KR101679604B1

KR101679604B1 - DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 신규 화합물 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물

Info

Publication number: KR101679604B1
Application number: KR1020150092057A
Authority: KR
Inventors: 박범준; 송규용; 오아영; 이지현; 허진혁
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 충남대학교산학협력단
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2016-11-28

Abstract

본 발명은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 신규 화합물 및 이의 의학적 용도에 관한 것으로서, 상기 화합물은 in vitro 및 in vivo 항암 효과를 검토한 결과 항암 효과가 우수하여 폐암을 포함한 다양한 암질환의 치료용 약제로서 유용할 뿐 아니라, 특히 아드리아마이신과 같은 항암제 내성이 야기된 세포주에서 아드리아마이신의 항암제 내성이 억제되어 항암 효과가 보다 증진됨으로써 항암효과 증진용 항암보조제로서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 신규 화합물 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물{New Compound Inhibiting Binding between DX2 and p14/ARF and Pharmaceutical Composition for Treating or Preventing Cancer Comprising the Same}

본 발명은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 신규 화합물, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물 및 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제 내성 항암제의 항암효과 증진용 항암보조제에 관한 것이다.

폐암은 주로 발암물질에 의해 유발되며 발생률이 전 세계적으로 증가하고 있는 추세이다. 우리나라에서 폐암에 의한 사망률은 전체 암중 1위로 가장 심각한 질병중 하나로서, 폐암은 소세포암(SCLC)과 비소세포암(NSCLC)의 두 가지로 분류되며, 비소세포암은 다시 선암, 편평상피암, 대세포암, 선편평상피암 등의 조직형으로 분류되며, 이러한 서로 다른 종류의 조직형에 따라 발생하기 쉬운 부위, 진행형식과 속도 및 증상 등의 임상상이 다양하며 치료방법 또한 다양하다.

대부분의 폐암은 화학요법과 방사선요법에 의해서는 치료될 수 없다. 소세포암은 그 크기를 축소시킴으로써 화학요법 및 방사선요법이 적용될 수 있으나 이에 의해서는 완전한 치료를 기대할 수 없고, 비소세포폐암은 소세포폐암에 비해 항암제의 효과가 적어 화학요법만으로는 치료가 거의 불가능하므로, 종양을 외과적으로 완전히 제거하는 것이 유일한 효과적인 치료법이다. 그러나 폐암 환자의 30% 이하가 진단 시 전부 절제할 수 없는 종양을 가지며, 이들 중의 3분의 1 이하만이 외과적 절제술 이후 5년간 생존할 뿐이다.

따라서 폐암의 조기진단, 암의 확산도를 더 정확하게 알아내고 더 효과적으로 치료할 수 있는 방법이 크게 요구되고 있다.

한국공개특허 제1997-0064605호

본 발명의 목적은 폐암을 포함한 암질환 치료에 유용한 신규 화합물을 개발하고자, DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 신규 화합물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 화합물을 유효성분으로 함유하는 약제 내성 항암제의 항암효과 증진용 항암보조제를 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는, 항암제의 약물 내성 억제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 항암제를 유효성분으로 함유하는, 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질 간의 상호작용을 억제하는 화합물을 선별하고, 이의 유사 화합물을 합성하여 in vitro 및 in vivo 항암 효과를 검토한 결과, 항암 효과가 우수하며, 특히 아드리아마이신과 같은 항암제 내성이 야기된 세포주에서 DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질 간의 상호작용을 억제하는 화합물을 처리하여 아드리아마이신의 항암제 내성이 억제되어 항암 효과가 보다 증진되는 것을 확인하였는 바, 본 발명에서 개시된 DX2 단백질 및 p14/ARF 단백질 간의 상호작용을 억제하는 화합물은 폐암과 같은 암질환의 항암제 또는 항암보조제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제를 스크리닝 하기 위한 ELISA계 스크리닝 방법을 개시한 것이다.
도 2는 SLCB050에 의해 DX2-p14/ARF 결합 억제 효과를 검토한 것으로서, 도 2A는 GST 풀-다운 실험, 도 2B는 면역 침전 분석, 도 2C는 His-DX2 단백질을 이용한 단백질 결합 분석을 수행한 것이다(IP : 단백질과 결합하여 침전시킨 그룹, Sup : 침전물의 상층액을 분리한 단백질과 결합하지 않는 그룹, Input : 세포파쇄물).
도 3 중 도 3A 내지 도 3C는 GST 풀-다운 실험을 통해 SLCB050이 DX2-특이적 영역과 상호작용 하는 것을 확인한 것이고, 도 3D 및 도 3E는 HJH141204, HJH141206 및 SLCB36의 DX2-p14/ARF 결합에 대한 억제 효과를 GST 풀-다운 실험으로 확인한 것이다(PPT: 단백질과 결합하여 침전시킨 그룹, Sup : 침전물의 상층액을 분리한 단백질과 결합하지 않는 그룹).
도 4 중 도 4A는 SLCB050 처리 후 DX2 및 p14/ARF의 해리에 관한 것이고, 도 4B는 SLCB050 처리 후 DX2 및 p14/ARF의 국재화 변화를 나타낸 것이고, 도 4C는 NSCLC 세포주인 H1299와 SCLC 세포주인 H69에서 SLCB050의 처리에 따른 영향을 나타낸 것이고, 도 4D는 p14/ARF-결핍 H322 세포에서 SLCB050의 처리에 따른 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 다양한 인간 폐암 세포주에 SLCB050를 처리한 후 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 6은 SCLC 세포주인 H128 세포에서 SLCB050의 처리에 따른 소프트 아가 콜로니 형성 분석 결과에 관한 것이다.
도 7은 SCLC 세포주인 H128 세포에 SLCB050, HJH141204, HJH141206 및 SLCB36를 처리한 후 세포생존율을 나타낸 것이다.
도 8은 SLCB050 처리에 의한 항암제의 약제 내성 감소 효과를 나타낸다.
도 9는 H446을 이용한 종양 이식 모델에서 아드리아마이신의 약제 내성에 대한 억제 효과를 나타낸 것이다(Adr: 0.2 ㎍/ml, SLCB050: 10 mg/kg).
도 10은 SLCB050의 In vivo 항암 효과를 검토한 것이다.
도 11은 SLCB050 처리된 DK 마우스로부터 유래된 폐암 조직의 H-E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 SLCB050의 In vivo 항암 효과를 검토한 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 DX2-p14/ARF 결합을 억제하는 화합물인 SLCB050의 폐암 치료효과에 대한 반응기전을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자의 한국공개특허 제2014-0113543호에서는 DX2가 발암 유도성 p14/ARF 유도를 억제하므로, DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제가 항암제로서 이용될 수 있음을 밝혔는 바, 본 발명에서는 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제를 발견하여 항암효과를 확인하여 본 발명을 완성한 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

