KR101754155B1

KR101754155B1 - 4-헥실레조르시놀 및 실크를 포함하는 국소적인 TNF-α 발현 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101754155B1
Application number: KR1020160063255A
Authority: KR
Inventors: 김성곤; 김민근; 권해용; 조유영; 이광길; 배성민
Original assignee: 강릉원주대학교산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2016-05-24
Filing date: 2016-05-24
Publication date: 2017-07-06

Abstract

본 발명에 따른 의약 조성물은 4-헥실레조르시놀 및 실크를 함께 포함하여, 가격이 저렴하고, 간단한 처리로 처치할 수 있으며, (a) 심도 화상, (b) 아토피성 피부염, (c) 피부 자가 면역 질환, (d) 구강 점막 내 자가 면역 질환 및 (e) 궤양성 질환의 치료에 효과적이다.

Description

4-헥실레조르시놀 및 실크를 포함하는 국소적인 TNF-α 발현 억제용 조성물{Development of ointment using 4-hexylresorcinol and silk for the inhibition of localized TNF-α expression}

본 발명은 4-헥실레조르시놀(hexylresorcinol) 및 실크를 이용하여 TNF-α 발현 억제용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)는 일반적으로 급성 염증에서 발현이 증가되는 사이토카인이나 다양한 형태의 자가 면역 질환에서도 발현이 증가된다. TNF-α의 지속적인 발현은 상처의 치유를 지연시키고 자가 면역 질환의 경우에는 정상조직의 파괴를 지속적으로 일으켜서 환자를 고통스럽게 한다. 구강 내 병소 중에는 편평태선에서 TNF-α의 발현이 증가된다 (비특허문헌 1). 피부질환 중에는 아토피성 피부염을 비롯하여 pemphigus, 모낭염 등에서도 TNF-α의 발현이 증가되어있다 (비특허문헌 2). 화상의 경우에는 가벼운 화상에서는 TNF-α의 발현이 높지 않으나 심한 화상의 경우에는 TNF-α의 발현이 증가되게 된다 (비특허문헌 3).

다른 자가 면역 질환과 마찬가지로 TNF-α의 발현이 증가되는 심한 화상 환자의 치료는 다양한 요인에 의해 복잡해진다. 실제로, 표피 화상 부상은 많은 염증성 사이토카인과 관련이 있다. 이들 중, 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 scald burn injury에서 높게 발현된다(비특허문헌 4). TNF-α 발현의 조절장애는 유아 돌연사 증후군과 관련된다(비특허문헌 5). 실험적인 화상 트라우마는 TNF-α 발현의 상당한 증가를 가져온다(비특허문헌 6). TNF-α 발현이 심바스타틴 어플리케이션에 의해 감소되는 경우, 화상에 의한 세포 사멸과 사망률은 감소한다(비특허문헌 7).

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol, 4HR)은 소독제로서 알려져 있으며, 구강 가글링 또는 살균제로서 사용되어 왔다(비특허문헌 8,9). 4-헥실레조르시놀은 트렌스글루타미나제, NF-kB pathway, 및 칼슘진동(calcium oscillation)을 억제한다(비특허문헌 10-12). 4-헥실레조르시놀이 소독 효과 및 NF-kB 경로 억제를 가지므로, 4-헥실레조르시놀로 코팅된 치과용 임플란트는 오염된 상태에서 더 나은 골 형성을 보였다(비특허문헌 13). 4-헥실레조르시놀이 실크와 같이 동종이식재로 사용되면, 4-헥실레조르시놀은 diacylglycerol kinase 매개 경로를 통해 거대 세포 형성을 억제할 수 있다. 그 결과, 실크 생체물질에 의해 유도된 이물반응을 줄일 수 있다. 4-헥실레조르시놀은 이물반응 유래 거대세포의 형성을 억제할 수 있으나, 상기 4-헥실레조르시놀이 TNF-α 발현을 저해하는지는 연구되지 않았다. 만약 4-헥실레조르시놀이 TNF-α 발현을 저해할 수 있다면 이식재 첨가물이 아닌 자가면역 질환 치료제로 사용이 가능하게 된다.

