KR101665234B1 - 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 - Google Patents
골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명의 골손실을 완화, 예방 또는 차료하는 약학적 조성물 등은 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하여, 파골세포 전구체의 증식을 억제하고 파골세포 전구체의 세포-세포 융합을 억제하여 골손실을 효과적으로 억제할 수 있다.
Description
본 발명은 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 대한 것으로, 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하여 골다공증과 같은 골손실 질환을 완화, 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물, 파골세포의 세포융합 억제제 및 골밀도 감소 예방 및 완화용 건강기능식품에 관한 것이다.
뼈의 발생, 성장 및 대사과정에는 뼈의 형성(bone modeling)과 재형성(remodeling) 과정이 중요한 역할을 한다. 뼈의 형성은 태생기부터 시작하여 이후 골격이 성숙되어 성장이 끝나는 청장년기까지 지속되어 20대에서 30대 초반까지 최대 골량을 형성하게 된다. 이후 약 3년 동안은 뼈를 제거하고 다시 이를 보충하는 골재형성 과정을 반복하게 된다. 이 시기가 지난 후에는 골 흡수에 따른 골손실을 골형성이 충분히 따라갈 수 없어 결국 연 0.3 내지 0.5% 정도의 골량 감소를 겪게 되며, 특히 여성의 경우에는 폐경 초기에 연 2 내지 3%의 상당한 골손실을 겪게 된다. 한편, 뼈는 크게 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast), 라이닝세포(lining cell) 및 골세포(osteocyte)의 네 가지 세포로 구성되어 있다. 이때, 골수내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래되는 조골세포는 골기질을 합성하는 분화된 세포로서 골형성을 주도하며, 조혈모세포로부터 유래되는 파골세포는 골흡수를 주도한다. 골형성과 골손실의 균형은, 구체적으로 골기질(mineralized bone matrix)의 파골세포(osteoclasts)에 의한 파괴와 골아세포(osteoblasts)에 의한 골형성의 기능적인 균형에 의하여 효과적으로 조절되는 프로세스로 균형이 유지된다(Harada and Rodan, 2003; Teitelbaum, 2000).
골량은 유전적요인, 영양 섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들에 의해 영향을 받으며, 골다공증과 같은 골손실 관련 질환의 원인으로는 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제 등과 각종 질병의 합병증 등이 알려져 있다. 골손실 관련 대표적인 질환인 골다공증(osteoporosis)은 골 조직의 석회가 감소되어 뼈의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강이 넓어지는 상태로, 증세가 진전됨에 따라 뼈가 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 골다공증은 정도에 차이는 있으나 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게 있어서는 피할 수 없는 증상으로, 선진국에는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 점차 증가하고 있어서 이를 치료가거나 예방 완화할 수 있는 제품이 필요한 실정이다. 또한, 전 세계적으로 골질환 치료와 관련되어 약 1300억 달러의 시장이 형성되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 골손실을 완화, 예방 또는 차료하는 약학적 조성물 등을 제공하는 것으로, 파골세포 전구체의 증식을 억제하고 파골세포 전구체의 세포-세포 융합을 억제하여 골손실을 억제할 수 있는 약학적 조성물, 파골세포의 세포융합 억제제, 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함한다.
상기 약학적 조성물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의하여 파골세포 또는 파골세포 전구체에 유도되는 DC-STAMP(Dendritic cell-specific transmembrane protein) 및 Atp6v0d2(d2 isoform of vacuolar (H+) ATPase Vodomain)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 것이 수 있다.
상기 골손실은 파제트병(Paget’s disease), 골다공증(osteoporosis), 또는 용해성 골전이(lytic bone metastasis)에 의한 것일 수 있고, 상기 약학적 조성물은 상기 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 0.01 내지 50 mg으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 파골세포의 세포융합 억제제는, 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 골손실 완화 또는 예방용 건강기능식품은 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 염을 포함한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예인 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함한다.
