KR101664800B1

KR101664800B1 - 테모졸로마이드와 nppb(5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산)를 결합한 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101664800B1
Application number: KR1020140149827A
Authority: KR
Inventors: 최기현; 윤호종; 박미리; 주희영; 박슬기
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2016-10-12
Also published as: KR20160052012A

Abstract

본 발명은 뇌종양 치료제인 테모졸로마이드(temozolomide, TMZ)를 클로라이드 채널 저해제인 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산 (5-nitro-2(3-phenylpropylamino)-benzoic acid, NPPB)를 결합한 화합물(이하, TMZ-NPPB로 약칭한다.) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화합물은 암 세포에 대한 세포사멸 활성과 세포침습 저해활성을 동시에 가짐으로써 뛰어난 항암활성을 나타내는바, 악성 신경교아종, 흑색종, 아교모세포종 및 기타 뇌암, 식도암, 췌장암, 폐암, 침윤성 직장암, 유방암, 전이성 전립선암, 난소암 등과 같은 다양한 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

테모졸로마이드와 NPPB(5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산)를 결합한 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Conjugate compound of temozolomide and 5-nitro-2(3-phenylpropylamino)-benzoicacid, and Pharmaceutical composition for prevention and treatment of cancer comprising the compound}

본 발명은 뇌종양 치료제인 테모졸로마이드(temozolomide, TMZ)를 클로라이드 채널 저해제인 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산(5-nitro-2(3-phenylpropylamino)-benzoic acid, NPPB)과 결합한 화합물(이하, TMZ-NPPB로 약칭한다.) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

교아종은 중추신경계의 아교 세포와 그 전구 세포에서 기원하는 악성 암으로 출혈 및 괴사를 동반하며, 뇌종양 중에서 발병 빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 1). 또한, 교아종은 암이 불규칙한 형태를 나타내고 경계가 불분명하여 주변 조직으로 신속하고 광범위하게 침습하는 성질이 있어 국부적인 외과 수술이나 방사선 및 화학요법으로 치료가 어려우며 대부분의 환자가 1년 이내에 사망한다 (비특허문헌 2).

교아종의 표준 치료법으로 방사선 요법과 함께 테모졸로마이드(Temozolomide, TMZ)라는 약물이 널리 사용되고 있는데, 테모졸로마이드는 알킬화제에 속하는 경구 항암제의 일종으로 뇌 종양을 치료하는 것으로 승인된 화학치료제다. 테모졸로마이드는 유전자의 염기 중 특히 구아닌(guanine)의 O6 또는 N7 위치를 알킬화하여 유전자를 파괴하는 것으로 알려져 있고 (비특허문헌 3), 미국에서는 Temodar, 유럽에서는 Temodal이라는 상표명으로 쉐링 코포레이션(Schering Corp.)에 의해 판매되고 있으며, 그 화학명은 3-메틸-8-아미노카르보닐-이미다조[5,1-d]-1,2,3,5-테트라진-4(3H)-온 (3-methyl-8-aminocarbonyl-imidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazin-4(3H)-on)이다.

한편, 교아종 세포가 뇌의 좁은 공간을 따라 활발하게 침습하기 위해서는 세포 수축이 필요한데, 교아종 세포는 이온 배출에 따른 수분 손실을 이용하여 세포 모양을 변화시키기 때문에 용이하게 침습할 수 있다 (비특허문헌 4). 특히 교아종 세포가 뇌의 정상조직으로 침습하는 성질은 세포 부피를 조절하는 클로라이드 채널이 활성화될 때 증가하며 실제로 교아종 환자의 생체시료에서 세포 부피를 조절하는 다양한 클로라이드 채널의 발현이 관찰되었다 (비특허문헌 5). 이중 CLC-3 클로라이드 채널은 뇌의 정상조직에 비해 4기 교아종 환자의 생체시료에서 10배 이상 과발현하는 것으로 보고되었으며, 이는 클로라이드 분비와 함께 일어나는 수분 손실이 교아종 세포의 이동과 침습에 중요하다는 사실을 증명한다.