한편, 실크 피브로인(silk fibrion)은 생체 친화적인 재료로 알려져 있으며, 생체 조직에서 이물반응이 적고 기계적, 물리적 성질이 우수하여 최근까지도 임상 활용을 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있다.

또한, 라놀린(lanolin)은 비친수성 흡수를 보이는 연고의 base 물질로 최근에는 단독으로 피부 결손에 적용되었을 때, epidermal growth factor (EGF)를 첨가한 경우와 거의 동일한 수준의 상피 재생을 보여주었다 (비특허문헌 14).

1. Kanokpanonta S, Damrongsakkula S, Ratanavaraporna J, Aramwit P. Physico-chemical properties and efficacy of silk fibroin fabric coated with different waxes as wound dressing. Int J Biol Macromol. 2013 Apr;55:88-97. 2. Baoyong L, Jian Z, Denglong C, Min L. Evaluation of a new type of wound dressing made from recombinant spider silk protein using rat models. Burns.2010 36:891-896. 3. Chiarini A, Petrini P, Bozzini S, Dal Pra I, Armato U. Silk fibroin/poly(carbonate)-urethane as a substrate for cell growth: in vitro interactions with human cells. Biomaterials.2003 24:789-799. 4. Quintana HT, Bortolin JA, da Silva NT, Ribeiro FA, Liberti EA, Ribeiro DA, de Oliveira F. Temporal study following burn injury in young rats is associated with skeletal muscle atrophy, inflammation and altered myogenic regulatory factors. Inflamm Res. 2015;64(1):53-62. 5. Moscovis SM, Gordon AE, Al Madani OM, Gleeson M, Scott RJ, Hall ST, Burns C, Blackwell C. Genetic and Environmental Factors Affecting TNF-α Responses in Relation to Sudden Infant Death Syndrome. Front Immunol. 2015;6:374. 6. Claassen L, Papst S, Reimers K, Stukenborg-Colsman C, Steinstraesser L, VogtPM, Kraft T, Niederbichler AD. Inflammatory response to burn trauma: nicotine attenuates proinflammatory cytokine levels. Eplasty. 2014;14:e46. 7. Zhao G, Yu YM, Kaneki M, Bonab AA, Tompkins RG, Fischman AJ. Simvastatin reduces burn injury-induced splenic apoptosis via downregulation of the TNF-α/NF-κB pathway. Ann Surg. 2015;261(5):1006-12. 8. Evans RT, Baker PJ, Coburn RA, Fischman SL, Genco RJ. In vitro antiplaque effects of antiseptic phenols.J Periodontol. 1977;48(3):156-62. 9. McNally D, Shephard A, Field E. Randomised, double-blind, placebo-controlled study of a single dose of an amylmetacresol/2,4-dichlorobenzyl alcohol pluslidocaine lozenge or a hexylresorcinol lozenge for the treatment of acute sore throat due to upper respiratory tract infection. J Pharm Pharm Sci. 2012;15(2):281-94. 10. Kim SG, Jeong JH, Park YW, Song JY, Kim AS, Choi JY, Chae WS. 4-Hexylresorcinol inhibits transglutaminase-2 activity and has synergistic effects along with cisplatin in KB cells. Oncol Rep. 2011;25(6):1597-602. 11. Kim SG, Lee SW, Park YW, Jeong JH, Choi JY. 4-hexylresorcinol inhibits NF-κB phosphorylation and has a synergistic effect with cisplatin in KB cells. Oncol Rep. 2011;26(6):1527-32. 12. Kim SG, Choi JY. 4-hexylresorcinol exerts antitumor effects via suppression of calcium oscillation and its antitumor effects are inhibited by calcium channel blockers. Oncol Rep 2013;29(5):1835-40. 13. Kim SG, Hahn BD, Park DS, Lee YC, Choi EJ, Chae WS, Baek DH, Choi JY. Aerosol deposition of hydroxyapatite and 4-hexylresorcinol coatings on titanium alloys for dental implants. J Oral Maxillofac Surg. 2011;69(11):e354-63. 14. Chvapil M1, Gaines JA, Gilman T. Lanolin and epidermal growth factor in healing of partial-thickness pig wounds. J Burn Care Rehabil 1988; 9(3): 279-84.