이때, 화학식 1로 표시되는 화합물은 HJH141204로 명명하고, 화학식 2로 표시되는 화합물은 HJH141206로 명명하며, 상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제할 수 있다.

그리고, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 SLCB050로 명명한다.

[화학식 3]

보다 상세하게는 도면을 참조하면, 본 발명에 따른 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제인 화합물을 도 1에 따른 ELISA계 스크리닝 방법을 통해 스크리닝 하였으며, 상기 스크리닝 반응계는 p14/ARF의 농도가 증가함에 따라 ELISA 값이 증가하는 반면, SLCB050와 같은 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제를 처리한 경우 유의성있게 ELISA 반응이 감소하므로, 상기 ELISA계 스크리닝 방법을 통해 1차적으로 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제인 화합물을 선별하였다.

도 2A는 SLCB050에 의해 DX2-p14/ARF 결합을 완전하게 차단하는 것을 GST 풀-다운 실험으로 확인하였고, 도 2B는 SLCB050이 세포에서 p14/ARF 및 DX2의 상호작용을 방해하는 것을 면역 침전 실험으로 확인하였으며, 이때 면역 침전 분석 전에 2개의 단백질의 감소를 방지하기 위하여 공감염된 293 세포를 MG132와 반응시켰으며, SLCB050(10 μM, 6시간) 처리 후 Myc 항체(DX2)를 이용하여 면역 침전 분석을 수행하였다. 도 2C는 DX2 및 AIMP2 간의 결합에 대한 SLCB050의 억제 효과로서, His-DX2 단백질을 이용한 단백질 결합 분석에서 DX2 및 AIMP2 간의 결합은 SLCB050 처리에 의해 감소하였다. 그리고, 도 3A에서도 SLCB050이 DX2-p14/ARF의 결합을 선택적으로 억제하며, 도 3B와 같이 p53-AIMP2 또는 DX2 결합을 차단하지 못하며, 도 3C와 같이 p14/ARF를 차단하지도 못하였기 때문에, SLCB050는 DX2-특이적 영역과 상호작용 하는 것으로 확인되었다.

그리고, SLCB050과 유사한 화합물로서 HJH141204, HJH141206 및 SLCB36을 각각 합성하였으며, DX2-p14/ARF 결합에 대한 억제 효과를 GST 풀-다운 실험으로 확인한 결과, 도 3D 및 도 3E와 같이 SLCB050, HJH141204 및 HJH141206은 DX2-p14/ARF 결합에 대한 억제 효과를 나타내며, p53-p14/ARF의 상호작용에 대해서는 영향을 미치지 않는 반면, SLCB36는 2가지 결합에 대한 억제 효과를 나타내지 못하였기 때문에, 화합물 중 리보오스 고리 구조를 갖는 것이 결합 억제에 필수적임을 확인하였다.

도 4A는 면역 침전 분석을 통해 DX2 및 p14/ARF의 해리를 검출한 것으로서, 293 세포를 정해진 벡터로 24시간 동안 형질감염 시킨 후, MG132 및 SLCB050으로 6시간 동안 반응시켰으며, 도 4B는 SLCB050 처리 후 DX2 및 p14/ARF의 국재화 변화를 나타낸 것으로서, SLCB050(10 μM, 6시간) 처리에 의해 DX2 및 p14/ARF 상호작용이 차단되어 핵질에서 DX2는 감소하였고, p14/ARF는 증가하였다. 그리고, 도 4C는 NSCLC 세포주인 H1299와 SCLC 세포주인 H69에서 SLCB050의 처리에 따른 영향을 나타낸 것으로서, NSCLC 세포주인 H1299와 SCLC 세포주인 H69에서 SLCB050의 처리에 의해 DX2는 감소하고, p14/ARF가 증가함을 나타내었다. 또한, 도 4D는 p14/ARF-결핍 H322 세포에서 SLCB050의 처리에 따른 영향을 나타낸 것으로서, DX2는 SLCB050 처리에 반응하여 p14/ARF-결핍 H322 세포에서 주목할 만큼 감소하였다.

도 5는 다양한 인간 폐암 세포주에 SLCB050를 24시간 처리한 후 MTT를 통한 세포생존율을 나타낸 것으로서, SCLC 세포는 매우 민감하게 SLCB050에 반응하였다.

도 6은 소프트 아가 콜로니 형성 분석 결과로서, SCLC 세포주인 H128 세포를 소프트 아가 플레이트에 분주하고 SLCB050를 48시간 동안 반응시킨 후, 세포를 트립판 블루 염색으로 검토한 결과이며, SLCB050은 농도의존적으로 콜로니 수를 감소시켰다.

도 7은 SCLC 세포주인 H128 세포에 SLCB050, HJH141204, HJH141206 및 SLCB36를 처리한 후 MTT를 통한 세포생존율을 나타낸 것으로서, SLCB050와 HJH141204, HJH141206은 농도의존적으로 H128 세포생존율을 감소시킨 반면, SLCB36는 세포생존율에 그다지 영향을 미치지 않았다.

