KR101702164B1 - 소량의 항불안제 약물로 사용가능한 산국화 추출물의 제조 방법 - Google Patents

소량의 항불안제 약물로 사용가능한 산국화 추출물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)이하로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법의 일 양태는 분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성 기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는 세공을 구비한 다공성 흡착제에 산국화 수추출물을 흡착시키는 단계; 및 용리액으로 물을 사용하여 유출액을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 제조 방법의 다른 일 양태는 산국화 수추출물에 에틸아세테이트(EtOAc) 첨가하여 용매분획을 수행하는 단계; 및 상기 용매분획 중 수층을 회수하는 단계를 포함한다.

Description

소량의 항불안제 약물로 사용가능한 산국화 추출물의 제조 방법{A method for preparing an extract of Crysanthemum indicum capable of being used as a small amount of anti-anxiety drug}
본 발명은, 소량의 항불안제 약물로 사용가능한 산국화 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.
불안은 마음이 조마조마하고 걱정이 있는 것으로 이는 대개 정상적인 반응이다. 그러나 과도한 불안 상태나 걱정이 6개월 이상 지속되는 경우에는 불안장애를 의심할 수 있다. 불안이 심해지면 숙면을 취하기 어렵고, 쉽게 피곤하고 지치게 되며, 근육의 지속적인 긴장, 가슴이 조이는 듯 답답한 현상이나 위의 통증이 종종 동반된다.
적절한 불안은 부정적인 결과가 예상되는 상황에서 긴장하고 경계하여 상황을 극복할 수 있게 도와준다. 따라서 이때에는 치료가 필요 없다. 다만, 위험이 없거나 사라졌음에도 불안을 느끼거나, 위험의 정도에 비해 과도하게 불안을 느끼는 경우가 병적인 불안이며 이때에는 치료가 필요하다. 불안 장애에 대한 진단과정을 거친 후 불안 장애의 세부 진단에 따라 치료법이 달라지게 되나 일반적으로 항불안제와 항우울제가 가장 흔히 사용된다.
한편, 우울증 또는 불안증의 치료를 위하여 세로토닌 재흡수 억제제 등의 개발이 지속적으로 이루어지고 있다. 그러나, 우울증 또는 불안증은 신경계와 밀접한 관련이 있어 그 부작용이 우려되고 있으며, 효능이 있는 치료제의 경우에도 약물에 대한 중독, 금단 현상 등의 부작용이 있어, 환자의 상태에 따라 의사의 처방에 각별한 주의가 필요하다.
종래 전통 식물은 부작용 등의 우려가 적기 때문에, 한방과 같은 전통 의약으로부터 우울증 또는 불안증에 대한 효능을 확인하는 시도가 이루어지고 있다. 대표적으로 산조인과 천마가 항불안 효과 등에 유용함이 보고되었다(Wu S.X. et al., China Journal of Chinese Materia Medica., 18, pp. 685-704; Huang J.H., Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao., 11, pp. 147-50, 1989).
한편, 본 발명자들은 대한민국 등록특허 제10-0806035호에서 산국화 추출물이 신경안정 및 항불안 효능이 있는 것을 확인하였다. 이에 더하여 본 발명자들은 추가적인 실험을 통해 Diaion HP 20 충진제에 산국화 수추출물을 흡착시킨 후 물로 용리시켜 수득한 산국화 추출물의 경우 화학 약물처럼 3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구 투여한 경우에서도 항불안 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
또한, Diaion HP 20 충진제에 산국화 수추출물을 흡착시킨 후 물로 용리시켜 수득한 산국화 추출물과 동일한 항불안 효능을, 소량 경구 투여시 나타내는 산국화 추출물의 생산 방법을 연구한 결과, 산국화 수추출물을 에틸아세테이트로 용매 분획하여 회수한 수층이 실질적으로 동일한 효능을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이하로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는, 세공을 구비한 다공성 흡착제에 산국화 수추출물을 흡착시키는 단계; 및 용리액으로 물을 사용하여 유출액을 회수하는 단계를 포함하여, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이하로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산국화 수추출물에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가하여 용매분획을 수행하는 단계; 및 상기 용매분획 중 수층을 회수하는 단계를 포함하여, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이하로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물의 제조 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명자들은 산국화 수추출물 또는 이의 감압농축액을 물로 희석한 것을, Diaion HP-20 충진제로 충진된 대량 오픈 컬럼(open column) 상에 흡착시키고 나서 이동상으로 물을 사용하여 용출시킨 것을 모두 수집한 후, 항불안 효과를 시험한 결과 15mg/체중kg(고형분 기준) 이하에서도, 예컨대 화학 약물처럼 3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구 투여한 경우에서도, 항불안 효과가 있음을 확인하였다(도 2 및 3).
