KR101682821B1 - 프로리포솜 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 물에 당류 지지체를 용해시켜 제 1 용액을 제조하는 단계; 유기용매에 생리활성성분, 안정화제 및 지질을 용해시켜 제 2 용액을 제조하는 단계; 상기 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합하여 균일하게 하는 단계; 상기 혼합용액을 응축교반하는 단계; 및 상기 응축교반된 혼합용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 프로리포솜 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프로리포솜 제조방법은 응축교반을 이용하여 기존의 프로리포솜보다 부형제의 양을 획기적으로 감소시켜 생리활성성분의 함유량이 증가된 약제학적 조성물의 제조가 가능하며, 생리활성성분으로 난용성 약물을 봉입하여 장관내 용출 및 흡수를 증진시킴으로써 생체이용률을 향상시킬 수 있는 프로리포솜을 제조할 수 있다.

Description

프로리포솜 제조방법{Preparing method of proliposomes}

본 발명은 응축교반 후 동결건조 방법을 이용하여 생리활성성분 및 지질의 함량이 증가된 프로리포솜 제조방법에 관한 것이다.

리포솜은 인지질로 구성된 이중막 구조를 지니는 소포체로써, 친수성 및 소수성 물질을 모두 운반할 수 있는 장점을 지니며, 세포막의 이중층 지질막과 유사한 구조를 지니고 있어 세포 내 물질 전달에 사용되고 있다. 또한 리포솜은 봉입된 물질의 안전성 및 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 흡수를 증가시키는 특징을 지니고 있어 약물전달체, 화장품제제 그리고 식품 첨가물에서도 널리 적용되고 있다.

그러나 리포솜이 수용액 상에 존재할 때 응집현상 및 융합현상에 의한 인지질의 가수분해와 반감기 감소 등의 영향으로 안정성이 떨어진다. 이를 극복하기 위한 대처 방안으로 동결건조를 통하여 리포솜 수용액 상의 물을 제거할 수 있지만 비용이 매우 증가하여 상업적으로 대량생산하여 사용하기에는 문제가 있다.

이러한 리포솜의 수용액상에서 지닐 수 있는 단점을 극복하기 위한 대안으로 프로리포솜이 연구되었다(Proliposomes: a novel solution to an old problem, Journal of Pharmaceutical Sciences 1986, 75, 325-239). 프로리포솜은 당류에 인지질 용액을 코딩하는 방법으로 회전증발 응축기, 분무건조기 또는 유동층 코팅기를 이용하여 제조된다. 이러한 프로리포솜은 사용 전에 즉시 수화하여 사용하기 때문에 수용액 리포솜에서 발생하는 응집이나 융합과 같은 단점을 극복할 수 있다. 또한, 스케일 업이 쉬워 상업적으로도 접근이 용이한 장점을 지닌다.

그러나 기존의 프로리포솜은 당류에 코팅할 수 있는 인지질의 양이 매우 제한적(5% 미만)이므로, 인지질과 함께 당류에 코팅된 생리활성성분의 양도 매우 적다. 따라서, 프로리포솜 제형은 인지질 양의 10배 이상의 부형제를 함께 투여해야 하는 단점이 있으며, 이를 해결하기 위한 기술의 개발이 필요한 실정이다.

