KR101720935B1 - 구판 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물 - Google Patents

구판 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 구판을 압력 파쇄하여 핀밀이나 디스크밀로 미분쇄한 후, 미분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 중량비율로 혼합한 후, 열처리, 살균 습윤, 냉각, pH 조정, 단백가수분해 처리 공정 후, 여과하여 구판 추출물을 제조하는 것을 특징으로 하는 구판 추출물의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 성장호르몬관련 유전자 CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6, SOCS2, Tgfbr3, BMP4 또는 Rgs2의 발현을 증가시키는 구판 추출물을 이용한 기능성 원료, 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 상기 구판 추출물은 의약약품, 식품 등에 성장호르몬관련 유전자들의 발현을 증가시키는 기능성 원료, 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 제공될 수 있을 것이다.

Description

구판 추출물을 유효성분으로 함유하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물{Composition for increasing expression level of genes related with growth hormone containing Gupan extracts as effective component}
본 발명은 성장호르몬관련 유전자들의 발현을 증가시키는 구판 추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 구판 추출물을 제조하는 방법, 상기 방법으로 제조된 성장호르몬관련 유전자들의 발현을 증가시키는 구판추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 원료, 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
성장호르몬(growth hormone, GH)은 포유동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 이러한 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증(dwarfism) 환자들의 치료에 사용되어 왔는데, 단백질의 손실을 억제하고 나이가 많은 장년 또는 노인에서 생리학적인 노화 현상을 지연시키는 작용이 있으므로 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있다(Horber, F. F. and Haymond, M.W., J. Clin. Invest., 1990, 86, 265-272). 성장호르몬을 지속적으로 투여하면 체중, 근육 및 지방의 무게 등이 증가하여 노화로 인한 질병을 예방할 수 있고, 일시적으로 투여하는 경우에도 혈장내의 인슐린 및 IGF-1(Insulin-like growth factor-1)의 농도를 증가시키며 소변 내의 단백질 농도를 감소시키는 것으로 알려져 있으며(Kohrt, W. M. et al., Med. Sci. Sports Exerc., 1992, 24, 832-837; Zachweija, J. J. et al., Am. J. Physiol., 1994, 266 (Endocrinol. Metab. 29), E840-844), 이외에도 간의 무게와 크기를 증가시키고 근육, 뼈 및 연결 조직 등의 말단 조직에서 단백질의 합성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Kaiser, F. E. et al., J. Am. Geriatr. Soc., 1991, 39, 235-240; Marcus, R. et al., J. Clin. Endocrino. Metab., 1990, 70, 519-527).
과거에 성장호르몬은 주로 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용되었으나, 이 과정에서 성장호르몬을 투여받은 환자들에게 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeldt-Jakob disease)이란 질병이 유발되는 것으로 밝혀졌다. 이렇게 성장호르몬의 분리 과정에서 다른 질병의 원인 물질까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 사체로부터 분리한 성장호르몬은 그 사용이 매우 제한되었다.
최근 지속적인 경제 성장과 식습관의 서구화, 영양상태의 개선 등으로 인해 소아 및 청소년의 성장발육이 크게 증가되는 추세이다. 또한 매스미디어를 통해 큰 키를 선호하는 사회적 분위기가 형성됨으로써 상대적으로 신장이 작은 소아의 열등감이 가중되어 왔다. 이렇게 평균 신장이 늘어남에 따라 대부분의 사람들이 성장에 많은 관심을 갖게 되었다. 지금까지 알려진 성장장애 치료법에는 성장 호르몬 제제 투여 및 일리자로프 수술 등이 있다. 성장 호르몬 사용에 의한 성장장애 치료의 경우, 성장과 관련된 여러가지 인자들을 함께 고려해야 하고, 주사부위의 소양감, 발작, 지방위축과 고혈압, 당 불내성(glucose intolerance), 췌장염, 전신 알레르기 반응, 성장 호르몬 항체양성, 암 발생 및 남성에게 여성화 유방 등의 증상과 같은 부작용이 있을 수 있다. 또한, 일리자로프 수술 요법에 의한 성장장애 치료의 경우, 키가 작은 사람이 양쪽다리를 모두 억지로 늘리기 위해 수술 요법을 사용하는 것으로, 환자의 고통이 클 수 있으며, 많은 비용이 소요될 뿐만 아니라 예상치 못한 부작용으로 인해 정상보행을 못할 수도 있다. 따라서 성장에 근본적으로 도움을 줄 수 있는, 과학적으로 검증된 의약품 및 식품소재에 대한 개발이 절실히 필요한 실정이다.