한편, 본 발명자들은 산국화 수추출물을 Diaion HP-20 충진제로 충진된 대량 오픈 컬럼상에 흡착시키고 나서 이동상으로 물을 사용하여 용출시킨 것을 모두 수집한, 산국화 추출물과 성분들의 분포 및 조합이 가장 유사한 산국화 추출물의 제조방법 또한 확립하고자 하였다. 이에, 산국화 수추출물을 다양한 용매로 용매분획 후 얻은 수층에 대해 크로마토그래프 성분 분석을 실시하였다. 그 결과, 에틸아세테이트로 용매분획 후 수층에서 얻은 산국화 추출물이, 15mg/체중kg(고형분 기준) 이하, 특히 3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구투여한 경우에서도 항불안 효과가 있는, 상기 Diaion HP-20 충진제를 이용하여 준비된 산국화 추출물과 가장 유사한 크로마토그래피 성분 패턴을 가짐을 확인하였다. 나아가 에틸아세테이트 용매 분획에서 에틸아세테이트층에서 얻은 산국화 추출물은 항불안 효과를 나타내지 못하는 반면(도 5), 수층에서 얻은 산국화 추출물의 경우, 우수한 항불안 효과를 나타냄을 확인하였다(도 6 및 7).
3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구 투여한 경우에서도 항불안 효과가 있는, 산국화 추출물은 DIAION HP 20 충진제가 충전된 디아니온 크로마토그래피(Dianion Chromatography)로 산국화 수추출물을 흡착시킨 후 물로 용리시켜 모두 수득한 산국화 추출물이다.
여기서, DIAION HP 20는 스티렌(Styrene)과 디비닐벤젠(Divinyl benzene, DVB)의 공중합체의 High Porous Type 합성흡착제(Synthetic Adsorbent)이다. DIAION HP 20은 다수의 세공(細孔)이 분포하며 비표면적(Surface Area)이 높아 흡착 능력이 우수하다. 세공이 비교적 크기 때문에 큰 분자의 흡착에 적합하며(MW 1,500 이상) 흡착물질의 용리(Elution)가 용이하다.
DIAION HP 20은 입자의 표면이 소수성(hydrophobic)을 띠고 있어서 유기물이 합성 흡착제에 흡착될 때 유기분자 중의 소수성기가 흡착된다. 따라서, 소수기의 소수정도가 큰 유기물(예, 지방산의 알킬기)이 흡착이 잘된다. 흡착된 유기물의 용리는 산, 알칼리, 극성 용매 등이 사용된다. 유기용매 중 합성흡착제는 팽윤하여 부피가 늘어난다. 부피가 팽창하면 입자의 세공 크기도 증가하여 흡착하고 있던 물질이 용리될 수 있다.
DIAION HP 20의 물성은 다음과 같다.
구분 DIAION HP 20
겉보기 밀도 (Shipping Weight) 680 g/l(approx.)
진비중 (Specific Gravity) 1.01g/ml
수 분 (Moisture Retention) 55~65%
입도분포 (Particle Size) 0.25 mm 이상이 90% 이상
유효경 (Effective Size) 0.25 mm 이상
균일계수 (Uniformity Coefficient) 1.6 이하
비표면적 (Specific Surface Area) 600 m2/g
세공용적 (Pore Volume) 1.3 ml/g
세공반경 (Pore Radius) 200~300 옹스트롱
DIAION HP 20의 각종 유기용매 중 체적변화율은 다음과 같다.