본 발명의 목적은 4-헥실레조르시놀 및 실크를 사용하여, 가격이 저렴하고, (a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 및 (d) 궤양성 질환에 치료 효과가 우수한 의약 조성물 또는 피부 외용제를 제공하는데 있다.

본 발명에서는 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol) 및 실크를 포함하며,

하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 TNF-α 발현 억제용 의약 조성물 또는 외용제 조성물을 제공한다.

(a) 심도 화상

(b) 피부 자가 면역 질환

(c) 구강 점막 내 자가 면역 질환

(d) 궤양성 질환

또한, 본 발명에서는 4-헥실레조르시놀, 실크 및 라놀린을 함께 사용하여, 우수한 상피 재생 효과를 부여할 수 있다.

도 1은 화상 후 1일, 5일 및 14일째, 각 그룹의 남은 탈상피 영역(Residual Deepithelized Area)의 크기를 나타내는 그래프이다.
도 2는 화상 후 5일 및 14일째, 각 그룹의 상피 영역을 나타내는 사진이다.
도 3은 화상 후 14 일이 경과하였을 때 시행한 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진(오리지널 배율 x 40)이다.
도 4는 화상 후 14 일이 경과하였을 때 TNF-α의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 연고 제재의 점도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol) 및 실크를 포함하며,

하기 (a) 내지 (d)로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 TNF-α 발현 억제용 의약 조성물에 관한 것이다.

(a) 심도 화상

(b) 피부 자가 면역 질환

(c) 구강 점막 내 자가 면역 질환

(d) 궤양성 질환

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol, 4HR)은 TNF-α 발현을 억제하여 상기 TNF-α의 과발현으로 인해 발생한 질환의 치료에 이용될 수 있다.

상기 4-헥실레조르시놀의 IUPAC 명은 4-헥실벤젠-1,3-디올(4-hexylbenzene-1,3-diol)이고, 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

일 구체예에서, TNF-α이 과발현되어 발생하는 질환으로는 (a) 심도 화상, (b) 피부 자가 면역 질환, (c) 구강 점막 내 자가 면역 질환 또는 (d) 궤양성 질환을 들 수 있다. 상기 피부 자가 면역 질환으로는 아토피성 피부염 등을 들 수 있고, 구강 점막 내 자가 면역 질환으로는 편평 태선을 들 수 있으며, 궤양성 질환으로는 아프타성 궤양을 들 수 있다.

일 구체예에서, 상기 4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)은 전체 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부 또는 0.2 내지 2 중량부로 포함될 수 있다. 상기 범위에서 TNF-α의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명에서는 4-헥실레조르시놀과 함께 실크를 사용하여 치료 상승효과를 부여할 수 있다.

실크는 누에고치로부터 분리되는데, 이러한 누에고치는 피브로인과 세레신 등으로 구성된다. 본 발명에서 상기 실크는 실크 피브로인(Silk fibroin)을 의미한다. 누에고치의 내피 성분인 실크 피브로인은 전형적인 자연 고분자 물질로서, 생체에 적용할 때 염증 반응을 거의 일으키지 않으면서, 세포 부착능력과 증식효과가 뛰어나다. 상기 실크 피브로인은 생체 적합성이 우수하여 특별한 정제 과정을 거치지 않아도 인체에 대한 거부 반응이 거의 일어나지 않고 분말, 막, 다공질체 및 겔 등 다양한 형태로 성형할 수 있는 특징이 있다.