한국공개특허 제2015-0032939호

본 발명은 기존의 생리활성성분에 비해 90% 이상의 당류를 포함하는 프로리포솜의 문제점을 해결하기 위해, 당류에 인지질을 코팅하는 기존의 방식이 아닌 당류와 지질을 응집시키는 방법을 개발하여 프로리포솜 내에 봉입되는 생리활성성분의 함유량을 증가시키고 지질함량을 증가시켜 생리활성성분의 안정성을 유지시킬 수 있는 프로리포솜의 제조방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 물에 당류 지지체를 용해시켜 제 1 용액을 제조하는 단계; 유기용매에 생리활성성분, 안정화제 및 지질을 용해시켜 제 2 용액을 제조하는 단계; 상기 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합하여 균일하게 하는 단계; 상기 혼합용액을 응축교반하는 단계; 및 상기 응축교반된 혼합용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 프로리포솜 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 프로리포솜 제조방법은 기존의 프로리포솜보다 부형제의 양을 획기적으로 감소시키고 지질 및 생리활성성분의 함유량이 증가된 약제학적 조성물의 제조가 가능하며, 상기 제조방법에 따라 제조된 프로리포솜은 증가된 지질함량을 통하여 난용성 약물과 같은 생리활성성분의 봉입양을 증가시킬 수 있으며, 봉입된 난용성 약물의 장관내 용출 및 흡수를 증진시켜 생체이용률을 향상시키는 것이 확인됨에 따라, 상기 프로리포솜 및 이의 제조방법은 치료 또는 예방용 약제, 화장품 또는 식품첨가제의 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 동결건조를 이용한 프로리포솜의 제조방법을 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 프로리포솜의 동결건조 후 및 분쇄 후의 성상을 확인한 결과이다.
도 3은 프로리포솜 구성물 및 제조된 프로리포솜의 입자 표면을 확인한 주사전자 현미경 분석 결과이다.
도 4는 수화된 프로리포솜의 형태를 확인한 투과전자 현미경 분석 결과이다.
도 5는 발사르탄 프로리포솜의 용출 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 발사르탄 프로리포솜이 경구투여된 랫트에서 8시간 동안 생체 내 약물동력학을 확인한 그래프이다.
도 7은 셀레콕시브 프로리포솜이 경구투여된 랫트에서 7시간 동안 생체 내 약물동력학을 확인한 그래프이다.

본 발명은 물에 당류 지지체를 용해시켜 제 1 용액을 제조하는 단계; 유기용매에 생리활성성분, 안정화제 및 지질을 용해시켜 제 2 용액을 제조하는 단계; 상기 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합하여 균일하게 하는 단계; 상기 혼합용액을 응축교반하는 단계; 및 상기 응축교반된 혼합용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 프로리포솜 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 제 1 용액은 물 100 중량부에 당류 지지체 1 내지 120 중량부를 용해시켜 제조할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 제 1 용액은 물 100 중량부에 안정화제 0.1 내지 6 중량부를 더 포함할 수 있다.

상기 제 2 용액은 유기용매 100 중량부에 생리활성성분 0.1 내지 4 중량부, 안정화제 0.1 내지 3 중량부 및 지질 0.1 내지 15 중량부를 용해시켜 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올 및 이들의 혼합용매일 수 있으며, 보다 바람직하게는 에탄올일 수 있다.

상기 혼합용액은 혼합용액 총 100 중량부에 대하여, 물을 10 내지 90 중량부로 함유될 수 있다.

상기 혼합용액의 용매는 바람직하게 물과 수-혼화성 유기용매의 조합으로 이루어지며, 상기 혼합용액 중 물의 함유량이 상기 범위를 벗어날 경우, 당류 지지체가 충분히 녹지않아 균일한 프로리포솜 응집체를 형성되지 않는 문제점이 야기될 수 있다.

상기 응축교반은 응축기에서 15 내지 50 ℃로 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 회전증발 응축기에서 40 ℃로 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 응축교반 시 온도 범위보다 높은 온도에서 응축교반될 경우 응축교반 과정에서 에탄올뿐만 아니라 물도 함께 증발되어 종말점(end point)이 명확하지 않아 최종 수득물이 불균일해지는 문제점이 야기될 수 있다.

상기 동결건조는 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하 기압에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 당류 지지체는 소르비톨, 만니톨, 글루코오스, 슈크로스, 락토스 및 푸코스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있으며, 상기 생리활성성분은 약물, 화장품 또는 식품첨가제를 구성하는 유효성분으로써, 친수성 성분 또는 소수성 성분 중 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

상기 생리활성성분 중 약물은 Biopharmaceutical classification system(BCS)의 Class Ⅱ 및 Ⅳ 에 속하는 난용성 약물로, 1회 약용량이 적은 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 발사르탄, 올메사르탄, 텔미사르탄, 셀레콕시브, 이트라코나졸, 인도메타신, 피록시캄, 디클로페낙, 카르바마제핀, 클로파지민, 디아제팜, 네비라핀, 니페디핀, 니카르디핀, 히드로코르티손, 소라페닙, 보센탄, 몬테루카스트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 안정화제는 폴록사머, 폴리올 유도체, 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 에테르로 이루어진 비이온성 계면활성제 또는 콜산, 타우로콜산, 디옥시콜산, 데히드로콜산 및 그 염으로 이루어진 담즙산 계열 계면활성제 또는 비타민 E TPGS(d-alpha tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate)에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 이때, 상기 안정화제가 상기 함량 범위를 벗어나 포함되면 수화 후 리포솜 형성시 문제가 야기될 수 있다.