Benzene 1.33
Toluene 1.31
Acetone 1.32
Methanol 1.26
Water 1.00
따라서, 본 발명은 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이하로 경구 투여시, 바람직하게는 1 ~ 15 mg/체중kg로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물을 제조하기 위해, 분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는, 세공을 구비한 다공성 흡착제에 산국화 수추출물을 흡착시킨 후, 용리액으로 물을 사용하여 물 가용유출물을 회수하는 것이 특징이다.
산국화(Chrysanthemum indicum, Asteraceae)는 가을과 겨울에 채취하고 전통적으로 부스럼과 같은 소염작용과 두통과 현기증에 사용예가 있다. 지금까지 알려진 산국화의 지하부에서 알려진 성분으로는 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 류인 구아이아노라이드(guaianolides), 크리세투논(chrysetunone) 등이 있다. 그 이외에도 다양한 종류의 정유성분 즉 캠퍼(camphor), 크리잔티논(chrysanthenone), 리모넨 (limonene), 피넨(pinene) 등이 있고 아캐신(acaciin), 루테올린(luteolin) 7-OB-글루코피라노시드(7-O-B-glucopiranoside), 아카세틴(acacetin) 7-B-D-갈락토피라노시드(7-B-D-galactopyranoside)과 같은 플라본(flavone)이 보고되었다. 또한, 최근에는 비스아볼랜 케토딜(bisabolane ketodil)인 인디쿠메논(indicumenone)이 분리되었고 이외에도 비정유성분으로 사이토스테롤(sitosterol), 프리델린 (fridelin), 세사민(sesamin)과 같은 성분이 보고되었다. 이의 유사생약인 국화 (C. morifolium)의 화수에서는 아캐신(acacin)과 아피제닌(apigenin) 배당체와 같은 플라보노이드(flavonoid) 계열의 성분이 보고되었고, 현재까지 알려진 생리활성으로는 혈소판 응집억제 작용이 있다.
본 발명에서 사용하는 산국화는 산국화의 꽃을 말린 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에서 사용되는 산국화 수추출물은 산국화를 물로 추출하여 수득한 것으로, 유효물질을 높은 수율로 추출하기 위해 추출온도, 추출시간, 추출용매의 양 등을 고려하는 것이 바람직하다.
이를 위한 추출온도는 20℃ 내지 80℃, 바람직하게는 30℃ 내지 70℃, 가장 바람직하게는 70℃이다.
추출시간은 2시간 내지 10시간, 바람직하게는 3시간 내지 9시간, 가장 바람직하게는 9시간이다.
물은 상기 산국화의 중량 대비 5 내지 25배, 바람직하게는 10 내지 20배, 가장 바람직하게는 15배를 사용한다.
또한, 산국화를 물로 추출시 2회 이상 추출하는 것도 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 추출온도를 70℃, 추출시간은 9시간으로 할 경우 수율이 우수하였다.
상기와 같이 제조된 산국화 수추출물은 그대로 또는 동결건조한 후 물로 희석한 다음 이후 단계에 사용할 수 있다.
본 발명은 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)이하로 경구 투여시 항불안 활성을 발휘할 수 있는 산국화 추출물을 제조하기 위해, 상기와 같이 준비된 산국화 수추출물을 분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는 세공을 구비한 다공성 흡착제에 흡착시킨 후, 용리액으로 물을 사용하여 물 가용유출물을 회수하거나, 상기와 같이 준비된 산국화 수추출물에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가하여 용매분획을 수행한 후 상기 용매분획 중 수층을 회수한다.
분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는 다공성 흡착제로는 DIAION HP 20 충진제를 사용할 수 있다.
한편, 산국화 수추출물을 에틸아세테이트 용매로 분획하면, 용매층과 수층으로 분리되며 이중 수층에 HP20 충진제를 이용한 물 분획층과 실질적으로 동일한 성분들이 포함되어 있어 수층을 회수한다.
상기 산국화 수추출물과 에틸아세테이트(EtOAc)의 부피비는 1:2 ~ 1:4 인 것이 바람직하며, 일 실시예에서는 1:3 이었다.