특히, 본 발명에서 실크 피브로인은 MG63 세포에서 타입 I 콜라겐의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 실크 피브로인을 4-헥실레조르시놀과 함께 사용할 경우 TNF-α이 과발현되어 발생하는 질환에서의 치료 효과를 높일 수 있으며, 이 중 화상 질환에서의 치료 효과를 높일 수 있다. 즉, 실크 피브로인을 포함하는 드레싱은 화상 상처에서 콜라겐의 재생을 증가시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서는 실크 피브로인을 사용하여 4-헥실레조르시놀의 사용량을 감소시킬 수 있다.

이러한 실크 피브로인은 금옥잠, 대성잠 또는 이들의 혼합물로부터 얻은 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 실크는 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부, 0.1 내지 5 중량부 또는 0.2 내지 2 중량부로 포함될 수 있다. 상기 함량 범위에서 4-헥실레조르시놀과의 높은 상승효과를 부여할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 전술한 4-헥실레조르시놀 및 실크 외에 라놀린(lanolin)을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 라놀린(lanolin)은 비친수성 흡수를 보이는 연고의 기재(베이스) 물질로 사용할 수 있다. 상기 라놀린은 EGF와 유사하게 상피 세포의 증식을 도와 창상의 조기 치유를 돕는 역할을 할 수 있으며, 다른 연고 기재에 비하여 단독으로 사용했을 경우 우수한 상피 재생 효과를 보인다.

또한, 라놀린은 TNF-α 발현을 억제하지 않으므로, 본 발명의 4-헥실레조르시놀과 함께 사용하여, 점막이나 피부에서 TNF-α 발현의 증가를 특징으로 하는 다양한 질환의 치료 효과를 상승시킬 수 있다.

상기 라놀린의 함량은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 100 중량부 대비 70 내지 99 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 4-헥실레조르시놀 및 실크를 포함하는 조성물은 의약품 또는 피부 외용제로 제조될 수 있다.

또한, 상기 의약품 또는 피부 외용제는 라놀린을 추가로 포함할 수 있다.

의약품으로 제조할 경우 경구적으로 또는 진피 내, 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등에 비경구적으로 투여된다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 각종 제형의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 '약제학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 이외에도 본 발명의 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

일 구체예에서 상기 조성물은 외용제로 제조될 수 있다. 상기 외용제는 시트제, 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 파프제, 분제, 침투 패드제, 분무제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제, 현탁액제, 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함될 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기 '약제학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 상기 유효성분이 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 30 중량부를 포함하는 것이 바람직하며, 0.1 내지 20 중량부를 포함하는 것이 보다 바람직하다.

일 구체예에서 상기 조성물은 화상 등에 직접 적용될 수 있다. 즉, 화상 부위 등에 산포될 수 있다. 시트의 형태인 경우는 화상 부위에 도포하는데 이때 도포한 부위에 적절히 드레싱하여 화상을 보호하면서 활성 성분의 치료 효과가 감소하는 것을 방지할 수 있다. 드레싱은 시판되고 있거나 통상적으로 알려져 있는 어떠한 것도 사용 가능하다. 시판되고 있는 드레싱의 예로는 컴필 (Compeel), 듀우덤 (Duoderm), 타가덤 (Tagaderm) 및 옵사이트 (Opsite)를 들 수 있다.

실시예

1. 동물 실험(Animal experiments)

본 연구는 강릉원주대학교 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 얻어 시행하였다(GWNU-2015-26). 수컷 12주령의 체중 350~400g의 Wistar 백서 13마리를 samtako(Soeul, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 동물들은 개개의 사육 cage에서 조절된 온도(20-22°C)와 습도(around 40%)에서 사육시켰다. 약 1주일간의 적응 기간이 지난 후 실험을 시작하였다.

네 개의 서로 다른 조성의 연고가 실험에 사용되었다. 음성 대조군(Negative control)으로 midium만 포함하고 있는 연고를 사용하였다. 실험군으로 2% 실크-A 그룹(이하, 실크-A), 2% 실크-B 그룹(이하, 실크-B), 0.2wt% 4HR 그룹(이하, 4HR)과 2% 실크-A + 0.2wt% 4HR 그룹(이하, 실크+4HR)을 사용하였다. 이때, 실크-A는 금옥잠에서 추출한 실크 피브로인을, 실크-B는 대성잠에서 추출한 실크 피브로인을 사용하였다.