상기 지질은 포스파티티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린, 디라우릴 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 난황 레시틴 및 대두 레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프로리포솜 제조방법에 따라 제조된 프로리포솜을 제공할 수 있으며, 상기 제조된 프로리포솜은 생리활성성분 0.1 내지 6 중량 %, 지질 1 내지 24 중량%, 안정화제 0.1 내지 6 중량% 및 잔량의 당류를 포함할 수 있다.

보다 바람직하게는 상기 지질은 전체 조성물 중 10 내지 20 중량 %로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이때, 지질이 상기 함량 범위를 벗어나 포함되면 지질에 의한 점성이 남아서 분쇄가 불가능하며 유동성이 떨어지고 칭량이 어려우므로 제제화하기 힘들다.

또한, 당류가 상기 함량 범위를 벗어나 사용되면 생리활성성분의 함량이 줄어들어 효능이 감소되는 문제가 야기될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 비교예 1> 응축교반 60℃ 조건에서 심바스타틴 - 폴록사머 188 프로리포솜 제조

소르비톨 3.16 g 을 정제수 3.75 mL 에 녹이고(제 1용액), 심바스타틴 0.16 g, 폴록사머 188 40 mg 및 대두 포스파티딜콜린 0.8 g 을 무수에탄올 8.75 mL 에 녹였다(제 2용액). 둥근 플라스크에 제 1용액과 제 2용액을 혼합한 후 교반(mixing)하여 균일화하였다. 상기 균일화된 용액을 60℃ 회전증발 응축기에서 응축교반하여 유기용매를 제거하고 남은 용액을 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하의 조건으로 동결건조하여 프로리포솜을 수득하였다. 수득한 프로리포솜을 둥근 플라스크에서 꺼내 유발 및 유봉으로 분쇄하여 폴리프로필렌 튜브에 담아 사용 전까지 - 4℃ 이하에서 보관하였다.

< 비교예 2> 고지질(지질 25%) 발사르탄 프로리포솜 제조

소르비톨 3.16 g 을 정제수 3.75 mL 에 녹이고(제 1 용액), 발사르탄 0.16 g, 폴록사머 188 40 mg 및 대두 포스파티딜콜린 1.0 g 을 무수에탄올 8.75 mL 에 녹였다(제 2용액). 둥근 플라스크에 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합한 후 교반(mixing)하여 균일화하였다. 균일화된 용액을 40℃ 회전증발 응축기에서 응축교반하여 유기용매를 제거하고 남은 용액을 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하의 조건으로 동결건조하여 프로리포솜을 수득하였다.

수득한 프로리포솜을 둥근 플라스크에서 꺼내 폴리프로필렌 튜브에 담아 사용 전까지 - 4℃ 이하에서 보관하였다.

< 비교예 3> 무응축교반 발사르탄 - 폴록사머 188 프로리포솜 제조

소르비톨 3.16 g 을 정제수 3.75 mL 에 녹이고(제 1 용액), 발사르탄 0.16 g, 폴록사머 188 40 mg 및 대두 포스파티딜콜린 1.0 g 을 무수에탄올 8.75 mL 에 녹였다(제 2용액). 둥근 플라스크에 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합한 후 교반(mixing)하여 균일화하였다. 균일화된 용액을 바로 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하의 조건으로 동결건조하여 프로리포솜을 수득하였다.

수득한 프로리포솜을 둥근 플라스크에서 꺼내 폴리프로필렌 튜브에 담아 사용 전까지 - 4℃ 이하에서 보관하였다. 프로리포솜은 사용하기 전에 수화시켜 리포솜을 형성한 후 바로 사용하였다.

< 실시예 1> 응축교반 40℃ 조건에서 발사르탄 - 폴록사머 188 프로리포솜 제조

소르비톨 3.16 g을 정제수 3.75 mL 에 녹이고(제 1 용액), 발사르탄 0.16 g, 폴록사머 188 40 mg 및 대두 포스파티딜콜린 0.8 g 을 무수에탄올 8.75 mL 에 녹였다(제 2 용액). 둥근 플라스크에 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합한 후 교반(mixing)하여 균일화하였다. 균일화된 용액을 40℃ 회전증발 응축기에서 응축교반하여 유기용매를 제거하고 남은 용액을 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하의 조건으로 동결건조하여 프로리포솜을 수득하였다. 수득한 프로리포솜을 둥근 플라스크에서 꺼내 유발 및 유봉으로 분쇄하여 폴리프로필렌 튜브에 담아 사용 전까지 - 4℃ 이하에서 보관하였다. 프로리포솜은 사용하기 전에 수화시켜 리포솜을 형성한 후 바로 사용하였다.