2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌{2-(2-((3,5-Dimethyl-1H-pyrrol-2-yl)methylene)-3-methoxy-2H-pyrrol-5-yl)-1H-indole}, GX-070, Obatoclax)는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로, 이 화합물 또는 이의 메실레이트 염(Obatoclax Mesylate)이 고형암과 림프종에 효과가 있는 것으로 알려져 임상시험이 진행중인 항암제 후보물질이다.
본 발명에서는 항암 용도가 아닌 골손실의 완화, 예방 또는 치료 용도로 위의 화합물을 적용하였으며, 특히 파골세포 전구체에 처리하였을 때에 파골세포 전구체의 증식이나 분화를 억제한다는 점을 확인하고 이 발명을 완성하였다.
상기 약학적 조성물은 파골세포 전구체의 증식을 억제할 수 있고, 특히 파골세포 전구체의 세포-세포 융합을 억제하는 용도를 갖는다.
파골세포가 골 재흡수의 기능을 수행하기 위해서, 단핵세포인 파골세포 전구체는 세포-세포 융합 과정을 통해서 다핵의 성숙된 파골세포로 변화해야 한다(Blare, 1998; Vignery, 2000). 그리고, 이 세포-세포 융합 과정은 CD44, TREM2, D9/CD81, ATP6v0d2, DC-STAMP 등에 의하여 조절을 받는다.
상기 약학적 조성물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의하여 파골세포 또는 파골세포 전구체에 유도되는 DC-STAMP(Dendritic cell-specific transmembrane protein) 및 Atp6v0d2(d2 isoform of vacuolar (H+) ATPase Vodomain)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 발현을 억제하여 골 손실을 억제할 수 있다.
특히, 위의 DC-STAMP과 Atp6v0d2는 세포 융합에 관여하는 단백질로, 상기 약학적 조성물은 파골세포 성숙의 초기 단계가 아니라 후기 단계의 세포-세포 융합을 억제하여 골 손실을 억제할 수 있다.
상기 골손실은 파제트병(Paget’s disease), 골다공증(osteoporosis), 또는 용해성 골전이(lytic bone metastasis)에 의한 것일 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 파제트병, 골다공증, 및 용해성 골전이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 골다공증은, 글루코코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증, 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류머티스성 골다공증에서 선택된 어느 하나의 골다공증일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 퇴행성 골다공증, 당뇨합병증으로 유발된 골다공증 등에 유용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 0.01 내지 50 mg으로 함유하는 것일 수 있고, 0.01 내지 25 mg 으로 함유하는 것일 수 있으며, 0.01 내지 0.01 내지 10 mg으로 함유하는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 상대적으로 저용량으로 환자에게 투약할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 조절될 수 있으나, 상기 약학적 조성물이 골다공증의 예방 또는 치료와 같은 골손실과 관련된 용도로 적용하기 위하여 항암제로 활용하는 경우보다 상대적으로 저용량으로 처리하는 것이 좋다. 예를 들어, 상기 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 60 mg 미만으로 투여할 수 있고, 1일 투여량이 1 mg/kg 이하가 되도록 할 수 있으며, 0.001 내지 1 mg/kg일 수 있고, 필요에 따라 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다. 상기 약학적 조성물은 골감소 관련 질환의 억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 생리학적으로 허용되는 보조제를 함께 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 경구 또는 비경구용의 인체 또는 수의용으로 제제화 또는 제형화 될 수 있다. 상기 약삭적 조성물을 제제화하는 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그 염을 포함하는 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘, 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성 용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mark Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강내, 국소 적용 등)할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 파골세포 세포융합 억제제는, 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 상기 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 및 이의 약학적으로 허용되는 염에 대한 설명은 위에서 설명한 것과 중복되므로 그 기재를 생략한다.
