KR101720923B1

KR101720923B1 - 4-헥실레조르시놀을 포함하는 국소적인 TNF-α 발현 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101720923B1
Application number: KR1020150182554A
Authority: KR
Inventors: 김성곤
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-21
Filing date: 2015-12-21
Publication date: 2017-04-10

Abstract

본 발명은 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하는 TNF-α 발현 억제용 의약 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 의약 조성물을 가격이 저렴하고, (a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 및 (d) 궤양성 질환의 치료에 효과적이다.

Description

4-헥실레조르시놀을 포함하는 국소적인 TNF-α 발현 억제용 조성물{Development of ointment using 4-hexylresorcinol for the inhibition of localized TNF-α expression}

본 발명은 4-헥실레조르시놀(hexylresorcinol)을 이용하여 TNF-α 발현 억제용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)는 일반적으로 급성 염증에서 발현이 증가되는 사이토카인이나 다양한 형태의 자가 면역 질환에서도 발현이 증가된다. TNF-α의 지속적인 발현은 상처의 치유를 지연시키고 자가 면역 질환의 경우에는 정상조직의 파괴를 지속적으로 일으켜서 환자를 고통스럽게 한다. 구강 내 병소 중에는 편평태선에서 TNF-α의 발현이 증가된다 (비특허문헌 1). 피부질환 중에는 아토피성 피부염을 비롯하여 pemphigus, 모낭염 등에서도 TNF-α의 발현이 증가되어있다 (비특허문헌 2). 화상의 경우에는 가벼운 화상에서는 TNF-α의 발현이 높지 않으나 심한 화상의 경우에는 TNF-α의 발현이 증가되게 된다 (비특허문헌 3).

다른 자가 면역 질환과 마찬가지로 TNF-α의 발현이 증가되는 심한 화상 환자의 치료는 다양한 요인에 의해 복잡해진다. 실제로, 표피 화상 부상은 많은 염증성 사이토카인과 관련이 있다. 이들 중, 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 scald burn injury에서 높게 발현된다(비특허문헌 4). TNF-α 발현의 조절장애는 유아 돌연사 증후군과 관련된다(비특허문헌 5). 실험적인 화상 트라우마는 TNF-α 발현의 상당한 증가를 가져온다(비특허문헌 6). TNF-α 발현이 심바스타틴 어플리케이션에 의해 감소되는 경우, 화상에 의한 세포 사멸과 사망률은 감소한다(비특허문헌 7).

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol, 4HR)은 소독제로서 알려져 있으며, 구강 가글링 또는 살균제로서 사용되어 왔다(비특허문헌 8,9). 4-헥실레조르시놀은 트렌스글루타미나제, NF-kB pathway, 및 칼슘진동(calcium oscillation)을 억제한다(비특허문헌 10-12). 4-헥실레조르시놀이 소독 효과 및 NF-kB 경로 억제를 가지므로, 4-헥실레조르시놀로 코팅된 치과용 임플란트는 오염된 상태에서 더 나은 골 형성을 보였다(비특허문헌 13). 4-헥실레조르시놀이 실크와 같이 동종이식재로 사용되면, 4-헥실레조르시놀은 diacylglycerol kinase 매개 경로를 통해 거대 세포 형성을 억제할 수 있다. 그 결과, 실크 생체물질에 의해 유도된 이물반응을 줄일 수 있다. 4-헥실레조르시놀은 이물반응 유래 거대세포의 형성을 억제할 수 있으나, 상기 4-헥실레조르시놀이 TNF-α 발현을 저해하는지는 연구되지 않았다. 만약 4-헥실레조르시놀이 TNF-α 발현을 저해할 수 있다면 이식재 첨가물이 아닌 자가면역 질환 치료제로 사용이 가능하게 된다.

라놀린(lanolin)은 비친수성 흡수를 보이는 연고의 base 물질로 최근에는 단독으로 피부 결손에 적용되었을 때, epidermal growth factor (EGF)를 첨가한 경우와 거의 동일한 수준의 상피 재생을 보여주었다 (비특허문헌 14).