최근에는 새로운 물질을 개발하는 접근 방식으로 화학물질 라이브러리(chemical library)를 이용하여 후보 물질들을 대량 검색하는 방법이 각광을 받고 있으며, 이외에도 길이가 짧은 펩타이드들로 구성된 펩타이드 라이브러리(peptide library) 및 자연계에 존재하는 여러 물질들로 구성된 천연물질 라이브러리(natural library)도 이러한 새로운 물질을 개발하기 위하여 활용되고 있으나, 이러한 물질의 경우 낮은 경구 흡수율, 다양한 부작용 발생 가능성 등으로 인하여 새로운 성장 호르몬 분비 촉진 인자를 개발하는 것이 용이하지 않다는 것을 보여준다.
이러한 연구의 일환으로 인체 내에 무해한 천연물 추출물을 이용하여 성장호르몬관련 유전자의 발현을 증가시키는 물질을 찾는 연구가 진행되고 있다. 그 예로 성장호르몬 분비를 자극하는 활성이 있는 황기 뿌리의 알콜 추출물(대한민국 특허등록 제257840호), 원지 추출물, 사상자 추출물, 백합 추출물 및 길경 추출물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 추출물을 함유하는 성장호르몬 분비촉진 조성물(대한민국 특허출원 제2000-0038805호), 천연 생약재로부터 성장호르몬 분비 자극인자를 추출하는 방법 및 수용성 속단 추출물(대한민국 특허출원 제1999-0080967호)에 대한 연구가 보고되어 있다.
구판(귀판)은 남생이과에 속한 남생이(Geoclemys reevesii Gray)의 복갑을 육을 제거하고 건조한 것으로, 외표면의 엷은 황색으로 그물망의 무늬를 가진다. 질은 견고하여 부수기 힘들며 힘을 주면 벌어지기도 한다. 가을과 겨울에 많이 포획하며 중국의 호북, 호남, 강소 및 절강 등에서 주로 생산되며, 우리나라에서도 소량 생산된다.
구판은 정기를 보충하고 허약한 체질을 개선하는 효능을 가진 보익약(補益藥)에 속한다. 한방에서는 허약한 정기를 보충하여 질병의 회복을 촉진하며, 허약으로 인하여 발생되는 질병의 예방효과가 있으며, 본경(本經)에서는 여성의 대하, 붕루, 징가를 치료하고, 사지가 무겁고 약해지는 증상을 치료하고, 오랫동안 복용하면 몸이 가벼워지고 배가 고프지 않게 된다. 별록(別錄)에서는 노기(怒氣)를 가라앉히고 복통을 치료하며 오랫동안 서 있지 못하는 증상을 치료하고, 뼛속이 시리거나 열이 나는 증상에 효능이 있는 약재로 기록되어 있다. 또한 혈분이 부족한 것을 충만하게 하고 양기가 위로 솟구쳐 오르는 것을 막아주고, 신이 허하여 허리와 다리가 약해지면서 식은땀이 나고 뼈 속에서 후끈거리는 열감, 목안이 아픈 증상, 어지럼증, 귀 울음, 가슴 두근거림, 유정, 자궁출혈, 치질 및 학질(말라리아) 등에 응용된다.
상기와 같은 구판은 구판 에틸아세테이트 추출물이 쥐 골수유래 간엽줄기세포의 증식을 향상시킨다는 보고가 있으며, 구판의 LPS로 유도된 염증반응 억제 효과를 입증한 바 있다. 또한, 구판의 95% 에탄올 추출물에서 항산화 효과가 보고되었으나, 현재로는 구판 추출물의 성장호르몬관련 유전자들에 대한 발현 증가 효과는 보고된 바 없다.