도 8은 SLCB050의 DX2 발현 세포에 대한 항암제의 약제 내성에 대한 억제 효과를 나타낸 것으로서, 도 8A는 DX2 및 DK MEF에서 p53 활성화제인 GN25[5 μM, 3-(5,8-디메톡시-1,4-디옥소나프탈렌-2-일티오)프로판오익 엑시드]와 SLCB050(10 또는 20 μM)를 6시간 동안 함께 처리한 경우 약제 내성 감소 효과를 MTT 분석으로 검토한 것이며, DX2 및 DK 세포에 대한 GN25의 내성은 SLCB050 처리에 의해 없어져 GN25의 항암효과가 회복되었다. 도 8B는 DX2 및 DK 마우스로부터 유래된 프라이머리 종양세포에서 아드리아마이신(0.2 μg/ml)과 SLCB050(10 μM)를 24시간 동안 함께 처리한 경우 약제 내성 감소 효과를 MTT 분석으로 검토한 것이며, 역시 아드리아마이신의 저항성이 없어지고, 항암 효과가 회복되었다. 도 8C는 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 대한 SCLC 세포주의 민감도에 관한 것으로서, SCLC 세포주인 H69에서도 SLCB050에 일부 반응하여 아드리아마이신의 민감도가 개선된 반면, p14/ARF-결핍 H322 세포에서는 SLCB050의 병용 처리에 의해 민감도가 개선되지 않았다.

도 9는 H446을 이용한 종양 이식 모델에서 아드리아마이신의 약제 내성에 대한 억제 효과를 나타낸 것으로서, 도 9A는 H446을 이용한 종양 이식 모델에서 아드리아마이신의 내성이 나타나며, SLCB050 처리에 의해 그 내성이 감소되었고, 도 9B에서 5 mg/kg의 아드리아마이신 처리에 의해 4주 이내 종양 성장이 억제되었으나, 높은 독성으로 실험이 중단된 반면, 10 mg/kg의 SLCB050와 함께 2.5 mg/kg 저용량의 아드리아마이신을 처리한 경우 심각한 독성 없이 종양 성장을 명확하게 억제하였다. 도 9C는 프라이머리 종양 세포에서 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 의해 p53을 상승적으로 유도하는 것을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.

도 10은 SLCB050의 In vivo 항암 효과를 검토한 것으로서, 도 10A는 In vivo 항암 효과를 검토하기 위한 DK 마우스를 이용한 실험 스케쥴을 나타낸 것이며, 도 10B는 SLCB050 처리된 DK 마우스로부터 유래된 폐암 조직의 H-E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과로서, 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 의해 종양 억제가 유도되었다. 도 10C는 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 의해 종양 체적이 감소되었다.

도 11은 SLCB050 처리된 DK 마우스로부터 유래된 폐암 조직의 H-E(Hematoxylin-eosin) 염색 결과로서, SCLC 영역은 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 의해 보다 명확하게 없어졌다.

도 12는 SLCB050의 In vivo 항암 효과를 검토한 것으로서, 도 12A는 SLCB050의 처리에 의한 DX2 감소를 나타낸 웨스턴 블롯 결과이고, 도 12B 및 도 12C는 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리된 DK 마우스 폐 조직의 TUNEL 염색 결과로서, SLCB050의 처리에 의해 아팝토시스성 종양 세포가 명확하게 증가하였다.

이러한 결과는 도 13과 같이 AIMP2의 비정상적인 스플라이싱에 의해 생성된 DX2가 p14/ARF의 직접적 상호작용과 억제를 통해 종양 특히 소세포성 폐암의 진행을 촉진함을 의미하며, 이러한 소세포성 폐암은 DX2-p14/ARF 결합을 억제하는 화합물에 의해 치료될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 함유하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제할 수 있다.

상기 암질환은 폐암, 대장암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종 및 혈액암로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 폐암은 비소세포성 폐암 또는 소세포성 폐암일 수 있으며, 바람직하게는 소세포성 폐암일 수 있다.

상기 항암제는 아드리아마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 사이클로포스파마이드, 도세탁셀, 파크리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 미토산트론, 커큐민, 제피티닙, 에를로티닙, 이리노테칸, 토포데칸, 빈플라스틴, 빈크리스틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 트라스트주맙, 비노렐빈, 플루오로우라실 및 3-(5,8-디메톡시-1,4-디옥소나프탈렌-2-일티오)프로판오익 엑시드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하여 항암제의 약물 내성을 억제하고 항암제의 항암효과를 증진시킬 수 있다.

또한, 상기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 항암제를 유효성분으로 함유하는, 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

상기 약학조성물은 DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제로 스크리닝된 물질인 SLCB050, HJH141204 및 HJH141206 외에도 이의 약제학적으로 허용되는 담체의 유효량을 포함한다. 본 명세서에서 용어 "유효량"은 암의 치료 효능을 발휘하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 적합한 1일 투여량은, 0.0001-100 mg/kg(체중)이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> DX2-p14/ARF의 결합 억제제의 스크리닝

본 발명자의 한국공개특허 제2014-0113543호를 참조하여, DX2가 발암 유도성 p14/ARF 유도를 억제하므로, DX2 및 p14/ARF 결합에 대한 특이적 억제제가 항암제로서 이용될 수 있다는 점에 착안하여 다음과 같이 항암제를 스크리닝 하였다.

1. 화합물 라이브러리 준비

개인적으로 합성한 화합물과 천연 화합물 라이브러리는 종래 문헌(J. Clin. Oncol. 16, 1207-1217, 1998; Nat. Rev. Cancer 2, 489-501, 2002)과 같이 준비하였고, 한국화합물은행을 통해 총 8000개의 화합물을 제공받아 실험에 이용하였다.