1. Kanokpanonta S, Damrongsakkula S, Ratanavaraporna J, Aramwit P. Physico-chemical properties and efficacy of silk fibroin fabric coated with different waxes as wound dressing. Int J Biol Macromol. 2013 Apr;55:88-97. 2. Baoyong L, Jian Z, Denglong C, Min L. Evaluation of a new type of wound dressing made from recombinant spider silk protein using rat models. Burns.2010 36:891-896. 3. Chiarini A, Petrini P, Bozzini S, Dal Pra I, Armato U. Silk fibroin/poly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth: in vitro interactions with human cells. Biomaterials.2003 24:789-799. 4. Quintana HT, Bortolin JA, da Silva NT, Ribeiro FA, Liberti EA, Ribeiro DA, de Oliveira F. Temporal study following burn injury in young rats is associated with skeletal muscle atrophy, inflammation and altered myogenic regulatory factors. Inflamm Res. 2015;64(1):53-62. 5. Moscovis SM, Gordon AE, Al Madani OM, Gleeson M, Scott RJ, Hall ST, Burns C, Blackwell C. Genetic and Environmental Factors Affecting TNF-α Responses in Relation to Sudden Infant Death Syndrome. Front Immunol. 2015;6:374. 6. Claassen L, Papst S, Reimers K, Stukenborg-Colsman C, Steinstraesser L, VogtPM, Kraft T, Niederbichler AD. Inflammatory response to burn trauma: nicotine attenuates proinflammatory cytokine levels. Eplasty. 2014;14:e46. 7. Zhao G, Yu YM, Kaneki M, Bonab AA, Tompkins RG, Fischman AJ. Simvastatin reduces burn injury-induced splenic apoptosis via downregulation of the TNF-α/NF-κB pathway. Ann Surg. 2015;261(5):1006-12. 8. Evans RT, Baker PJ, Coburn RA, Fischman SL, Genco RJ. In vitro antiplaque effects of antiseptic phenols.J Periodontol. 1977;48(3):156-62. 9. McNally D, Shephard A, Field E. Randomised, double-blind, placebo-controlled study of a single dose of an amylmetacresol/2,4-dichlorobenzyl alcohol pluslidocaine lozenge or a hexylresorcinol lozenge for the treatment of acute sore throat due to upper respiratory tract infection. J Pharm Pharm Sci. 2012;15(2):281-94. 10. Kim SG, Jeong JH, Park YW, Song JY, Kim AS, Choi JY, Chae WS. 4-Hexylresorcinol inhibits transglutaminase-2 activity and has synergistic effects along with cisplatin in KB cells. Oncol Rep. 2011;25(6):1597-602. 11. Kim SG, Lee SW, Park YW, Jeong JH, Choi JY. 4-hexylresorcinol inhibits NF-κB phosphorylation and has a synergistic effect with cisplatin in KB cells. Oncol Rep. 2011;26(6):1527-32. 12. Kim SG, Choi JY. 4-hexylresorcinol exerts antitumor effects via suppression of calcium oscillation and its antitumor effects are inhibited by calcium channel blockers. Oncol Rep 2013;29(5):1835-40. 13. Kim SG, Hahn BD, Park DS, Lee YC, Choi EJ, Chae WS, Baek DH, Choi JY. Aerosol deposition of hydroxyapatite and 4-hexylresorcinol coatings on titanium alloys for dental implants. J Oral Maxillofac Surg. 2011;69(11):e354-63. 14. Chvapil M1, Gaines JA, Gilman T. Lanolin and epidermal growth factor in healing of partial-thickness pig wounds. J Burn Care Rehabil 1988; 9(3): 279-84.

본 발명의 목적은 4-헥실레조르시놀을 사용하여, 가격이 저렴하고, (a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 및 (d) 궤양성 질환에 치료 효과가 우수한 의약 조성물 또는 피부 외용제를 제공하는데 있다.

본 발명에서는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하며,

하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 TNF-α 발현 억제용 의약 조성물을 제공한다.

(a) 심도 화상

(b) 피부 자가 면역 질환

(c) 구강 점막 내 자가 면역 질환

(d) 궤양성 질환

본 발명에 따른 의약 조성물을 4-헥실레조르시놀을 포함하여, 가격이 저렴하고, 간단한 처리로 처치할 수 있으며, (a) 심도 화상, (b) 아토피성 피부염, (c) 피부 자가 면역 질환, (d) 구강 점막 내 자가 면역 질환 및 (e) 궤양성 질환의 치료에 효과적이다.