< 실시예 2> 발사르탄 - 콜린산 프로리포솜 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 폴록사머 188 대신 콜린산(Cholic Acid)을 동량 첨가하여 제조, 보관 및 사용하였다.

< 실시예 3> 발사르탄 - 타우로콜린산 나트륨염 프로리포솜 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 폴록사머 188 대신 타우로콜린산 나트륨염(Sodium Taurocholate)을 동량 첨가하여 제조, 보관 및 사용하였다.

< 실시예 4> 심바스타틴 - 폴록사머 188 프로리포솜 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발사르탄 대신 심바스타틴을 동량 첨가하여 제조, 보관 및 사용하였다.

< 실시예 5> 셀레콕시브 - 폴록사머 188 프로리포솜 제조

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발사르탄 160 mg 대신 셀레콕시브 100 mg을 첨가하여 제조, 보관 및 사용하였다.

< 실시예 6> 셀레콕시브 - 폴록사머 188- TPGS 프로리포솜 제조

소르비톨 3.16 g 및 비타민 E TPGS 0.2g을 정제수 3.75 mL 에 녹이고(제 1 용액), 셀레콕시브 0.1 g, 폴록사머 188 40 mg 및 대두 포스파티딜콜린 0.8 g 을 무수에탄올 8.75 mL 에 녹였다(제 2 용액). 둥근 플라스크에 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합한 후 교반(mixing)하여 균일화하였다. 균일화된 용액을 40℃ 회전증발 응축기에서 응축교반하여 유기용매를 제거하고 남은 용액을 -90 ℃ 이하 및 300 mTorr 이하의 조건으로 동결건조하여 프로리포솜을 수득하였다. 수득한 프로리포솜을 둥근 플라스크에서 꺼내 유발 및 유봉으로 분쇄하여 폴리프로필렌 튜브에 담아 사용 전까지 - 4℃ 이하에서 보관하였다. 프로리포솜은 사용하기 전에 수화시켜 리포솜을 형성한 후 바로 사용하였다.

< 실험예 1> 프로리포솜 성상 확인

상기 방법으로 제조된 비교예 1 내지 3 및 실시예 1의 프로리포솜의 성상과 분쇄 후 유동성을 확인하였다.

먼저, 비교예 1과 실시예 1의 동결건조 후 및, 분쇄 후의 성상과 비교예 2 및 비교예 3의 동결건조 후 성상을 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 비교예 1 및 실시예 1은 동결건조 후 제조된 리포솜에 끈적임이 없고, 유발 및 유봉으로 분쇄하는데 어려움이 없었다.

반면, 비교예 3과 같이 제조 중 응축교반 과정을 거치지 않고 제조된 프로리포솜은 당류 지지체와 지질의 상분리가 나타났다.

상기 결과는 동결건조 과정 중 정제수와 에탄올의 증발온도 차이에 의해 한 종류의 용매가 먼저 증발하면서 상분리가 일어난 것으로 판단되며, 이렇게 제조된 프로리포솜의 경우, 프로리포솜 내에 생리활성 성분을 균일하게 봉입할 수 없으므로, 프로리포솜 제조에 있어서 균일한 프로리포솜을 제조할 수 있는 방법이 중요하다. 따라서, 실시예 1의 제조방법과 같이 동결건조 전 혼합용액의 유기용매를 최대한 제거할 수 있는 응축교반 단계가 매우 중요한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 비교예 2와 같이 지질이 상기 중량% 범위보다 과 첨가되어 제조될 경우, 제조된 프로리포솜에 지질에 의한 끈적임이 남아 분쇄가 불가능하며 유동성이 없고 칭량이 어려워 적절히 제제화하기 어려웠다.

상기 결과로부터 유동성 있는 프로리포솜을 제조하기 위한 지질의 함량은 25 중량% 미만이 적합한 것으로 확인되었다.

< 실험예 2> 프로리포솜 현미경 관찰

당류로 사용된 소르비톨, 생리활성성분인 발사르탄, 실시예 1에서 생리활성성분을 제거하고 제조된 블랭크 프로리포솜 및 실시예 1과 같이 제조된 프로리포솜의 입자 표면을 주사전자 현미경으로 확인하였다.