이에 본 발명의 발명자는 대표적인 뇌종양 치료제인 TMZ에 클로라이드 채널 저해제를 결합하여 사용할 경우 TMZ에 의한 암세포의 사멸 효능(potency)을 향상시키는 동시에 사멸하지 않은 암세포의 이동과 침습을 억제함으로써 보다 효과적인 항암 치료가 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

Chen J, McKay RM, Parada LF (2012). Malignant glima: lessons from genomics, mouse models, and stem cells. Cell 149: 36-47. Liu J, Guo S, Li Q Yang L, Xia Z, Zhang L, et al. (2013) Phosphhoglycerate dehydrogenase induces glioma cells proliferation and invasion by stabilizing forkhead box M1. Journal of neuro-oncology 111: 245-255. Zhang J, Stevens MF, Bradshaw TD (2012). Temozolomide: mechani는 of action, repair and resistance. Current molecular pharmacology 5: 102-114. Cuddapah VA, Robel S, Watkins S, Sontheimer H (2014) A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature reviews. Neuroscience 15: 455-465. Olsen ML, Schade S, Lyons SA, Amaral MD, Sontheimer H (2003) Expression of voltage-gated chloride channels in human glioma cells. The Journal of neuroscience 23: 5572-5582.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 암세포 사멸 효능을 향상시키는 동시에 사멸하지 않은 암세포의 이동과 침습을 억제함으로써 보다 효과적인 항암 치료가 가능한 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다

[화학식 1]

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또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료 효과는 암세포의 성장뿐만 아니라, 이동(전이)도 함께 억제함을 포함하며, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 암세포의 세포사멸 및 세포침습 억제를 통하여 항암활성을 나타낼 수 있다.

특히, 본 발명의 치료 대상이 되는 암은 악성 신경교아종, 흑색종, 아교모세포종 및 기타 뇌암, 식도암, 췌장암, 폐암, 침윤성 직장암, 유방암, 전이성 전립선암, 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 암세포에 대한 세포사멸 활성과 세포침습 저해활성을 동시에 가짐으로써 뛰어난 항암활성을 나타내는바, 악성 신경교아종, 흑색종, 아교모세포종 및 기타 뇌암, 식도암, 췌장암, 폐암, 침윤성 직장암, 유방암, 전이성 전립선암, 난소암 등과 같은 다양한 암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 농도에 따른 인간 교아종 세포 U-373MG에 대한 세포사멸 효과를 TMZ, NPPB를 단독, 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 경우와 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 인간 교아종 세포 U-373MG의 이동에 대한 영향을 확인하기 위한 상처-회복 실험(wound-healing assay) 결과로, TMZ-NPPB 화합물, TMZ, NPPB를 단독 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 배양접시 바닥에 상처를 낸 직후와 24시간 동안 상처 회복 후의 상태를 보여주는 사진이다.
도 3은 상처-회복실험에서 상처를 낸 24시간 후 세포의 이동으로 회복된 부분을 이동시간으로 나누어 이동속도(migration rate)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 U-373MG 인간 교아종 세포의 침습(invasion)에 대한 영향을 확인하기 위한 트랜스웰 챔버(transwell chamber) 실험 결과로, TMZ-NPPB 화합물, TMZ, NPPB를 단독 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 매트리젤(matrigel)에 U-373MG 세포를 분주하고 24시간 후에 세포의 침습 정도를 보여주는 사진이다.
도 5는 트랜스웰 챔버(transwell chamber) 실험에서 24시간 동안 침습한 U-373MG 세포(invaded cells)의 수를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB에 의한 U-373MG 인간 교아종 세포의 클로라이드 전류 감소를 패치 클램프(patch clamp)로 측정한 결과로, TMZ-NPPB와 NPPB 경우 모두 농도-의존적(concentration-dependent) 클로라이드 전류 감소를 보였다.
도 7은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB에 의한 U-373MG 인간 교아종 세포의 클로라이드 전류 감소를 +120 ㎷ 전압에서 측정한 최대 전류를 이용하여 계산한 %저해(% Inhibition)를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

원발성 뇌종양은 뇌-척수조직이나 이를 싸고 있는 막에 생기는 종양으로 지속적으로 증가 추세에 있다. 그 중 교아종(glioblastoma)은 중추신경계의 아교 세포와 그 전구 세포에서 기원하는 악성 암으로 출혈 및 괴사를 동반하며, 뇌종양 중에서 발병 빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다. 또한 암이 불규칙한 형태를 나타내고 경계가 불분명하여 주변 조직으로 신속하고 광범위하게 침습하는 성질이 있어 국부적인 외과 수술이나 방사선 및 화학요법으로 치료가 어려워 대부분의 환자가 1년 이내에 사망하는 것으로 알려져 있다.