또한, 본 발명에서는 4-헥실레조르시놀과 라놀린을 함께 사용하여, 우수한 상피 재생 효과를 부여할 수 있다.

도 1은 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 Western blot analysis 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 화상 후 시간에 따른 상피화가 이루어지지 않은 영역의 평균 넓이를 나타내는 그래프이다.
도 3은 화상 후 1일, 5일 및 14일째, 각 그룹의 조직학 사진(헤마톡실린 및 에오신 착색, 오리지널 배율 x 40)을 나타낸다.
도 4는 화상 후 14 일이 경과하였을 때 시행한 콜라겐 염색 결과를 나타낸 사진(피크로-시리우스 레드 착색, 오리지널 배율 x 40)이다. .
또한, 도 5는 화상 후 14일이 경과하였을 때 시행한 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진(대비염색 시행하지 않음. 오리지널 배율 x 40) 및 TNF- α의 상대적인 발현 Level을 측정한 그래프이다.

본 발명은 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하며,

하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 TNF-α 발현 억제용 의약 조성물에 관한 것이다.

(a) 심도 화상

(b) 피부 자가 면역 질환

(c) 구강 점막 내 자가 면역 질환

(d) 궤양성 질환

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol, 4HR)은 TNF-α 발현을 억제하여 상기 TNF-α의 과발현으로 인해 발생한 질환의 치료에 이용될 수 있다.

상기 4-헥실레조르시놀의 IUPAC 명은 4-헥실벤젠-1,3-디올(4-hexylbenzene-1,3-diol)이고, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

일 구체예에서, TNF-α이 과발현되어 발생하는 질환으로는 (a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 또는 (d) 궤양성 질환을 들 수 있다. 상기 피부 자가 면역 질환으로는 아토피성 피부염 등을 들 수 있고, 구강 점막 내 자가 면역 질환으로는 편평 태선을 들 수 있으며, 궤양성 질환으로는 아프타성 궤양을 들 수 있다.

일 구체예에서, 상기 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)은 전체 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부, 01 내지 5 중량부 또는 0.2 내지 2 중량부로 포함될 수 있다. 상기 범위에서 TNF-α의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 라놀린(lanolin)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 라놀린(lanolin)은 비친수성 흡수를 보이는 연고의 기재(베이스) 물질로 사용할 수 있다. 상기 라놀린은 EGF와 유사하게 상피 세포의 증식을 도와 창상의 조기 치유를 돕는 역할을 할 수 있으며, 다른 연고 기재에 비하여 단독으로 사용했을 경우 우수한 상피 재생 효과를 보인다.

또한, 라놀린은 TNF-α 발현을 억제하지 않으므로, 본 발명의 4-헥실레조르시놀과 함께 사용하여, 점막이나 피부에서 TNF-α 발현의 증가를 특징으로 하는 다양한 질환의 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

상기 라놀린의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 100 중량부 대비 70 내지 99 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 4-헥실레조르시놀을 포함하는 조성물은 의약품 또는 피부 외용제로 제조될 수 있다.

또한, 상기 의약품 또는 피부 외용제는 라놀린을 추가로 포함할 수 있다.

의약품으로 제조할 경우 경구적으로 또는 진피 내, 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등에 비경구적으로 투여된다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 각종 제형의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 '약제학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 이외에도 본 발명의 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

일 구체예에서 상기 조성물은 외용제로 제조될 수 있다. 상기 외용제는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 상기 유효성분이 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 30 중량부를 포함하는 것이 바람직하며, 0.1 내지 20 중량부를 포함하는 것이 보다 바람직하다.

일 구체예에서 상기 조성물은 화상 등에 직접 적용될 수 있다. 즉, 화상 부위 등에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 화상 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 화상을 보호하면서 활성 성분의 치료 효과가 감소하는 것을 방지할 수 있다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필 (Compeel), 듀우덤 (Duoderm), 타가덤 (Tagaderm) 및 옵사이트 (Opsite)를 들 수 있다.