본 발명은 상기한 종래 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명에서는 미분쇄한 구판으로부터 구판 추출물을 제조하였고, 제조한 구판 추출물이 재조합 인간성장호르몬(rhGH)에 비해 성장호르몬관련 유전자들의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 롤밀과 핀밀 또는 디스크밀을 사용하여 평균입경 100㎛ 이하로 미분쇄한 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 비율로 혼합한 후 열처리, 살균 습윤, 냉각, pH 조절, 단백 효소 실활, 여과 단계를 포함하는 구판 추출물 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 구판 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 구판 추출물을 유효성분으로 포함하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 구판 추출물을 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 구판 추출물은 재조합 인간성장호르몬(rhGH)에 비해 성장호르몬관련 유전자들의 발현을 증가시킨다. 따라서 상기 구판 추출물은 의약품, 식품 등에 성장호르몬관련 유전자들의 활성을 증가시키는 기능성 원료, 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 제공될 수 있을 것이다.
도 1a는 본 발명의 방법에 의해 제조된 구판 추출물의 CISH(Cytokine inducible SH2-containing protein), Npy1r(Neuropeptide Y receptor Y1) 유전자에 대한 발현 양상을 Cq 평균값과 3처리 구간의 Ratio 값, rhGH과의 normalized 하여 발현량을 분석한 그래프이다.
도 1b는 본 발명의 방법에 의해 제조된 구판 추출물의 Ugdh(UDP-glucose dehydrogenase), BTC(Betacellulin) 유전자에 대한 발현 양상을 Cq 평균값과 3처리 구간의 Ratio 값, rhGH과의 normalized 하여 발현량을 분석한 그래프이다.
도 1c는 본 발명의 방법에 의해 제조된 구판 추출물의 Bcl6(B cell leukemia/lymphoma 6) 유전자에 대한 발현 양상을 Cq 평균값과 3처리 구간의 Ratio 값, rhGH과의 normalized 하여 발현량을 분석한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조된 구판 추출물의 SOCS2(Suppressor of cytokine signalling-2)와 Tgfbr3(Transforming growth factor, beta receptor III) 유전자에 대한 발현 양상을 Cq 평균값과 3처리 구간의 Ratio 값, rhGH과의 normalized 하여 발현량을 분석한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 제조된 구판 추출물의 BMP4(Bone morphogenic protein 4)와 Rgs2(G protein signalling regulator RGS2) 유전자에 대한 발현 양상을 Cq 평균값과 3처리 구간의 Ratio 값, rhGH과의 normalized 하여 발현량을 분석한 그래프이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 구판을 압력 파쇄하여 구판 압편을 얻는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 구판 압편을 핀밀 또는 디스크밀로 분쇄하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 중량 비율로 혼합한 후, 열처리, 살균 습윤, 냉각, pH 조정 단계를 거쳐 단백가수분해 처리하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계의 단백가수분해된 반응물을 여과하여 구판 추출물을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 구판 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 구판 추출물의 제조방법은 구체적으로는
(a) 구판을 롤밀로 평균입경 1000㎛ 이하 되도록 압력 파쇄하여 구판 압편을 얻는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻어진 구판 압편을 핀밀이나 디스크밀로 평균입경 100㎛ 이하로 미분쇄하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 미분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 중량비율로 혼합한 후, 70℃∼90℃에서 20∼40분간 열처리하여 살균 습윤한 후, 35~45℃로 냉각한 후, pH 8.0∼9.0으로 조정한 후, 단백가수분해효소를 가하여 40~60시간 효소 가수 분해하는 단계; 및
(d) 상기 (c)단계의 단백가수분해된 반응물을 가열하여 효소를 실활시킨 후, 여과하여 구판 추출물을 수득하는 단계를 포함하여 제조할 수 있으며,
보다 구체적으로는
(a) 구판을 롤밀로 1차 평균입경 1000㎛ 이하 되도록 압력 파쇄하여 구판 압편을 얻는 단계;
(b)상기 (a)단계에서 얻어진 구판 압편을 핀밀이나 디스크밀로 평균입경 100㎛ 이하로 미분쇄하는 단계;
(c)상기 (b)단계에서 미분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 중량비율로 혼합한 후, 80℃ 30분간 열처리하여, 살균 습윤 한 후, 40℃로 냉각한 후, pH 8.5로 조정한 후, 단백가수분해효소를 가하여 48시간 효소 가수 분해하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 단백가수분해된 반응물을 100℃로 5분간 가열하여 효소를 실활시키고, 여과하여 여과액을 수득하는 단계를 포함하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 추출물의 제조 방법에서, 상기 (a)단계는 구판을 롤밀로 평균입경 1000㎛ 이하, 바람직하게는 100~1000㎛로 파쇄할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 압력 파쇄하는 방법은 롤밀을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 압력 파쇄할 수 있는 방법이면 어느 것이든 가능할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 추출물의 제조 방법에서, 상기 (b)단계는 (a)단계에서 얻어진 구판 압편을 핀밀이나 디스크밀로 평균입경 100㎛ 이하, 바람직하게는 10~100㎛로 미분쇄할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 추출물의 제조 방법에서, 상기 (c)단계의 단백가수분해효소는 알칼라아제(덴마크, 노보자임 사) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 구판 추출물을 제공한다.