그 결과, 도 3과 같이 소르비톨의 표면에 침상의 입자가 불규칙적으로 확인되었으며, 발사르탄의 경우 결정성 입자가 확인되었다. 반면, 프로리포솜으로 제조된 후에는 상기 소르비톨 및 발사르탄의 입자 형태가 관찰되지 않았다.

상기 결과로부터 실시예 1의 제조방법으로 제조된 프로리포솜은 제조 과정에서 각 구성물들이 잘 혼합되었음이 확인되었다.

또한, 실시예 1 및 블랭크 프로리포솜을 물에 수화시킨 후 만들어진 리포솜을 투과전자현미경으로 확인하였다.

그 결과, 도 4와 같이 실시예 1의 프로리포솜 및 블랭크 프로리포솜의 모양이 구형인 것을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 프로리포솜 입자 크기 및 표면 전하 확인

비교예 1, 실시예 1 내지 실시예 6에서 제조된 프로리포솜을 물에 재분산시킨 리포솜 용액의 입자 크기 및 표면 전하를 전기영동 광산란 분광광도기(ELS-Z, Otsuka, Japan)를 이용하여 확인하였으며, 그 결과를 표 1과 같이 확인하였다.

	Zeta 전위( mV )	입자크기	다분산성
비교예 1	-	651.4 ~ 938.4 (±31.9 ~ ±165.9)	0.291 ~ 0.440 (±0.007 ~ ±0.050)
실시예 1	- 45.61 ~ - 57.42 (±0.36 ~ ±1.33)	350.1 ~ 444.9 (±5.4 ~ ±30.7)	0.291 ~ 0.335 (±0.003 ~ ±0.084)
실시예 2	- 55.88 (±1.68)	334.4 (±1.3)	0.321 (±0.023)
실시예 3	- 50.93 (±0.29)	464.1 (±42.7)	0.303 (±0.074)
실시예 4	- 54.41 ~ -59.73 (±20.6 ~ ±1.86)	570.3 ~ 634.3 (±20.6 ~ ±150.5)	0.340 ~ 0.354 (±0.022 ~ ±0.061)
실시예 5	- 61.31 (±2.65)	537.1 (±5.0)	0.336 (±0.014)
실시예 6	- 60.68 (±0.23)	286.7 (±2.4)	0.318 (±0.010)

상기 표 1을 참고하면, 비교예 1의 프로리포솜은 입자 크기가 크고 각 제조단위의 편차가 매우 크게 나타났다.

상기 결과는 회전증발 응축기에서 유기용매를 제거할 때의 온도 조건이 실시예 1 내지 실시예 6의 온도 조건 보다 높은 60 ℃ 조건에서 응축교반 하였기 때문에 유기용매의 증발과 일부 수분의 증발이 동시에 일어났으며 증발 정도가 균일하지 못한 것으로 판단됨에 따라, 프로리포솜 제조 과정 중 응축교반의 온도 조건은 입자 크기를 결정하는데 중요한 영향을 미치는 것이 확인되었다.

상기 결과로부터 응축교반의 온도 조건은 수분 증발이 일어나지 않는 15 내지 50 ℃의 온도를 유지하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다.

< 실험예 4> 프로리포솜 생체활성성분 함유량(봉입률) 확인

비교예 1과 실시예 1 내지 실시예 6에서 제조된 프로리포솜을 아세토나이트릴 및 정제수(50:50, v/v)에 녹인 용액을 HPLC 분석을 수행하여 생체활성성분 함유량을 확인하고 함유량을 표 2와 같이 프로리포솜 1g 당 포함된 생체활성성분의 mg 양으로 나타내었다.

또한, 상기 프로리포솜을 각각 재분산시킨 리포솜 용액을 0.45 μm syringe filter(minisart RC15)로 필터링한 후 필터링 전후 용액을 HPLC 분석하여 생체활성성분의 리포솜 봉입률을 확인하였다.