전신마취 유도를 위하여 0.15 mL의 틸레타민(tiletamine) 플러스 졸라제팜(zolazepam)(Zoletil; Bayer Korea, Seoul, Korea) 과 0.15mL의 자일라진 염산염(xylazine hydrochloride)(Rompun; Bayer Korea)을 사용하였다. 등의 털은 제모제를 사용하여 제모하였다. 제모 후 10 % 포비돈 이오다인 용액을 사용하여 피부를 소독하였다. 깊은 3도 화상부를 2x2cm 의 사각형 금속판을 이용하여 형성하였다. 금속판을 170℃까지 가열한 후 백서의 등에 약 2초간 적용하였다. 각 그룹에 설정한 연고를 도포하였다. 연고 외 다른 dressing은 시행하지 않았다. 감염을 예방하기 위하여 1 mg/kg의 gentamicin (Kukje Pharm, Seongnam, Korea)과 0.5mL/Kg 의 pyrin (Green Cross Veterinary Products, Yongin, Korea)을 근육주사하였다. 연고 도포는 매일 시행하였으며 각 동물에서 2개의 화상부를 얻어 총 80개의 화상부를 실험에 사용하였다.

상처부의 치유를 평가하기 위하여 화상 형성 후 1일, 5일, 14일에 사진촬영을 하였다. 상피화가 일어나지 못한 부위는 Sigma Pro® (SPSS Inc, Chicago, IL)를 이용하여 평가하였다. 동물은 14일에 희생하여 조직학적 평가를 시행하였다.

2. 조직학적 분석

화상을 입힌 등 피부 조직을 채취하여 포르말린에 고정하였다. 표본은 에틸알콜과 자일렌을 이용하여 탈수시킨 후 파라핀 블록으로 포매하였다. 파라핀 블록은 얇게 섹션하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 시행하였다.

염색 과정은 다음과 같다. 첫째, 왁스를 표본에서 제거한 후 파라핀 섹션을 수화시킨다. 슬라이드는 헤마톡실린에서 5분간 염색을 시행한다. 과염색된 섹션은 산-알코올에서 수초간 agitating시켜 differentiate시킨 후 흐르는 물에 5분간 수세하였다. 슬라이드를 30초 동안 에오신에 침지시키고, 흐르는 물에 1분 동안 수세하였다. 슬라이드를 탈수시킨 후 자이렌에서 clear시킨다.

콜라겐 재생 분석을 위해 피크로-시리우스 레드 착색(Pico-sirius red staining)은 구입한 kit(ab150681, Abcam)을 이용하여 제조사에서 권하는 프로토콜에 따라 염색하였다. 간략히, 파라핀을 제거한 섹션을 피크로-시리우스 레드 용액에서 1시간 염색한 후 아세트산 용액에서 2번에 거쳐 빠르게 린스하였다.

TNF-α의 발현 정도를 결정하기 위하여, TNF-α 항체(antibodies) (Abcam)을 이용하여 면역 조직화학적 착색(immunohistochemical staining)을 시행하였다. 백서로부터 파라핀 포매 조직을 얻었다. TNF-α에 대한 1차 항체(Primary antibody)의 희석은 1:50으로 시행하였다.

면역 조직화학적 염색 과정은 Boonkaew B, Kempf M, Kimble R, Cuttle L. Cytotoxicity testing ofsilver-containing burn treatments using primary and immortal skin cells. Burns2014;40(8):1562-9.에서 기술한 대로 시행하였다. 음성 대조군(Negative control)은 primary antibodies 없이 염색하였다.

염색된 섹션들은 Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) 현미경(microscope)을 이용하여 분석하였다. 면역 조직화학적 반응 지수(reaction intensity)를 정량화하기 위하여, 피부에서 10개의 random fields를 x200 배율에서 그레이스 스케일(grayscale)로 이미지 변환을 시행한 후 computer assited image analysis를 통하여 평가하였다. 염색 강도는 평균 강도 값(mean intensity value)(0: no stain, 255: highest stain)으로 표현되었다. 흡광도는 면역반응 생산물에 기인하므로 샘플을 대비하지는 않았다.