교아종의 표준 치료법으로 방사선 요법과 함께 테모졸로마이드(Temozolomide, TMZ)라는 약물이 널리 사용되고 있는데, 테모졸로마이드는 알킬화제에 속하는 경구 항암제의 일종으로 뇌 종양을 치료에 승인된 화학치료제이다. 테모졸로마이드는 유전자의 염기 중 특히 구아닌(guanine)의 O6 또는 N7 위치를 알킬화하여 유전자를 파괴하는 것으로 알려져 있고, 미국에서는 Temodar, 유럽에서는 Temodal이라는 상표명으로 쉐링 코포레이션(Schering Corp.)에 의해 판매되고 있으며, 그 화학명은 3-메틸-8-아미노카르보닐-이미다조[5,1-d]-1,2,3,5-테트라진-4(3H)-온 (3-methyl-8-aminocarbonyl-imidazo[5,1-d]-1,2,3,5-tetrazin-4(3H)-on)이며 하기와 같은 화학구조를 이루고 있다.

[TMZ]

한편, 교아종 세포가 뇌의 좁은 공간을 따라 활발하게 침습하기 위해서는 세포 수축이 필요한데, 교아종 세포는 이온 배출에 따른 수분 손실을 이용하여 세포 모양을 변화시키기 때문에 용이하게 침습할 수 있다. 특히, 교아종 세포가 뇌의 정상조직으로 침습하는 성질은 세포 부피를 조절하는 클로라이드 채널이 활성화될 때 증가하며 실제로 교아종 환자의 생체시료에서 세포 부피를 조절하는 다양한 클로라이드 채널의 발현이 관찰되었다. 이중 CLC-3 클로라이드 채널은 뇌의 정상조직에 비해 4기 교아종 환자의 생체시료에서 10배 이상 과발현하는 것으로 보고되었으며, 이는 클로라이드 분비와 함께 일어나는 수분 손실이 교아종 세포의 이동과 침습에 중요하다는 사실을 증명한다.

이에 본 발명의 발명자는 대표적인 뇌종양 치료제인 TMZ에 하기와 같은 화학구조를 이루고 있는 클로라이드 채널 저해제인 5-니트로-2-(3-페닐프로필아미노)벤조산 (5-nitro-2(3-phenylpropylamino)-benzoic acid, NPPB)을 결합하여 사용할 경우 TMZ에 의한 암세포의 사멸 효능을 향상시키는 동시에 사멸하지 않은 암세포의 이동과 침습을 억제함으로써 보다 효과적인 항암 치료가 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

[NPPB]

따라서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다

[화학식 1]

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상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않은 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 본 발명의 화합물을 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등의 술폰산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 카프릭산, 이소부탄산, 말론산, 석신산, 프탈산, 클루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리실산 등과 같은 유기 카본산과 반응시켜 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물을 염기와 반응시켜, 암모늄염, 나트륨염 또는 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 칼슘 또는 마그네슘염 등의 알칼리토금속염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민 등의 유기 염기들의 염 및 아르기닌, 리신 등의 아미노산염을 형성하여 얻을 수도 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 통상적인 유기 합성 경로를 통해 합성될 수 있으며, 바람직하게는 하기 실시예에 기재되어 있는 반응식 1 내지 3의 경로를 통해 합성될 수 있다. 이때 사용되는 반응 용매는 예를 들어, 디클로로메탄, 디클로로에탄 등의 할로겐화탄화수소류, 에틸아세테이트 등의 아세테이트류, 아세토니트릴 등의 니트릴류, 메탄올, 에탄올 등의 알콜류, 헥산, 톨루엔 등의 탄화수소류, 테트라하이드로퓨란(THF), 디에틸 에테르, 이소프로필 에테르 등의 에테르류, 디메틸포름아미드(DMF) 등의 아미드류 등이 사용될 수 있다.

이때, 상기 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있다. 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리키드 파라핀 외에 여러 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸롤레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물의 제형은 과립제, 산제, 피복정, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 대상체는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 암의 예방 또는 치료 효과는 암세포의 성장뿐만 아니라, 이동(전이)과 침습도 함께 억제함을 포함하며, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 암세포의 세포사멸 및 세포 침습 억제를 통하여 항암활성을 나타낼 수 있다.