2. ELISA 분석

DX2-p14/ARF의 결합 억제제를 스크리닝하기 위하여, 도 1과 같은 변형된 ELISA 반응계를 이용하였다. 즉, 0.5% 파라포름알데히드(PFA)를 포함한 96 웰 플레이트 상에 His-DX2 재조합 단백질을 고정시켰다. 건조 및 세정 후, GST-p14/ARF 단백질과 임의의 화합물(최종 농도: 0.1 mM)을 반응시켰다. 1시간 후, TBS-T로 플레이트를 세정하고 항-GST 항체(1:10,000, 30분)와 항-마우스-IgG-HRP (1:50,000, 1시간)으로 반응시켰다. 2회 세정 후, 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액(Calbiochem)과 정지 용액(1N H₂SO₄)으로 반응시켰다. 그 후, ELISA 리더를 이용하여 450 nm에서 측정하여 DX2-p14/ARF의 결합 억제제 후보 약물을 선별하였다. 이때, 보다 상세한 실험방법은 종래 알려진 문헌(Nat. Rev. Cancer 2, 489-501, 2002)을 참조하였으며, PAK1-Smad4 결합 억제제를 이용하여 공통적인 억제제로 확인된 약물은 배제하였다.

3. 재조합 단백질, 면역 침전 및 GST 풀-다운 분석

GST 풀-다운 분석을 통해 앞서 선별된 DX2-p14/ARF의 결합 억제제 후보 약물 중 보다 특이적인 결합 억제제를 선별하였다. 즉, p14/ARF 단편(Full-length)을 pGEX-4T1에 TEV 프로테아제 절단 부위를 더해서 제조한 pGEX-TEV 벡터의 EcoRI과 Hind II 부위에 라이게이션 시켰다. 상기 재조합 단백질을 E. coli 균주 BL21(DE3)에서 GST 융합 단백질 형태로 발현시켰다. 상기 단백질을 글루타치온 친화성 크로마토그래피로 정제하였다.

두 단백질 간의 직접적인 결합을 확인하기 위해서, RIPA 버퍼(Radioimmunoprecipitation assay; 150mM NaCl, 25mM Tris-Cl, 1% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 프로테아제 저해제 혼합물)에서 4℃에서 1시간 동안 아가로즈-비드 접합 GST(음성 대조군) 또는 GST-타겟 단백질을 세포 파쇄물 또는 재조합 단백질과 반응시켰다.

면역침전(Immunoprecipitation, IP) 분석은 RIPA 버퍼에서 세포 파쇄물 또는 재조합 단백질로 수행하였다. 모든 세포 파쇄물은 4℃에서 2시간 동안 적합한 항체와 반응시킨 후, A/G-아가로즈 비즈-접합 2차 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 2시간 동안 혼합하였다. 이러한 반응 후, 혼합물을 RIPA 버퍼로 2번 세척한 후, 침전된 단백질은 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.

4. 웨스턴 블랏 분석

웨스턴 블랏 분석을 위하여, 단백질을 RIPA 버퍼에서 불활성화(95℃, 7분 열처리) 한 후, 단백질을 SDS-PAGE에 적용하고, 알려진 방법(J. Clin. Oncol. 16, 1207-1217, 1998; Nat. Rev. Cancer 2, 489-501, 2002)에 따라 웨스턴 블랏을 실시하였다. 이때, 사용한 항체들은 HA (sc-7392), His (sc-8036), GFP (sc-9996), GST (sc-138), Actin (se-1616) 및 p19/ARF (sc-32748)는 Santa Cruz Biochnology에서 구매하였고, 항-p14/ARF (MAB3782)는 Millipore에서 구매하였으며, FLAG-M2 및 항-C-Myc (M5546)는 Sigma Aldrich에서 구매하였으며, 항-AIMP2는 김성훈 교수(Seoul Nat. Univ.)로부터 제공받았다.

5. DX2-p14/ARF의 결합 억제제 선별

도 2A, 도 2B 및 도 3A와 같이, DX2-p14/ARF의 결합을 선택적으로 억제하는 화합물로서, SLCB050를 얻었으며, 특히 SLCB050는 도 2C와 같이 DX2 및 AIMP2 간의 상호작용을 차단할 뿐, 도 3B와 같이 p53-AIMP2 또는 DX2 결합을 차단하지 못하며, 도 3C와 같이 p14/ARF를 차단하지도 못하였기 때문에, SLCB050는 DX2-특이적 영역과 상호작용 하는 것으로 확인되었다.

[반응식 1]

[단계 1]

N₂ 가스 하에서 100 mL 라운드 플라스크에 트랜스-3-(2-퓨라닐)아크릴산 (560 mg, 4.06 mmol, 1eq), N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 염산염 (EDC, 1.17 g, 6.09 mmol, 1.5eq) 그리고 4-(디메틸아미노)피리딘 (4-DMAP, 198 mg, 1.62 mmol, 0.4 eq)를 넣은 후, 이를 무수 디클로로메탄 (100 ml)으로 용해하였다. 상기 혼합용액에 (S)-(+)-데쿠르시놀 (1 g, 4.06 mmol, 1 eq, 한국등록특허 제0715206호에 따라 제조됨)을 넣고, 실온에서 5 시간 동안 교반한 후, 감압농축 하였다. 여액은 실리카겔 컬럼 분리 (에틸아세테이트 : n-헥산 = gradient elution to 1:3 from 1:8)를 하여 하기 물성치를 갖는 (7S)-(+)-3-(2-furanyl)-acrylic acid, 8,8-dimethyl-2-oxo-6,7-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-7-yl-ester (SLCB050)를 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율 73.6 %; 오렌지색 고체상; mp: 96.1 ℃; R_f = 0.62 (n-hexane:ethyl acetate =1:1); [α]_D ²⁵ +62.4 (c=3, CHCl₃);