실시예

1.1 세포 실험

Cell bank에서 murin 대식세포(macrophage) (RAW264.7; Korean Cell Line Bank No. 40071)를 얻어 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)과 antibiotics/antimycotics (PenStrepFungizone, Invitrogen)를 보충한 serum-free medium (SFM, Invitrogen, Grand Island, NY) 에 suspend 시켰다. 모든 대식세포를 배양한 palte들은 RGD (arginine-glycine-aspartate) polymer reagent (fibronectin-like protein polymer, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 25 μg/ml로 30 분간 pre-coated하였다. 그리고 phosphate-buffered saline containing calcium과 magnesium (PBS++, Invitrogen)으로 2회 수세하였다. 대식세포를 6-well culture plates에 plate당 3×10⁶ 로 위치시킨 후 37℃에서 humidified atmosphere(5% CO2 /95% air)에서 1.5시간 동안 배양하였다. 그리고 붙은 셀들은 pre-warmed (37 °C) PBS++ 로 수세한 후 웨스턴 블롯 분석을 위하여 sample 하였다. 남아있는 culture들은 1, 5 및 10 ug/ml의 4-헥실레조르시놀(4HR)을 적용한 후 2, 8, 24 시간 동안 incubate 하였다.

웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플들은 reducing SDS(sodium dodecyl sulfate) 버퍼와 혼합하여 가열하고, 10% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gels)에 전기영동(electrophorese)하였다(Laemmli method). 겔들은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 맴브레인(polyvinylidene difluoride membrane)으로 electroblotted하여 면역블롯 분석(immunoblot analysis)을 시행하였다. 1시간 동안 0.1% Tween 20 (PBST; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, U.S.A.)이 함유된 PBS 에서 5% nonfat dry milk로 블락킹을 시행한 후, 블롯(Blots)들은 0.5% milk in PBST (for 1.5 hour at 25 °C)에 diluted된 primary antibody로 프로브되었다. 그런 후 peroxidase-conjugated goat anti-mouse 또는 anti-rabbit IgG, diluted to 1:50,000로 horseradish하였다.

Primary antibodies의 sourse와 specifications는 다음과 같다: TNF-α (ab6671, Abcam, Cambridge, U.K.), β-actin (Sigma-Aldrich); the antibody dilution ratio was 1:500. signal들은 ECL kit (RTN2106, GE Health Care, Buckinghamshire, U.K.)를 사용하여 화학발광(chemiluminescence)으로 검출하였다. 블롯들은 고-민감 디지털 카메라(high-sensitivity digital camera)에 피트된 ChemiDoc XRS system (Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 실시간으로 정량화 하였다. 대표적인 bot과 상대적인 평균 강도 ± 세가지 독립적인 bot들의 표준 편차가 정량화되어 β-actin으로 정상화되었다.

1.2 결과

각각의 세 그룹간의 비교를 위하여 ANOVA test를 사용하였다. Post-hoc test를 위하여 Bonferoni’s method를 사용하였다. 통계학적 유의 수준은 P<0.05로 설정하였다.

본 발명에서 도 1은 RAW264.7 세포에서 TNF-α의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타내는 그래프이다.

상기 도 1에 나타난 바와 같이, 배양된 Raw264.7 세포에서 TNF-α 단백질 Level은 4HR의 농도가 1에서 10 μg/ml까지 증가함에 따라 억제되었다. 그룹간 TNF-α 단백질 Level의 차이는 2시간에서는 통계적으로 유의하지 않았으며(P>0.05), 8시간과 24시간에서는 통계적으로 유의할만한 차이를 보였다(P=0.009, 0.013).

대식세포(Macrophage) suspensions에서 TNF-α 단백질 레벨의 상대적인 발현은 1,5,10 μg/ml에서 각각 1.31±0.21, 0.89±0.14, 0.68±0.13로 나타났다. Post-hoc test에서 8시간과 24 시간에서 10 μg/ml 4HR 처리 군에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의할 정도로 낮은 값이 나타났다 (P=0.010, 0.023).