이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1. 화학식 1의 화합물( TMZ - NPPB )의 제조

하기와 같이 4단계의 합성 과정을 통해 화학식 1의 화합물(TMZ-NPPB)을 제조하였다.

단계 1: 화학식 4의 화합물 합성

하기 반응식 1에 따라, 하기 화학식 4의 2-((6-(1,3-디옥소이소인돌린-2-일)헥실)아미노)-5-니트로벤조산을 합성하였다.

[반응식 1]

[화학식 2] [화학식 3] [화학식 4]

상기 반응식 1에서, (c)는 N-메틸-2-피롤리돈(NMP), 탄산나트륨 및 요오드칼륨을 포함하는 반응조건이다.

상기 화학식 2의 메틸 2-아미노-5-니트로벤조에이트(948 ㎎, 4.83 m㏖)와 상기 화학식 3의 2-(6-브로모헥실)이소인돌린-1,3-디온(1.5 g, 4.83 m㏖)에 N-메틸-2-피롤리돈(NMP, 24 ㎖)을 가한 후, 탄산나트륨(1.02 g, 9.66 m㏖) 및 요오드칼륨(802 ㎎, 4.83 m㏖)을 상온에서 가한 후, 100 ℃에서 2일 동안 교반하였다. 반응용액을 상온으로 식힌 후, 1 N HCl을 가하여 반응을 종결하고 pH 2~3으로 산성화시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 소금물로 씻어주고 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피 방법(실리카 겔; 에틸 아세테이트:헥산 = 1:4 -> 1:2)을 이용하여 노란 고체의 화합물을 얻었다. 얻은 화합물을 디클로로메탄과 헥산을 이용하여 재결정하여 노란 고체의 표제화합물(1.23 g, 2.99 m㏖, 수율 62%)을 얻었다.

¹H NMR (400 ㎒, CDCl₃) δ 8.80(d, J =2.8 ㎐, 1H), 8.11(dd, J = 2.8 ㎐, 9.2 ㎐, 1H), 7.84-7.82(m, 2H), 7.71-7.69(m, 2H), 6.65(d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.30(t, J = 6.8 ㎐, 2H), 3.70(t, J = 6.8 ㎐, 2H), 1.82-1.68(m, 4H), 1.53-1.39(m, 4H)

단계 2: 화학식 5의 화합물 합성

하기 반응식 2에 따라, 하기 화학식 5의 2-((6-아미노헥실)아미노)-5-니트로 벤조산을 합성하였다.

[반응식 2]

[화학식 4] [화학식 5]

상기 반응식 2에서, (b)는 히드라진 수화물 및 메탄올을 포함하는 반응조건이다.

상기 화학식 4의 2-((6-(1,3-디옥소이소인돌린-2-일)헥실)아미노)-5-니트로벤조산(200 ㎎, 0.482 m㏖)을 에탄올/테트라히드로푸란(4.8 ㎖, 1:1)에 녹인 후, 0 ℃에서 히드라진 수화물(0.03 ㎖, 0.723 m㏖)을 가한 후 5분 동안 교반하였다. 이후 환류 장치를 연결하고 80 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 반응용액을 상온으로 식힌 후, 셀라이트를 이용해 고체 부산물을 여과하고, 디클로로메탄과 메탄올을 이용해 수차례 씻어주었다. 얻어진 여과액을 농축하여 추가 정제 없이 다음 반응에 이용하였다.

단계 3: 화학식 6의 화합물 합성

하기의 방법을 통해 하기 화학식 6의 3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로이미다조[5,1-d][1,2,3,5]테트라진-8-카보닐클로라이드를 제조하였다.

3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로이미다조[5,1-d][1,2,3,5]테트라진-8-카복시산(94 ㎎, 0.482 m㏖)을 치오닐 클로라이드(SOCl₂, 1 ㎖)에 녹인 후, 디메틸 포름아미드(1 방울)를 넣고 100°C에서 1 시간 동안 교반하였다. 1 시간 후, 반응물을 상온으로 식힌 후 농축/진공 건조하여 추가 정제 없이 다음 반응에 이용하였다.

단계 4: 화학식 1의 화합물 합성

하기 반응식 3에 따라, 하기 화학식 1의 2-((6-(3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로이미다조[5,1-d][1,2,3,5]테트라진-8-카복사미도)헥실)아미노)-5-니트로벤조산을 합성하였다.