3. 점도 측정

점도 측정은 TA instrument사의 discovery hybrid rheometer (DHR-3)을 이용하여 시행되었다. Concentric cylinder geometry가 정적인 상태인 진동 상태에서 측정에 이용되었다. 점도를 측정하기 위한 shear rate의 범위는 0.1에서 10 s-1이었고 진동 빈도는 0.1에서 100 rad/s였다.

4. 통계 분석(Statistical analysis)

네개의 독립적인 그룹의 비교를 위하여, ANOVA tests를 사용하였다. 사후 검증(post-hoc tests)을 위해, Bonferroni's method을 사용하였다. 통계적 유의 수준은 P<0.05로 설정하였다.

5. 결과

본 발명에서 도 1은 화상 후 1일, 5일 및 14일째, 각 그룹의 남은 탈상피 영역(Residual Deepithelized Area), 즉 상피화가 이루어지지 않은 영역의 평균 넓이를 그래프이고, 도 2는 각 그룹의 상피 영역을 나타내는 사진이다.

화상 후 1일 째, 상피화가 이루어지지 않은 영역의 평균 넓이, 즉 평균 치유되지 않은 영역(average denuded surface area)은 음성 대조군(control), 실크-A, 실크-B, 4HR, 및 실크+4HR이 각각 541.30 ± 39.67 mm², 551.84 ± 29.95 mm², 539.00 ± 56.25 mm2, 472.31± 36.79 mm², 및 490.28 ± 47.11 mm²로 그룹간의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(P>0.05).

화상 후 5일 째, 평균 치유되지 않은 영역(average denuded surface area)은 음성 대조군(control), 실크-A, 실크-B, 4HR, 및 실크+4HR이 각각 502.00 ± 36.37 mm², 496.06 ± 38.45 mm², 468.41 ± 35.98 mm², 390.88 ± 40.75 mm², 및 400.03 ± 52.05 mm²로 측정되었다(P<0.001).

사후 검증(post-hoc tests)에서, 화상 5일 후 평균 치유되지 않은 영역(average denuded surface area)은 4HR이 음성 대조군, 실크-A와 비교하여 작은 값을 가졌다. 실크+4HR도 음성 대조군과 비교하여 작은 값을 가졌다(P=0.009 및 0.015, 각각).

화상 후 14일 째, 평균 치유되지 않은 영역(average denuded surface area)은 음성 대조군, 실크-A, 실크-B, 4HR, 및 실크+4HR이 각각 364.39 ± 18.96 mm², 293.40 ± 42.74 mm², 281.64 ± 31.81 mm², 271.15 ± 33.40 mm², 및 242.40 ± 31.63 mm²로, 그룹 간의 차이가 통계적으로 유의했다(P<0.012).

사후 검증에서, 화상 후 14일 일 째 상피화가 일어나지 않은 영역은 실크+4HR이 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 작은 값을 가졌다.

따라서, 실크+4HR은 실크-A, 실크-B, 4-HR 보다 우수한 상피 재생 효과를 보였다.

본 발명에서 도 3은 화상 후 14 일이 경과하였을 때 시행한 면역조직화학 염색 결과를 나타내는 사진(오리지널 배율 x 40)이다.

조직학적 검사는 음성 대조군에서 표피와 진피의 괴사가 여전히 관찰되었다. 괴사된 피부의 국소적인 박리는 모든 그룹에서 관찰되었다. 괴사된 피부의 점진적인 박리 및 상처 변연에서의 상피 형성은 4HR 및 실크+4HR에서 발견되었으며, 특히 실크+4HR에서 상피 형성이 우수한 것을 확인할 수 있다.

