며, mRNA 추출과 역전사의 신뢰도를 확보하기 위하여, 모든 샘플은 GAPDH 특이적 프라이머로 PCR 증폭하여 정상화하였다. 표준곡선법을 이용하여 유전자 발현의 상대적 양을 정량화하였는데, 이 방법은 다른 샘플에서 표적 DNA와 mRNA의 상대적인 양의 직접 비교에 사용될 수 있는 단위 이하 정규화 식 값을 제공한다. 모든 샘플은 이중으로 실험하여 평균값을 사용하였으며, DNA 카피 수와 mRNA 발현양이 mean test(암)/ reference(점막)의 비율이 0.5배 이하일 때 감소된 것으로 정의하였다.

그 결과, NKX6.3의 DNA 카피 수는 18 개의 위암 DNA에서 그 주변부의 위 점막 DNA에 비해 감소된 것으로 확인되었다(도 2A 참조). NKX6.3 유전자 전사체는 모든 예에 상응하는 비-암성 위 점막 조직에서 발현되고 있었다(도 2B 참조). mRNA 전사체의 발현 소실 또는 감소는 분석된 55개 위암 조직 중 34개(61.8%)에서 관찰되었다. 비-암성 위 점막 조직과 위암 조직에서 모두, NKX6.3의 DNA 카피 수와 mRNA 전사체 발현 간의 유의한 상관관계를 나타내었다(P<0.0001)(도 2C 그리고 2D 참조).

< 실시예 6>

NKX6 .3 발현이 Cdx2 발현 및 장형화생에 미치는 영향

real-time RT-PCR분석을 통해 55개의 위 조직에서 NKX6.3의 mRNA 발현량을 조사해 보았다. H.pyroli.의 감염, 위축성 위염, 장형화생이 없는 위 점막에서의 mRNA 발현의 평균값을 대조군으로 사용하였다. 각 경우의 mRNA 발현 변화는 대조군 위 점막의 평균값으로 정상화하였고, 0.5배 이하로 감소한 경우 mRNA 발현양이 감소한 것으로 정의하였다.

그 결과, 28개의 조직(50.9%)에서 NKX6.3의 mRNA 발현량이 감소하였다. 장형화생을 가지고 있는 20개의 위 조직 샘플 중 19개(95.0%)에서 NKX6.3 mRNA 발현 감소가 관찰되었다(도 3A 참조).

한편, 산점도 분석에서 NKX6.3 mRNA 발현은 단핵세포 침투(Student t-test, P<0.0001), 위축성 위염(P=0.0274), 장형화생(P<0.0001)과 밀접하게 연관되어 있었으나, 과립성 백혈구 침투(P=0.3550)와는 상관관계가 없는 것으로 나타났다(도 3B 참조).

인간 위 점막 조직으로부터 위축성 위염 또는 장형화생을 구분하기 위하여 NKX6.3을 사용하여 ROC 커브 분석을 실시해 보았다. 그 결과, NKX6.3 발현 정도는 위축성 위염과 장형화생 조직에서 각각 AUC 값이 0.6892(95% confidence interval[CI], 05463-0.8321; P=0.02386)과 0.9414(95% CI, 08847-0.9981; P<0.0001)로 나타났다(도 3C 참조).

Cdx2 mRNA 발현은 산점도 분석 결과 단핵세포 침투(Student t-test, P=0.0036), 위축(P=0.0038), 장형화생(P<0.0001)과 밀접하게 연관되어 있는 것으로 나타났다(도 3D 참조).

인간 위 점막 조직으로부터 위축성 위염 또는 장형화생을 구분하기 위하여 Cdx2를 사용하여 ROC 커브 분석을 실시해 보았다. 그 결과, Cdx 2 발현 정도는 위축성 위염과 장형화생 조직에서 각각 AUC 값이 0.7613(95% confidence interval[CI], 0.6250-0.8976; P=0.001812)과 0.9971(95% CI, 0.9895-1.005; P<0.0001)로 나타났다(도 3E 참조).

상기와 같은 결과를 종합하여 볼 때, 암으로 발전하기 전 단계인 위축성 위염이나 장형화생 단계에서 NKX6.3의 발현은 감소하고 Cdx2의 발현은 증가하는 것으로 나타나, 암으로 발전하기 전 병변인 위축성 위염 및 장형화생 단계에서 NKX6.3의 발현을 증가시키거나 Cdx2의 발현을 감소시키는 경우 암 발생을 예방할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 7>

NKX6 .3 발현이 위 점막상피세포의 분화에 미치는 효과 분석

위 상피세포에서 NKX6.3의 기능을 확인하기 위해 AGS 및 MKN1 세포주에 NKX6.3을 안정적으로 발현시킬 수 있도록 하였다. 이를 위하여 AGS와 MNK1 세포주에 NKX6.3을 안정적으로 발현하는 세포주인 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주을 제작하고, 이에 대한 대조군인 AGS^mock 와 MNK1^mock 세포주를 제작하였으며 NKX6.3의 안정적 발현은 웨스턴 블라팅으로 확인하였다.