[반응식 3]

[화학식 5] [화학식 6] [화학식 1]

상기 반응식 3에서, (a)는 디클로로메탄 및 트리에틸아민을 포함하는 반응조건이다.

상기 단계 3을 통해 얻은 화학식 6의 3-메틸-4-옥소-3,4-디히드로이미다조[5,1-d][1,2,3,5]테트라진-8-카보닐클로라이드에 디클로로메탄(5 ㎖)을 가한 후 교반하였다. 또한 단계 2에서 얻은 화학식 5의 2-((6-아미노헥실)아미노)-5-니트로벤조산을 디클로로메탄(5 ㎖)에 녹인 후, 트리에틸아민(0.33 ㎖, 2.41 m㏖)을 천천히 넣었다. 단계 2의 이 용액을 캐뉼라를 이용해 단계 3의 용액에 천천히 넣은 후, 12 시간 동안 상온에서 교반하였다. 1 N HCl을 가하여 반응을 종결하고 pH 2~3으로 산성화시킨 후, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 소금물로 씻어주고 황산마그네슘으로 건조한 후 농축하였다. 잔사를 디클로로메탄과 헥산을 이용하여 재결정하여 노란 고체의 표제화합물(159 ㎎, 0.347 m㏖, 수율 72%)을 얻었다.

¹H NMR (400 ㎒, DMSO) δ 8.79(s, 1H), 8.56(d, J = 2.8 ㎐, 1H), 8.47(t, J = 6.0 ㎐, 1H), 8.06(dd, J = 2.8 ㎐, 9.2 ㎐, 1H), 7.82(bs, 1H), 4.25(t, J = 6.8 ㎐, 2H), 3.84(s, 3H), 3.29(q, J = 6.8 ㎐, 2H), 1.75-1.68(m, 2H), 1.59-1.39(m, 2H), 1.38-1.36(m, 4H)

실시예 2. 인간 교아종 세포 U-373 MG 에 대한 TMZ - NPPB 의 세포사멸 실험

2-1. U-373 MG 세포주 배양

인간 교아종 세포인 U-373MG의 배양액은 둘베코 개질 이글 배양액(Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM)에 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, v/v)을 첨가하여 제조하고 세포는 37 ℃, 95% 공기와 5% CO₂의 가습 조건에서 배양하였으며, 배양액은 3-4일에 한 번씩 교환하고 세포는 매주 분주하였다.

2-2. 화합물 처리 및 세포사멸 실험

Poly-L-lysine이 코팅된 투명한 96-웰 플레이트(clear wall/bottom 96-well plate; Falcon)에 웰 당 실시예 2-1의 세포 5x10³개를 분주하고 24 시간 후에 각 화합물을 배양액에 농도별로 희석하여 각 웰에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 10x PBS 용액에 5 ㎎/㎖ 농도로 녹인 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (TBTB; Sigma Aldrich)를 배양액에 1:9의 비율(TBTB-PBS 용액 10 ㎕ + 배양액 90 ㎕)로 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 (TBTB 50 ㎍ 씩) 첨가하였다. 37°C에서 1시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 100 ㎕ DMSO를 넣은 후, Flexstation3 플레이트 리더(Plate Reader; Molecular Devices)를 사용하여 560 ㎚ 파장에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 화합물 농도에 따른 % 세포 생존(% cell viability)은 화합물을 처리하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 % 값으로 계산하고, 농도-반응 저해 공식(concentration-response inhibition function)으로 곡선 적합(curve fitting)하여 GI₅₀ 값(half-maximum growth inhibition value)을 구하였다.

도 1은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 농도에 따른 인간 교아종 세포 U-373MG에 대한 세포사멸 효과를 TMZ, NPPB를 단독, 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 경우와 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 이를 통해 TMZ-NPPB 화합물이 TMZ, NPPB를 단독 처리한 경우, 또는 병용 처리(TMZ+NPPB)한 경우에 비해 암세포 사멸 효능(porency)이 뛰어난 것을 알 수 있다.