본 발명의 제조방법은 이전 단계에서 회수한 수층을 에틸아세테이트 용매로 분획하여 수층을 회수하는 단계를 1회 이상 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 이전단계에서 회수된 수층을 감압 하에 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 산국화 추출물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하여 항불안제 조성물로 사용할 수 있다. 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 산국화 추출물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
이와 같은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 산국화 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 산국화 추출물은 화학 약물처럼 3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구 투여한 경우에서도 항불안 효과가 있다.
또한, 산국화 수추출물을 에틸아세테이트로 용매 분획하여 수층을 회수하는 본 발명의 제조방법은, 화학 약물처럼 3mg/체중kg(고형분 기준)로 소량 경구 투여한 경우에서도 항불안 효과가 있는 산국화 추출물을 높은 수율과 낮은 생산비용으로 대량생산할 수 있다.
도 1은 제조예 1, 실시예 1 및 2에 따라 본 발명의 일 구체예에 따른 산국화 추출물을 제조하는 공정을 도시한 것이다.
도 2는 십자 미로 측정법(elevated plus-maze test)에서 산국화 HP20 fraction의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군, 양성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 마우스가 열린 길에서 머문 시간(도 2A) 및 열린 길로 들어간 횟수(도 2B)에 대한 백분율을 도시한 그래프이다(*p<0.05, **p<0.01 compared to the DW).
도 3은 오픈필드 테스트(open field test)에서 산국화 HP20 fraction의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군, 양성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 센터에서 머문 시간(도 3A) 및 센터로 들어간 횟수(도 3B)에 대한 백분율을 도시한 그래프이다.
도 4는 십자 미로 측정법(elevated plus-maze test)에서 산국화 물 조추출물의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 마우스가 열린 길에서 머문 시간(도 4A) 및 열린 길로 들어간 횟수(도 4B)에 대한 백분율을 도시한 그래프이다(*p<0.05 compared to the DW).
도 5는 십자 미로 측정법(elevated plus-maze test)에서 산국화 에틸아세테이트 분획물의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 마우스가 열린 길에서 머문 시간(도 5A) 및 열린 길로 들어간 횟수(도 5B)에 대한 백분율을 도시한 그래프이다.
도 6은 십자 미로 측정법(elevated plus-maze test)에서 산국화 물 분획물의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 마우스가 열린 길에서 머문 시간(도 6A) 및 열린 길로 들어간 횟수(도 6B)에 대한 백분율을 도시한 그래프이다(*p<0.05 compared to the DW).
도 7은 명암 상자 테스트(light-dark box test)에서 산국화 물 분획물의 항불안 효과를 나타낸 도로서, 음성대조군 및 산국화 추출물 투여군에서 마우스가 명실에서 머문 시간(도 7A) 및 명실로 들어간 횟수(도 7B)를 도시한 그래프이다 (*p<0.05 compared to the DW).
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제조예: 산국화 수추출물의 제조
국화과 식물인 산국화는 경동시장에서 구입하여 사용하였다. 건조된 산국화 꽃부분 1kg을 마쇄하지 않고 사용하였으며, 추출온도, 추출시간, 물의 사용량(건조된 산국화의 부피 대비)은 하기 표 3의 조건으로 추출하였다. 추출횟수는 2회로 하였으며, 각 추출된 산국화 수추출물(추출물 중 고형분 기준)은 동결건조하여 사용된 산국화에 대하여 수율을 계산하였다.
제조예 번호 추출온도(℃) 추출시간(h) 물의 사용량(배) 수율(%)
제조예 1-1 30 3 10 21.20
제조예 1-2 30 3 15 22.10
제조예 1-3 30 3 20 22.16
제조예 1-4 30 6 10 25.00
제조예 1-5 30 6 15 26.18
제조예 1-6 30 6 20 27.29
제조예 1-7 30 9 10 26.02
제조예 1-8 30 9 15 27.87
제조예 1-9 30 9 20 28.65
제조예 1-10 50 3 10 22.76
제조예 1-11 50 3 15 23.20
제조예 1-12 50 3 20 26.70
제조예 1-13 50 6 10 28.78
제조예 1-14 50 6 15 29.72
제조예 1-15 50 6 20 30.31
제조예 1-16 50 9 10 30.51
제조예 1-17 50 9 15 31.90
제조예 1-18 50 9 20 33.00
제조예 1-19 70 3 10 24.70
제조예 1-20 70 3 15 26.15
제조예 1-21 70 3 20 27.55
제조예 1-22 70 6 10 31.12
제조예 1-23 70 6 15 31.76
제조예 1-24 70 6 20 32.30
제조예 1-25 70 9 10 37.38
제조예 1-26 70 9 15 38.11
제조예 1-27 70 9 20 39.22
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 대부분 약 21% 이상의 높은 수율을 나타내었으며, 특히 추출온도가 70℃, 추출시간이 9 시간인 경우 높은 수율을 나타내었다.