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.64(1H, s, H-6'), 7.58(1H, d, J = 9.6Hz, H-4), 7.56(1H, d, J = 16.0Hz, H-3'), 7.41(1H, d, J = 1.6Hz, H-7'), 7.17(1H, s, H-5), 6.82(1H, s, H-10), 6.55(1H, d, J = 1.6Hz, H-8'), 6.23(1H, d, J = 9.6Hz, H-3), 6.13(1H, d, J = 16.0Hz, H-2'), 5.17(1H, t, J = 4.4Hz, H-7), 3.23(1H, dd, J = 4.4, 17.6Hz, H-6a), 2.92(1H, dd, J = 4.4, 17.6Hz, H-6b), 1.42(3H, s, CH₃-8), 1.38(3H, s, CH₃-8);

¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ_C 166.3(C-1'), 161.3(C-2), 156.3(C-9a), 154.1(C-10a), 144.8(C-4'), 144.5(C-6'), 143.1(C-4), 135.8(C-3'), 128.7(C-5), 117.0(C-2'), 115.6(C-5a), 113.3(C-3), 112.9(C-7'), 112.9(C-4a), 107.2(C-8'), 104.7(C-10), 76.6(C-8), 70.0(C-7), 27.8(C-6), 24.8(CH3-8), 23.3(CH3-8);

ESI-MS: m/z = 389 [M+Na]⁺.

6. HJH141204 및 HJH141206 합성

앞서 선별한 SLCB050와 유사한 화합물로서 HJH141204, HJH141206 및 SLCB36을 각각 합성하였다.

도 3D 및 도 3E와 같이 SLCB050, HJH141204 및 HJH141206은 DX2-p14/ARF 결합에 대한 억제 효과를 나타내며, p53-p14/ARF의 상호작용에 대해서는 영향을 미치지 않는 반면, SLCB36는 2가지 결합에 대한 억제 효과를 나타내지 못하였기 때문에, 화합물 중 리보오스 고리 구조를 갖는 것이 결합 억제에 필수적임을 확인하였다.

1) HJH141206 합성: (7S)-(+)-2-(Furan-2-yl)vinylcarbamic acid, 8,8-dimethyl-2-oxo-6,7-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-7-yl-ester

[반응식 2]

[단계 1] 라운드 플라스크에 트랜스-3-(2-퓨라닐)아크릴산 (500 mg, 3.37 mmol)를 dry 벤젠 20 mL에 용해시킨 후 트리에틸아민 (TEA, 234㎕, 1.683 mmol), 디페닐 포스포릴 아자이드 (DPPA, 362㎕, 1.683 mmol)을 넣고 80 ℃에서 3시간 반응시켰다. 물과 에틸아세테이트로 추출한 다음 황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압 농축하였다.

[단계 2] 이를 다시 dry 벤젠에 녹여 80 ℃에서 하루동안 가열 환류시켰다.

[단계 3] 여기에 (+)-데쿠르시놀 (207 mg, 0.841 mmol)을 넣고 트리에틸아민 (TEA, 281㎕, 2.019 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 82 mg, 0.673 mmol)을 넣고 80 ℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 용액을 감압 농축하였으며 이를 실리카겔 컬럼 분리 (에틸아세테이트 : n-헥산 = gradient elution to 1:3 from 1:8)를 하여 하기 물성치를 갖는 (7S)-(+)-2-(Furan-2-yl)vinylcarbamic acid, 8,8-dimethyl-2-oxo-6,7-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-7-yl-ester (HJH141206)를 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율: 69.7%; 갈색 고체상; mp: 58.5 ℃; R_f = 0.46 (n-hexane:ethyl acetate =1:1); [α]_D ²⁵ +79.6933 (c=3, CHCl₃);

¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆): δ_H 9.894(d, J = 10.2Hz, 1H), 7.920(d, J = 9.6Hz, 1H), 7.493(s, 2H), 6.984(dd, J = 10.2, 14.7Hz, 1H), 6.798(s, 1H), 6.401-6.383(m, 1H), 6.264(d, J = 9.6Hz, 1H), 6.190(d, J = 3.3, 1H), 5.912(d, J = 14.4Hz, 1H), 5.056(t, J = 3.6Hz, 1H), 3.254(dd, J = 4.2, 18.0Hz, 1H), 2.917(dd, J = 3.3, 17.7Hz, 1H), 1.384(s, 3H, CH₃), 1.313(s, 3H, CH₃);

¹³C NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ_C 160.3, 155.8, 153.5, 153.1, 151.5, 144.1, 141.1, 129.6, 123.9, 115.7, 112.7, 112.6, 111.5, 105.2, 103.5, 99.9, 76.8, 70.2, 27.3, 24.3, 23.7

ESI-MS: m/z = 382 [M+H]⁺.

2) HJH141204 합성: (7R)-(-)-2-(Furan-2-yl)vinylcarbamic acid, 8,8-dimethyl-2-oxo-6,7-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-7-yl-ester

[반응식 3]

[단계 1] 상기 반응식에서 나타난 바와 같이 라운드 플라스크에 (+)-데쿠르시놀 (1, 85 g, 0.35 mol)과 트리페닐포스핀 (226 g, 0.87 mol)을 넣고 아세트 나이트릴 (600 mL)과 사염화탄소(600 mL)을 1:1로 용해한 후, 50-60 ℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 여액의 반 정도를 감압농축한 후, 실리카겔 컬럼분리를 통해 하기 물성치를 갖는 8,8-디메틸-8H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온(8)을 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율: 98.6%; 백색 고체상; m.p: 124℃; R_f=0.62 (n-hexane:ethyl acetate=1:1);

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.583(d, J = 9.52Hz, 1H), 7.049(s, 1H), 6.711(s, 1H), 6.340(d, J = 10.0Hz, 1H), 6.213(d, J = 9.52Hz, 1H), 5.691(d, J = 9.76Hz, 1H), 1.467(s, 6H, CH₃X2);

ESI-MS: m/z = 229 [M+H]⁺.