상기 파골세포 세포융합 억제제는 in vivo(생체 내) 또는 in vitro(시험관 내)에서 파골세포 전구체의 세포-세포융합을 억제할 수 있으며, 특히 RANKL에 의하여 유도되는 파골세포 전구체의 세포-세포 융합을 억제하여 파골세포 전구체가 파골세포로 성숙하는 것을 억제할 수 있다.
또한, 상기 파골세포 세포융합 억제제는 RANKL에 의하여 유도되는 DC-STAMP 및/또는 Atp6v0d2 단백질의 발현을 억제하며, 파골세포 전구체의 성숙의 마지막 단계에서 용량 의존적으로 ERK1/2 MAP 키나아제 경로를 막아 성숙된 파골세포 형성을 억제한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 건강기능식품은 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 염을 포함하여 골손실의 완화, 또는 예방한다. 상기 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 및 이의 염에 대한 설명은 위에서 설명한 것과 중복되므로 기재를 생략한다.
상기 골손실의 완화, 또는 예방용 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 예로는 유제품, 제과물, 조미료, 음료 및 드링크제, 스낵, 캔디류, 아이스크림 및 냉동용 디저트, 아침 곡물류, 영양바, 스낵 바 초콜렛 제품, 가공 식품, 곡물 제품 및 파스타, 스프, 소스 및 드레싱, 과자 제품, 오일 및 지방제품, 유제품 음료 (dairy drink) 및 우유 음료, 두유 및 콩 유제품 (soy dairy-like product), 냉동식품, 조리 음식 및 대체음식, 육류 제품, 치즈, 요구르트, 빵 및 롤빵, 효모 제품, 케이크 및 쿠키 및 크래커로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능식품은 이는 캡슐, 정제, 분말, 액상 현탁액, 환제 및 과립제 등으로 제형화하여 사용할 수 있고, 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 상기 건강기능식품이 음료 제형의 건강기능식품인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 녹용추출물, 배변활동과 칼슘의 흡수를 도와주는 프락토올리고당, 아카시아꿀, 천연 보존제인 복합황금추출물, 침전개선 점증제인 젤란검 등의 기능성 원료도 부가할 수 있으나, 이에 한정하지는 않고 건강기능식품에 적합한 성분을 적절하게 사용할 수 있다.
본 발명의 골손실을 완화, 예방 또는 차료하는 약학적 조성물, 파골세포 세포융합 억제제 및 건강기능식품은 파골세포 전구체의 증식을 억제하고 파골세포 전구체의 세포-세포 융합을 억제하여 골손실을 효과적으로 억제할 수 있다.
도 1은 화학식 1로 표시되는 화합물의 파골세포 전구체에 대한 세포독성을 시험한 결과이다.
도 2은 화학식 1로 표시되는 화합물이 파골세포 전구체의 세포증식에 미치는 영향을 시험한 결과이다.
도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물의 파골세포 전구체의 세포사(Apoptosis)에 미치는 영향을 평가한 결과이다
도 4는 파골세포 전구체를 이용하여 RANKL에 의한 MAP 키나아제의 활성을 AP 키나아제-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해서 확인한 결과이다.
도 5는 상기 도 4의 단백질 밴드를 밀도 측정에 의하여 정량화한 결과를 나타낸다.
도 6은 RANKL에 의하여 유도된 파골세포 전구체의 세포활성에 화학식 1의 화합물(Ob)과 ERK 억제제인 PD98059(PD)이 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 7은 RANKL에 의하여 유도된 파골세포 전구체의 세포사에 화학식 1의 화합물(Ob)과 ERK 억제제인 PD98059(PD)이 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 8은 파골세포 전구체(왼쪽), RANKL 처리에 의하여 성숙된 파골세포(가운데), 및 PD98059 + RANKL 처리된 파골세포(오른쪽)를 현미경(배율 100배)으로 관찰한 결과이다.