실시예 1: HP-20 충진제를 사용한 산국화 추출물의 제조
상기 제조예 1-26에서 제조된 산국화 수추출물을 물로 희석한 후, diaion HP-20 충진제(Biotage, USA)가 충진된 대량 오픈 컬럼(open column) 상에 흡착시키고, 이어서 이동상을 물로 하여 용출시킨 것을 모두 수집한 후, 여과 농축한 후 최종 동결건조하여 산국화 추출물을 제조하였다(수율: 20.2%).
실시예 2: 에틸아세테이트를 이용한 산국화 추출물의 제조
상기 제조예 1-26에서 제조된 산국화 수추출물 253g을 물로 희석한 후, 에틸아세테이트와 부피비 1:3으로 혼합하여 용매분획하였다. 수층을 회수한 후, 다시 에틸아세테이트와 부피비 1:3으로 혼합하여 용매분획하였으며, 이를 1회 더 반복하였다. 수층을 회수한 후 여과 감압농축하여 산국화 추출물을 제조하였다(수율: 22.7%).
비교예 1: 클로로포름을 이용한 산국화 추출물의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 산국화 추출물을 제조하되, 에틸아세테이트 대신 클로로포름을 사용하여, 산국화 추출물을 제조하였다.
비교예 2: 이소부탄올을 이용한 산국화 추출물의 제조
실시예 2와 동일한 방법으로 산국화 추출물을 제조하되, 에틸아세테이트 대신 이소부탄올을 사용하여, 산국화 추출물을 제조하였다.
실험예 1: 산국화 추출물의 유효성분 비교
실시예 1에 따라 HP-20 충진제에 흡착시킨 후 물로 용출시킨 산국화 추출물과, 실시예 2에 따라 에틸아세테이트로 용매 분획하여 수층으로 얻은 산국화 추출물, 비교예 1 및 2에 따라 얻은 산국화 추출물의 성분들을 확인 및 비교하기 위하여, 각 추출물을 크로마토그래프 성분 분석을 실시하였다.
그 결과, 실시예 2에서 제조된 에틸아세테이트를 이용한 산국화 추출물과, 실시예 1에서 제조된 HP-20 충진제를 사용한 산국화 추출물을 비교하였을 때, 크로마토그래프의 패턴이 매우 유사한 결과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 실시예 2에서 제조된 산국화 추출물은 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물과 유사한 효과가 있음을 유추할 수 있다.
실험예 2: 항불안 효과 측정
(1) 실험동물
실험동물은 ICR계 수컷 마우스(23-30g)를 (주) Koatech Ltd.(평택, 대한민국)에서 공급받아, 온도와 습도가 일정하게 유지되고(23 ± 1℃, 55 ± 5 %) 12시간 단위로 낮과 밤 주기가 바뀌며 사료와 물이 자유롭게 제공되는 성균관대학교 약학대학 동물 사육실에서 1주일간의 적응기간을 거친 후 실험에 이용하였다. 각 실험에 1군당 10 내지 20마리의 마우스를 사용하였다.