본 발명의 구판 추출물은 또한, 성장호르몬관련 유전자 CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6, SOCS2 및 Tgfbr3의 발현을 재조합 인간성장호르몬(rhGH)에 비해 상당히 증가시키는 등 부작용 없이 우수한 성장호르몬관련 유전자의 발현 증가 효과를 가져올 수 있어 특히 어린이 성장 촉진용 식품소재의 기능성 원료 등으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 구판 추출물을 유효성분으로 포함하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 의한 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물은 그 제형이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 약학 조성물 또는 건강식품 조성물일 수 있다. 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물인 경우에는 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물에 필요에 따라서 하기의 첨가제의 1종 또는 2종 이상을 첨가 배합할 수 있다. 상기 첨가제로는, 예를 들어 그레이프프루트, 사과, 오렌지, 레몬, 파인애플, 바나나, 배 등의 각종 과즙(농축 과즙, 분말 과즙 등이어도 좋다); 비타민류(팔미트산 레티놀, 리보플라빈, 피리독신, 시아노코발아민(cyanocobalamine), 아스코르빈산 나트륨, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 엽산, 비오틴, 콜레칼시페롤(cholecalciferol), 중주석산콜린, 토코페롤 또는 β-카로틴 등의 수용성 및 지용성 비타민류); 향미료(레몬플레이버, 오렌지플레이버, 딸리플레이버, 그레이프프루트플레이버 또는 바닐라 에센스 등); 아미노산, 핵산 및 그들의 염류(글루탐산, 글루탐산나트륨, 글리신, 알라닌, 아스파라긴산, 아스파라긴산 나트륨, 이노신산 등); 식물 섬유(폴리덱스트로오스, 펙틴, 크산탄 고무, 글루코만난 또는 알긴산 등); 또는 미네랄류(염화나트륨, 초산나트륨, 황산마그네슘, 염화칼륨, 염화마그네슘, 탄산마그네슘, 염화칼슘, 인산 2칼륨, 인산 1나트륨, 글리세로인산칼슘, 구연산제1철나트륨, 구연산철암모늄, 구연산철, 황산망간, 황산구리, 요오드화나트륨, 솔빈산칼륨, 아연, 망간, 구리, 요오드 또는 코발트 등) 등이 포함될 수 있다.