재생 콜라겐 섬유는 특수 염색으로 확인하였다. 콜라겐 섬유 재생은 음성 대조군과 비교하여 실크-A, 실크-B, 및 실크+4HR에서 분명하였다. 4HR 역시 음성 대조군과 비교하여 더 좋은 재생을 보여주었다. 재생된 콜라겐의 양으로 해석될 수 있는 적색의 강도를 비교하면, 4HR의 강도는 실크-B, 및 실크+4HR의 강도보다 작았다. 따라서 실크+4HR이나 실크-B의 경우 4HR을 단독으로 적용한 경우에 비하여 교원섬유의 재생이 우수하였다.

또한, 본 발명에서 도 4는 화상 후 14 일이 경과하였을 때 TNF-α의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.

면역조직화학적 분석에서, 실크+4HR은 음성 대조군보다 낮은 TNF-α 발현을 나타내었다. TNF-α의 상대적인 발현량은 음성 대조군, 실크-A, 실크-B, 4HR, 및 실크+4HR에서 각각 116.41 ± 11.98, 123.60 ± 18.34, 100.57 ± 18.17, 104.28 ± 12.54, 및 90.07 ± 16.37로 측정되었다(P=0.024).

사후 검증에서, 실크+4HR은 음성 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 적은 TNF-α 발현 값을 가지는 결과를 나타내며(P=0.015), 실크-A와 비교하여도 유의하게 적은 값을 가졌다(P=0.003).

즉, 본 발명에서는 실크-4HR 연고를 사용한 동물이 다른 그룹들과 비교하여 가장 우수한 치료 효과를 보였다. 이는 실크 피브로인과 4HR의 상승 효과에 의한 것이다.

4HR은 대식세포에서 TNF-α의 발현을 억제할 수 있다. TNF-α는 급성 염증의 중요한 마커로서, 상기 TNF-α의 억제는 염증 반응을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서 4HR 또는 실크+4HR은 다른 그룹과 비교하여 TNF-α의 발현이 적게 나타났다. 따라서, 4HR을 포함하는 연고(드레싱)는 TNF-α억제를 통한 항염증 효과를 가지고, 빠른 상처 치유에 기여할 수 있다.

또한, 본 발명에서 실크 피브로인을 포함하는 연고는 실크 피브로인을 가지지 않는 것 보다 더 나은 콜라겐 재생을 보여주었다.

실크 피브로인은 MG-63 세포주에서 콜라겐의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 실크 피브로인은 약물 전달 시스템의 전달체로도 많이 연구되고 있다. 본 발명에서 4HR은 TNF-α의 발현을 억제하기는 하나 0.2%의 농도에서 다른 그룹에 비하여 유의하게 억제시키지는 못하였다. 하지만 4HR과 함께 실크 피브로인을 약물 전달물질로 사용하는 경우 0.2%의 농도에서도 4HR이 유의하게 TNF-α의 발현을 억제하였다. 즉, 실크+4HR은 적은 양의 4HR의 사용으로도 TNF-α 발현을 억제하고, 콜레겐의 발현을 증가시켜서 상처의 치유를 촉진시킬 수 있다.

또한, 본 발명에서 도 5는 연고 제재의 점도를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 4HR과 실크를 함께 사용한 실크+4HR은 4HR이나 연고 기제 단독으로 사용하는 경우(Silk-A, Silk-B)와 비교하여 연고의 점도를 증가시키는 물성의 개선 효과를 가져왔다.

이는 연고가 구강 내와 같은 습한 환경에서 사용된다고 하더라도 쉽게 세척되지 않고 약효가 오랜 기간 유지될 수 있음을 의미한다.

Claims

4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol) 및 실크를 포함하는 심도 화상의 치료를 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol)의 함량은 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부인 심도 화상의 치료를 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
실크는 금옥잠, 대성잠 또는 이들의 혼합물로부터 얻은 것인 심도 화상의 치료를 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
실크의 함량은 조성물 100 중량부 대비 0.05 내지 10 중량부인 심도 화상의 치료를 위한 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,
라놀린을 추가로 포함하는 심도 화상의 치료를 위한 의약 조성물.
4-헥실레조르시놀(4-hexylresorcinol) 및 실크를 포함하는 심도 화상의 치료를 위한 피부 외용제.