도 9는 상기 도 8의 결과 중에서 TRAP 양성 단핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 10는 상기 도 8의 결과 중에서 20개 이상의 핵을 함유하고 100 μm이상의 직경을 갖는 TRAP 양성 다핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 11은 파골세포 전구체(위의 왼쪽), RANKL 처리에 의하여 성숙된 파골세포(위의 오른쪽), 화학식 1의 화합물로 처리된 파골세포 전구체(아래의 왼쪽), 및 표시된 농도로 화학식 1의 화합물로 전처리 후 RANKL 처리된 파골세포(아래의 가운데 및 아래의 오른쪽)를 현미경(배율 100배)으로 관찰한 결과이다.
도 12는 상기 도 11의 결과 중에서 TRAP 양성 단핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 13는 상기 도 11의 결과 중에서 20개 이상의 핵을 함유하고 100 μm이상의 직경을 갖는 TRAP 양성 다핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 14는 화학식 1의 화합물(100 nM)로 전처리한 후 RANKL 처리한 파골세포 전구체의 RNA를 분리한 시료를 이용하여 실시간 PCR 분석한 결과, 파골세포 마커 진인 c-Fos, TRAP, RANK 및 CtsK에 대한 결과를 나타낸다.
도 15는 화학식 1의 화합물(100 nM)로 전처리한 후 RANKL 처리한 파골세포 전구체의 RNA를 분리한 시료를 이용하여 실시간 PCR 분석한 결과, 파골세포 마커 진인 DC-STAMP 와 Atp6v0d2에 대한 결과를 나타낸다.
도 16은 파골세포 전구체를 10 μM의 PD98059 (PD)로 전처리한 후 3일 동안 RANKL(R)로 처리하여 얻은 세포의 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 한 결과이다.
도 2은 화학식 1로 표시되는 화합물이 파골세포 전구체의 세포증식에 미치는 영향을 시험한 결과이다.
도 3은 화학식 1로 표시되는 화합물의 파골세포 전구체의 세포사(Apoptosis)에 미치는 영향을 평가한 결과이다
도 4는 파골세포 전구체를 이용하여 RANKL에 의한 MAP 키나아제의 활성을 AP 키나아제-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해서 확인한 결과이다.
도 5는 상기 도 4의 단백질 밴드를 밀도 측정에 의하여 정량화한 결과를 나타낸다.
도 6은 RANKL에 의하여 유도된 파골세포 전구체의 세포활성에 화학식 1의 화합물(Ob)과 ERK 억제제인 PD98059(PD)이 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 7은 RANKL에 의하여 유도된 파골세포 전구체의 세포사에 화학식 1의 화합물(Ob)과 ERK 억제제인 PD98059(PD)이 미치는 영향을 평가한 결과이다.
도 8은 파골세포 전구체(왼쪽), RANKL 처리에 의하여 성숙된 파골세포(가운데), 및 PD98059 + RANKL 처리된 파골세포(오른쪽)를 현미경(배율 100배)으로 관찰한 결과이다.
도 9는 상기 도 8의 결과 중에서 TRAP 양성 단핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 10는 상기 도 8의 결과 중에서 20개 이상의 핵을 함유하고 100 μm이상의 직경을 갖는 TRAP 양성 다핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 11은 파골세포 전구체(위의 왼쪽), RANKL 처리에 의하여 성숙된 파골세포(위의 오른쪽), 화학식 1의 화합물로 처리된 파골세포 전구체(아래의 왼쪽), 및 표시된 농도로 화학식 1의 화합물로 전처리 후 RANKL 처리된 파골세포(아래의 가운데 및 아래의 오른쪽)를 현미경(배율 100배)으로 관찰한 결과이다.
도 12는 상기 도 11의 결과 중에서 TRAP 양성 단핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 13는 상기 도 11의 결과 중에서 20개 이상의 핵을 함유하고 100 μm이상의 직경을 갖는 TRAP 양성 다핵 세포의 수를 상대퍼센트(%)로 나타낸 그래프이다.