1. 발사르탄 HPLC 분석방법

분석법: 액체 크로마토그래피법

칼 럼: Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm)

이동상: 0.025% TFA(Trifluoroacetic acid) 아세토니트릴:0.025% TFA 인산

완충액(5 mM, pH 2.5) = 70:30

주입량: 10 μL

유 속: 1.0 mL/min

검출기: 형광 excitation 234 nm, emmision 378 nm

2. 심바스타틴 HPLC 분석방법

분석법: 액체 크로마토그래피법

칼 럼: Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm)

이동상: 아세토니트릴: 인산 완충액(5 mM, pH 5.6) = 80:20

주입량: 20 μL

유 속: 1.0 mL/min

검출기: UV 238 nm

3. 셀레콕시브 HPLC 분석방법

분석법: 액체 크로마토그래피법

칼 럼: Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm)

이동상: 0.1% Triethylamine 아세토니트릴: 0.1% Triethylamine 인산 완충액(10 mM, pH 9.0) = 70 : 30

주입량: 10 μL

유 속: 1.0 mL/min

검출기: 형광 exitation 252 nm, emission 358 nm

	함유량( mg /g)	봉입률(%)
비교예 1	37.17 ~ 41.02 (±0.80 ~ ±6.83)	26.67 ~ 73.03
실시예 1	35.29 ~ 37.75 (±0.08 ~ ±3.02)	69.11 ~ 76.83
실시예 2	37.30 (±0.82)	84.77
실시예 3	37.30 (±0.37)	83.45
실시예 4	37.85 ~ 38.84 (±0.27 ~ ±1.02)	68.33 ~ 72.77
실시예 5	23.09 (±0.80)	86.2
실시예 6	22.56 (±0.49)	83.1

상기 표 2와 같이 비교예 1의 조건으로 제조된 프로리포솜의 봉입률이 각각 제조단위 별로 균일하게 봉입되지 않은 것으로 나타났다.

상기 결과는 실험예 3에서 언급한 바와 같이 프로리포솜 제조시 회전증발 응축기에서의 유기용매 제거 시 수분의 증발이 동시에 일어났으며, 증발 정도가 균일하지 않았기 때문에 비교예 1과 같이 제조된 프로리포솜의 물성이 균일하지 않은 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 프로리포솜 제조과정 중 응축교반을 하는 온도의 설정이 입자 크기에 영향을 미치는 것이 확인되었으며, 수분 증발이 일어나지 않도록 응축교반 시 15 내지 50 ℃의 온도를 유지하는 것이 매우 중요한 것으로 확인되었다.

< 실험예 5> 생체 외( in vitro ) 약물 용출 확인

발사르탄 용량이 10 mg이 되도록 실시예 1의 분말을 경질캡슐 충진하고, 기존의 발사르탄 분말 10 mg을 충진한 경질캡슐을 대조군으로 하여 용출차이를 비교하였다.

용출된 발사르탄 양은 대한약전 일반시험법 중 용출시험법 제 2법(패들법)에 따라 2시간 동안 정해진 시간에 용출액을 취하여 0.45 μm 멤브레인 필터를 사용하여 여과한 후 상기 실험예 4에 기재된 발사르탄 HPLC 분석법에 따라 확인하였다.

용출시험장치: Electrolab TDT-08L

용출액: 1) Tween 80을 0.03 % (v/v) 첨가한 제 1액 (pH 1.2), 500 mL

2) 아세트산·아세트산나트륨완충액, pH 4.0 500 mL

3) 제 2액, pH 6.8 500mL

4) 정제수 500 mL,

용출액의 온도: 37 ± 0.5 ℃

회전속도: 용출액 2), 3), 4)은 50 ± 2 rpm, 용출액 1)은 100 ± 2 rpm

도 5와 같이 제 1액은 낮은 pH로 인하여 발사르탄의 용해도가 낮게 나타남에 따라, 계면활성제 중 하나인 폴리소르베이트 80을 0.03 %(v/v) 첨가하여 용출액의 발사르탄 용해도를 높여 용출시간 동안 용출량을 확인하였다.

그 결과 도 5와 같이 모든 용출액에서 대조군인 발사르탄 파우더보다 실시예 1의 프로리포솜이 빠른 용출 속도와 높은 용출률을 나타내었다.

상기 결과는 동결건조법으로 제조된 프로리포솜이 물속에서 약물이 봉입된 리포솜을 형성하여 약물의 용해도를 증가시킴으로써, 대조군보다 발사르탄 용출속도 및 용출률이 증가된 것이다.

상기 결과로부터 생체 내 발사르탄 프로리포솜을 물과 함께 경구투여할 경우, 물속에서 빠르게 리포솜을 형성하여 용해도를 증가시킬 수 있으며, 소화관에서 발사르탄 파우더보다 높은 비율로 발사르탄이 용출되어 흡수가 증가될 수 있음이 확인되었다.

< 실험예 6> 실시예 1의 생체 내( in vivo ) 약물동력학 확인

실시예 1 및 발사르탄 파우더에 대하여 생체 내 약물동력학을 확인하였다.