상기 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 더 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 또한 본 발명에 의한 조성물이 건강식품 조성물일 경우에는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 비타민 복합제 또는 건강 기능성 식품류 등으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 구판 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 0∼20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기 구판 추출물의 함량은 특별히 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 10∼90 중량% 범위로 함유되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 구판 추출물을 유효성분으로 포함하는 성장촉진용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 구판 추출물은 성장호르몬관련 유전자 발현을 증가시키므로 성장 촉진용 건강기능식품으로 사용될 수 있는 것이다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1: 구판 추출물 제조
구판을 롤밀로 1차 평균입경 1000㎛ 이하 되도록 압력 파쇄하여 구판 압편을 제조하였다. 상기 수득한 구판 압편을 핀밀이나 디스크밀을 사용하여 평균입경 100㎛ 이하로 더욱 미분쇄하였고, 미분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 비율로 혼합한 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 살균 습윤하였다, 살균 습윤된 수득물을 40℃로 냉각한 후, pH를 8.5로 조정하였고, 단백가수분해효소인 알칼라아제(덴마크, 노보자임 사)를 가하여 48시간동안 가수 분해하였다. 가수분해된 수득물을 100℃에서 5분간 가열하여 효소를 실활시키고, 여과 단계를 통해 최종적으로 구판 추출물을 수득하였다.
실험방법
1. Mouse C2C12 세포 배양
미국 ATCC로부터 구입한 골격근(skeletal muscle) 유래의 mouse C2C12 세포를 배양액 DMEM (10% FBS, 25 mM Hepes pH 7.4, 항생제 (10,000 units/㎖ 페닐실린 G 및 10 ㎎/㎖ 스트렙토마이신))에서 배양하여 80% 정도의 성장률을 나타낼 때, 5% horse serum과 25 mM Hepes가 첨가된 DMEM 배양액에 4일간 배양하여myotube로 분화시켰다(Resmimi et al., 2011. Identification of novel GH-regulated genes in C2C12. 43: 919-930). 분화된 세포를 16시간 동안 무혈청 배지에 배양하여 완전한 골격근 세포로 분화시켰다.
2. 재조합 인간성장호르몬(rhGH)과 구판 추출물 처리
상기 분화된 세포에 재조합 인간성장호르몬(rhGH)(양성대조군, Gibco 사)을 500 ng/㎖, 구판 추출물을 15 ㎍/㎖ 농도로 각각 6시간 처리하였다. 3개의 처리구(분화된 세포에 아무것도 처리하지 않은 무처리구, 재조합 인간성장호르몬(rhGH)을 처리한 대조군, 구판 추출물을 처리한 실험군)를 각각 3반복으로 처리하여 성장호르몬관련 유전자(CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6, SOCS2, Tgfbr3, BMP4 및 Rgs2)의 발현을 분석하였다.
3. 성장호르몬관련 유전자 발현 분석
재조합 인간성장호르몬(rhGH)과 구판 추출물을 500 ng/㎖, 15 ㎍/㎖ 농도 각각 처리하여 반응시킨 세포를 회수하여 Trizol 시약(Roche 사)을 사용하여 total RNA를 분리한 후, 시중에 판매하는 cDNA synthesis kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 9개의 성장호르몬관련 유전자인 CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6, SOCS2, Tgfbr3, BMP4 및 Rgs2에 대하여 하기와 같이 qPCR 프라이머를 제작하였다.
프라이머 명칭 정방향(서열번호) 역방향(서열번호)
Cish 5'-acctgttcacactgtcagtc-3' (No.1) 5'-cacacagatgttgtaagctg-3'
(No.2)
npy1r 5'-atcaacatcatgctgctctc-3'
(No.3)		 5'-tcagagacgtcttggacacat-3'
(No.4)
Ugdh 5'-tccagtatctacattagcaag-3'
(No.5)		 5'-ctcaccaggagtgtacggaat-3'
(No.6)
BTC 5'-tagcagtgtcagctccctgc-3'
(No.7)		 5'-caggtgcagacgccgatgact-3'
(No.8)
Bcl6 5'-cagcatacagagatgtgcctc-3'
(No.9)		 5'-gtgcaggttacacttctcaca-3'
(No.10)
Socs2 5'-agatagttcgcattcagactacct-3'(No.11) 5'-accggtacatttgttaatggcga-3'
(No.12)
tgfbr3 5'-gtctgattacaccatcatcgaga-3'
(No.13)		 5'-taatctacttggaggaccacg-3'
(No.14)
BMP4 5'-tcagaatcagccgatcgttacct-3'
(No.15)		 5'-tgtcatactcatccaggtaca-3'
(No.16)
Rgs2 5'-ttgatgaactgctggccagt-3'
(No.17)		 5'-cataagtcctggtagaattcgg-3'
(No.18)
FastStart Essential DNA Green Master (Roche 사)를 사용하여 cDNA 샘플 2㎕, PCR primer (0.2uM) 2㎕, Master Mix 10㎕, water 3㎕를 각각 첨가하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 시료를 프로그램(LightCycler 96 SW 1.1 Roche 사)에 따라 분석하여 Cq 평균 값을 계산하고, 상기 수치와 비교하여 GAPDH의 Cq 값과 비교하여 3처리 구간의 Ratio 값을 계산하고, 재조합 인간성장호르몬(rhGH)과 normalized 하여 9개의 성장호르몬관련 유전자의 발현량을 비교, 분석하였다.