2.1 동물 실험

본 연구는 강릉원주대학교 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 얻어 시행하였다(GWNU-2015-26). 수컷 12주령의 체중 350~400g의 Wistar 백서 24마리를 samtako(Soeul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 동물들은 개개의 사육 cage에서 조절된 온도(20-22°C)와 습도(around 40%)에서 사육시켰다. 약 1주일간의 적응 기간이 지난 후 실험을 시작하였다. 세 개의 서로 다른 조성의 연고가 실험에 사용되었다. 음성 대조군(Negative control)으로 midium만 포함하고 있는 연고를 사용하였다. 실험군으로 0.2wt% 4HR group과 2wt% 4HR group을 사용하였다. 전신마취 유도를 위하여 0.15 mL의 틸레타민(tiletamine) 플러스 졸라제팜(zolazepam)(Zoletil; Bayer Korea, Seoul, Korea) 과 0.15mL의 자일라진 염산염(xylazine hydrochloride)(Rompun; Bayer Korea)를 사용하였다. 등의 털은 제모제를 사용하여 제모하였다. 제모 후 10 % 포비돈 이오다인 용액을 사용하여 피부를 소독하였다. 깊은 3도 화상부를 2x2cm 의 사각형 금속판을 이용하여 형성하였다. 금속판을 170℃까지 가열한 후 백서의 등에 약 2초간 적용하였다. 각 그룹에 설정한 연고를 도포하였다. 연고 외 다른 dressing은 시행하지 않았다. 감염을 예방하기 위하여 1 mg/kg의 gentamicin (Kukje Pharm, Seongnam, Korea)과 0.5mL/Kg 의 pyrin (Green Cross Veterinary Products, Yongin, Korea)을 근육주사하였다. 연고 도포는 매일 시행하였으며 각 동물에서 2개의 화상부를 얻어 총 45개의 화상부를 실험에 사용하였다.

상처부의 치유를 평가하기 위하여 화상 형성 후 1일, 5일, 14일에 사진촬영을 하였다. 상피화가 일어나지 못한 부위는 Sigma Pro® (SPSS Inc, Chicago, IL)를 이용하여 평가하였다. 동물은 화상부 형성 후 1일, 5일 및 14일에 희생하여 조직학적 평가를 시행하였다.

2.2 결과

본 발명에서 도 2는 화상 후 시간에 따른 상피화가 이루어지지 않은 영역의 평균 넓이를 나타낸다.

화상 후 1일 째 상피화가 이루어지지 않은 영역의 평균 넓이는 음성 대조군 그룹과 0.2 wt% 4HR, 2 wt% 4HR 그룹에서 각각 483.31 ± 32.52 mm², 472.31± 36.79 mm², and 485.28±31.53 mm²로, 그룹간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(P>0.05).

화상 후 5일 째 상피화가 일어나지 않은 영역의 평균 넓이는 control 그룹과 0.2 wt% 4HR, 2 wt% 4HR 그룹에서 각각 413.46 ± 40.12 mm², 390.88 ± 40.75 mm², 429.24 ± 16.39 mm²이었고(P>0.05), 또한, 화상 후 14일 째 상피화가 일어나지 않은 영역의 평균 넓이는 음성 대조군 그룹과 0.2 wt% 4HR, 2 wt% 4HR 그룹에서 각각 356.13 ± 47.21 mm², 271.15 ± 33.40 mm², 257.43 ± 60.93 mm² 으로, 그룹간의 차이는 통계적으로 유의하였다(P=0.015).

Post hoc test에서 화상 후 14일 째 상피화가 일어나지 않은 영역은 2 wt% 4HR group에서 대조군에 비하여 작은 것으로 나타났으며 이는 통계학적으로 유의할 정도의 차이로 나타났다(P=0.022).

3.1 조직학적 분석

화상을 입힌 등 피부 조직을 채취하여 포르말린에 고정하였다. 표본은 에틸알콜과 자일렌을 이용하여 탈수시킨 후 파라핀 블록으로 포매하였다. 파라핀 블록은 얇게 섹션하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 시행하였다.