수컷 SD 랫트(Sprague-Dawley rat, 무게 235 ± 5 g, Orient Bio, Sungnam, Korea)에서 생체내 약물동력학 연구를 수행하였으며, 각 그룹별로 개체 수는 3마리 이상으로 하였다.

랫트의 혈액 채취를 위해 마취 하에서 좌측 대퇴부 동맥에 폴리에틸렌 튜브를 삽관하고 발사르탄 또는 분쇄된 실시예 1을 9호 젤라틴 마이크로 캡슐에 넣어 3 mg/kg 용량으로 경구 투여 후 즉시 l mL의 정제수를 투여하였다.

투여 후 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 240 및 480 분에 300 ㎕의 혈액 시료를 대퇴부 동맥으로부터 채혈하였다. 채혈한 혈액 시료를 4℃, 16,100 rcf에서 2.5분간 원심분리하고, 일정량의 혈장 시료를 정량분석 수행 전까지 - 20 ℃이하에서 보관하였다.

보관된 혈장 시료를 상온에서 해동한 뒤 혈장 시료 100 ㎕에 로사르탄(Losartan, internal standard) 아세토니트릴 용액(0.5 ㎍/mL)을 1 mL 첨가한 후, 30분간 와류 교반(vortex-mix)하였다. 그 후, 16,100 rcf에서 5분간 원심분리한 후, 상층액 1 mL을 채취하여 적절한 방법으로 용매를 제거한 후 아세토니트릴 및 정제수(50:50, v/v)로 재건(reconstitution)하였다. 재건된 시료를 HPLC으로 분석하였다.

분석법: 액체 크로마토그래피법

칼 럼: Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm)

이동상: 0.025% TFA(Trifluoroacetic acid) 아세토니트릴:0.025% TFA 인산 완충액(5mM, pH 2.5) = 60:40

주입량: 10 μL

유 속: 1.0 mL/min

검출기: 형광 excitation 247 nm, emmision 387nm

상기와 같은 방법으로 랫트의 경구 투여된 발사르탄 분발 및 실시예 1의 흡수 결과를 확인하고, 표 3 및 도 6으로 나타내었다.

표 3의 결과값은‘평균 ± 표준편차’의 형식으로 나타냈으며, 발사르탄의 약물동력학적 파라미터(시작점부터 480분까지의 혈장 중 발사르탄 농도-시간 곡선 하 총 면적(total area under VST concentration in the plamatime curve from time zero to infinity, AUC)는 윈넌린 프로그램(WinNonlin, Version 3.1, Pharsight, Mountain View, CA, USA)으로 산출하였으며, 통계적 유의성은 t-검정으로 확인하였다.

파라미터	발사르탄 분말(n=3)	실시예 1(n=4)
AUC0 -480m(μg*min/mL)	149.7±49.7	269.8±54.6*
AUC0 -∞(μg*min/mL)	159.9±50.0	291.3±71.6*
Cmax(μg/mL)	0.70±0.25	1.32±0.30*
Tmax(분)	45±15	58±29
상대적 생체이용률(%)	100	180
*:p<0.05

상기 표 3 및 도 6과 같이 실시예 1의 프로리포솜을 랫트에 경구투여한 결과, AUC가 발사르탄 분말보다 유의적으로 높은 값을 나타내었으며, 혈중 최고 농도 역시 유의적으로 높았다.

상기 결과로부터 발사르탄을 프로리포솜으로 제조하여 경구투여한 경우, 프로리포솜이 약물의 흡수를 증가시켜 경구 생체이용률이 높아진 것으로 확인되었다.

프로리포솜을 투여한 랫트에서 약물의 경구 생체이용률이 증가된 것은 프로리포솜이 수화되어 생성된 리포솜으로 인해 약물의 용해도가 증가된 것으로, 리포솜 내에 포함된 인지질이 생체 내에서 담즙산 및 약물과 mixed micelle을 형성하여 흡수를 촉진했을 것으로 제안된다.

< 실험예 7> 실시예 5의 생체 내( in vivo ) 약물동력학 확인

실시예 5 및 셀레콕시브 파우더에 대하여 생체 내 약물동력학을 확인하였다.

수컷 SD 랫트(Sprague-Dawley rat, 무게 248 ± 9 g, Orient Bio, Sungnam, Korea)에서 생체내 약물동력학 연구를 수행하였다.