[단계 2] 라운드 플라스크에 15% 소듐 하이퍼클로라이트 용액 (60 mL)과 0.05M 소듐포스페이트 디베이직 용액 (24 mL)을 넣고 반응 용액의 pH가 11.3이 되도록 1N의 소듐 하이드록사이드 용액이나 1N의 하이드로크로라이드 용액으로 맞추었다. 이 반응 용액에 8,8-디메틸-8H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온(8, 1.3 g, 5.7 mmol)과 (R,R)-(-),N,N`-비스(3,5-디-테트 부틸 살이시리딘)-1,2,-시클로헥산디아미노 망간네스(Ⅲ) 클로라이드 (얍곱센 촉매, 69.9 mg, 0.11 mmol)을 디클로로메탄 (15 ml)에 용해시킨 것을 첨가하였다. 이 반응 혼합액을 0℃에서 7시간 정도 교반하였다. 반응 혼합액을 디클로로메탄에 추출시킨 후 물로 씻어 후 붉은 갈색의 유기층을 얻었다. 유기층을 무수망초로 수분을 제거한 후, 여액은 감압 농축하였다. 순수한 생성물을 얻기 위해 농축액은 실리카겔 컬럼 분리를 통해 하기 물성치를 갖는 (6R,7R)-6,7-에폭시-8,8-디메틸-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온(9)를 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율: 56.3%; 백색 고체상; m.p : 145.2 ℃; R_f=0.32(n-hexane:ethyl acetate=1:1); [α]_D ²⁵ +201.8(c=3, CHCl₃)

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.643(d, J = 9.52Hz, 1H), 7.470(s, 1H), 6.754(s, 1H), 1H), 6.265(d, J = 9.52 Hz, 1H), 3.976(d, J = 3.88Hz, 1H), 3.551(d, J = 3.88Hz, 1H), 1.609(s, 3H, CH₃), 1.312(s, 3H, CH₃);

ESI-MS: m/z = 245 [M+H]⁺.

[단계 3] 상기 반응식에서 나타난 바와 같이 라운드 플라스크에 (6R,7S)-6,7-에폭시-8,8-디메틸-6H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온(9, 600 ㎎, 2.456 mmol)을 테트라하이드로푸란에 용해시킨 후, 소듐 시아노보로하이드라이드와 보란 트리플로라이드 디에틸 이터레이트을 넣었다. 반응혼합액을 0℃에서 30분정도 교반하였다. 이 반응혼합액의 여액을 감압농축한 후, 실리카겔 컬럼분리를 통해 하기 물성치를 갖는 (-)-데쿠르시놀[decursinol; (7R)-7-하이드록시-8,8-디메틸-8H-피라노[3,2-g]크로멘-2-온 (10)]을 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율 : 98.6 %; 백색 고체상; m.p : 135.6 ℃; R_f=0.179(n-hexane:ethyl acetate=1:1); [α]_D ²⁵ -18.4(c=4, CHCl₃)

¹H NMR(400 MHz, CDCl₃): δ_H 7.579(d, J = 9.5Hz, 1H), 7.180(s, 1H), 6.780(s, 1H), 6.219(d, J = 9.52Hz, 1H), 3.876(d, J = 5.1Hz, 1H), 3.112(dd, J = 4.8Hz, 16.7Hz, 1H), 2.837(dd, J = 5.6Hz, 16.6Hz, 1H), 1.397(s, 3H, CH₃), 1.367(s, 3H ,CH₃)

ESI-MS: m/z = 247 [M+H]⁺.

[단계 4] 라운드 플라스크에 트랜스-3-(2-퓨라닐)아크릴산 (500mg, 3.37mmol)을 dry 벤젠 20 mL에 용해시킨 후 트리에틸아민 (TEA, 234㎕, 1.683 mmol), 디페닐 포스포릴 아자이드 (DPPA, 362㎕, 1.683 mmol)를 넣고 80 ℃에서 3시간 반응시켰다. 물과 에틸아세테이트로 추출한 다음 황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 감압 농축하였다.

[단계 5] 이를 다시 dry 벤젠에 녹여 80 ℃에서 하루 동안 가열 환류시켰다.

[단계 6] 여기에 단계 3에서 합성한 (-)-데쿠르시놀 (207 mg, 0.841 mmol)을 넣고 트리에틸아민 (TEA, 281㎕, 2.019 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘 (DMAP, 82 mg, 0.673 mmol)을 넣고 80 ℃에서 3시간 반응시켰다. 반응 용액을 감압 농축하였으며 이를 실리카겔 컬럼 분리 (ethyl acetate : n-hexane = gradient elution to 1:3 from 1:8)를 하여 하기 물성치를 갖는 (7R)-(-)-2-(Furan-2-yl)vinylcarbamic acid, 8,8-dimethyl-2-oxo-6,7-dihydro-2H,8H-pyrano[3,2-g]chromen-7-yl-ester (HJH141204)를 얻어 실험의 시료로 사용하였다.

수율: 80.9 %; 갈색 고체상; mp: 58.1 ℃; R_f = 0.46 (n-hexane:ethyl acetate=1:1); [α]_D ²⁵ -79.6467 (c=3, CHCl₃);

¹H NMR(300 MHz, DMSO-d₆): 9.896(d, J = 10.2Hz, 1H), 7.902(d, J = 9.6Hz, 1H), 7.477(s, 2H), 6.992(dd, J = 10.2, 14.4Hz, 1H), 6.790(s, 1H), 6.396-6.387(m, 1H), 6.255(d, J = 9.6Hz, 1H), 6.185(d, J = 3.3Hz, 1H), 5.919(d, J = 14.4Hz, 1H), 5.059(t, J = 3.7Hz, 1H), 3.251(dd, J = 4.2, 18.0Hz, 1H), 2.922(dd, J = 3.3, 18.0Hz, 1H), 1.384(s, 3H, CH₃), 1.313(s, 3H, CH₃);

¹³C NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ_C 160.3, 155.9, 153.6, 153.2, 151.6, 144.0, 141.1, 129.6, 124.0, 115.7, 112.7, 112.6, 111.5, 105.2, 103.5, 100.0, 76.9, 70.3, 27.3, 24.3, 23.7

ESI-MS: m/z = 382 [M+H]⁺.