실시예 1: CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6 유전자
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 구판 추출물과 재조합 인간성장호르몬(rhGH)을 처리한 C2C12 세포에서 CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6 유전자 발현량을 비교한 결과, CISH, Npy1r 및 Ugdh 유전자는 재조합 인간성장호르몬(rhGH) 처리구보다 구판 추출물을 처리한 실험군에서 발현량이 월등히 증가되는 것을 확인하였다(도 1). 또한 BTC, Bcl6은 재조합 인간성장호르몬(rhGH)보다 다소 낮은 발현량을 나타내었으나, 아무것도 처리하지 않은 무 처리구와 비교하여 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
실시예 2: SOC2, Tgfbr3 유전자
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 구판 추출물과 재조합 인간성장호르몬(rhGH)을 처리한 C2C12 세포에서 SOC2와 Tgfbr3 유전자 발현량을 비교한 결과, SOC2와 Tgfbr3 유전자는 아무것도 처리하지 않은 무 처리구와 비교하여 발현량이 다소 증가되는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3: BMP4, Rgs2 유전자
상기 제조예 1의 방법으로 제조된 구판 추출물과 재조합 인간성장호르몬(rhGH)을 처리한 C2C12 세포에서 BMP4와 Rgs2 유전자 발현량을 비교한 결과, BMP4와 Rgs2 유전자는 재조합 인간성장호르몬(rhGH) 처리구와 비교하여 발현량이 약간 감소하였으며, 무 처리구와 비슷한 발현량을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
<110> KIM, YONG SOO Hoseo University Academic Cooperation Foundation <120> Composition for increasing expression level of genes related with growth hormone containing Gupan extracts as effective component <130> PN16530 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acctgttcac actgtcagtc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cacacagatg ttgtaagctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atcaacatca tgctgctctc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcagagacgt cttggacaca t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tccagtatct acattagcaa g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcaccagga gtgtacggaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tagcagtgtc agctccctgc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caggtgcaga cgccgatgac t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagcatacag agatgtgcct c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgcaggtta cacttctcac a 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 agatagttcg cattcagact acct 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 accggtacat ttgttaatgg cga 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtctgattac accatcatcg aga 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 taatctactt ggaggaccac g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcagaatcag ccgatcgtta cct 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tgtcatactc atccaggtac a 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ttgatgaact gctggccagt 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cataagtcct ggtagaattc gg 22

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 구판 추출물을 유효성분으로 포함하는 CISH, Npy1r, Ugdh, BTC, Bcl6, SOCS2 및 Tgfbr3 중에서 선택된 1종 이상의 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 구판 추출물은 성장호르몬관련 유전자의 발현을 재조합 인간성장호르몬(rhGH)보다 더 증가시키는 것을 특징으로 하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 구판 추출물은
    (a) 구판을 압력 파쇄하여 구판 압편을 얻는 단계;
    (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 구판 압편을 핀밀 또는 디스크밀로 분쇄하는 단계;
    (c) 상기 (b)단계에서 분쇄된 구판 분말과 물을 1:7 내지 1:10의 중량 비율로 혼합한 후, 열처리, 살균 습윤, 냉각, pH 조정 단계를 거쳐 단백가수분해 처리하는 단계; 및
    (d) 상기 (c)단계의 단백가수분해된 반응물을 여과하여 구판 추출물을 수득하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물인 것을 특징으로 하는 성장호르몬관련 유전자 발현 증가용 조성물.
  8. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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