염색 과정은 다음과 같다. 첫째, 왁스를 표본에서 제거한 후 파라핀 섹션을 수화시킨다. 슬라이드는 헤마톡실린에서 5분간 염색을 시행한다. 과염색된 섹션은 산-알코올에서 수초간 agitating시켜 differentiate시킨 후 흐르는 물에 5분간 수세하였다. 슬라이드를 탈수시킨 후 자이렌에서 clear시킨다. 피크로-시리우스 레드 착색(Pico-sirius red staining)은 구입한 kit(ab150681, Abcam)을 이용하여 제조사에서 권하는 프로토콜에 따라 염색하였다. 간략히, 파라핀을 제거한 섹션을 피크로-시리우스 레드 용액에서 1시간 염색한 후 아세트산 용액에서 2번에 거쳐 빠르게 린스하였다.

TNF-α의 발현 정도를 결정하기 위하여 TNF-α 항체(antibodies) (Abcam)을 이용하여 면역 조직화학적 착색(immunohistochemical staining)을 시행하였다. 백서로부터 파라핀 포매 조직을 얻었다. TNF-α에 대한 1차 항체(Primary antibody)의 희석은 1:50으로 시행하였다.

면역 조직화학적 염색 과정은 Boonkaew B, Kempf M, Kimble R, Cuttle L. Cytotoxicity testing ofsilver-containing burn treatments using primary and immortal skin cells. Burns2014;40(8):1562-9.에서 기술한 대로 시행하였다. 음성 대조군(Negative control)은 primary antibodies 없이 염색하였다.

염색된 섹션들은 Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) 현미경(microscope)을 이용하여 분석하였다. 면역 조직화학적 반응 지수(reaction intensity)를 정량화하기 위하여, 피부에서 10개의 random fields를 x200 배율에서 그레이스 스케일(grayscale)로 이미지 변환을 시행한 후 computer assited image analysis를 통하여 평가하였다. 염색 강도는 평균 강도 값(mean intensity value)(0: no stain, 255: highest stain)으로 표현되었다. 대비 염색(Counter stain)은 시행하지 않았기 때문에 흡광도가 유일하게 면역 조직화학적 반응의 결과에 영향을 줄 수 있었다.

3. 2 결과

본 발명에서 도 3은 화상 후 1일, 5일 및 14일째, 각 그룹의 조직학 사진(헤마톡실린 및 에오신 착색, 오리지널 배율 x 40)을 나타낸다.

상기 도 3에 나타난 바와 같이, 조직학적 검사에서 모든 그룹에서 화상 후 1일째에는 표피와 진피에서 괴사 소견을 보였다. 괴사된 피부의 국소적인 박리는 화상 후 5일째 모든 그룹에서 관찰되었다. 괴사된 피부의 점진적인 박리 및 상처 변연에서의 상피화 소견은 화상 14일째 모든 그룹에서 관찰되었다.

또한, 도 4는 화상 후 14 일이 경과하였을 때 시행한 콜라겐 염색 결과를 나타낸 사진(피크로-시리우스 레드 착색, 오리지널 배율 x 40)이다. 재생된 콜라겐은 빨강색으로 non-collagenous tissue는 노랑색으로 보인다. 대조군(A)과 비교할 때, 0.2 wt% 4HR Group(B)과 2 wt% 4HR group(C)에서 더욱 강한 빨강색이 피부에서 관찰되었다.

또한, 도 5는 화상 후 14일이 경과하였을 때 시행한 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진(대비염색 시행하지 않음. 오리지널 배율 x 40) 이다. Control group(A)과 비교할 때 0.2 wt% 4HR group (B)과 2 wt% 4HR group (C) 에서 모두 TNF-α(노랑색)의 발현이 더 적게 나타났다.

화상 후 14일 샘플에서 TNF- α의 상대적인 발현 Level은 대조군, 0.2 wt% 4HR, 2 wt% 4HR group에서 각각 120.85 ± 10.92, 104.28 ± 12.54, 95.85 ± 14.43으로 나타났다(도 5D, P=0.026). post-hoc test에서 2 wt% 4HR 그룹에서 대조군에 비하여 유의할 정도로 낮은 값이 나타났다(P=0.027).

Claims

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하는
(a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 또는 (d) 궤양성 질환의 치료를 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)의 함량은 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부인 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
라놀린을 추가로 포함하는 의약 조성물.
4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)을 포함하는
(a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 또는 (d) 궤양성 질환의 치료를 위한 피부 외용제.