실시예 3. 인간 교아종 세포 U-373 MG 의 이동 및 침습에 대한 TMZ - NPPB 의 영향 실험

3-1. 상처-회복 실험

Poly-L-lysine이 코팅된 6-웰 플레이트(6-well plate; Nunc)에 웰 당 5x10⁵개의 실시예 2-1 세포를 분주한 후 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 2-㎕ 파이펫 팁을 이용하여 배양접시 바닥을 긁어 상처를 낸 후 PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 새로운 배양액에 각 화합물을 실시예 2-2에서 구한 화합물 고유의 GI₅₀ 값(half-maximum growth inhibition value)으로 희석하여 각 웰에 처리하고 0시간과 24시간 후 상처 부분을 현미경(ECLIPSE Ti, Nikon Instruments)으로 관찰하였다. Image J 프로그램(National Institutes of Health; NIH)을 이용하여 세포의 이동으로 감소한 상처 넓이를 계산하고 이동 시간으로 나눠 세포 이동 속도(migration rate)를 구하였다.

도 2는 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 인간 교아종 세포 U-373MG의 이동에 대한 영향을 확인하기 위한 상처-회복 실험(wound-healing assay) 결과로, TMZ-NPPB 화합물, TMZ, NPPB를 단독 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 배양접시 바닥에 상처를 낸 직후와 24시간 동안 상처 회복 후의 상태를 보여주는 사진이다. 이를 통해 TMZ에 의한 암세포 이동 억제 효과는 없는 반면에 TMZ-NPPB 화합물은 NPPB 또는 TMZ와 NPPB를 병용 처리(TMZ+NPPB)한 경우와 비슷한 정도의 암세포 이동 억제 효과를 보이는 것을 알 수 있다.

3-2. 트랜스웰 챔버 ( Transwell chamber ) 세포침습 실험

Matrigel Invasion Chamber (8.0-㎛ pore size; BioCoat Corning) 24-웰 플레이트에 37℃ 배양액을 첨가하여 37℃, 95% 공기와 5% CO₂의 가습 조건에서 2시간 동안 재수화(rehydration)시켰다. 배양액을 제거한 후 플레이트의 각 웰에 약물을 포함한 배양액을 첨가하였다. 약물을 포함한 배양액에 희석한 실시예 2-1의 세포 1x10⁵개를 각 챔버에 첨가한 후 집게를 이용하여 각 웰로 옮겼다. Matrigel Invasion Chamber에 분주한 세포를 37℃, 95% 공기와 5% CO₂의 가습 조건에서 24시간 동안 배양한 후, 세포를 4% 포름알데히드와 100% 메탄올로 고정하고 Trypan Blue (Gibco)로 살아있는 세포를 염색하였다. Matrigel 위에 침습하지 않고 남아있는 세포를 면봉으로 닦아준 후 각 웰당 임의로 고른 서로 다른 부분을 현미경(ECLIPSE Ti, Nikon Instruments) 20x 배율로 관찰하였고 Image J 프로그램(National Institutes of Health; NIH)을 이용하여 세포의 개수를 세었다.

도 4는 본 발명에 따른 TMZ-NPPB 화합물의 U-373MG 인간 교아종 세포의 침습(invasion)에 대한 영향을 확인하기 위한 트랜스웰 챔버(transwell chamber) 실험 결과로, TMZ-NPPB 화합물, TMZ, NPPB를 단독 또는 병용(TMZ+NPPB) 처리한 매트리젤(matrigel)에 U-373MG 세포를 분주하고 24시간 후에 세포의 침습 정도를 보여주는 사진이다.

도 5는 트랜스웰 챔버(transwell chamber) 실험에서 24시간 동안 침습한 U-373MG 세포(invaded cells)의 수를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

이를 통해 TMZ에 의한 암세포 침습 억제 효과는 없는 반면에 TMZ-NPPB 화합물은 NPPB 또는 TMZ와 NPPB를 병용 처리(TMZ+NPPB)한 경우와 비슷한 정도의 암세포 침습 억제 효과를 보이는 것을 알 수 있다.