(2) 십자 미로 측정법( elevated plus - maze test )에 의한 항불안 효과 측정
십자 미로(elevated plus-maze)는 바닥에서 50cm 높이에 설치된 십자형 (+) 미로로서, 4 개의 통로 가운데 마주보는 2개(길이 30cm, 폭 5cm)는 개방되어 있고, 크기가 동일한 다른 2개의 통로는 높이 15cm의 벽으로 둘러싸여 있다. 중심부위는 가로 5cm 및 세로 5cm로 하였고, 미로의 중앙부 천장에 비디오카메라를 설치하여 동물의 행동을 기록하였으며 광도는 24lux로 조정하였다. 실험을 시작할 때 마우스의 시선이 열린 길의 바깥을 향하도록 하여 놓은 후, 마우스가 자발적으로 열린 길 또는 막힌 길을 택하여 미로를 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 마우스가 열린 길과 막힌 길에 머문 시간, 각 길로 들어간 횟수 등을 EthoVision 3.1 system(Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)으로 각각 측정하였다. 파라미터들은 다음과 같이 계산하였다.
; 열린 길에서 머문 시간에 대한 백분율(%)
= (열린 길에서 머문 시간/ 각 길에서 보낸 총 시간) X 100
; 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율(%)
= (열린 길로 들어간 횟수 / 각 길로 들어간 총 횟수) X 100
(3) 오픈필드 테스트( open field test )에 의한 항불안 효과 측정
동물의 행동은 NeuroVision(Pusan, Republic of Korea) 비디오 추적 시스템을 사용하였다. 비디오카메라는 바닥으로부터 높이 100cm인 천장 중앙부에 설치하였고 각각의 오픈필드 테스트용 플라스틱 상자(가로 30cm, 세로 30cm, 높이 30cm)를 찍을 수 있게 하였다. 약물을 투여한 지 1 시간이 지났을 때, 마우스를 광도가 100-120 lux로 조정된 플라스틱 상자 안에서 10분 동안 적응시키고, 다음 10 분 동안의 행동을 기록하였다. 플라스틱 상자의 중심부위(center zone)은 가로 15 cm, 세로 15 cm로 지정하였다.
(4) 명암 상자 테스트( light - dark box test )에 의한 항불안 효과 측정
명암 상자(light and darkness chamber)는 명실(가로 25 cm, 세로 25 cm, 높이 25 cm)과 암실(가로 18 cm, 세로 25 cm, 높이 25 cm)로 분리되어 있다. 상자의 중앙부 천장에 비디오카메라를 설치하여 동물의 행동을 기록하였으며 명실(light space)의 광도는 600-700 lux로 조정하였고 암실(darkness space)의 광도는 0-2 lux로 조정하였다. 실험을 시작할 때 마우스는 암실에 머리가 명실의 입구 반대편 벽을 향하게 놓은 다음 상자 안을 자유롭게 탐색하도록 하였다. 행동은 5 분간 관찰하였으며, 마우스가 명실에 머문 시간, 출입 횟수 등을 EthoVision 3.1 system(Noldus Information Technology, Wageningen, Netherlands)으로 각각 측정하였다.
실험예 2-1: 십자형 미로 측정법에서 산국화 HP20 fraction 의 항불안 효과
실험 시작 1 시간 전에, 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물을 3, 7.5, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량으로 마우스에 경구 투여하였다. 음성 대조군으로 증류수를 동일 용량으로 마우스에 경구 투여하였으며, 양성 대조군으로는 항불안제인 부스피론(buspirone) (5 mg/kg, i.p., Sigma St. Louis, USA)을 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물을 소량으로 경구 투여한 마우스의 십자형 미로 측정법을 실시한 결과, 산국화 추출물 투여군과 양성 대조군(buspirone, 5mg/kg) 모두에서 증류수(DW) 투여군에 비해 열린 길에서 머문 시간과 출입 횟수가 증가하는 경향이 있었다. 열린 길에서 머문 시간의 백분율은 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물 3, 7.5, 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량에서 증류수 투여군에 비해 각각 181.6%, 190.8%, 202.9%의 유의한 증가를 보임을 관찰할 수 있었다(*p<0.05, **p<0.01). 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물을 투여한 그룹은 3mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)와 같이 소량으로 투여되어도, 항불안제인 부스피론(5 mg/kg)을 투여한 그룹보다 증가하는 경향이 있었다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 산국화 수추출물은 화학 약물과 같이 소량으로 경구 투여하여도 항불안 효과가 있음을 알 수 있다(도 2 A, B 참조).