도 14는 화학식 1의 화합물(100 nM)로 전처리한 후 RANKL 처리한 파골세포 전구체의 RNA를 분리한 시료를 이용하여 실시간 PCR 분석한 결과, 파골세포 마커 진인 c-Fos, TRAP, RANK 및 CtsK에 대한 결과를 나타낸다.
도 15는 화학식 1의 화합물(100 nM)로 전처리한 후 RANKL 처리한 파골세포 전구체의 RNA를 분리한 시료를 이용하여 실시간 PCR 분석한 결과, 파골세포 마커 진인 DC-STAMP 와 Atp6v0d2에 대한 결과를 나타낸다.
도 16은 파골세포 전구체를 10 μM의 PD98059 (PD)로 전처리한 후 3일 동안 RANKL(R)로 처리하여 얻은 세포의 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
실시예 1: 화학식 1로 표시되는 화합물에 의한 파골세포 전구체의 증식억제실험
1) 파골세포 전구체의 분리
살균된 21G의 주사기를 이용하여 4 내지 6주령된 마우스(C57BL/6)의 대퇴골로부터 골수세포를 채취하고, 10 % FBS와 10 ng/ml M-CSF(R&D Systems)를 포함하는 알파-MEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후에 부유세포를 수거해서 M-CSF (20 ng/ml)에 3일동안 배양하였다. 부유세포를 씻어낸 후 부착 세포를 파골세포 전구체로 사용하였다.
2) 파골세포 전구체에 대한 세포독성 평가
화학식 1로 표시되는 화합물(obatoclax, Selleck Chemicals)의 파골세포 전구체에 대한 세포독성을 시험하였다. 파골세포 전구체를 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 0, 10, 100, 및 1000 nM로 각각 24시간 동안 처리한 후, 세포활성도를 MTT 분석 키트{(3-[4,5-dimethyl-2-thiazolyl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay kit, Sigma}를 이용하여 측정해 그 결과를 도 1에 나타내었다(**p < 0.005 vs. 미처리 세포). 흡광도는 570 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Rad)로 측정하였다. 상기 도 1을 참조하면, 10 nM와 100 nM의 저용량에서 오바토클락스는 세포독성을 보이지 않았으나, 1000 nM의 고용량에서는 세포활성을 완전히 저하시키는 세포독성 특성을 보였다.
3) 파골세포 전구체에 대한 세포증식 평가
화학식 1로 표시되는 화합물의 파골세포 전구체에 대한 세포증식능을 시험하였다. 파골세포 전구체를 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 0, 10, 100, 및 200 nM로 각각 48시간 동안 처리한 후, 세포 증식은 BrdU incorporation assay kit(Cell Signaling Technology)를 이용하여 매뉴얼에 따라서 분석하였다. BrdU은 배양이 끝나기 12 시간 전에 넣어주었고, 배양의 마지막에, 30분 동안 고정 용액으로 세포들을 고정하고, PBS 용액으로 두 번 행군 후 1시간동안 monoclonal anti-BrdU antibody으로 배양한 후 30분동안 anti-mouse secondary antibody로 배양하였다. 마지막 세척 후 기질을 웰에 넣고 종료용액을 도입했다. 핵 내에 BrdU이 도입된 총 세포의 수를 450 nm 파장에서 microplate reader (Bio-Rad)로 흡광도를 측정하여 평가하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다(*p < 0.05, **p < 0.005 vs. 미처리 세포). 상기 도 2를 참조하면, 저 용량의 오바토클락스가 상당한 정도로 파골세포 전구체의 증식 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
4) 파골세포 전구체의 세포사 평가
화학식 1로 표시되는 화합물의 파골세포 전구체의 세포사(Apoptosis)에 미치는 영향을 평가하였다. 96-웰 플레이트에 파골세포 전구체를 2×104 cells/ well로 접종하고 각각 도 3에 표시된 농도의 화학식 1로 표시되는 화합물로 48시간 동안 처리한 후 늘어난 세포사를 관찰하였다. 세포사는 Annexin V Apoptosis Kit (BD Biosciences)로 매뉴얼에 따라 측정되었으며, 구체적으로 PBS로 셀들을 세척한 후 1×Annexin V binding buffer (BD Biosciences)에 재서스펜션 시키고, 10 μl Annexin V-APC (BD Biosciences)으로 어두운 곳에서 30분동안 라벨링하였다. 배양 후, 바인딩 버퍼를 넣고 FACScan flow cytometer (Becton Dickinson)을 이용하여 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다(*p < 0.05 및 **p < 0.005 vs. 미처리세포). 상기 도 3을 참고하면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 농도의존적으로 세포사된 파골세포 전구체의 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다
이러한 결과들을 종합하면, 파골세포 전구체의 세포사 도입에 의하여 상기 화합물이 세포 증식을 억제한다는 것을 보여주는 결과로 생각된다.