3) SLCB36 화합물:

<실시예 2> 항암 효과 검토

1. 세포 배양

A549, HCT116, H1299 및 HEK293 세포주는 각각 American Type culture collection (ATCC, Manassas, VA)로부터 구매하였고, 10% FBS 및 1% 항생제를 함유한 RPMI-1640 또는 DMEM 배지에서 배양하였다. NSCLC 세포주(NCI-H23, NCI-H322, NCI-H358 및 NCI-H460)는 ATCC에서 구매하였고, SCLC 세포주(NCI-H69, NCI-H128 및 NCI-H146)는 Korean Cell line Bank (KCLB, Seoul, Korea)에서 구매하였으며, 10% FBS를 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. MEF(mouse embryonic fibroblast) 세포는 표준 프로토콜을 이용하여 14.5일차 배아로부터 분리하였으며, 15% FBS 및 1% 항생제를 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다.

2. 마우스 준비

실험동물을 이용한 모든 실험절차는 부산대학교 동물윤리위원회의 승인을 받고 수행하였다. DX2(C57/BL6) 및 K-RasLA2(C57/BL6) 마우스는 서울대 김성훈 박사님과 연세대 최강렬 교수님으로부터 각각 얻었으며, double Tg 마우스는 DX2 및 K-RasLA2 마우스의 교배육종에 의해 얻었다. 실험 전에 모든 마우스는 온도 및 빛이 제어된 환경(20-23℃, 12 h/12 h 광/암 주기) 하에서 사육하였으며 자유롭게 멸균된 식이와 물을 제공하였다.

3. 면역 침전, GST 풀-다운 및 웨스턴 블랏 분석

앞서 실시예 1과 동일한 방법으로 면역 침전, GST 풀-다운 및 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

4. MTT 분석

MTT 분석을 통해 종양 세포 생존율을 통해 항암 효과를 확인하였다. 즉, 세포를 37℃에서 4시간 동안 0.5 mg/ml의 MTT 용액에서 반응시킨 후, 형성된 포마젼 산물을 디메틸설폭사이드(DMSO)로 용해시키고 540 nm에서 분광분석기로 흡광도를 측정하였다.

5. in vivo 약물 처리

DK(5 month-old, N=6) 마우스는 담체(carrier), SLCB050(5 또는 10 mg/kg), 아드리아마이신(1, 2.5 또는 5 mg/kg) 및 SLCB050와 아드리아마이신의 조합을 복강 주사로 투여하였다. 각 실험군의 실험 종료 후, 마우스를 절개하여 폐조직을 분리하였다. 이종이식을 위해, 1x10⁷개의 H446 세포(ATCC)를 누드 마우스에 경피로 분주하였다. 4주 후, 마우스가 갖는 종양에 아드리아마이신, SLCB0505 또는 이들의 조합을 6주 동안 주입하였다. 매주 종양 체적 및 몸무게를 측정하였다.

6. 조직학적 분석

마우스를 제거한 후, 조직을 10% 포르말린(in PBS)을 이용하여 24시간 동안 고정시키고, 통상적인 조직 처리 공정에 따라 파라핀 블록에 포매시켰다. 조직학적 분석을 위해, 포매된 조직을 Leica 마이크로톰(Wetzlar, Germany)을 이용하여 5 μM로 잘라 접착제-코팅 슬라이드(Marienfeld laboratory glassware, Germany) 상으로 옮겼다. 파라핀을 제거하고 재수화시킨 후, 절편을 알려진 방법에 따라 H&E로 염색하였다.

IHC 염색을 위해, 재수화된 조직 절편을 Ki-67에 대한 항체(Abcam, ab15580), 팬-케라틴에 대한 항체(Sigma, C2931), 프로-설펙턴트 C에 대한 항체(Millipore, AB3786), NSE에 대한 항체(DAKO, IS612) 및 HER2/Neu에 대한 항체(DAKO, A0458)와 반응시켰다. 항원 복구는 10 mM 구연산 나트륨(pH 6.0)을 이용하여 95℃에서 10분간 2회 수행하였고, 내인성 퍼옥시데이즈 활성은 10분 동안 3% 과산화수소로 블로킹하였다. 그 후, 슬라이드를 표준 방법에 따라 탈수시키고 모니터링 용액을 이용하여 커버글래스로 밀봉하였다. 종래 알려진 방법에 따라 TUNEL 반응을 수행하여 In Situ Cell Death Detection Kit, POD (Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Swizerland)로 측정하였다.

7. 종양 발생 정도 및 면적 분석

종양 발생 정도를 평가하기 위하여, 각 마우스의 폐 조직을 파라핀으로 고정하고 포매시켰다. 3명의 다른 조사관이 각 마우스의 5개의 절편을 검사하여 종양 수를 세었다. 그리고, 종양 면적은 photoshop soft wear를 이용하여 전체 폐 면적 중 종양이 차지하는 면적에 의해 산출하였다.

8. 실험결과

도 4A 및 도 4B와 같이, SLCB050의 처리에 의해 DX2-p14/ARF 상호작용이 차단되었으며, DX2 및 p14/ARF이 핵에서 국재화 되었다. 그리고, 도 4C와 같이 SLCB050이 처리된 H1299, H69 세포주에서 p14/ARF의 증가가 관찰되었고, 도 4D와 같이 p14/ARF 결핍 세포주(H322, H460 and A549)에서 DX2의 감소가 관찰되었다. 또한, 도 5와 같이 p14/ARF 결핍 세포주는 SLCB050에 대한 저항성을 갖는 반면, SCLC 세포주는 SLCB050에 대한 민감성을 나타내었다. 특히, 도 6과 같이 SLCB050는 H128 세포 성장을 완전하게 억제하였다. 그리고, 도 7과 같이 HJH141204 및 HJH141206도 세포 생존을 억제하여 화합물-DX2 결합에 의해 종양 세포 성장이 억제됨을 확인하였다.