실험예 2-2: 오픈필드 테스트에서 산국화 HP20 fraction 의 항불안 효과
오픈필드 테스트에서 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물의 항불안 효과를 시험하기 위하여, 상기 실험예 2-1과 동일한 실험방법을 수행하였다. 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물 3, 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)을 각각 경구 투여한 마우스의 오픈필드 테스트를 실시한 결과, 증류수 투여군에 비해 센터로 들어간 횟수에 대한 백분율이 증가하는 경향이 있었으며 양성대조군으로 쓰인 부스피론 투여군도 증류수 투여군에 비해 증가하는 경향이 있었다.
센터에서 머문 시간의 백분율은 부스피론 투여군과 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물 3, 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)을 각각 경구 투여한 마우스 그룹 모두에서 증류수 투여군에 비해 증가하는 경향이 있었고 산국화 추출물 투여군에서는 양성대조군에 비해 증가하는 경향이 있었음을 관찰할 수 있었다. 이러한 사실은 실시예 1에서 제조된 산국화 추출물이 3mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)와 같이 소량으로 투여되어도, 항불안제인 부스피론(5 mg/kg)을 투여한 그룹과 비교시, 오픈필드(open field)에서 항불안 효과를 가지고 있음을 입증하고 있다(도 3 A, B 참조).
실험예 2-3: 십자형 미로 측정법에서 산국화 물 조추출물의 항불안 효과
상기 제조예 1-26에서 제조된 산국화 물 조추출물을 10, 30, 100mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량으로 경구 투여한 다음, 1시간 후 카메라를 이용하여 실시간 측정하였다. 제조예 1-26에서 제조된 산국화 물 조추출물 10, 30, 100mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)을 각각 경구 투여한 마우스의 십자형 미로 측정법을 실시한 결과, 산국화 추출물 투여군에서 열린 길에서 머문 시간과 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율이 증류수(DW) 투여군에 비해 증가하는 경향이 있었다. 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율은 제조예 1-26에서 제조된 산국화 수추출물 30mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)에서 증류수(DW) 투여군에 비해 유의적으로 증가함을 관찰할 수 있었다(*p<0.05). 이러한 사실은 실시예 1-26에서 제조된 산국화 물 조추출물이 십자형 미로 측정법에서 항불안 효과를 가지고 있음을 나타내는 것이나, 산국화 물조추출물이 투여된 마우스에 항불안 효과를 나타나기 위해서는 최소 30mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이상이 투여되어야 한다는 것 역시 나타낸다(도 4 A, B).
실험예 2-4: 십자형 미로 측정법을 이용한 산국화 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물의 항불안 효과 비교
1) 산국화 에틸아세테이트 분획물의 십자형 미로 측정법을 통한 항불안 효과 확인
상기 실시예 2의 산국화 수추출물을 에틸아세테이트와 물로 용매 분획하는 과정에서, 에틸아세테이트 층을 회수하였고, 회수된 에틸아세테이트 분획물의 항불안 효과를 십자형 미로 측정법으로 확인하였다.
구체적으로, 산국화 에틸아세테이트 분획물을 각각 10, 30, 100mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량으로 마우스에 경구 투여한 다음, 1시간 후 카메라를 이용하여 실시간 측정하여 마우스의 십자형 미로 측정법을 실시하였다.
그 결과, 산국화 투여군에서 열린 길에서 머문 시간과 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율이 증류수(DW) 투여군에 비해 유의한 변화가 없는 것을 확인하였다. 이러한 사실은 실시예 2에서 수층을 회수하여 제조한 본 발명의 산국화 추출물과 달리, 산국화 에틸아세테이트 층에서 회수한 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 항불안 효과를 가지고 있지 않음을 나타내는 것이다(도 5 A, B 참조).
2) 산국화 물 분획물의 십자형 미로 측정법을 통한 항불안 효과 확인
상기 실시예 2에서 본 발명의 방법으로 제조한 산국화 물 분획물을 3, 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량으로 마우스에 경구 투여한 다음, 1시간 후 카메라를 이용하여 실시간 측정하여 십자형 미로 측정법을 실시하였다.