5) RANKL에 의한 MAP 키나아제의 활성 관여 평가
화학식 1로 표시되는 화합물이 어떻게 파골세포 전구체의 증식에 관여하는지를 확인하기 위하여, RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, 파골세포 분화유도 단백질)에 의한 MAP 키나아제 활성에 위의 화합물이 관여하는지 시험하였다.
파골세포 전구체는 도 4에 표시된 시간(각각 5, 15, 및 60 min) 동안 화학식 1로 표시되는 화합물 100 nM로 처리되거나 처리되지 않은 상태로 최대 2 시간 동안 RANKL로 처리되었다. 이렇게 처리된 총 단백질은 분리된 후 MAP 키나아제-특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통해서 분석되었다. 구체적으로, 처리된 파골세포 전구체에 포함된 단백질은 lysis buffer에 세포분쇄 시키고, 원심분리 후 상등액을 취하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel)에 전기영동 시키고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane)에 블롯하였다. 면역블로팅(immunoblotting)은 p-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2), ERK1/2, p-JNK1/2(phosphorylated JNK1/2), JNK1/2, p-p38(phosphorylated p38), p38 MAP 키나아제에 특이적인 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)로 진행되었고, HRP-conjugated secondary antibodies로 처리된 후 ECL 검사 키트(ECL detection kit, Amersham Biosciences)를 이용하여 확인하였으며, 확인된 웨스턴 블롯 분석 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 단백질 밴드는 밀도측정에 의해서 정량화되었고, 인산화된 ERK1/2 MAP 키나아제의 수준은 ERK1/2를 기준으로 정량화하여 도 5에 나타내었다(*p < 0.05 및 **p < 0.005 vs. 미처리세포).
상기 도 4 및 도 5를 참조하면, RANKL은 효과적으로 ERK1/2, JNK1/2, 그리고 p38 MAP 키나아제를 활성화 시킨다는 점을 확인했으며, 화학식 1로 표시되는 화합물로 처리한 샘플은 RANKL에 의한 ERK1/2의 활성이 현저하게 억제되었으나, JNK1/2와 p38 MAP kinases의 활성에는 영향이 없다는 점을 확인할 수 있었다.
6) ERK1/2 MAP 키나아제 억제 효과 확인
화학식 1로 표시되는 화합물에 의하여 ERK1/2 MAP 키나아제가 억제되는 지를 확인하기 위해 세포 증식에 연관된 ERK 억제제인 PD98059를 도입하여 실험하였다.
상기 파골세포 전구체를 이용하여 RANKL로 48시간 동안 처리하기 2시간 전에 화학식 1의 화합물(100 nM, Ob로 표시)로 처리하였고, ERK 억제제인 PD98059(10 μM, PD로 표시)는 30분 전에 처리하여 실험을 진행한 후 세포활성과 세포사 평가 결과를 각각 도 6 및 도 7에 나타내었다(*p < 0.05 및 **p < 0.005 vs. 미처리세포).