실시예 4. TMZ - NPPB 에 의한 인간 교아종 세포 U-373 MG 의 클로라이드 전류 감소 실험

4-1. 전 세포 패치 클램프 기록( whole - cell patch - clamp recording ) 방법

전 세포 패치 클램프 기록 방법으로 U-373MG 세포의 클로라이드 전류를 측정한다. 클로라이드 전류 측정에 사용할 U-373MG 세포는 실험 4 시간 전에 poly-L-lysine이 코팅된 커버 글라스(cover glass; 12CIR-1, Fisher Scientific)에 깔아 놓았다. 패치 파이펫(patch pipette)은 얇은 벽 모세관 유리 튜브(thin-wall capillary glass tubing; G150T-3, Warner Instruments)을 이용하여 마이크로 파이펫 풀러(Micropipette Puller; P-97, Sutter Instrument)로 최종 저항 값이 5-7 MΩ이 되도록 제작하였다. 클로라이드 전류 측정을 위한 내부 용액(internal solution)은 140 mM CsCl, 2 mM MgCl₂, 4.9 mM CaCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES 완충 용액을 Tris base로 적정하여 pH 7.2로 맞추었다. 내부 용액에 사용한 4.9 mM CaCl₂는 세포 내 칼슘 농도([Ca² ⁺]_i) 180 nM에 해당하며, 이 농도의 칼슘은 클로라이드 채널을 활성화시킴으로써 클로라이드 전류를 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Cuddapah et al ., 2013). 외부 용액(external solution)은 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 10.55 mM Glucose, 32.5 mM HEPES 완충 용액으로 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 적정하였다. 전 세포 기록을 위한 패치 클램프 증폭기(patch-clamp amplifier)는 Patch Clamp EPC 10 USB (HEKA Elektronik)를 이용하고 전용 프로그램인 PatchMaster(HEKA Elektronik)를 이용하여 10 ㎑ 샘플링 속도로 데이터를 저장하고 분석하였다. 클로라이드 채널의 외향 전류(outward current)를 유도하기 위한 펄스 프로토콜(pulse protocol)은 다음과 같다. -40 ㎷에서 세포를 고정(holding)하고 측정 펄스는 -60 ㎷에서 +120 ㎷까지 20 ㎷씩 증가시키면서 0.18초 동안 2초 간격으로 측정한다. 전압-의존성 전류(voltage-dependent current)는 P/4 누수 감하기 프로토콜(P/4 leak subtraction protocol)을 이용하여 누수 전류(leak current)와 잔여 정전용량(residual capacitance)에 대해 보정한다.

4-2. TMZ - NPPB 에 의한 클로라이드 전류 감소 실험

클로라이드 채널 저해제에 의한 클로라이드 전류 감소 실험을 위해, 외부 용액에 125 μM 또는 300 μM TMZ-NPPB를 준비하여 처리하고 대조 약물로는 같은 농도의 NPPB를 사용하였다. 자세하게는, TMZ-NPPB 용액의 경우 초음파기(ultrasonicator; BRANSON 1510, Branson Ultrasonics)로 10분 동안 4회 소니케이션(sonication)하여 준비하였다. 외부 용액을 충분히 교환하기 위해 200-㎕ 용량 챔버(chamber)의 10배 정도 되는 용액(2 ㎖)을 흘려주었다. 화합물에 따른 % 저해(% inhibition)는 -120 ㎷ 측정 펄스에서 최대 외향 전류를 화합물을 처리하지 않은 대조군에 대한 % 값으로 계산하였다.

도 6은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB에 의한 U-373MG 인간 교아종 세포의 클로라이드 전류 감소를 패치 클램프(patch clamp)로 측정한 결과로, TMZ-NPPB와 NPPB 경우 모두 농도-의존적(concentration-dependent) 클로라이드 전류 감소를 보였다.

도 7은 본 발명에 따른 TMZ-NPPB에 의한 U-373MG 인간 교아종 세포의 클로라이드 전류 감소를 +120 ㎷ 전압에서 측정한 최대 전류를 이용하여 계산한 %저해(% Inhibition)를 나타낸 그래프이다.

이를 통해 TMZ-NPPB 화합물이 NPPB와 비슷한 정도의 클로라이드 전류 저해 효과를 보이는 것을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 1]

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제1항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 인간 교아종 세포 U-373MG의 증식, 침습 또는 이동(전이)에 의해 유발된 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 인간 교아종 세포 U-373MG의 증식, 침습 또는 이동(전이)에 의해 유발된 암세포의 세포사멸 및 세포침습 억제를 통하여 항암활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
상기 인간 교아종 세포 U-373MG의 증식, 침습 또는 이동(전이)에 의해 유발된 암은 악성 신경교아종, 흑색종, 뇌암, 식도암, 췌장암, 폐암, 침윤성 직장암, 유방암, 전이성 전립선암 및 난소암으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.