SLCB050가 항암제의 민감성을 회복시킬 수 있는지 검토하였고, 도 8A와 같이 DX2 및 DK MEF에서 GN25(한국등록특허 제1298168호에 따라 합성됨)의 저항성이 SLCB050을 함께 처리한 경우 없어졌다. 또한, 도 8B와 같이 DX2 및 DK MEF에서 아드리아마이신(Adr)과 SLCB050을 함께 처리한 경우에도 아드리아마이신의 저항성이 없어졌으며, 도 8C와 같이 SCLC 세포주 H69에서도 SLCB050에 일부 반응하였다. 그러나, 도 8C와 같이 p14/ARF 결핍 H322 세포주에서는 SLCB050의 병용 처리에 의해 상승 효과가 나타나지 않았다.

도 9A와 같이, H446을 이용한 종양 이식 모델은 아드리아마이신에 저항성이 있으며 SLCB050에 부분적으로 반응하였다. 그리고, 도 9B와 같이, H446을 이용한 종양 이식 모델에서 증가된 종양 체적은 SLCB050 주입(10 mg/kg, 1주일 3회)에 의해 완화하게 억제되었다. 그리고, 5 mg/kg의 아드리아마이신(1주일 3회)의 주입에 의해 종양 억제 효과가 관찰되었지만 재빠른 몸무게 감소 및 죽음을 야기하는 반면, SLCB050(10 mg/kg)와 함께 처리 시에는 도 9B와 같이 저용량(2.5 mg/kg)의 아드리아마이신 처리에도 불구하고 보다 명확한 항암 효과를 나타내었다. 그리고, 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리는 도 9C와 같이 DX2 또는 DK 마우스에서 수득한 프라이머리 종양 세포에서 p53 발현을 명확하게 유도하였다. 이러한 결과로부터 DX2의 억제는 p14/ARF의 재활성화를 통해 항암제 민감성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

마우스 모델에서 SLCB050의 항암 효과를 검토하기 위하여, 도 10A와 같은 실험 스케쥴로 DK 마우스에 SLCB050를 주입하였다. SLCB050(10 mg/kg) 및 저용량(2.5 mg/kg)의 아드리아마이신의 병용 처리는 도 10B 및 도 10C와 같이 종양 진행을 눈에 띄게 억제하였으며, 유의성있는 몸무게 감소는 야기하지 않았다. 그러나, 도 10B와 같이, 아드리아마이신의 비독성 용량으로는 이러한 마우스 모델에서 항암 효과를 나타내지 않았다.

보다 상세한 조직학적 분석을 통해, SCLC 영역은 도 11과 같이 아드리아마이신과 SLCB050의 병용 처리에 의해 보다 명확하게 없어졌다. 도 12A와 같이, SLCB050의 처리에 의한 DX2 감소된 조건 하에서 도 12B 및 도 12C와 같이 아팝토시스성 종양 세포가 명확하게 증가하였다. 이러한 결과는 도 13과 같이 AIMP2의 비정상적인 스플라이싱에 의해 생성된 DX2가 p14/ARF의 직접적 상호작용과 억제를 통해 종양 특히 소세포성 폐암의 진행을 촉진함을 의미하며, 이러한 소세포성 폐암은 DX2-p14/ARF 결합을 억제하는 화합물에 의해 치료될 수 있음을 확인하였다.

한편, 본 발명에 따른 화합물 SLCB050은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 정제(직접 가압)

SLCB050 5.0㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈 USNF 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 2> 정제(습식 조립)

SLCB050 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 80 0.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후 이 용액의 적당량을 첨가한 다음, 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

<제제예 3> 분말과 캡슐제

SLCB050 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎와 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 넣어 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제

SLCB050 100 mg, 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수 2974 mg를 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 투명 유리로 된 앰틀 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클레이브시켜 살균하여 주사제를 제조하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

[화학식 2]
청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 화합물.
하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
청구항 3에 있어서, 상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하는 것을 특징으로 하는 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물.
삭제
청구항 3에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성 폐암 또는 소세포성 폐암인 것을 특징으로 하는 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물.
하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는, 폐암에 대한 항암제의 약물 내성 억제용 약학조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
청구항 7에 있어서, 상기 항암제는 아드리아마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 사이클로포스파마이드, 도세탁셀, 파크리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 미토산트론, 커큐민, 제피티닙, 에를로티닙, 이리노테칸, 토포데칸, 빈플라스틴, 빈크리스틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 트라스트주맙, 비노렐빈, 플루오로우라실 및 3-(5,8-디메톡시-1,4-디옥소나프탈렌-2-일티오)프로판오익 엑시드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 폐암에 대한 항암제의 약물 내성 억제용 약학조성물.
청구항 7에 있어서, 상기 화합물은 DX2 단백질과 p14/ARF 단백질 간의 결합을 억제하여 폐암에 대한 항암제의 약물 내성을 억제하고 폐암에 대한 항암제의 항암효과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 폐암에 대한 항암제의 약물 내성 억제용 약학조성물.
하기 화학식 1 내지 화학식 3으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 화합물 및 폐암에 대한 항암제를 유효성분으로 함유하는, 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물:
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
청구항 10에 있어서, 상기 항암제는 아드리아마이신, 카페시타빈, 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 사이클로포스파마이드, 도세탁셀, 파크리탁셀, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 미토산트론, 커큐민, 제피티닙, 에를로티닙, 이리노테칸, 토포데칸, 빈플라스틴, 빈크리스틴, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 트라스트주맙, 비노렐빈, 플루오로우라실 및 3-(5,8-디메톡시-1,4-디옥소나프탈렌-2-일티오)프로판오익 엑시드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물.
삭제
청구항 10에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성 폐암 또는 소세포성 폐암인 것을 특징으로 하는 폐암 치료 또는 예방용 약학조성물.