상기 도 6 및 도 7을 참조하면, RANKL 단독으로는 파골세포 전구체의 세포증식과 세포사를 조절하지 못하는 반면에, PD98059로 처리된 경우에는, 화학식 1의 화합물로 처리한 것과 유사하게, 세포증식을 효과적으로 억제하고 RANKL의 존재 하에서도 세포사를 증가시킨다는 점을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 화학식 1의 화합물이 ERK1/2 MAP 키나아제의 억제를 통하여 파골세포 전구체의 증식과 세포사를 조절한다는 것을 보여주는 결과로 생각된다.
실시예 2: 화학식 1로 표시되는 화합물에 의한 파골세포 전구체의 세포융합 억제실험
1) 화학식 1로 표시되는 화합물로 처리한 파골세포 전구체의 파골세포형성능 평가
우선, 파골세포에 대한 PD98059의 영향을 시험하였다. 파골세포 형성 분석(osteoclast formation assay)을 위해 쥐의 대퇴부에서 채취한 파골세포 전구체 세포를 RANKL 200 ng/ml과 M-CSF 30 ng/ml의 존재 하에서 배양하였다. 3일 후, 세포를 고정하고 TRAP 염색 키트(TRAP staining kit, Sigma)을 이용하여 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)으로 염색하여 관찰하고, 크기가 100 μm 이상이고 20 개 이상의 핵을 함유하는 TRAP-양성 다중핵 세포(TRAP+ MNCs)과 TRAP-양성 단색 세포들의 수를 상대 비율(%)로 나타내서 파골세포형성능을 평가하였다.
동일한 방법으로, 30분 동안 PD98059 10 μM으로 전처리한 후 RANKL로 3일동안 처리한 샘플을 TRAP 염색하여 배율 100 배로 관찰하였고 그 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다. 상기 도 8 내지 도 10을 참조하면, RANKL에 의한 자극은 파골세포 분화를 눈에 띄게 유도한다는 점을 확인할 수 있었으며, PD98059로 전처리한 경우에는 20개 이상의 핵을 포함하며 크기가 100 μm 이상인 융합된 다핵세포의 수가 완전히 억제된 반면에, TRAP 양성 단핵 세포의 수가 늘어난다는 점도 확인할 수 있었다.
PD98059로 처리하는 대신에 각각 100 nM 또는 200 nM의 화학식 1로 표시되는 화합물(Ob)로 2시간 동안 처리한 것을 제외하면 위와 동일하게 처리한 세포를 TRAP 염색하여 관찰하였고, 그 결과를 도 11 내지 도 13에 각각 나타내었다. 상기 도 11 내지 도 13을 참조하면, 화학식 1로 표시되는 화합물은 단독으로 파골세포 분화를 조절하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나, RANKL에 의한 자극에도 불구하고 농도 의존적으로 20개 이상의 핵을 포함하며 크기가 100 μm 이상인 융합된 다핵세포의 수가 완전히 억제된다는 점을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 종합하면, 화학식 1의 화합물은 ERK 억제제와 유사한 효과를 보이며, ERK1/2 MAP 키나아제에 의하여 파골세포 전구체가 단핵세포에서 다핵세포로 세포-세포 융합되는 것을 다운레귤레이션 시키는 것으로 보인다. 즉, 화학식 1의 화합물은 ERK1/2 신호전달을 블락킹해서 파골세포 전구체의 세포융합을 저하시킨다.
2) 화학식 1의 화합물에 의한 DC-STAMP 과 Atp6v0d2 억제 평가
화학식 1로 표시되는 화합물에 의하여 파골세포 전구체의 세포-세포 융합에 관여하는 DC-STAMP 와 Atp6v0d2의 발현을 조절한다는 점을 확인하기 위한 실험을 진행하였다.