그 결과, 상기 산국화 물 분획물을 투여한 모든 군에서 열린 길에서 머문 시간과 열린 길로 들어간 횟수가 증류수(DW) 투여군에 비해 증가하는 경향이 있었다. 특히, 실시예 2에서 제조된 산국화 물 분획물 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)을 각각 경구 투여한 마우스에서 열린 길에서 머문 시간과 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율이 증류수(DW) 투여군에 비해 유의적으로 증가함을 관찰할 수 있었다(*p<0.05). 이러한 사실은 실시예 2에서 제조된 산국화 물 분획물이 실시예 2에서 HP20 충진제를 이용하여 제조된 산국화 추출물과 소량 경구 투여시 실질적으로 동일한 항불안 효능을 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 이러한 결과는 본 발명의 방법으로 제조한 산국화 물 분획물의 경우, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준) 이하의 양으로 마우스에 투여하여도 우수한 항불안 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다(도 6 A, B 참조).
실험예 2-5: 명암 상자 테스트에서 산국화 물 분획물의 항불안 효과
상기 실시예 2에서 제조한 산국화 물 분획물을 3, 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)용량으로 각각 마우스에 경구 투여한 다음, 1시간 후 카메라를 이용하여 실시간 측정하면서, 명암 상자 테스트를 실시하였다.
그 결과, 산국화를 투여한 모든 군에서 명실에서 머문 시간과 명실로 들어간 횟수가 증류수(DW) 투여군에 비해 증가하는 경향이 있었다. 실시예 2에서 제조된 산국화 물 분획물 7.5, 15mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)을 각각 경구 투여한 마우스에서 열린 길에서 머문 시간과 열린 길로 들어간 횟수에 대한 백분율이 증류수(DW) 투여군에 비해 유의적으로 증가함을 관찰할 수 있었다(*p<0.05). 이러한 사실은 실시예 2에서 제조된 산국화 물 분획물이 화학 약물과 같이 소량으로 경구 투여하여도 명암 상자 테스트에서 항불안 효과를 가지고 있음을 나타내는 것이다. 또한, 상기와 같은 결과는 본 발명의 방법으로 제조한 산국화 추출물의 경우, 15mg/체중kg 이하의 양으로 마우스에 투여하여도 우수한 항불안 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다(도 7 A, B 참조).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 분자량 1500 이상으로 적어도 일부에 소수성기를 갖는 고분자를 흡착할 수 있는 세공을 구비한 다공성 흡착제에 추출온도 30℃ 내지 80℃에서의 산국화 수추출물을 흡착시키는 제1a단계; 및 용리액으로 물을 사용하여 유출액을 모두 회수하는 제2a단계를 통해 수득된 고형분을 함유하는 산국화 추출물을, 3mg/체중kg ~ 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)로 함유하는 경구 투여용 항불안 약학 조성물.
  2. 추출온도 30℃ 내지 80℃에서의 산국화 수추출물에 에틸아세테이트(EtOAc)를 첨가하여 용매분획을 수행하는 제1b단계; 및 상기 용매분획 중 수층을 회수하는 제2b단계를 통해 수득된 고형분을 함유하는 산국화 추출물을, 3mg/체중kg ~ 15 mg/체중kg(추출물 중 고형분 기준)로 함유하는 경구 투여용 항불안 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 제2b단계에서 회수한 수층을 에틸아세테이트 용매로 분획하여 수층을 회수하는 단계를 1회 이상 더 수행하여 수득된 고형분을 함유하는 것이 특징인 항불안 약학 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 산국화 수추출물의 추출시간은 2시간 내지 10시간인 것이 특징인 항불안 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 산국화 수추출물은 산국화의 중량 대비 5 내지 25배의 물을 사용하여 준비된 것이 특징인 항불안 약학 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 산국화 수추출물과 에틸아세테이트(EtOAc)의 부피비는 1:2 ~ 1:4인 것이 특징인 항불안 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2a단계 또는 제2b단계 이후 감압하에 농축하는 단계를 추가로 수행하여 수득된 고형분을 함유하는 것이 특징인 항불안 약학 조성물.
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