이에 본 발명자들은 NKX6.3이 세포 분화에 미치는 영향을 분석하고자, NKX6.3 이 위 분화 마커인 Sox2 와 장 분화 마커인 Cdx2 의 전사인자로 작용하여 발현을 조절하는 지를 Chromatin immunoprecipitation-PCR 법으로 조사하였다.

그 결과, NKX6.3 은 Sox2 와 Cdx2 유전자들의 프로모터 부위에 결합하는 전사인자로서 위 분화 마커인 Sox2 의 발현을 유도하고 장 분화 마커인 Cdx2의 발현을 억제함을 확인하였다 (도 4 참조). 또한, 인체 위 점막조직에서 정상의 위선 (gastric gland)는 NKX6.3, Sox2 그리고 Muc5ac를 발현하고 있으나 장형화생이 있는 위선은 이들의 발현이 소실되고 장 분화 마커인 Cdx2 와 Muc2 가 발현하고 있어 세포주 연구 결과를 검증하였다 (도 5 참조).

< 실시예 8>

NKX6 .3에 의한 위암 세포주의 세포증식 억제 효과 분석

위 상피세포에서 NKX6.3의 기능을 확인하기 위하여, AGS 및 MKN1 세포주에 NKX6.3을 안정적으로 발현시킬 수 있도록 하였다. 이를 위하여 AGS와 MNK1 세포주에 NKX6.3을 안정적으로 발현하는 세포주인 AGS^NKX6.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주을 제작하고, 이에 대한 대조군인 AGS^mock 와 MNK1^mock 세포주를 제작하였다. AGS^NKX6.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 NKX6.3의 안정적 발현은 웨스턴 블라팅으로 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주는 대조군에 비하여 NKX6.3 단백질을 안정적으로 발현하는 것으로 확인되었다.

이에 본 발명자들은 NKX6.3이 세포 생존에 미치는 영향을 분석하고자, MTT[3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl -2,5-diphenyltetrazoliumbromide] 분석법에 의하여 AGS^mock, MNK1^mock, AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 24, 48, 72 시간째 세포 생존율을 분석하였다. 흡광도는 540nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였고, 세포 생존율은 mock(빈 벡터 + 리포펙타민)에 대해 상대적으로 관찰하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서는 시간이 경과함에 따라 NKX6.3이 상기 위암 세포의 생존을 현저히 억제시키는 것을 알 수 있었다(도 6A 참조). 또한 세포증식에 미치는 영향을 BrdU incorporation 법으로 조사한 결과 대조군에 비해 NKX6.3 이 위암 세포의 증식을 시간이 경과함에 따라 현저히 억제하였으며 콜로니 형성 또한 억제하였다 (도 6B 와 5C 참조). 이와 함께 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6.3 세포주에서 NKX6.3 은 세포주기 진행을 억제하였다 (도 6D 참조).

< 실시예 9>

NKX6 .3에 의한 위암 세포주의 세포사멸 분석

NKX6.3을 외부에서 도입한 경우 위암 세포주의 세포 사멸이 유도되는지 확인해 보고자 NKX6.3을 안정적으로 발현하는 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 FITC-표지된 annexin V 염색을 통해 세포 염색하여 세포 사멸을 분석해 보았다. 이를 위하여 제조자 방식에 따라 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3 세포주에서 배양 후 24, 48 및 72시간에서 Annexin V-binding assay를 실시하였다. 이를 위하여, AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3세포주는 차가운 PBS로 두 번 워싱하고, 100㎕ 바인딩 버퍼를 이용하여 재현탁한 후, 100㎕의 상층액을 400㎕의 블라킹 용액과 혼합하고, 각 혼합액에 5㎕(1㎍/ml)의 annexin V-FITC 와 5㎕의 PI (2 ㎍/ml)를 첨가하여 암실에서 15분간 반응시켰다. 이후 세포를 유세포분석기(FACS, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였고, PI 염색 없는 형광-양성 세포만을 사멸되는 세포로 간주하였다.

그 결과, NKX6.3을 발현하는 AGS^NKX6 ^.3 와 MNK1^NKX6 ^.3세포주에서 시간이 경과함에 따라 세포사멸하는 세포 수가 증가하는 것으로 나타났다(도 7 참조).