분리된 파골세포 전구체를 2시간 동안 100 nM의 화학식 1의 화합물(Ob)로 전처리한 후 RANKL(R)로 표시된 시간만큼 처리한 후 RNA를 분리해 실시간 PCR처리를 했다. 분리한 RNA를 역전사효소(SuperscriptⅢ reverse transcriptase, Invitrogen)을 이용하여 매뉴얼에 따라 역전사한 후 실시간 PCR처리 하였으며, 타겟 유전자에 특이적인 프라이머와 HPRT를 이용하여 Brilliant UltraFast SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent Technologies)과 MX3000 instrument (Agilent Technologies)을 이용하여 수행하였고 그 결과를 도 14 및 도 15(*p < 0.05, **p < 0.005 vs. 미처리 세포. #p < 0.05 vs. 24시간 동안 RANKL 처리된 세포)에 나타내었다. HPRT는 정규화의 목적으로 사용되었다.
상기 도 14 및 도 15를 참조하면, RANKL은 효과적으로 파골세포 마커 유전자(c-Fos, TRAP, RANK, 및 CtsK)의 발현을 유도하였고, 화학식 1의 화합물로 전처리한 경우에도 이들의 발현에 영향이 없었다. 그러나, RANKL 자극에 의해서 유도된 DC-STAMP 과 Atp6v0d2의 발현은 화학식 1의 화합물을 이용한 전처리에 의해서 사라진다는 점을 확인할 수 있었다. 즉, 화학식 1의 화합물은 DC-STAMP 와 Atp6v0d2의 발현을 저해한다는 결과를 얻었다.
이러한 결과가 ERK1/2 MAP 키나아제의 억제에 의한 것인지를 확인하기 위해, 세포들을 30분동안 10 μM의 PD98059로 전처리한 후 3일 동안 RANKL(R)로 처리하여 제조한 세포들의 용해물 30 μg을 이용해 웨스턴 블롯 분석을 수행했고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 상기 도 16을 참조하면, PD98059로 전처리한 경우도 RANKL에 의하여 유도된 DC-STAMP 과 Atp6v0d2의 발현이 억제된다는 점을 확인할 수 있었고, 이는 도 15의 결과와 마찬가지로 화학식 1의 화합물이 ERK 1/2 MAP 키나아제 경로를 통해서 파골세포가 융합되는 것을 조절한다는 점을 보여주는 결과이다.
이러한 결과들에 의하여, 위의 화학식 1로 표시되는 화합물은 RANKL에 의한 ERK1/2 MAP 키나아제 경로를 억제하여 파골세포 전구체의 증식과 융합을 저해하는 역할을 하는 것을 확인하였다.
* 통계분석: 위의 결과들은 적어도 3번의 독립적인 실험한 결과의 mean ± SD 로 도출되었고, 통게분석은 Student’s t test을 이용하여 P < 0.05를 유의수준으로 처리하였다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (5)
- 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는, 파골세포의 분화 억제 또는 파골세포의 세포융합 억제 활성에 의한, 파제트병(Paget's disease), 골다공증(osteoporosis), 및 용해성 골전이(lytic bone metastasis)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 골손실의 완화, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)에 의하여 파골세포 또는 파골세포 전구체에 유도되는 DC-STAMP(Dendritic cell-specific transmembrane protein) 및 Atp6v0d2(d2 isoform of vacuolar (H+) ATPase Vodomain)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 발현을 억제하는 것인, 약학적 조성물. - 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, in vitro(시험관)에서의 파골세포 분화 억제용 조성물.
- In vitro(시험관)에서 파골세포 전구체에 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌을 처리하는 단계를 포함하는, 파골세포 전구체의 세포-세포융합을 억제하여 파골세포 전구체가 파골세포로 성숙하는 것을 억제하는 방법.
- 2-(2-((3,5-디메틸-1H-피롤-2-일)메틸렌)-3-메톡시-2H-피롤-5-일)-1H-인돌 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는, 파골세포의 분화 억제 또는 파골세포의 세포융합 억제 활성에 의한, 파제트병(Paget's disease), 골다공증(osteoporosis), 및 용해성 골전이(lytic bone metastasis)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 골손실의 완화 또는 예방용 건강기능식품.
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