랫트의 혈액 채취를 위해 마취 하에서 좌측 대퇴부 동맥에 폴리에틸렌 튜브를 삽관하고 셀레콕시브 또는 분쇄된 실시예 5를 9호 젤라틴 마이크로 캡슐에 넣어 셀레콕시브 분말은 1.8 mg/kg, 실시예 5는 1.9 mg/kg 용량으로 경구 투여하였다.

투여 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4 및 7시간에 300 ㎕의 혈액 시료를 대퇴부 동맥으로부터 채혈하였다. 채혈한 혈액 시료를 4℃, 16,100 rcf에서 2.5분간 원심분리하고, 일정량의 혈장 시료를 정량분석 수행 전까지 - 20 ℃이하에서 보관하였다.

보관된 혈장 시료를 상온에서 해동한 뒤 혈장 시료 100 ㎕에 아세토니트릴을 1 mL 첨가한 후, 5분간 와류 교반(vortex-mix)하였다. 그 후, 16,100 rcf에서 5분간 원심분리한 후, 상층액 900 ㎕을 채취하여 적절한 방법으로 용매를 제거한 후 이동상으로 재건(reconstitution)하였다. 재건된 시료를 HPLC으로 분석하였다.

분석법: 액체 크로마토그래피법

칼 럼: Phenomenex C18 (250 mm × 4.6 mm)

이동상: 0.1% Triethylamine 아세토니트릴: 0.1% Triethylamine 인산 완충액(10 mM, pH 9.0) = 70 : 30

주입량: 20 μL

유 속: 1.0 mL/min

검출기: UV 260 nm

상기와 같은 방법으로 랫트의 경구 투여된 셀레콕시브 분발 및 실시예 5의 흡수 결과를 확인하고, 표 4 및 도 7으로 나타내었다.

표 4의 결과값은평균 ± 표준편차의 형식으로 나타냈으며, 셀레콕시브의 약물동력학적 파라미터(시작점부터 7시간까지의 혈장 중 셀레콕시브 농도-시간 곡선 하 총 면적(total area under celecoxib concentration in the plasma time curve from time zero to 7h, AUC)는 윈넌린 프로그램(WinNonlin, Version 3.1, Pharsight, Mountain View, CA, USA)으로 산출하였다. 상대적 생체이용률은 각 군 당 투여 용량이 다른 것을 보정하여 하기식으로 확인하였다.

상대적 생체이용률(%)=

파라미터	셀레콕시브 분말	실시예 5
AUC0 -7h(μg*h/mL)	3.40±0.06	7.09±0.47
Cmax(μg/mL)	0.61±0.08	1.51±0.02
상대적 생체이용률(%)	100	199

상기 표 4 및 도 7과 같이 실시예 5의 프로리포솜을 랫에 경구투여한 결과, AUC와 혈중 최고 농도가 셀레콕시브 분말보다 높은 값을 나타내었으며, 혈중 최고 농도에 도달한 시간도 짧았다.

상기 결과로부터 셀레콕시브를 프로리포솜으로 제조하여 경구투여한 경우, 프로리포솜이 약물의 흡수속도를 빠르게 하고 흡수되는 약물의 양을 증가시켜 경구 생체이용률이 높아진 것으로 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

1. 물에 소르비톨을 용해시켜 제 1 용액을 제조하는 단계;
   무수에탄올에 셀레콕시브, 폴록사머 188 및 대두 포스파티딜콜린을 용해시켜 제 2 용액을 제조하는 단계;
   상기 제 1 용액과 제 2 용액을 혼합하여 균일하게 혼합용액을 준비하는 단계;
   상기 혼합용액을 40℃의 회전증발 응축기에서 응축교반하는 단계; 및
   상기 응축교반된 혼합용액을 동결건조하는 단계를 포함하는 프로리포솜 제조방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 제 1 용액은 물 100 중량부에 소르비톨을 1 내지 120 중량부를 용해시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 프로리포솜 제조방법.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서, 상기 제 2 용액은 무수에탄올 100 중량부에 셀레콕시브 0.1 내지 4 중량부, 폴록사머 188 0.1 내지 3 중량부 및 대두 포스파티딜콜린 0.1 내지 15 중량부를 용해시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 프로리포솜 제조방법.
5. 삭제
6. 청구항 1에 있어서, 상기 혼합용액은 혼합용액 총 100 중량부에 대하여, 물을 10 내지 90 중량부를 함유하는 것을 특징으로 하는 프로리포솜 제조방법.
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