상기와 같은 결과를 통하여, NKX6.3은 위암 세포에서 특이적으로 발현이 감소됨을 알 수 있었고, 이와 같은 위암 세포주에 NKX6.3을 도입하면 위암 세포주 특이적으로 세포 증식을 억제하고 세포 사멸을 유도할 수 있으므로, NKX6.3은 위암 치료제로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Use of NKX6.3 for early diagnosis and treatment of cancer <130> PN1405-146 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 265 <212> PRT <213> homeobox protein Nkx-6.3 from Homo sapiens <400> 1 Met Glu Ser Asn Leu Gln Gly Thr Phe Leu Leu Asn Asn Thr Pro Leu 1 5 10 15 Ala Gln Phe Pro Glu Met Lys Ala Pro Val Cys Gln Tyr Ser Val Gln 20 25 30 Asn Ser Phe Tyr Lys Leu Ser Pro Pro Gly Leu Gly Pro Gln Leu Ala 35 40 45 Ala Gly Thr Pro His Gly Ile Thr Asp Ile Leu Ser Arg Pro Val Ala 50 55 60 Ala Pro Asn Asn Ser Leu Leu Ser Gly Tyr Pro His Val Ala Gly Phe 65 70 75 80 Gly Gly Leu Ser Ser Gln Gly Val Tyr Tyr Ser Pro Gln Val Gly Asn 85 90 95 Phe Ser Lys Ala Gly Asn Glu Tyr Pro Thr Arg Thr Arg Asn Cys Trp 100 105 110 Ala Asp Thr Gly Gln Asp Trp Arg Gly Gly Arg Gln Cys Ser Asn Thr 115 120 125 Pro Asp Pro Leu Ser Asp Ser Ile His Lys Lys Lys His Thr Arg Pro 130 135 140 Thr Phe Thr Gly His Gln Ile Phe Ala Leu Glu Lys Thr Phe Glu Gln 145 150 155 160 Thr Lys Tyr Leu Ala Gly Pro Glu Arg Ala Arg Leu Ala Tyr Ser Leu 165 170 175 Gly Met Thr Glu Ser Gln Val Lys Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Thr 180 185 190 Lys Trp Arg Lys Lys Ser Ala Leu Glu Pro Ser Ser Ser Thr Pro Arg 195 200 205 Ala Pro Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Asp Arg Ala Pro Ser 210 215 220 Glu Asn Glu Asp Asp Glu Tyr Asn Lys Pro Leu Asp Pro Asp Ser Asp 225 230 235 240 Asp Glu Lys Ile Arg Leu Leu Leu Arg Lys His Arg Ala Ala Phe Ser 245 250 255 Val Leu Ser Leu Gly Ala His Ser Val 260 265 <210> 2 <211> 798 <212> DNA <213> NKX6.3 DNA sequence from homo sapiens <400> 2 atggagtcca acctgcaggg gacgttcctg ctgaacaaca cgccgctggc tcagtttccg 60 gagatgaagg ccccggtgtg ccagtactct gtgcagaact ccttctacaa gctcagcccc 120 ccagggctgg gcccccagct ggccgccgga accccccacg ggatcacgga catcctgagc 180 aggcccgtgg ctgcgccgaa caacagcctc ctctccggct acccccacgt ggcaggcttt 240 ggggggctca gctcgcaggg ggtctactac agcccccagg tagggaattt ttccaaggct 300 gggaacgagt acccgacccg gacccggaac tgctgggcgg acacgggcca agactggcga 360 ggcgggcggc agtgcagcaa caccccagac cccctgagtg acagcataca caagaagaag 420 cacacccggc ccaccttcac ggggcaccag atctttgccc tggagaaaac ctttgagcag 480 accaagtact tggctggccc cgagagggca cggctggcat actcactggg catgaccgag 540 tcgcaggtca aggtgtggtt ccagaaccgc aggaccaagt ggcggaagaa gagcgccctg 600 gagccctcgt cctccacgcc ccgggccccg ggcggcgcgg gtgcaggcgc aggcggggac 660 cgcgcaccct cggagaacga ggacgacgag tacaacaagc cgctggaccc cgactcggac 720 gacgagaaga tccgcctgct gctgcgcaag caccgcgccg ccttctcggt gctcagcctg 780 ggagcgcaca gcgtctga 798

Claims

NKX6.3(NK6 homeobox3)단백질 또는 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물로서, 상기 암은 위암(stomach cancer)인 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 NKX6.3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 NKX6.3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
삭제
피검체로부터 채취된 생물학적 시료에 있는 NKX6.3 단백질의 발현양, NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수를 확인하여 위암 발생 예측, 위암 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서, 상기 위암 발생 예측을 위한 생물학적 시료는 비암성 또는 전암성(前암성) 조직이고, 상기 위암 진단 또는 예후 분석을 위한 생물학적 시료는 위암 조직이고, 상기 비암성 또는 전암성 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질의 발현양이 감소하거나; NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양이 감소하거나; 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수가 감소하는 경우; 위암 발생 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하되, 위 점막에서 상기 비암성 또는 전암성 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질, Sox2 단백질 및 Muc5ac 단백질의 발현이 소실되고, Cdx2 및 Muc2의 발현이 증가되는 경우 장형화생이 진행되고 있어 위암 발생이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
제6항에 있어서,
상기 위암 조직이 그 주변부의 정상 조직에 비해 NKX6.3 단백질의 발현양이 감소하거나; NKX6.3 단백질을 코딩하는 mRNA의 발현양이 감소하거나; 또는 NKX6.3 유전자의 DNA 카피 수가 감소하는 경우; 위암으로 진단하거나 위암의 악성도가 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
항암제 후보물질을 세포에 처리하여 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법으로서, 상기 암은 위암인 것인 방법.
제12항에 있어서,
상기 후보물질이 NKX6.3 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 NKX6.3 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 NKX6.3 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 웨스턴 블라팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.